Szybkie wytwarzanie amyloidu z białek natywnych in vitro

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest szybkie uzyskanie amyloidu fis z dowolnego białka in vitro. Osiąga się to poprzez rozpuszczenie wybranego białka w buforze MES w celu wywołania nieprawidłowego fałdowania struktury. Białko można następnie inkubować w wysokiej temperaturze, co sprzyja tworzeniu się amyloidu przy braku innych kofaktorów.

Alternatywnie, białko jest sieciowane przez EDC w celu wytworzenia stabilizowanych rozpuszczalnych więzadeł białkowych, prekursora amyloidu. Wreszcie, niebiałkowe kofaktory są mieszane ze stabilizowanymi rozpuszczalnymi oligomerami białkowymi, aby umożliwić tworzenie hybrydowych wyników amyloidu, które pokazują, że natywne białka mogą być łatwo przekształcane w potwierdzenie amyloidu, gdy jest to ułatwione przez sprzyjające warunki. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące chorób związanych z nieprawidłowym fałdowaniem białek, takie jak to, jak precyzyjnie amyloid tworzy się z rozpuszczalnych oligomerów białkowych oraz czy różne typy amyloidu mają różne funkcje biologiczne i patologiczne.

Na początek przygotuj bufor MES zgodnie z opisem w protokole tekstowym zarówno dla amyloidu zawierającego tylko białko, jak i stabilizowanego białka rozpuszczalnego. Następnie wszystkie więzadła ważą wybrane białko i odpuszczają je do 10 miligramów na mililitr w buforze MES. W tej demonstracji stosuje się albuminę surowicy ludzkiej lub HSA, inkubuje się roztwór w temperaturze 65 stopni Celsjusza w łaźni wodnej przez cztery godziny.

Pod koniec okresu w roztworze widoczny jest biały osad. Zneutralizować próbkę z 10% objętością na objętość. T tris, HCL dializują białko w kasecie dializacyjnej przez noc, aby wymienić je na pożądany bufor.

Do dalszej analizy należy przygotować próbkę kontrolną białka natywnego, wykonując następujące kroki bez wytrącania ciepła. Aby przygotować ustabilizowane rozpuszczalne białko, wszystkie więzadła ważą wybrane białko i rozpuszczają je do 10 miligramów na mililitr. W buforze MES pozostaw roztwór białkowy w temperaturze pokojowej na 15 minut.

Przygotuj świeży zapas 20 miligramów na mililitr EDC w buforze MES. Wymieszać roztwory białka i EDC w stosunku od dwóch do pięciu, a następnie inkubować w temperaturze pokojowej przez dwie godziny po inkubacji. Zneutralizować próbkę z 10% objętością na objętość tris HCL, dializować białko w kasecie dializacyjnej przez noc w celu wymiany do pożądanego buforu.

Do dalszej analizy. Przechowuj ustabilizowane rozpuszczalne białko we wszystkich więzadłach w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez okres do czterech tygodni. Zawiesina ta zostanie wykorzystana do przygotowania hybrydowych amyloidów do przygotowania zarówno DNA zawierającego amyloid, jak i RNA zawierającego amyloid

Wymieszaj kwas nukleinowy i stabilizowane rozpuszczalne białko wszystkie więzadła w stosunku jeden do jednego. W tym okresie pozostaw mieszaninę w temperaturze czterech stopni Celsjusza na co najmniej dwie godziny. Nierozpuszczalny osad jest widoczny w roztworze, gdy początkowe stężenie białka wynosi 0,5 miligrama na mililitr lub więcej.

Aby przygotować heparynę zawierającą amyloid, wymieszaj heparynę i stabilizowane rozpuszczalne białko, wszystkie więzadła w stosunku jeden do jednego, a następnie inkubuj je w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez co najmniej dwie godziny. Podobnie jak kwas nukleinowy zawierający amyloidy w rozpuszczalnym osadzie, widoczny jest w roztworze. Gdy początkowe stężenie białka wynosi 0,5 miligrama na mililitr lub więcej, zdolność do bezpośredniego przekształcania natywnych białek w amyloid zależy od potwierdzającej zmiany zachodzącej w wysokiej temperaturze.

W buforze MES wytrącanie się w roztworze jest dobrym wskaźnikiem agregacji białek i możliwego tworzenia amyloidu, aby umożliwić stabilizację rozpuszczalnych oligomerów białkowych. EDC służy do sieciowania białek w celu zestalenia potwierdzenia oligomerycznego indukowanego w buforze MES. W rezultacie, stabilizowane białka allgas są białkami multimerycznymi różniącymi się od monomerycznych białek natywnych lub agregatów indukowanych ciepłem.

Po rozdzieleniu przez stabilizowane stroną SDS rozpuszczalne białko wszystkie więzadła mogą łatwo wiązać się z kwasami nukleinowymi, w tym zarówno DNA, jak i RNA, w sposób niezależny od sekwencji. W związku z tym można przeprowadzić test przesunięcia żelu, aby uwidocznić bezpośrednią interakcję między ustabilizowanym rozpuszczalnym białkiem, wszystkimi więzadłami i DNA, co skutkowałoby opóźnioną migracją DNA na żel AROS. Cytotoksyczność jest archetypiczną cechą białka rozpuszczalnego.

Wszystkie więzadła stabilizowały rozpuszczalne białko, wszystkie więzadła indukowały śmierć komórki w zależności od dawki, którą można wykryć za pomocą sortowania komórek aktywowanego fluorescencją. Jak pokazano tutaj, komórki RP I 8 2 2 6 są niezwykle podatne na rozpuszczalne białka, całą śmierć wywołaną przez więzadła, która jest mierzona przez barwienie jodkiem propidyny. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować różne rodzaje amyloidu z dowolnego wybranego białka in vitro.