Name: Szybkie wytwarzanie amyloidu z białek natywnych in vitro (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-05T16:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 48 s
Description: Poznaj szybką metodę wytwarzania amyloidów z białek natywnych in vitro przy użyciu buforu MES i wysokiej temperatury. Technika ta umożliwia badanie mechanizmów nieprawidłowego zwijania białek i ich roli w chorobach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca jest wspierana przez granty dla W.C. z National Institutes of Health Grant AI074809 oraz The University of Texas M. D. Anderson Cancer Center Institutional Research Grant Program.

1. Przygotuj bufor MES
<ol>
	<li>Użyć buforu MES (0,1 M kwas 2-(N-morfolino)etanosulfonowy i 0,9 M NaCl) do przygotowania zarówno amyloidu zawierającego tylko białka, jak i stabilizowanych rozpuszczalnych oligomerów białkowych. Odważyć 1,95 g MES i 5,27 g NaCl. DodaćH2Oi dostosować pH do 4,7. Uzupełnić końcową objętość do 100 ml. Przechowywać w temperaturze 4º C do 6 miesięcy.</li>
</ol>
2. Przygotuj amyloid zawierający tylko białko bezpośrednio z natywnych białek
<ol>
	<li>Zważyć wybrane białko (dowolne białko natywne lub peptyd) i rozpuścić w buforze MES do 10 mg/ml.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 65 °C w łaźni wodnej przez 4 godziny. Pod koniec okresu w roztworze widoczny jest biały osad.</li>
	<li>Zneutralizować próbkę 10% (v/v) Tris-HCl (1 M, pH 10,5).</li>
	<li>Białko należy dializować w kasecie dializacyjnej przez noc, aby wymienić je na żądany bufor w celu dalszej analizy.</li>
	<li>Próbkę kontrolną białka natywnego można przygotować, wykonując kroki 2.1, 2.3 i 2.4 bez wytrącania ciepła (krok 2.2).</li>
</ol>
3. Przygotowanie hybrydowego amyloidu ze stabilizowanych rozpuszczalnych oligomerów natywnych białek
<ol>
	<li>Przygotowanie stabilizowanych rozpuszczalnych oligomerów białkowych
	<ol>
		<li>Zważyć wybrane białko i rozpuścić je w buforze MES do 10 mg/ml. Pozostawić w temperaturze pokojowej na 15 minut.</li>
		<li>Odważyć chlorowodorek 1-etylo-3-[3-dimetyloaminopropylo]karbodimidu (EDC) i przygotować świeży zapas 20 mg/ml w buforze MES.</li>
		<li>Wymieszać roztwory białka i EDC w stosunku 2:5 (v/v), tj. 2 mg białka na każde 10 mg EDC.</li>
		<li>Inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 godziny.</li>
		<li>Zneutralizować próbkę 10% (v/v) Tris-HCl (1 M, pH 10,5).</li>
		<li>Białko należy dializować w kasecie dializacyjnej przez noc, aby wymienić je na żądany bufor w celu dalszej analizy.</li>
		<li>Ustabilizowany rozpuszczalny oligomer białkowy należy przechowywać w temperaturze 4 ºC do 4 tygodni.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować hybrydowe amyloidy ze stabilizowanego rozpuszczalnego oligomeru białkowego.
	<ol>
		<li>Aby przygotować amyloid zawierający DNA, należy wymieszać DNA i stabilizowany rozpuszczalny oligomer białkowy w stosunku 1:1 (w/w). Pozostawić w temperaturze 4 ºC na co najmniej 2 godziny. W tym okresie nierozpuszczalny osad jest widoczny w roztworze, gdy początkowe stężenie białka wynosi 0,5 mg/ml lub więcej.</li>
		<li>Aby przygotować amyloid zawierający RNA, należy wymieszać RNA i stabilizowany rozpuszczalny oligomer białkowy w stosunku 1:1 (w/w). Pozostawić w temperaturze 4 ºC na co najmniej 2 godziny. W tym okresie nierozpuszczalny osad jest widoczny w roztworze, gdy początkowe stężenie białka wynosi 0,5 mg/ml lub więcej.</li>
		<li>Aby przygotować amyloid zawierający heparynę, należy zmieszać heparynę i stabilizowany rozpuszczalny oligomer białkowy w stosunku 1:1 (w/w). Pozostawić w temperaturze 4 ºC na co najmniej 2 godziny. W tym okresie nierozpuszczalny osad jest widoczny w roztworze, gdy początkowe stężenie białka wynosi 0,5 mg/ml lub więcej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Selkoe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding+proteins+in+fatal+ways%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Folding proteins in fatal ways.</a> Nature. 426, 900-904 (2003).</li>
<li>Schnabel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+folding%3A+The+dark+side+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Protein folding: The dark side of proteins.</a> Nature. 464, 828-829 (2010).</li>
<li>Goldberg, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+degradation+and+protection+against+misfolded+or+damaged+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Protein degradation and protection against misfolded or damaged proteins.</a> Nature. 426, 895-899 (2003).</li>
<li>Chiti, F., Dobson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+misfolding%2C+functional+amyloid%2C+and+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Protein misfolding, functional amyloid, and human disease.</a> Annu. Rev. Biochem. 75, 333-366 (2006).</li>
<li>Goldschmidt, L., Teng, P. K., Riek, R., Eisenberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+the+amylome%2C+proteins+capable+of+forming+amyloid-like+fibrils%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Identifying the amylome, proteins capable of forming amyloid-like fibrils.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 3487-3492 (2010).</li>
<li>Fowler, D. M., Koulov, A. V., Balch, W. E., Kelly, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+amyloid+-+from+bacteria+to+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem.+Sci%22%5BJournal%5D)">Functional amyloid - from bacteria to humans.</a> Trends Biochem. Sci. 32, 217-224 (2007).</li>
<li>Chapman, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Escherichia+coli+Curli+Operons+in+Directing+Amyloid+Fiber+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Role of Escherichia coli Curli Operons in Directing Amyloid Fiber Formation.</a> Science. 295, 851-855 (2002).</li>
<li>Barnhart, M. M., Chapman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Curli+Biogenesis+and+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Curli Biogenesis and Function.</a> Annu. Rev. Microbiol. 60, 131-147 (2006).</li>
<li>Claessen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+n%09olved+in+aerial+hyphae+formation+in+Streptomyces+coelicolor+by+forming+amyloid-like+fibrils%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A n	olved in aerial hyphae formation in Streptomyces coelicolor by forming amyloid-like fibrils.</a> Genes Dev. 17, 1714-1726 (2003).</li>
<li>Maji, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+Amyloids+As+Natural+Storage+of+Peptide+Hormones+in+Pituitary+Secretory+Granules%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Functional Amyloids As Natural Storage of Peptide Hormones in Pituitary Secretory Granules.</a> Science. 325, 328-332 (2009).</li>
<li>Badtke, M. P., Hammer, N. D., Chapman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+Amyloids+Signal+Their+Arrival%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Signal%22%5BJournal%5D)">Functional Amyloids Signal Their Arrival.</a> Sci. Signal. 2, pe43(2009).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RIP1%2FRIP3+Necrosome+Forms+a+Functional+Amyloid+Signaling+Complex+Required+for+Programmed+Necrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The RIP1/RIP3 Necrosome Forms a Functional Amyloid Signaling Complex Required for Programmed Necrosis.</a> Cell. 150, 339-350 (2012).</li>
<li>Hou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAVS+forms+functional+prion-like+aggregates+to+activate+and+propagate+antiviral+innate+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">MAVS forms functional prion-like aggregates to activate and propagate antiviral innate immune response.</a> Cell. 146, 448-461 (2011).</li>
<li>Stefani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+and+biophysical+features+of+both+oligomer%2Ffibril+and+cell+membrane+in+amyloid+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">Biochemical and biophysical features of both oligomer/fibril and cell membrane in amyloid cytotoxicity.</a> FEBS J. 277, 4602-4613 (2010).</li>
<li>Glabe, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+classification+of+toxic+amyloid+oligomers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Structural classification of toxic amyloid oligomers.</a> J. Biol. Chem. 283, 29639-29643 (1074).</li>
<li>Di Domizio, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+with+nucleic+acids+or+glycosaminoglycans+converts+soluble+protein+oligomers+to+amyloid%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Binding with nucleic acids or glycosaminoglycans converts soluble protein oligomers to amyloid.</a> J. Biol. Chem. 287, 736-747 (2012).</li>
<li>Zhang, X., Li, J. -P., Lijuan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heparan+sulfate+proteoglycans+in+amyloidosis%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Mol.+Biol.+Transl.+Sci%22%5BJournal%5D)">Heparan sulfate proteoglycans in amyloidosis.</a> Prog. Mol. Biol. Transl. Sci. 93, 309-334 (2010).</li>
<li>Jiménez, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-DNA+Interaction+at+the+Origin+of+Neurological+Diseases%3A+A+Hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Alzheimer%27s+Dis%22%5BJournal%5D)">Protein-DNA Interaction at the Origin of Neurological Diseases: A Hypothesis.</a> J. Alzheimer's Dis. 22, 375-391 (2010).</li>
<li>Bhattacharya, M., Jain, N., Mukhopadhyay, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+the+Mechanism+of+Aggregation+and+Fibril+Formation+from+Bovine+Serum+Albumin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem.+B%22%5BJournal%5D)">Insights into the Mechanism of Aggregation and Fibril Formation from Bovine Serum Albumin.</a> J. Phys. Chem. B. 115, 4195-4205 (2011).</li>
<li>Vetri, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bovine+Serum+Albumin+protofibril-like+aggregates+formation%3A+Solo+but+not+simple+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Biochem.+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Bovine Serum Albumin protofibril-like aggregates formation: Solo but not simple mechanism.</a> Arch. Biochem. Biophysics. 508, 13-24 (2011).</li>
<li>Bucciantini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inherent+toxicity+of+aggregates+implies+a+common+mechanism+for+protein+misfolding+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Inherent toxicity of aggregates implies a common mechanism for protein misfolding diseases.</a> Nature. 416, 507-511 (2002).</li>
<li>McParland, V. J., Kalverda, A. P., Homans, S. W., Radford, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+properties+of+an+amyloid+precursor+of+b2-microglobulin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural properties of an amyloid precursor of b2-microglobulin.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 9, 326-331 (2002).</li>
<li>Chiti, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designing+conditions+for+in+vitro+formation+of+amyloid+protofilaments+and+fibrils%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Designing conditions for in vitro formation of amyloid protofilaments and fibrils.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 3590-3594 (1999).</li>
<li>McParland, V. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partially+Unfolded+States+of+b2-Microglobulin+and+Amyloid+Formation+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Partially Unfolded States of b2-Microglobulin and Amyloid Formation in vitro.</a> Biochemistry. 39, 8735-8746 (2000).</li>
<li>Liu, K., Cho, H. S., Lashuel, H. A., Kelly, J. W., Wemmer, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+glimpse+of+a+possible+amyloidogenic+intermediate+of+transthyretin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">A glimpse of a possible amyloidogenic intermediate of transthyretin.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 7, 754-757 (2000).</li>
<li>Pfefferkorn, C. M., McGlinchey, R. P., Lee, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+pH+on+aggregation+kinetics+of+the+repeat+domain+of+a+functional+amyloid%5BTitle%5D)+AND+%22Pmel17.+Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Effects of pH on aggregation kinetics of the repeat domain of a functional amyloid.</a> Pmel17. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 21447-21452 (2010).</li>
<li>Di Domizio, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleic+acid-containing+amyloid+fibrils+potently+induce+type+I+interferon+and+stimulate+systemic+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Nucleic acid-containing amyloid fibrils potently induce type I interferon and stimulate systemic autoimmunity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 14550-14555 (2012).</li>
<li>Halle, A., Hornung, V., Petzold, G. C., Stewart, C. R., Monks, B. G., Reinheckel, T., Fitzgerald, K. A., Latz, E., Moore, K. J., Golenbock, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+NALP3+inflammasome+is+involved+in+the+innate+immune+response+to+amyloid-%CE%B2%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The NALP3 inflammasome is involved in the innate immune response to amyloid-β.</a> Nat. Immunol. 9, 857(2008).</li>
<li>Masters, S. L., O'Neill, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease-associated+amyloid+and+misfolded+protein+aggregates+activate+the+inflammasome%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Disease-associated amyloid and misfolded protein aggregates activate the inflammasome.</a> Trends Mol. Med. 17, 276-282 (2011).</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

Opisana tutaj metoda oferuje szybki i elastyczny sposób przygotowania włókienek amyloidowych in vitro z praktycznie dowolnego białka lub peptydu. Można niezawodnie przygotować kilka różnych rodzajów amyloidu - fibryle zawierające tylko białko lub agregaty hybrydowe zawierające DNA, RNA lub glikozaminoglikany. Stosowane procedury są proste, nieskomplikowane i nie wymagają zaawansowanego szkolenia technicznego. Amyloid przygotowany tą metodą jest dość stabilny i może być bezpiecznie przechowywany w temperaturze -8...

Białka są najliczniejszymi biologicznymi makrocząsteczkami obecnymi we wszystkich typach komórek. Występują w bardzo różnych rozmiarach, strukturach i modyfikacjach potranslacyjnych i spełniają ogromny zakres ważnych funkcji biologicznych, gdy są w swoich rodzimych formach. Ponad dwa tuziny nieprawidłowych polipeptydów jest zaangażowanych w liczne stany patologiczne człowieka, takie jak choroba Alzheimera, choroba Parkinsona i cukrzyca typu 21-4. Końcowe nieprawidłowo sfałdowane białka gromadzą się jako fibryle amyloidowe, nierozpuszczalne, stabilne agregaty, które występują zewnątrzkomórkowo lub wewnątrzkomórkowo.
Pomimo implikacji określonych białek w niektórych chorobach, coraz więcej dowodów potwierdza pogląd, że wszystkie polipeptydy mają wewnętrzne właściwości, które umożliwiają transformację amyloidu. Badanie sekwencji całego genomu zidentyfikowało "amylom", w którym fragmenty podatne na amyloid stanowią około 15% wszystkich kodujących segmentów peptydowych od E. coli do ludzi5. W związku z tym w ostatnich latach odkryto coraz większą liczbę funkcjonalnych amyloidów, które uczestniczą w różnych ważnych procesach komórkowych. Na przykład bakterie gromadzą amyloidy, tworząc biofilm i struktury zarodników, które mają kluczowe znaczenie dla ich przetrwania i patogenezy6-9. Hormony peptydowe tworzą złogi amyloidu podczas przechowywania w granulkach wydzielniczych ssaków przed uwolnieniem, co dodatkowo sugeruje, że forma białka amyloidu może pełnić korzystne funkcje biologiczne6,10,11. Co więcej, białka mogą również łączyć się w fibryle amyloidowe, aby przekazywać krytyczne sygnały komórkowe12,13.
Przez wiele lat, najczęściej badane amyloidy są przygotowywane z pojedynczych peptydów, które są związane z chorobami ludzkimi, takich jak beta amyloid czy peptyd prionowy. Peptydy te zwykle nie mają dobrze zdefiniowanej struktury i spontanicznie tworzą amyloid w roztworze w miarę upływu czasu, w procesie pośredniczonym przez częściowo nieprawidłowo sfałdowany produkt pośredni, który służy jako prekursor nierozpuszczalnego amyloidu. Prekursor amyloidu nazywany jest również rozpuszczalnym oligomerem białkowym, który jest rzadki i niestabilny, gdy jest generowany z naturalnych peptydów14,15. Jednak, jak opisano wcześniej, prawie każde białko w zasadzie może przyjąć konformację amyloidu w odpowiednich warunkach. Niedawno opracowaliśmy metodę otrzymywania stabilizowanych rozpuszczalnych oligomerów białek natywnych, które łatwo tworzą amyloid w obecności różnych kofaktorów16. Powstałe w ten sposób fibryle amyloidowe odzwierciedlają złożoną naturę końcowych agregatów nieprawidłowego fałdowania białek17,18. Tutaj używamy terminu amyloid tylko białkowy w odniesieniu do włókien białkowych bez kofaktorów i amyloidu hybrydowego dla włókien zawierających składniki niebiałkowe.
Poprzednio, różne metody generowania amyloidu in vitro poprzez stosowanie warunków znanych z nieprawidłowego fałdowania białek, takich jak wysoka temperatura, hydrofobowe środowisko i wahania pH19-23. Wiążą się one jednak z różnymi problemami, takimi jak niska wydajność, odwracalne składanie, duże różnice w partiach czy powolna kinetyka. Opisane tutaj podejście jest powtarzalne, łatwe do skalowania i pozwala precyzyjnie kontrolować czas i stan konwersji amyloidu.

<table><tbody><tr><td>Kwas 2-(N-morfolino)etanosulfonowy (MES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8250</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>BP358-10</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek 1-etylo-3-[3-dimetylo-aminopropylo]karbodimidu (EDC)</td><td>Thermo/Pierce</td><td>22980</td><td></td></tr><tr><td>DNA z plemników łososia</td><td>Sigma</td><td>D1626</td><td></td></tr><tr><td>RNA z drożdży torula</td><td>Sigma</td><td>R6625</td><td></td></tr><tr><td>Heparyna z błony śluzowej jelit świń</td><td>Sigma</td><td>H3149</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Fisher</td><td>BP152-1</td><td></td></tr><tr><td>Sprzęt:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Łaźnia wodna</td><td>Fisher Science</td><td>Isotemp 210</td><td></td></tr><tr><td>Kaseta do dializy Slide-A-Lyzer</td><td>Thermo/Pierce</td><td>66380</td><td></td></tr></tbody></table>

szybkie wytwarzanie amyloidu z białek natywnych in vitro

Rapid Generation of Amyloid from Native Proteins In vitro

Białka wykonują kluczowe zadania w organizmach, pełniąc funkcje wynikające z ich specyficznych trójwymiarowych fałd. Chociaż natywne struktury polipeptydów spełniają wiele celów, obecnie uznaje się, że większość białek może przyjąć alternatywny zestaw amyloidu bogatego w arkusze beta. Nierozpuszczalne fibryle amyloidowe są początkowo kojarzone z wieloma dolegliwościami u ludzi, ale coraz częściej są przedstawiane jako funkcjonalni gracze uczestniczący w różnych ważnych procesach komórkowych. Ponadto amyloid zdeponowany w tkankach pacjenta zawiera składniki niebiałkowe, takie jak kwasy nukleinowe i glikozaminoglikany (GAG). Kofaktory te mogą ułatwiać tworzenie się amyloidu, co skutkuje powstawaniem różnego rodzaju nierozpuszczalnych osadów. Wykorzystując naszą wiedzę na temat nieprawidłowego fałdowania białek na pośrednim etapie rozpuszczalnego prekursora amyloidu, opracowaliśmy metodę przekształcania natywnych białek w fibryle amyloidowe in vitro. Takie podejście pozwala na przygotowanie amyloidu w dużych ilościach, zbadanie właściwości amyloidu generowanego z określonych białek oraz ocenę zmian strukturalnych towarzyszących konwersji.

Zdolność do bezpośredniej konwersji białek natywnych w amyloid opiera się na zmianie konformacyjnej występującej w wysokiej temperaturze w buforze MES. Wytrącanie w roztworze jest dobrym wskaźnikiem agregacji białek i prawdopodobnego tworzenia się amyloidu. Z drugiej strony, aby umożliwić stabilizację rozpuszczalnych oligomerów białkowych, stosuje się EDC do sieciowania białek w celu utrwalenia konformacji oligomerycznej indukowanej w buforze MES. W rezultacie ustabilizowane oligomery białkowe są białkami multimerycznymi...

Białka mogą albo przyjąć natywną strukturę, albo nieprawidłowo sfałdować się w nierozpuszczalny amyloid. Warunki, które sprzyjają szlakowi nieprawidłowego fałdowania, prowadzą do powstawania różnych typów włókienek amyloidowych. Opisane tu metody pozwalają na szybką konwersję natywnych białek do amyloidu in vitro.

Szybkie wytwarzanie amyloidu z białek natywnych in vitro

Proteins carry out crucial tasks in organisms by exerting functions elicited from their specific three dimensional folds. Although the native structures ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest szybkie uzyskanie amyloidu fis z dowolnego białka in vitro. Osiąga się to poprzez rozpuszczenie wybranego białka w buforze MES w celu wywołania nieprawidłowego fałdowania struktury. Białko można następnie inkubować w wysokiej temperaturze, co sprzyja tworzeniu się amyloidu przy braku innych kofaktorów.Alternatywnie, białko jest sieciowane przez EDC w celu wytworzenia stabilizowanych rozpuszczalnych więzadeł białkowych, prekursora amyloidu. Wreszcie, niebiałkowe kofaktory są mieszane ze stabilizowanymi rozpuszczalnymi oligomerami białkowymi, aby umożliwić tworzenie hybrydowych wyników amyloidu, które pokazują, że natywne białka mogą być łatwo przekształcane w potwierdzenie amyloidu, gdy jest to ułatwione przez sprzyjające warunki. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące chorób związanych z nieprawidłowym fałdowaniem białek, takie jak to, jak precyzyjnie amyloid tworzy się z rozpuszczalnych oligomerów białkowych oraz czy różne typy amyloidu mają różne funkcje biologiczne i patologiczne.Na początek przygotuj bufor MES zgodnie z opisem w protokole tekstowym zarówno dla amyloidu zawierającego tylko białko, jak i stabiliz

rapid-generation-of-amyloid-from-native-proteins-in-vitro

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Szybkie generowanie amyloidu z białek naturalnych in vitro

SDD-AGE jest użyteczną techniką wykrywania i charakteryzacji polimerów amyloidopodobnych w komórkach. Przedstawiamy tutaj adaptację, która sprawia, że technika ta nadaje się do zastosowań na szeroką skalę.

Przesiewowe badanie agregacji amyloidu metodą półdenaturującej elektroforezy w żelu agarozowym z detergentem

Źródło: Balczon, R., et al. Metody wykrywania cytotoksycznych amyloidów po zakażeniu komórek śródbłonka płuc przez Pseudomonas aeruginosa. J. Vis. Exp. (2018)Ten film przedstawia procedurę wytwarzania cytotoksycznego supernatantu z komórek śródbłonka płuc po zakażeniu Pseudomonas aeruginosa. Opisuje, w jaki sposób bakteryjne białka efektorowe zaburzają strukturę komórek gospodarza i indukują uwalnianie cytotoksycznych oligomerów amyloidowych do supernatantu.

Otrzymywanie cytotoksycznych amyloidów po zakażeniu bakteryjnym komórek śródbłonka płuc szczura

Opisujemy metody badania aspektów amylopatii u robaka C. elegans. Pokazujemy, jak konstruować robaki wyrażające ludzkie Aβ42 w neuronach i jak testować ich funkcję w testach behawioralnych. Dalej pokazujemy, jak uzyskać pierwotne hodowle neuronów, które można wykorzystać do badań farmakologicznych.

System modelowy Caenorhabditis elegans do badania amylopatii

Opisana jest dwuetapowa metoda chromatograficzna oczyszczania rekombinowanego białka Shadoo wyrażonego jako ciała inkluzyjne w Escherichia coli, a także protokół migotania oczyszczonego Shadoo do struktur amyloidowych.

Oczyszczanie i ponowne fałdowanie do włókienek amyloidowych rekombinowanego białka Shadoo znakowanego znakowanym 6 ekspresji jako ciała inkluzyjne w E. coli

Łatwy w użyciu, bezkomórkowy protokół ekspresji do specyficznego dla reszty włączania niekanonicznych analogów aminokwasów do białek, w tym dalszej analizy, jest prezentowany do badań medycznych, farmaceutycznych, strukturalnych i funkcjonalnych.

Specyficzne dla reszt włączenie aminokwasów niekanonicznych do białek modelowych przy użyciu bezkomórkowego systemu transkrypcyjno-translacyjnego Escherichia coli

Istnieje zapotrzebowanie, aby testy przedkliniczne nowej klasy leków "sierocych" zwanych farmakologicznymi białkami opiekuńczymi były powtarzalne, szybkie i skuteczne. Opracowaliśmy prosty, wysoce ustandaryzowany i wszechstronny test oparty na hodowli komórkowych do badań przesiewowych dla kwalifikujących się pacjentów, a także nowatorskie farmakologiczne leki opiekuńcze.

In vitro Pomiar enzymów w celu zbadania farmakologicznej reakcji białka opiekuńczego w chorobie Fabry'ego i Pompego

Opisano proste metody demonstrowania produkcji cytotoksycznych amyloidów po zakażeniu śródbłonka płuc przez Pseudomonas aeruginosa.

Metody wykrywania cytotoksycznych amyloidów po zakażeniu komórek śródbłonka płuc przez Pseudomonas aeruginosa

Tutaj prezentujemy protokół do analizy wzrostu Aspergillus flavus i produkcji aflatoksyn w ziarnach kukurydzy wyrażających białko przeciwgrzybicze. Używając szczepu A. flavus wykazującego ekspresję GFP, monitorowaliśmy infekcję i rozprzestrzenianie się grzyba w dojrzałych ziarnikach w czasie rzeczywistym. Test jest szybki, wiarygodny i powtarzalny.

Hamowanie wzrostu Aspergillus flavus i produkcji aflatoksyn w transgenicznej kukurydzy z ekspresją inhibitora α-amylazy z Lablab purpureus L.

Dostępny jest tutaj protokół do badania interakcji między natywnymi formami, prefibrylarnymi i dojrzałymi fibrylami amyloidowymi różnych peptydów i białek z mitochondriami izolowanymi z różnych tkanek i różnych obszarów mózgu.

Interakcje i przenikanie błony mitochondriów mózgowych przez fibryle amyloidowe

Tutaj opisujemy układ drożdżowy rekonstytuujący ludzką γ-sekretazę. System ten umożliwia identyfikację i badanie mutacji wpływających na aktywność oraz badanie inhibitorów γ-sekretazy (GSI). Wykorzystując właściwości utraty funkcji u rodzinnych mutantów choroby Alzheimera, możliwe jest badanie przesiewowe pod kątem modulatorów γ-sekretazy (GSM).

Saccharomyces cerevisiae Modele choroby Alzheimera do badania genów, mutacji i substancji chemicznych wpływających na produkcję amyloidu beta przez γ-sekretazę

Poznaj szybką metodę wytwarzania amyloidów z białek natywnych in vitro przy użyciu buforu MES i wysokiej temperatury. Technika ta umożliwia badanie mechanizmów nieprawidłowego zwijania białek i ich roli w chorobach.

Szybkie wytwarzanie amyloidu z białek natywnych in vitro

Przeglądaj więcej filmów