Metody modulacji i analizy neurogenezy dorosłych zależnej od NF-κB

Ogólnym celem tej procedury jest zbadanie funkcji czynnika transkrypcyjnego NF kappa B w dorosłym mózgu. Osiąga się to poprzez pierwszą hodowlę myszy transgenicznych, które specyficznie hamują aktywność NF kappa B w neuronach. Drugim krokiem procedury jest przetestowanie behawioralnych konsekwencji inhibicji NF kappa B za pomocą wzorca przestrzennego, separacji lub stodół, labiryntu.

Trzecim krokiem jest staranne rozmnażanie zwierząt, usunięcie mózgów i właściwe ich podzielenie na sekcje. Ostatnim krokiem jest analiza efektów histologicznych i strukturalnych, takich jak wizualizacja projekcji włókien mcha za pomocą barwienia immunologicznego. Ostatecznie, zastosowanie testu behawioralnego, a następnie histologii, może skorelować zmiany w uczeniu się zależnym od zakrętu zębatego ze zmianami strukturalnymi w powiązanych tkankach.

Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak Mars Vase, jest to, że przestrzenne wiązania separacji wzorców MA oferują możliwość specyficznego pomiaru procesów uczenia się zależnych od dziecka, a także neurodegeneracji i regeneracji w tym obszarze mózgu. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie neurogenezy dorosłych, takie jak uczenie się jako specjalna separacja wzorców. Demonstracją labiryntu zajmie się Angela Kula, technik z mojego laboratorium.

Perfuzja zostanie zaprezentowana przez Petera Hymana, pracownika naukowego. Następnie sekcje mózgów zostaną pokazane przez technika Ulricha KA. I na koniec, konfokalna mikroskopia skaningowa zostanie zaprezentowana przez Jeanine Muah, doktorantkę mojego laboratorium Przeprowadzanie przestrzennej separacji wzorów.

Barnes Maze Testy behawioralne zgodnie z międzynarodowymi i lokalnymi wytycznymi. Do tego testu ważne jest, aby używać tylko samców myszy w wieku co najmniej sześciu miesięcy. W każdej serii badań zwierzęta muszą osiągnąć wiek poniżej czterech dni, a ten sam podmiot powinien przeprowadzić wszystkie testy przed badaniem.

Myszy powinny być karmione standardową dietą, aby były zmotywowane słodkim jedzeniem. Aby najpierw skonfigurować test, zaopatrz się w białą płytkę o średnicy 120 centymetrów wykonaną z twardego plastiku. Dodatkowe wskazówki labiryntu mogą być wykonane z różnych materiałów i mogą mieć różne kształty.

Co ważne, muszą one charakteryzować się wysokim kontrastem, aby były wyraźnie rozpoznawalne przez biegnące koła zwierzęcia. Drabiny i tunele są dobrymi wskazówkami. Umieść płytkę pod kilkoma neonowymi lampami fluorescencyjnymi, które są umiarkowanie intensywne, aby myszy były zmotywowane do wyjścia ze światła.

W pomieszczeniu musi być kontrolowana wilgotność i mieć stałą temperaturę 22 stopni Celsjusza. Teraz skonfiguruj system śledzenia wideo. Ustaw kamerę 115 centymetrów nad środkiem płyty.

Następnie przymocuj wielokolorowe dodatkowe wskazówki labiryntu do białej szmatki, która pasuje do talerza. Umieść je w pobliżu środka tkaniny, aby były dobrze widoczne dla zwierząt. Teraz ostrożnie wyczyść płytkę szybkim środkiem dezynfekującym, który może usunąć wszelkie zapachy z konfiguracji eksperymentalnej.

Ustaw siedem identycznych żółtych domków z jedzeniem na białym talerzu. Ich pozycje powinny być jednoznacznie zaznaczone na dzień przed rozpoczęciem testów, przyzwyczaić każdą mysz do dysku. Umieść słodkie nagrody w postaci granulek jedzenia, takich jak ćwiartka pętli owocowej, w każdym z siedmiu domów z jedzeniem, aby przeprowadzić próbę zamieszkania.

Umieść każdą mysz w punkcie początkowym talerza i pozwól jej na eksplorację przez 10 minut. Nagraj tę eksplorację między myszami. Wyczyść okrągłą płytę i pojemniki na żywność szybkim środkiem dezynfekującym.

Uzupełnij także nagrody w postaci jedzenia. W ciągu następnych siedmiu kolejnych dni uruchom próby testowe dla testów. Wszystkie domy, z wyjątkiem jednego, są zamykane przezroczystą taśmą na czas całego eksperymentu.

To zawsze ten sam dom. Każdy dom jest nadal załadowany nagrodą, a test jest przeprowadzany jak próba przyzwyczajenia. Przeprowadzaj testy o tej samej porze dnia dla każdego zwierzęcia, aby uniknąć zmian w rytmie okołodobowym.

Później przeanalizuj opóźnienia, pokonany dystans i błędy, korzystając z odpowiednich statystyk. Oprogramowanie definiuje błędy jako zbliżenie się do niewłaściwego punktu gastronomicznego lub nawiązanie kontaktu z właściwym pojemnikiem, ale nie wejście i nie odzyskanie nagrody. Aby porównać grupy, należy użyć dwukierunkowej ANOVA z testem bon fer post hoc.

Po znieczuleniu zwierzęcia wstrzyknięciem międzyotrzewnowym wertyny, należy go ostrożnie wykonać trans serdecznie za pomocą PBS zawierającego heparynę i propan. Zrób otwór w lewej komorze za pomocą igły o rozmiarze 26. Wykonaj również nacięcie w prawym przedsionku, aby umożliwić wypłynięcie krwi i perfuzji ósemki.

Włóż igłę perfuzyjną do lewej komory przy otworze pod kątem prostym i na głębokość od jednego do dwóch milimetrów. Użyj ciśnienia hydrostatycznego od 1,2 do 1,4 metra i przepuszczaj mysz przez dwie do czterech minut. Postępuj zgodnie z heparyną i propanem z 4% paraldehydem w PBS przez 10 do 15 minut.

Perfuzja powinna wynosić 15 mililitrów na minutę. Teraz przeanalizuj mózg. Powinien być bladobiały bez widocznych czerwonych naczyń krwionośnych.

Utrwal wszystkie zebrane mózgi w 4% para formaldehydzie w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 24 godziny. Następnego dnia. Kriokryoproteza chroni mózgi w 30% sacharozie w PBS, przechowuje je w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez co najmniej 24 godziny później.

Mózgi są zamrażane na stoliku kriotonowym i krojone na poziome sekcje o grubości 40 mikronów. Po wybarwieniu skrawków przeciwciałem dla włókna nerwowego M, projekcje włókien omszałych można uwidocznić za pomocą konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego o długości fali odpowiedniej dla przeciwciała fluorescencyjnego. Rozpocznij skanowanie w małym powiększeniu i zorientuj się w hipokampie i projekcjach włókien omszałych.

Następnie, przy większym powiększeniu, zbierz skany włókien omszałych przez cesarskie cięcie w wysokiej rozdzielczości do analizy w celu zbadania ekspresji transgenu I kappa B alfa AA one. U podwójnie transgenicznych myszy wyizolowano, poddano kriogenicznemu cięciu i barwieniu przy użyciu przeciwciała przeciwko konfokalnemu skanowaniu laserowemu GFP. Mikroskopia wykazała wysoką ekspresję transgenu w regionie CA jeden, regionie CA trzy oraz w DG w celu określenia najwcześniejszego typu komórki wyrażającej CAMK dwa napędzane alfa I kappa B alfa AA jeden w regionie neurogennym hipokampa.

Sekcje kriogeniczne hipopotama Campi z I Kappa BTTA. Zwierzęta barwiono pod kątem podwójnej courtyny, a analiza konfokalna transgenu ujawniła sygnały GFP w młodych komórkach ziarnistych DCX dodatnich oznaczonych strzałkami wskazującymi na indukcję ekspresji transgenu przez aktywność CAMK dwóch alfa. Odcinki koronalne hipokampa myszy i kappa BTTA i i Kappa B minus zostały wybarwione pod kątem neurofilamentu M, aby uwidocznić projekcje włókien omszałych i ujawnić złożoną i pęcherzykową organizację u myszy I kappa BTTA.

Występy włókien omszałych były poważnie osłabione. Ponadto inhibicja NF kappa B doprowadziła do znacznego zmniejszenia grubości blaszki peralnej i mniejszej objętości DG w celu zbadania potencjalnych przyczyn dramatycznej wady strukturalnej. Świeże, nieutrwalone plastry hipokampa z grupy kontrolnej i myszy I kappa BTTA wybarwiono jadeitem fluorowym C, co pozwala na specyficzne wykrycie śmierci komórek neuronalnych.

Dramatycznie zwiększoną liczbę degenerujących się neurytów zaobserwowano u podwójnie transgenicznych zwierząt w porównaniu z pojedynczymi transgenicznymi kontrolami. Co więcej, u myszy I kappa BTTA wykryto znaczny wzrost rozszczepionych trzech dodatnich komórek Capace. W przeciwieństwie do tego, barwienie immunohistochemiczne przeciwko DCX ujawniło znacznie zwiększoną ilość komórek DCX dodatnich w mózgach myszy I kappa BT.

Co więcej, komórki d CX dodatnie w hipopotamie I kappa B TTA Campi nie były ułożone wyłącznie w strefie subziarnistej, ale znaleziono je również w głębszych regionach dg. Natomiast przodkowie D CX dodatni u zwierząt kontrolnych byli zlokalizowani prawie wyłącznie w strefie subziarnistej. Badanie zwiększonej ilości komórek wykazujących ekspresję DCX było wynikiem dojrzewania wcześniejszych komórek progenitorowych lub bezpośrednio w wyniku proliferacji komórek DCX dodatnich.

BRDU wstrzyknięto dootrzewnowo myszom i kappa BTTA i kontrolnym, które następnie poddano kriogenicznemu cięciu i barwieniu DCX i BRDU w celu analizy proliferacji. BRDU wstrzyknięto raz, a następnie przeprowadzono analizę po 24 godzinach. W celu analizy różnicowania wykonywano trzy wstrzyknięcia dziennie, a następnie analizę po siedmiu dniach po pojedynczym wstrzyknięciu BRDU.

Nie zaobserwowano istotnych różnic w całkowitej liczbie komórek BRDU dodatnich między zwierzętami ujemnymi I kappa BTTA a zwierzętami kontrolnymi. W przeciwieństwie do tego, podejście oparte na trzech seryjnych wstrzyknięciach ujawniło wyraźnie zwiększoną ilość komórek dodatnich B-R-D-U-D-C-X w DG I capa, BTTA. Myszy zaburzone różnicowanie lub integracja komórek wykazujących ekspresję DCX mogły mieć zwiększoną liczbę komórek, a komórki typu trzeciego mogły być zaangażowane w specyficzne testowanie zachowania podwójnie transgenicznych myszy.

W zadaniu zależnym od DG zatrudniono S-P-S-B-M. Zwierzęta kontrolne I kappa B eksplorowały pomieszczenia z żywnością seryjnie pierwszego dnia eksperymentu. Po siedmiu dniach treningu zwierzęta były w stanie bezpośrednio znaleźć otwarty dom z jedzeniem.

W przeciwieństwie do tego, zwierzęta IA BTTA kontynuują seryjną eksplorację gospodarstw spożywczych nawet po treningu. Zaobserwowanie znacznego wzrostu pokonywanych odległości oraz wyższych opóźnień i wskaźników błędów u zwierząt I kappa BTTA w porównaniu ze zwierzętami kontrolnymi i Kappa B sugeruje, że zwierzęta te miały poważne wady w uczeniu się. Po ustaleniu tę technikę można wykonać w ciągu 30 minut na zwierzę, jeśli jest wykonywana prawidłowo po jego rozwoju.

Technika ta może utorować drogę innym neurobiologom zainteresowanym zadaniami zależnymi od żyroskopów daid, takimi jak neurogeneza, degeneracja lub regeneracja u dorosłych.