Name: Metody modulacji i analizy neurogenezy dorosłych zależnej od NF-κB (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-13T23:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 58 s
Description: Poznaj metody modulacji neurogenezy dorosłych zależnej od NF-κB w hipokampie myszy. Protokół obejmuje test behawioralny Barnes maze oraz analizę histologiczną projekcji włókien mchowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy Angeli Kralemann-Köhler za doskonałe wsparcie techniczne. Opisane w niniejszym dokumencie prace eksperymentalne zostały przeprowadzone w naszym laboratorium i były wspierane przez granty Niemieckiej Rady ds. Badań Naukowych (DFG) dla CK i BK oraz grant niemieckiego Ministerstwa Badań i Edukacji (BMBF) dla BK.

Oświadczenie etyczne
To badanie zostało przeprowadzone w ścisłej zgodności z przepisami rządowego komitetu ds. zwierząt i opieki, LANUV kraju związkowego Nadrenia Północna-Westfalia, (Düsseldorf, Niemcy). Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez LANUV, Düsseldorf na podstawie licencji o numerze 8.87–51.04.20.09.317 (LANUV, NRW). Dołożono wszelkich starań, aby zminimalizować stres i liczbę zwierząt potrzebnych do badania.
1. Opieka nad zwierzętami i ich trzymanie
<ol>
	<li>Wszystkie zwierzęta wykorzystywane w protokołach opisanych w niniejszym dokumencie powinny być trzymane w określonych warunkach wolnych od czynników chorobotwórczych, określonych przez Federację Europejskiego Stowarzyszenia Nauk o Zwierzętach Laboratoryjnych (FELASA).</li>
	<li>Myszy powinny być trzymane w standardowych klatkach w pomieszczeniu o kontrolowanej temperaturze i wilgotności (22 °C) w warunkach dobowych (12-godzinny cykl światła/ciemności) z powietrzem filtrowanym HEPA.</li>
	<li>Standaryzowane pożywienie i woda powinny być dostarczane ad libitum.</li>
	<li>Jeżeli wykorzystuje się myszy kontrolne IκB/tTA i IκB /-, genotypowanie oparte na PCR należy przeprowadzić dla każdego zwierzęcia, jak opisano wpkt 7,18.</li>
	<li>Samce, u których różnica wieku jest mniejsza niż cztery dni, powinny być wykorzystywane w celu zmniejszenia zmienności osobniczej.</li>
	<li>(OPCJONALNIE): W przypadku eksperymentów reaktywacji NF-κB doksycyklinę należy podawać w wodzie pitnej (2 mg/ml z 2,5% sacharozy) przez co najmniej 14 dni.</li>
</ol>
2. Separacja wzorców przestrzennych-labirynt Barnesa (SPS-BM)
<ol>
	<li>Wszystkie testy behawioralne powinny być przeprowadzane zgodnie z międzynarodowymi i lokalnymi wytycznymi.</li>
	<li>ważny! Używaj tylko samców myszy w wieku sześciu miesięcy lub starszych. Różnica wieku między zwierzętami w jednej serii badań powinna być mniejsza niż cztery dni. Badanie musi być przeprowadzone przez ten sam operator dla każdej serii. Myszy powinny otrzymać standardową dietę przed testem, aby jeszcze bardziej zwiększyć motywację, częściowo napędzaną przez nagrodę w postaci słodkiego jedzenia.</li>
	<li>Ustaw białą okrągłą płytę wykonaną z twardego tworzywa sztucznego (średnica 120 cm, patrz rysunek 5A) w pomieszczeniu o kontrolowanej wilgotności i temperaturze (22 °C), oświetlonym świetlówkami neonowymi o mocy co najmniej 4 x 80 W i 3 x 215 W. WAŻNY! Upewnij się, że używane jest odpowiednie oświetlenie, ponieważ motywacja myszy do wchodzenia do pomieszczeń z jedzeniem jest częściowo napędzana przez ich niechęć do jasnych, odsłoniętych miejsc.</li>
	<li>Skonfiguruj system śledzenia wideo. Kamera powinna być umieszczona 115 cm powyżej środka płyty (patrz Rysunek 5A).</li>
	<li>Przymocuj wielokolorowe wskazówki do labiryntu (EMC) do białej tkaniny w miejscach łatwo widocznych dla zwierząt, około 100 cm od krawędzi tabliczki (patrz Rysunek 5A).</li>
	<li>Ostrożnie wyczyść płytkę szybkim środkiem dezynfekującym, który może usunąć wszelkie zapachy z zestawu eksperymentalnego.</li>
	<li>Umieść siedem identycznych żółtych domków na żywność (12 cm x 7 cm x 8 cm, patrz Rysunek 5A) na białym talerzu. Pozycje powinny być jednoznacznie oznaczone (patrz rysunek 5A).</li>
	<li>Umieść nagrody w postaci słodkich granulek żywności (jedna czwarta pętli Kellogs's Froot Loop/domku z jedzeniem) we wszystkich pomieszczeniach z żywnością w określonych miejscach (patrz Rysunek 5A), przy czym tylko jeden zdefiniowany pojemnik na żywność jest swobodnie dostępny dla zwierzęcia (lokalizacja F, patrz Rysunek 5A). Zamknij niedocelowe pojemniki z żywnością przezroczystą folią.</li>
	<li>Przed badaniem należy przeprowadzić habituację (dzień przed rozpoczęciem zadania). Zadbaj o to, aby wszystkie domki z jedzeniem były swobodnie dostępne i pozwalały myszom na swobodne eksplorowanie labiryntu i zdobywanie nagrody w postaci granulek jedzenia (10 minut na zwierzę).</li>
	<li>Włącz komputer i kamerę, a następnie uruchom oprogramowanie systemu śledzenia wideo.</li>
	<li>Rozpocznij nagrywanie.</li>
	<li>Umieść zwierzę w określonym punkcie początkowym na okrągłej płytce (Rysunek 5A, S: pozycja początkowa) i pozwól myszom szukać docelowego domu z jedzeniem przez 10 minut.</li>
	<li>Zatrzymaj śledzenie wideo.</li>
	<li>ważny! Wyczyść okrągłą płytę i pojemniki na żywność po każdej próbie szybkim środkiem dezynfekującym.</li>
	<li>Powtarzaj test codziennie przez siedem kolejnych dni (dla każdego zwierzęcia).</li>
	<li>Analizuj wyniki (opóźnienia, pokonany dystans i błędy) za pomocą odpowiedniego oprogramowania statystycznego. Zdefiniuj błędy jako zbliżanie się do niewłaściwego pojemnika z żywnością i / lub kontakt z właściwym pudełkiem bez wejścia i odzyskania nagrody w postaci granulek żywności. Do analizy grupowej należy użyć dwukierunkowej ANOVA z testem post-hoc Bonferroniego.</li>
	<li>(OPCJONALNIE) Poświęć myszy i przeanalizuj hipokampy, jak opisano poniżej.</li>
</ol>
3. Etykietowanie BrdU
<ol>
	<li>Wstrzykiwać dootrzewnowo 50 mg/kg i.p. BrdU raz na dobę przez 3 dni (analiza różnicowania i integracji) lub 200 mg/kg i.p. w pojedynczym wstrzyknięciu (analiza proliferacji).</li>
	<li>Złóż zwierzęta w ofierze, rozkrój hipokampa i przygotuj skrawki 40 μm, jak opisano poniżej.</li>
	<li>Denaturować skrawki 2 M HCl przez 10 minut i inkubować w 0,1 M buforze boranowym przez 10 minut.</li>
	<li>Oznaczyć jedną na dwanaście serii odcinków 40 μm (w odległości 240 μm od siebie) od każdego zwierzęcia immunohistochemicznie, jak opisano poniżej, używając przeciwciał skierowanych przeciwko BrdU.</li>
	<li>Określ ilościowo znakowane komórki za pomocą analizy mikroskopii konfokalnej w całym zasięgu rostrocaudalnym warstwy komórek ziarnistych i strefy subziarnistej. Pomnóż otrzymane liczby przez 12, aby uzyskać szacunkową całkowitą liczbę komórek znakowanych BrdU na hipokamp i podziel przez dwa, aby uzyskać całkowitą liczbę znakowanych komórek na DG.</li>
</ol>
4. Usuwanie mózgów i przygotowanie kriosekcji od zwierząt bez perfuzji
<ol>
	<li>Przestrzegaj lokalnie zatwierdzonych procedur eutanazji zwierząt. Myszy mogą zostać bezpośrednio poddane eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy.</li>
	<li>(OPCJONALNIE) Zwierzęta mogą być znieczulone przed eutanazją zgodnie z lokalnymi i międzynarodowymi wytycznymi, np. poprzez dootrzewnowe wstrzyknięcie 0,8 ml Avertin dla myszy o wadze 33 g (świeżo przygotowanej przez zmieszanie 150 ml roztworu podstawowego sporządzonego z 2,2 mg 2,2,2-tribromoetanolu w 1 ml etanolu izoamylowego z 1,85 ml soli fizjologicznej lub buforu fizjologicznego).</li>
	<li>Wysterylizuj głowę gazą nasączoną betadiną (10% jodowidonu), a następnie przetrzyj gazą nasączoną 70% etanolem.</li>
	<li>Odetnij głowę zwierzęcia za pomocą odpowiednich nożyczek chirurgicznych i odciągnij skórę na bok.</li>
	<li>(OPCJONALNIE) Można zastosować utrwalacze, aby uniknąć fałdowania się opóźnionej skóry.</li>
	<li>Wykonaj nacięcie w linii środkowej czaszki i ostrożnie odciągnij fragmenty czaszki na bok.</li>
	<li>Ostrożnie usuń cały mózg za pomocą odpowiedniego narzędzia chirurgicznego (np. łyżki Moria).</li>
	<li>Schłodzić 25 ml 2-metylobutanu w zlewce o pojemności 50 ml (np. Schott Duran) do temperatury -30–-40 °C na suchym lodzie. 
	Uwaga: W przypadku swobodnego barwienia "grubych" skrawków, które idealnie nadają się do konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej, należy usunąć mózg, przemyć 3 razy w buforze i przechowywać w temperaturze 4 °C w buforowanym fosforanem 30% roztworze sacharozy w probówce o pojemności 50 ml, aż mózg opadnie na dno (zwykle na noc).</li>
	<li>Ostrożnie umieścić mózg na kawałku Nescofilmu (Parafilm) i przykryć dużą ilością związku TissueTek OCT, zamrozić na Nescofilm w 2-metylobutanie, przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu użycia. 
	Uwaga: W przypadku długotrwałego przechowywania w temperaturze -20 °C przechowywać w 9% sacharozy, 7 mM MgCl2, 50 mM buforze fosforanowym, 44% glicerolu.</li>
	<li>Pokrój mózg na skrawki o grubości 10-12 μm na odpowiednim kriomikrotomie. 
	Uwaga: W przypadku grubych, swobodnie unoszących się odcinków, należy zamrozić mózg na etapie kriotomu odpowiedniego kriotomii (np. Reichert Jung, Frigomobil) i ciąć odcinki poziome o grubości 40 μm w temperaturze od -20° do -25 °C. Zebrać skrawki z noża za pomocą drobnej szczotki i zebrać w buforze lub przechowywać w roztworze do przechowywania (krok 4.9) w temperaturze -20 °C do długotrwałego przechowywania.</li>
	<li>Ostrożnie zamontuj dwie plastry na pojedynczych szkiełkach mikroskopowych. Zdecydowanie zaleca się stosowanie prowadnic Superfrost UltraPlus, aby zmaksymalizować przyczepność sekcji.</li>
	<li>Suszyć szkiełka przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Szkiełka można przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu użycia.</li>
</ol>
5. Przygotowanie sekcji z perfekcji zwierząt
<ol>
	<li>Znieczulić zwierzęta zgodnie z powyższym opisem (krok 4.2).</li>
	<li>Ostrożnie perfuzję przezsercową zwierzęcia z solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) zawierającą heparynę (0,025 g/100 ml PBS) i prokainę (0,5 g/100 ml PBS) przez 2-4 minuty, a następnie 4% paraformaldehydu w PBS przez 10-15 min. Perfuzja jest optymalnie przeprowadzana przez perfuzję przez lewą komorę i otwarcie prawego przedsionka przy użyciu ciśnienia hydrostatycznego około 1,2-1,4 m lub przy użyciu pompy perystaltycznej ustawionej na około 15 ml/min. Optymalna perfuzja Powoduje blady biały mózg bez widocznych czerwonych naczyń krwionośnych.</li>
	<li>Wypreparować i utrwalić mózgi w 4% paraformaldehydzie w temperaturze 4 °C przez 24 godziny.</li>
	<li>Krioprotekcja mózgu w 30% sacharozie w PBS w temperaturze 4 °C przez co najmniej 24 godziny.</li>
	<li>Zamroź mózgi na etapie kriotomii.</li>
	<li>Przygotuj poziome odcinki o grubości 40 μm z całego przodomózgowia za pomocą odpowiedniego kriotomii.</li>
	<li>Szkiełka można przechowywać w roztworze krioprotektantu (0,1 M bufor fosforanowy, 50% glicerol, 0,14% MgCl2, 8,6% sacharozy) w temperaturze -20 °C do czasu użycia.</li>
</ol>
6. Immunohistochemia wycinków mózgu zwierząt bez perfuzji
<ol>
	<li>Po utrwaleniu kriosekcji, przygotowanych w sposób opisany powyżej, przy użyciu metanolu w temperaturze -20 °C przez 10 minut.</li>
	<li>Blok z 5% normalną surowicą zawierającą 0,3% Triton-X (z gatunku, który był używany do wytworzenia przeciwciała drugorzędowego) przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przepłukać 3x 1x PBS i inkubować z przeciwciałami pierwszorzędowymi przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przepłukać 3x 1x PBS i inkubować z przeciwciałami drugorzędowymi w temperaturze pokojowej przez godzinę.</li>
	<li>Płukać 3x za pomocą 1x PBS</li>
	<li>Przeciwbarwić skrawek DNA za pomocą SYTOX green lub DAPI (lub alternatywnego barwnika DNA).</li>
	<li>Płukać 3x za pomocą 1x PBS</li>
	<li>Osadź skrawki w wodnym podłożu do zatapiania.</li>
	<li>Pozwól pożywce do zatapiania polimeryzować przez co najmniej 48 godzin.</li>
</ol>
7. Immunohistochemia wycinków mózgu zwierząt z perfuzją
<ol>
	<li>Blokować zgodnie z opisem w kroku 6.2, a następnie inkubować nieruchome skrawki mózgu w roztworze przeciwciała pierwszorzędowego rozcieńczonym w PBS zawierającym 0,3% Triton-X (swobodnie pływający) przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przepłukać trzykrotnie 1x PBS i inkubować w drugorzędowym roztworze przeciwciał rozcieńczonym w PBS zawierającym 0,3% Triton-X (swobodnie pływający) w temperaturze pokojowej przez 3 godziny.</li>
	<li>Płukać 3x za pomocą 1x PBS</li>
	<li>Przeciwbarwić skrawek DNA za pomocą SYTOX green lub DAPI (lub alternatywnego barwnika DNA).</li>
	<li>Spłucz trzykrotnie 1x PBS</li>
	<li>Osadź skrawki w wodnym podłożu do zatapiania.</li>
	<li>Pozwól pożywce do zatapiania polimeryzować przez co najmniej 48 godzin.</li>
</ol>
8. Badanie projekcji włókien mszystych
<ol>
	<li>Złożyć zwierzęta w ofierze, przygotować skrawki koronalne 40 μm, jak opisano powyżej, i wybarwić przekrój hipokampa za pomocą przeciwciała dla neurofilamentu M.</li>
	<li>Zeskanuj skrawki przy odpowiedniej długości fali za pomocą konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego, aby uwidocznić omszałe włókna i jądra. Rozpocznij skanowanie przy małym powiększeniu.</li>
	<li>Użyj obrazów o małym powiększeniu do orientacji i celuj w hipokamp za pomocą projekcji z omszałych włókien.</li>
	<li>Skanuj przekroje (przekrój z) w wysokiej rozdzielczości i dużym powiększeniu.</li>
	<li>Przeanalizuj morfologiczny wygląd i łączność włókien omszałych uwidocznionych za pomocą barwienia dla NF-M.</li>
	<li>(OPCJONALNIE) Przeanalizuj rozmiar i objętość łopatek hipokampa. Do pomiarów należy użyć sygnału DNA.</li>
</ol>
9. Test fluoro-jadeitowy C (śmierć komórek neuronalnych)
<ol>
	<li>Złóż zwierzęta w ofierze, rozprowadź sekcję hipokampa i przygotuj skrawki 12 μm, jak opisano powyżej.</li>
	<li>Pozostaw sekcje do wyschnięcia na 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Utrwalić sekcje w 4% PFA na 40 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Krótko umyć sekcje 3x za pomocą ddH2O.</li>
	<li>Inkubować skrawki z 0,06 % nadmanganianem potasu (KMnO4) przez 10 minut pod ciągłym, delikatnym wstrząsaniem.</li>
	<li>Umyć sekcje 3x za pomocą ddH2O.</li>
	<li>Inkubować sekcje z 0,002% roztworem fluoro-jadeitu C przez 20 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>(OPCJONALNIE) W przypadku jednoczesnego barwienia jądrowego, 0,002% roztwór fluoro-jadeitu C można uzupełnić 10 μg/ml DAPI.</li>
	<li>Krótko umyć sekcje 3x za pomocą ddH2O.</li>
	<li>Pozostaw sekcje do wyschnięcia na 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Inkubacja skrawków z ksylenem (1 min)</li>
	<li>Zamontuj sekcje za pomocą medium montażowego na bazie ksylenu (DPX).</li>
</ol>

<ol><li>Gutierrez, H., Davies, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+neural+process+growth%2C+elaboration+and+structural+plasticity+by+NF-kappaB%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Regulation of neural process growth, elaboration and structural plasticity by NF-kappaB.</a> Trends Neurosci. 34, 316-325 (2011).</li>
<li>Imielski, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regrowing+the+adult+brain%3A+NF-kappaB+controls+functional+circuit+formation+and+tissue+homeostasis+in+the+dentate+gyrus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Regrowing the adult brain: NF-kappaB controls functional circuit formation and tissue homeostasis in the dentate gyrus.</a> PLoS One. 7, (2012).</li>
<li>Zheng, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrahippocampal+injection+of+A+beta%281-42%29+inhibits+neurogenesis+and+down-regulates+IFN-gamma+and+NF-kappaB+expression+in+hippocampus+of+adult+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Amyloid%22%5BJournal%5D)">Intrahippocampal injection of A beta(1-42) inhibits neurogenesis and down-regulates IFN-gamma and NF-kappaB expression in hippocampus of adult mouse brain.</a> Amyloid. 20 (1-42), 13-20 (2013).</li>
<li>Denis-Donini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+adult+neurogenesis+associated+with+short-term+memory+defects+in+NF-kappaB+p50-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Impaired adult neurogenesis associated with short-term memory defects in NF-kappaB p50-deficient mice.</a> J. Neurosci. 28, 3911-3919 (2008).</li>
<li>Bracchi-Ricard, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astroglial+nuclear+factor-kappaB+regulates+learning+and+memory+and+synaptic+plasticity+in+female+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J%2C+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Astroglial nuclear factor-kappaB regulates learning and memory and synaptic plasticity in female mice.</a> J, Neurochem. 104, 611-623 (2008).</li>
<li>Koo, J. W., Russo, S. J., Ferguson, D., Nestler, E. J., Duman, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+factor-kappaB+is+a+critical+mediator+of+stress-impaired+neurogenesis+and+depressive+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Nuclear factor-kappaB is a critical mediator of stress-impaired neurogenesis and depressive behavior.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 2669-2674 (2010).</li>
<li>Fridmacher, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forebrain-specific+neuronal+inhibition+of+nuclear+factor-kappaB+activity+leads+to+loss+of+neuroprotection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Forebrain-specific neuronal inhibition of nuclear factor-kappaB activity leads to loss of neuroprotection.</a> J. Neurosci. 23, 9403-9408 (2003).</li>
<li>Whiteside, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C-terminal+sequences+control+degradation+of+MAD3%2FI+kappa+B+alpha+in+response+to+inducers+of+NF-kappa%5BTitle%5D)+AND+%22B+activity.+Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">C-terminal sequences control degradation of MAD3/I kappa B alpha in response to inducers of NF-kappa.</a> B activity. Mol. Cell. Biol. 15, 5339-5345 (1995).</li>
<li>Mayford, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+memory+formation+through+regulated+expression+of+a+CaMKII+transgene%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Control of memory formation through regulated expression of a CaMKII transgene.</a> Science. 274, 1678-1683 (1996).</li>
<li>Rosenfeld, M. E., Prichard, L., Shiojiri, N., Fausto, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevention+of+hepatic+apoptosis+and+embryonic+lethality+in+RelA%2FTNFR-1+double+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Prevention of hepatic apoptosis and embryonic lethality in RelA/TNFR-1 double knockout mice.</a> Am. J. Pathol. 156, 997-1007 (2000).</li>
<li>Morris, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developments+of+a+water-maze+procedure+for+studying+spatial+learning+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Developments of a water-maze procedure for studying spatial learning in the rat.</a> J Neurosci. Methods. 11, 47-60 (1984).</li>
<li>Barnes, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Memory+deficits+associated+with+senescence%3A+a+neurophysiological+and+behavioral+study+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Compar.+Physiol.+Psychol%22%5BJournal%5D)">Memory deficits associated with senescence: a neurophysiological and behavioral study in the rat.</a> J. Compar. Physiol. Psychol. 93, 74-104 (1979).</li>
<li>Brun, V. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Place+cells+and+place+recognition+maintained+by+direct+entorhinal-hippocampal+circuitry%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Place cells and place recognition maintained by direct entorhinal-hippocampal circuitry.</a> Science. 296, 2243-2246 (2002).</li>
<li>Meshi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippocampal+neurogenesis+is+not+required+for+behavioral+effects+of+environmental+enrichment%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Hippocampal neurogenesis is not required for behavioral effects of environmental enrichment.</a> Nat. Neurosci. 9, 729-731 (2006).</li>
<li>Bakker, A., Kirwan, C. B., Miller, M., Stark, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+separation+in+the+human+hippocampal+CA3+and+dentate+gyrus%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Pattern separation in the human hippocampal CA3 and dentate gyrus.</a> Science. 319, 1640-1642 (2008).</li>
<li>Dupret, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+relational+memory+requires+hippocampal+adult+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Spatial relational memory requires hippocampal adult neurogenesis.</a> PLoS One. 3, (2008).</li>
<li>Leutgeb, J. K., Leutgeb, S., Moser, M. B., Moser, E. I. Pattern separation in the dentate gyrus and CA3 of the hippocampus. Science. 315. , 961-966 (2007).</li>
<li>Kaltschmidt, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NF-kappaB+regulates+spatial+memory+formation+and+synaptic+plasticity+through+protein+kinase+A%2FCREB+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">NF-kappaB regulates spatial memory formation and synaptic plasticity through protein kinase A/CREB signaling.</a> Mol. Cell. Biol. 26, 2936-2946 (2006).</li>
<li>Clelland, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+role+for+adult+hippocampal+neurogenesis+in+spatial+pattern+separation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A functional role for adult hippocampal neurogenesis in spatial pattern separation.</a> Science. 325, 210-213 (2009).</li>
<li>Kempermann, G., Jessberger, S., Steiner, B., Kronenberg, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Milestones+of+neuronal+development+in+the+adult+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Milestones of neuronal development in the adult hippocampus.</a> Trends Neurosci. 27, 447-452 (2004).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie ma dla nich konfliktu interesów.

Neurogeneza u dorosłych osób i możliwość jej manipulacji poprzez hamowanie NF-κB w neuronach, a następnie jej reaktywacja przez doksycyklinę, oferuje fascynujący system do badań nad nowo narodzonymi neuronami w dorosłym mózgu, a także nad degeneracją i regeneracją neuronów. Piękno tego systemu polega na tym, że hamowanie szlaku sygnałowego NF-κB w neuronach powoduje nie tylko zmiany w śmierci komórek neuronalnych, proliferację i migrację progenitorów oraz poważne zmiany strukturalne i anatomiczne, ale także oczywiste wad...

Ontologicznie, hipokamp jest jedną z najstarszych znanych anatomicznych struktur mózgu. Jest odpowiedzialny za różnorodne złożone zadania, takie jak kluczowe funkcje w regulacji pamięci długotrwałej, orientacji przestrzennej oraz tworzeniu i utrwalaniu odpowiedniej pamięci. Anatomicznie hipokamp składa się z warstw komórek piramidalnych (stratum pyramidale), w tym regionów cornu Ammonis (CA1, CA2, CA3 i CA4) oraz zakrętu zębatego (gyrus dentatus), który zawiera komórki ziarniste i kilka neuronalnych komórek progenitorowych w swojej strefie subziarnistej. Komórki ziarniste wystają w kierunku regionu CA3 za pośrednictwem tak zwanych włókien omszałych (aksonów komórek ziarnistych).
Do końca ubiegłego wieku mózg dorosłego ssaka był uważany za statyczny organ pozbawiony plastyczności komórkowej i neurogenezy. Jednak w ciągu ostatnich dwóch dekad coraz więcej dowodów wyraźnie wskazuje na to, że neurogeneza dorosłych zachodzi w co najmniej dwóch regionach mózgu, strefie podkomorowej (SVZ) i strefie podziarnistej hipokampa.
Nasze poprzednie badania, jak i te z innych grup, wykazały, że czynnik transkrypcyjny NF-κB jest jednym z kluczowych molekularnych regulatorów neurogenezy u dorosłych, a jego deregulacja powoduje poważne strukturalne defekty hipokampa i zaburzenia poznawcze1-6. NF-κB to ogólna nazwa indukowalnego czynnika transkrypcyjnego składającego się z różnych dimerycznych kombinacji pięciu podjednostek wiążących DNA: p50, p52, c-Rel, RelB i p65 (RelA), z których trzy ostatnie mają domeny transaktywacyjne. W mózgu najliczniejszą formą występującą w cytoplazmie jest heterodimer p50 i p65, który jest utrzymywany w nieaktywnej formie przez inhibitor białek kappa B (IκB).
Aby badać i bezpośrednio manipulować neurogenezą sterowaną przez NF-κB, używamy transgenicznych modeli myszy, aby umożliwić proste hamowanie wszystkich podjednostek NF-κB, szczególnie w przodomózgowiu7 (patrz Rysunek 1). W tym celu skrzyżowaliśmy następujące transgeniczne linie myszy, IκB/- i -/tTA. Transgeniczna linia IκB/- została wygenerowana przy użyciu trans-dominującego ujemnego mutanta inhibitora NF-κB IκBa (super-represora IκBa-AA1)8. W przeciwieństwie do IκBα typu dzikiego, IκBα-AA1 ma dwie reszty seryny zmutowane do alaniny (V32 i V36), które utrudniają fosforylację i późniejszą degradację proteasomalną inhibitora. W celu uzyskania specyficznej dla neuronów przodomózgowia ekspresji transgenu IκBa-AA1, myszy IκB/- krzyżowano z myszami posiadającymi zależny od kalmoduliny wapnia promotor kinazy IIα (CAMKIIα), który może być napędzany przez transaktywator tetracykliny (tTA)9.
p65 myszy z nokautem mają embrionalny fenotyp letalny, spowodowany masywną apoptozą wątroby10, więc pokazane tutaj podejście zapewnia elegancką metodę badania roli NF-κB w neurogenezie postnatalnej i dorosłej.
Klasyczny test behawioralny do badania przestrzennego uczenia się i pamięci został opisany w latach 80. przez Richarda Morrisa, test znany jako wodny labirynt Morrisa (MWM)11. W tym labiryncie wodnym na otwartym polu zwierzęta uczą się uciekać z nieprzezroczystej wody na ukrytą platformę w oparciu o orientację i wskazówki poza labiryntem. Suchym wariantem MWM jest tzw. labirynt Barnesa (BM)12. Ten test wykorzystuje okrągłą płytkę z 20 okrągłymi otworami rozmieszczonymi na granicy płyty, z jednym zdefiniowanym otworem jako polem ucieczki i wizualnymi wskazówkami dotyczącymi orientacji poza labiryntem. Oba eksperymentalne paradygmaty opierają się na zachowaniu podczas lotu wywołanym niechęcią gryzonia do wody lub otwartych, jasno oświetlonych przestrzeni. Oba testy pozwalają na zbadanie orientacji przestrzennej i związanej z nią wydajności pamięci. Chociaż hipokamp odgrywa ogólną i zasadniczą rolę w tworzeniu pamięci przestrzennej, zaangażowane regiony hipokampa różnią się w zależności od zastosowanego testu. Pamięć badana w BM powstaje w wyniku aktywności neuronalnej między korą enhorinalną (EC) a neuronami piramidowymi znajdującymi się w regionie CA1 hipokampa bez udziału DG13-16. W szczególności klasyczny BM opiera się głównie na nawigacji za pośrednictwem monosynaptycznego szlaku czasowo-amonicznego od EC III do CA1 do EC V. Co ważne, DG jest w decydujący sposób zaangażowana w tzw. rozpoznawanie wzorców przestrzennych17, co oznacza nie tylko przetwarzanie informacji wizualnych i przestrzennych, ale także przekształcanie podobnych reprezentacji lub wspomnień w różne, Reprezentacje, które nie nakładają się na siebie. Zadanie to wymaga funkcjonalnego obwodu trisynaptycznego od EC II do DG do CA3 do CA1 i EC VI, którego nie można przetestować w BM15.
Aby sprostać tym wyzwaniom, opracowaliśmy SPS-BM jako test behawioralny do testowania zdolności poznawczych zależnych od zakrętu zębatego u zwierząt kontrolnych oraz w modelu super-represora IκB/tTA po inhibicji NF-κB. Co ważne, w przeciwieństwie do MWM lub BM, SPS-BM może ujawniać subtelne deficyty behawioralne wynikające z upośledzenia neurogenezy. Ponieważ separacja wzorców przestrzennych jest ściśle zależna od obwodu funkcjonalnego między EC II i DG oraz CA3 i CA1 i EC VI, test ten jest bardzo wrażliwy na potencjalne zmiany w neurogenezie, modyfikacje szlaku włókien omszałych lub zmiany homeostazy tkanek w DG.
Technicznie, konfiguracja naszego testu opiera się na badaniu przeprowadzonym przez Clelland et al., w którym wzorzec separacji przestrzennej został przetestowany przy użyciu drewnianego 8-ramiennego labiryntu z promieniowym ramieniem (RAM)19. W naszej zmodyfikowanej konfiguracji osiem ramion zostało zastąpionych siedmioma identycznymi żółtymi pojemnikami na żywność. Podsumowując, przedstawione tutaj metody, w tym analiza komórek z podwójną ekspresją kortyny (DCX+) w hipokampie, projekcje włókien omszałych, śmierć komórek neuronalnych, a w szczególności przedstawiony tutaj SPS-BM, mogą być zastosowane do badań innych modeli myszy zawierających transgeny, które mają wpływ na neurogenezę dorosłych. Dalsze zastosowania mogą obejmować badanie środków farmakologicznych i pomiar ich wpływu na DG i separację wzorców przestrzennych.

<table><tbody><tr><td>Łyżka perforowana Moria MC17&nbsp;</td><td>FST</td><td>10370-18</td><td>usuwanie mózgów</td></tr><tr><td>Mikroskop preparacyjny</td><td>Carl Zeiss</td><td>Stemi SV8</td><td>usuwanie mózgów</td></tr><tr><td>Nożyczki chirurgiczne&nbsp;</td><td>FST</td><td>14084-08</td><td>usuwanie mózgu</td></tr><tr><td>Nożyczki chirurgiczne&nbsp;</td><td>FST</td><td>14381-43</td><td>usuwanie mózgów</td></tr><tr><td>Kleszcze Dumont #5</td><td>FST</td><td>11254-20</td><td>usuwanie mózgów</td></tr><tr><td>Slajdy SuperFrost Szkiełka</td><td>Carla Rotha</td><td>1879</td><td>do immunohistochemii</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>utrwalacz</td></tr><tr><td>Związek TissueTek OCT</td><td>Sakura Finetek</td><td>1004200018</td><td>osadzanie mózgów</td></tr><tr><td>Normalna surowica kozia</td><td>Jackson Immunolabs</td><td>005-000-001</td><td>blokowanie w IHC</td></tr><tr><td>Normalne serum królika</td><td>Jackson Immunolabs</td><td>011-000-001</td><td>blokowanie w IHC</td></tr><tr><td>Normalne surowice osła</td><td>Jackson Immunolabs</td><td>017-000-001</td><td>blokowanie przeciwciała IHC</td></tr><tr><td>anty-Neurofilament-M</td><td>Badania rozwojowe Hybridoma Bank</td><td>2H3</td><td>IHC, Rozcieńczenie 1:200</td></tr><tr><td>anty-Doublecortin&nbsp; przeciwciało</td><td>sc-8066</td><td>Santa Cruz</td><td>IHC, Rozcieńczenie 1:800</td></tr><tr><td>przeciwciało anty-GFP</td><td>Abcam</td><td>ab290</td><td>IHC, Rozcieńczenie 1:2,000</td></tr><tr><td>przeciwciało anty-BrdU</td><td>OBT0030G</td><td>Accurate Chemicals</td><td>IHC, Rozcieńczenie 1:2,000&nbsp;</td></tr><tr><td>Fluoro-Jade C</td><td>FJ-C</td><td>HistoChem</td><td>Oznaczanie śmierci komórek neuronalnych</td></tr><tr><td>Betadine</td><td>Mundipharma</td><td>D08AG02</td><td>środek dezynfekujący</td></tr><tr><td>Kriomikrotom</td><td>Leica</td><td>CM1900</td><td>przygotowanie plastrów mózgu</td></tr><tr><td>Heparyna sól sodowa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3393</td><td>perfuzja</td></tr><tr><td>Okrągła płytka wykonana z twardego tworzywa sztucznego (średnica 120 cm)</td> <td>wykonana w</td> <td>laboratoriumbrak</td><td>talerz do SPS-BM, średnica 120 cm</td></tr><tr><td>Szybki środek dezynfekujący Buraton&nbsp;</td><td>Sch&uuml; lke Mayr</td><td>113 911</td><td>środek dezynfekujący</td></tr><tr><td>System śledzenia wideo TSE VideoMot 2 z pakietem oprogramowania VideoMot2</td><td>TSE Systems</td><td>302050-SW-KIT</td><td>śledzenie i analiza SPS-BM</td></tr><tr><td>Triton X-100&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787</td><td>permeabilizacja/IHC</td></tr><tr><td>Cryotome</td><td>Reichert Jung/Leica</td><td>Frigomobil 1206</td><td>przygotowanie 40 &mikro; m plastry mózgu</td></tr><tr><td>Mowiol 4-88</td><td>Carl Roth</td><td>Art.-Nr. 0713</td><td>osadzanie slajdów</td></tr><tr><td>SYTOX zielony</td><td>Invitrogen</td><td>S7020</td><td>Barwienie jądrowe</td></tr><tr><td>Granulki spożywcze (Kellog's Froot Loops)</td><td>Kellog's</td><td></td><td>SPS-BM</td></tr><tr><td>Prism, wersja 3.0</td><td>Graph Pad Software, San Diego, USA</td><td></td><td>Ocena statystyczna oprogramowania SPS-BM</td></tr><tr><td>Zen 2008 lub Zen 2011</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>Software (mikroskop konfokalny)</td></tr><tr><td>D.P.X</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>317616</td><td>podłoże montażowe do barwienia fluoro-jadeitu C</td></tr></tbody></table>

metody modulacji i analizy neurogenezy dorosłych zależnej od nf-κb

Methods for the Modulation and Analysis of NF-&#954;B-dependent Adult Neurogenesis

Hipokamp odgrywa kluczową rolę w tworzeniu i utrwalaniu epizodycznych wspomnień oraz w orientacji przestrzennej. Historycznie rzecz biorąc, dorosły hipokamp był postrzegany jako bardzo statyczny obszar anatomiczny mózgu ssaków. Jednak ostatnie odkrycia wykazały, że zakręt zębaty hipokampa jest obszarem o ogromnej plastyczności u dorosłych, obejmującym nie tylko modyfikacje istniejących obwodów neuronalnych, ale także neurogenezę dorosłych. Ta plastyczność jest regulowana przez złożone sieci transkrypcyjne, w których czynnik transkrypcyjny NF-κB odgrywa znaczącą rolę. Do badania i manipulowania neurogenezą dorosłych można wykorzystać transgeniczny model myszy do specyficznego dla neuronów przodomózgowia hamowania aktywności NF-κB.
W tym badaniu opisano metody analizy neurogenezy zależnej od NF-κB, w tym jej aspekty strukturalne, apoptozę neuronów i proliferację progenitorów oraz znaczenie poznawcze, które zostało specjalnie ocenione za pomocą testu behawioralnego zależnego od zakrętu zębatego (DG), separacji przestrzennej - labirynt Barnesa (SPS-BM). Protokół SPS-BM można po prostu zaadaptować do użytku z innymi transgenicznymi modelami zwierzęcymi zaprojektowanymi do oceny wpływu poszczególnych genów na neurogenezę dorosłego hipokampa. Ponadto projekt SPS-BM może być stosowany w innych warunkach eksperymentalnych mających na celu badanie i manipulowanie uczeniem się zależnym od DG, na przykład przy użyciu środków farmakologicznych.

Krzyżowanie transgenicznych linii myszy IκB/- oraz tTA prowadzi do warunkowego hamowania aktywności NF-κB w hipokampie.
Aby zbadać ekspresję transgenu IκBα-AA1 u myszy podwójnie transgenicznej (Rysunek 1A), wyizolowano mózgi, wykonano ich kriosekcje i zabarwiono za pomocą przeciwciała przeciwko GFP (zielonemu białku fluorescencyjnemu). Konfokalna mikroskopia laserowa wykazała wysoką ekspresję transgenu w obszarach CA1 i CA3 oraz w DG (Rysunek 1B</stron...

Opisano metody manipulacji i analizy neurogenezy hipokampa zależnej od NF-κB u dorosłych. Przedstawiono szczegółowy protokół testu behawioralnego zależnego od zakrętu zębatego (określanego jako separacja wzorca przestrzennego - labirynt Barnesa) w celu zbadania wyników poznawczych u myszy. Technika ta powinna również pomóc w umożliwieniu badań w innych warunkach eksperymentalnych.

Metody modulacji i analizy neurogenezy dorosłych zależnej od NF-κB

The hippocampus plays a pivotal role in the formation and consolidation of episodic memories, and in spatial orientation. Historically, the adult ...

Ogólnym celem tej procedury jest zbadanie funkcji czynnika transkrypcyjnego NF kappa B w dorosłym mózgu. Osiąga się to poprzez pierwszą hodowlę myszy transgenicznych, które specyficznie hamują aktywność NF kappa B w neuronach. Drugim krokiem procedury jest przetestowanie behawioralnych konsekwencji inhibicji NF kappa B za pomocą wzorca przestrzennego, separacji lub stodół, labiryntu.Trzecim krokiem jest staranne rozmnażanie zwierząt, usunięcie mózgów i właściwe ich podzielenie na sekcje. Ostatnim krokiem jest analiza efektów histologicznych i strukturalnych, takich jak wizualizacja projekcji włókien mcha za pomocą barwienia immunologicznego. Ostatecznie, zastosowanie testu behawioralnego, a następnie histologii, może skorelować zmiany w uczeniu się zależnym od zakrętu zębatego ze zmianami strukturalnymi w powiązanych tkankach.Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak Mars Vase, jest to, że przestrzenne wiązania separacji wzorców MA oferują możliwość specyficznego pomiaru procesów uczenia się zależnych od dziecka, a także neurodegeneracji i regeneracji w tym obszarze mózgu. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie neurogenezy dorosł

methods-for-modulation-analysis-nf-b-dependent-adult

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Metody modulacji i analizy zależnej od NF-κB neurogenezy u dorosłych

Opisano metodę badania integracji nowo powstałych komórek ziarnistych zakrętu zębatego u dorosłych zwierząt. Technika ta wykorzystuje zmodyfikowanego retrowirusa do znakowania nowych neuronów, a następnie rejestrację elektrofizjologiczną w celu określenia funkcjonalnej integracji in vivo.

Badanie integracji neuronów powstałych w wieku dorosłym

Funkcja neuronów u dorosłych ssaków pozostaje aktywnym obszarem badań. Promieniowanie jonizujące hamuje powstawanie nowych neuronów. Korzystając z napromieniania ogniskowego pod kontrolą tomografii komputerowej (CFIR), trójwymiarowe anatomiczne celowanie w określone populacje progenitorów nerwowych może być teraz wykorzystane do oceny funkcjonalnej roli neurogenezy dorosłych.

Funkcjonalne badanie neurogenezy podwzgórza u dorosłych z ogniskowym hamowaniem radiologicznym

Migracja neuroblastów jest kluczowym krokiem w neurogenezie poporodowej. Opisany tutaj protokół może być wykorzystany do zbadania roli kandydatów na regulatory migracji neuroblastów poprzez zastosowanie nukleofekcji DNA/małego RNA spinki do włosów (shRNA) oraz testu migracji 3D z neuroblastami wyizolowanymi z pourodzeniowego strumienia migracyjnego rostralnego gryzoni.

Nukleofekcja neuroblastów gryzoni do badania migracji neuroblastów in vitro

Ten artykuł wideo ilustruje kompleksowy protokół do wykrywania i ilościowego określania wszystkich etapów neurogenezy dorosłego hipokampa w obrębie tego samego odcinka tkanki. Opracowaliśmy metodę przezwyciężania ograniczeń pośredniej immunofluorescencji mnogiej, które powstają, gdy odpowiednie przeciwciała od różnych gatunków gospodarzy są niedostępne.

Immunohistochemia i wielokrotne znakowanie przeciwciałami od tego samego gatunku gospodarza w celu zbadania neurogenezy hipokampa u dorosłych

Opisujemy protokół immunohistochemiczny do badania profilu aktywacji neuronów hipokampa po ekspozycji na zadanie uczenia przestrzennego w modelu mysim charakteryzującym się deficytami poznawczymi pochodzenia neurorozwojowego. Protokół ten może być stosowany zarówno do genetycznych, jak i farmakologicznych modeli myszy charakteryzujących się deficytami poznawczymi.

Immunohistochemiczna wizualizacja aktywności neuronów hipokampa po uczeniu przestrzennym w mysim modelu zaburzeń neurorozwojowych

Tutaj opisujemy procedurę opartą na wykorzystaniu cząsteczek lentiwirusowych do długoterminowej modyfikacji genetycznej nerwowych komórek macierzystych i/lub ich sąsiadujących komórek wyściółkowych w dorosłej komorowo-podkomorowej niszy neurogennej, która pozwala na oddzielną analizę autonomicznych i nieautonomicznych, zależnych od niszy efektów na neuronalne komórki macierzyste.

Stabilna i wydajna modyfikacja genetyczna komórek dorosłej myszy V-SVZ do analizy autonomicznych i nieautonomicznych efektów neuronalnych komórek macierzystych

Celem tego protokołu jest opisanie podejścia do analizy zachowania dorosłych nerwowych komórek macierzystych/progenitorowych w odpowiedzi na manipulację chemogenetyczną specyficznego lokalnego obwodu neuronowego.

Regulacja specyficzna dla obwodu testowego dorosłych nerwowych komórek prekursorowych hipokampa

Możliwość trwałego oznaczania komórek macierzystych i ich potomstwa za pomocą fluoroforu za pomocą indukowalnej linii myszy śledzącej transgeniczną linię genealogiczną pozwala na przestrzenną i czasową analizę aktywacji, proliferacji, migracji i/lub różnicowania in vivo. Śledzenie linii może ujawnić nowe informacje na temat zaangażowania w linię, odpowiedzi na interwencję (interwencje) i multipotencji.

Śledzenie linii indukowalnych fluorescencyjnie znakowanych komórek macierzystych w mózgu dorosłej myszy

Przedstawiona tutaj jest metoda sekwencjonowania pojedynczych jąder wyizolowanych z mysiego zakrętu zębatego, która wyklucza większość neuronów poprzez sortowanie jąder aktywowanych fluorescencją (FAN). Takie podejście pozwala na uzyskanie wysokiej jakości profili ekspresji i ułatwia badanie większości innych typów komórek reprezentowanych w niszy, w tym rzadkich populacji, takich jak nerwowe komórki macierzyste.

Aktywowane fluorescencją sortowanie jąder ujemnych neuronów w połączeniu z sekwencjonowaniem RNA pojedynczych jąder w celu zbadania niszy neurogennej hipokampa

Tutaj opisujemy system nukleofekcji zaprojektowany w celu zwiększenia efektywności dostarczania genów w rozszerzonych nerwowych komórkach macierzystych (NSC) wyizolowanych z dorosłej mysiej strefy podkomorowej. Wyniki pokazują, że metoda ta znacznie poprawia perturbację genów w NSC, przewyższając skuteczność tradycyjnych protokołów transfekcji i zwiększając wskaźnik przeżywalności komórek.

Izolacja, ekspansja i nukleofekcja nerwowych komórek macierzystych z dorosłej mysiej strefy podkomorowej

Testy wzrostu neurytów dostarczają ilościowej wartości na temat regeneracyjnych procesów neuronalnych. Zaletą tego półautomatycznego oprogramowania jest to, że segmentuje ciała komórek i neuryty oddzielnie, tworząc maskę i mierzy różne parametry, takie jak długość neurytów, liczba punktów rozgałęzień, obszar klastra komórka-ciało i liczba klastrów komórek.

Standaryzacja nowatorskiego półautomatycznego oprogramowania do pomiaru przyrostu neurytów

Poznaj metody modulacji neurogenezy dorosłych zależnej od NF-κB w hipokampie myszy. Protokół obejmuje test behawioralny Barnes maze oraz analizę histologiczną projekcji włókien mchowych.

Metody modulacji i analizy neurogenezy dorosłych zależnej od NF-κB

Przeglądaj więcej filmów