Name: Hodowla nerwowych komórek macierzystych z konwencjonalnych i niekonwencjonalnych regionów mózgu dorosłego gryzonia (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-18T20:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 27 s
Description: Poznaj metodę hodowli nerwowych komórek macierzystych z różnych regionów mózgu dorosłego gryzonia. Technika ta pozwala badać ich potencjał samoodnawiania i różnicowania w kontekście neurobiologii oraz medycyny regeneracyjnej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca została sfinansowana (częściowo) przez Helmholtz Alliance ICEMED - Imaging and Curing Environmental Metabolic Diseases, poprzez Fundusz Inicjatywy i Sieci Stowarzyszenia Helmholtza, grant z Fundacji Else Kroener-Fresenius oraz grant z Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 655: Komórki w tkanki).

Praca jest zgodna z Deklaracją Helsińskiego i Oświadczeniem ARVO o zwierzętach. Do pobierania tkanek wykorzystano zwierzęta, a wszystkie odpowiednie metody były przestrzegane zgodnie z instrukcjami zakładu dla zwierząt na Uniwersytecie w Dreźnie. Zwierzęta były traktowane i trzymane w pomieszczeniach zgodnie z niemieckimi wytycznymi federalnymi dotyczącymi użytkowania i opieki nad zwierzętami laboratoryjnymi, a badanie zostało zatwierdzone przez Landesdirektion Dresden. Prosimy o skonsultowanie się z polityką weterynaryjną Państwa instytucji (IACUC lub inną radą) w sprawie właściwej metodologii eutanazji.
Konkretne zapasy i stężenia robocze odczynników można znaleźć w Tabelach Odczynników dołączonych do tego protokołu.
1. Przygotowanie potrawy kulturowej
<ol>
	<li>Pokryć naczynia wystarczającą objętością 75 μg/ml poli-L-ornityny (tj. 2 ml/dołek z płytki 6-dołkowej) przez noc w inkubatorze do hodowli komórkowych na 2 dni przed planowaną datą sekcji.</li>
	<li>Odessać poli-L-ornitynę następnego dnia i przemywać każdą studzienkę 2x 3 ml PBS przez 5 minut.</li>
	<li>Usuń ostatnie płukanie, a następnie dodaj fibronektynę (rozcieńczoną w stosunku 1:250, 4 μg/ml w PBS) do płytki i umieść naczynia w inkubatorze na noc.</li>
	<li>Odessać fibronektynę w dniu sekcji i umyć naczynia 2x PBS. Płytki zawierające ostatnie przepłukanie PBS należy umieścić z powrotem w inkubatorze do momentu, gdy zdysocjowana tkanka będzie gotowa do hodowli. W tym czasie należy usunąć PBS przed posiewem tkanki.</li>
	<li>Płytki pokryte poli-L-ornityną należy przechowywać w inkubatorze do 3 tygodni. Płytki pokryte fibronektyną można przechowywać do 1 tygodnia. Powlekanie fibronektyną można wykonać w ciągu zaledwie 2 godzin, jeśli jest to pilne. Fibronektyna jest podatna na denaturację; Nie mieszaj roztworu ani nie pozwól naczyniom wyschnąć.</li>
</ol>
2. Rozwarstwienie/Poszycie
<ol>
	<li>Protokół ten dotyczy wykorzystania 3 dorosłych szczurów (w wieku 3-6 miesięcy).</li>
	<li>Schłodź blok sekcyjny mózgu na lodzie przed eutanazją szczura.</li>
	<li>Umieść na lodzie 15 ml probówkę Falcon zawierającą 5 ml pożywki N2 z dodatkiem bFGF.</li>
	<li>Poddaj szczury eutanazji zgodnie z polityką weterynaryjną swojej instytucji.</li>
	<li>Usuń mózg z czaszki, wykonując nacięcie wzdłuż linii środkowej głowy. Użyj kleszczy, aby oderwać kość, co pozwoli na ostrożne wydobycie mózgu.</li>
	<li>Umieść mózg na 10-centymetrowej szalce Petriego zawierającej lodowaty PBS. Spowoduje to usunięcie wszelkich resztek włosów i krwi. (Rysunek 1A)</li>
	<li>Umieść mózg w schłodzonym bloku sekcyjnym. (Rysunek 1B)</li>
	<li>Włóż jedną nową, czystą żyletkę do bloku, jak pokazano na rysunku 1C.</li>
	<li>Włóż drugą czystą żyletkę 3 mm ogonową do pierwszej, jak pokazano na rysunku 1D.</li>
	<li>Ostrożnie podnieś ostrza z bloku, zabierając ze sobą interesującą Cię sekcję.</li>
	<li>Odsuń sekcję od ostrza, zanurzając ją w PBS. (Rysunek 1E)</li>
	<li>Zbierz tkankę z obszaru zainteresowania (w tym przykładzie użyliśmy spoidła przedniego, (przedniego) ACA, ryc. 1F) za pomocą kleszczy #5 i zbierz do stożkowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej 1 ml pożywki N2 zawierającej bFGF.</li>
	<li>Przenieś probówkę do kaptura do hodowli komórek z przepływem laminarnym, kontynuując pozostałą część protokołu w sterylnych warunkach.</li>
	<li>Mechanicznie zdysocjować tkankę za pomocą końcówki do pipety o pojemności 1 ml dołączonej do pipetora P1000. Kilkakrotnie pipetować w górę i w dół (około 20 razy z szybkością 1 cyklu pipetowania na sekundę), jednocześnie dociskając otwór końcówki pipety do dna rurki stożkowej (rysunki 1G 1-3). Zatrzymaj rozcieranie, gdy roztwór stanie się jednorodny.</li>
	<li>Pozostaw roztwór na 2 minuty, aby każda większa niezdysocjowana tkanka mogła osiąść na dnie. (Rysunek 1G 4)</li>
	<li>Zebrać jednorodny supernatant i umieścić w stożkowej probówce zawierającej 8,5 ml pożywki N2 plus 20 ng/ml bFGF, 500 ng/ml Dll4, 500 ng/ml Ang2 i 200 nMJAK inhibitora.</li>
	<li>Umieść je w 3 dołkach na płytce 6-dołkowej, używając 3 ml rozcieńczonego roztworu komórek/dołka.</li>
	<li>Umieścić płytkę w inkubatorze z nawilżanymi komórkami w temperaturze 37 °C, 5% CO2, 5% O2 .</li>
</ol>
3. Codzienna pielęgnacja
<ol>
	<li>Zastąp pożywkę na szalkach hodowlanych pożywką N2 zawierającą bFGF, Ang2, Dll4 i inhibitor JAK 24 godziny po posiewie.</li>
	<li>Następnego dnia dodać bolus z bFGF, Dll4, Ang2 i inhibitorem JAK.</li>
	<li>Kontynuuj ten naprzemienny proces zmian pożywek i dodawania czynników przez łącznie 10-14 dni.</li>
</ol>
4. Indukcja różnicowania
<ol>
	<li>Odstaw pożywkę zawierającą bFGF, Dll4, Ang2 i inhibitor JAK i zastąp ją pożywką N2, która nie zawiera żadnych dodatkowych czynników.</li>
	<li>Zmieniaj podłoże co drugi dzień.</li>
	<li>Napraw komórki po 10 dniach i wykonaj immunocytochemię.</li>
</ol>
5. Detekcja immunocytochemiczna
<ol>
	<li>Odessać pożywkę i utrwalić płytki do hodowli komórkowych 2 ml 4% paraformaldehydu przez 20 minut.</li>
	<li>Myć 2x po 3 ml PBS po 5 min.</li>
	<li>Odessać PBS, a następnie przeniknąć i zablokować komórki, dodając 2 ml PBS zawierającego 5% normalnej surowicy osła (NDS) i 0,1% Triton X-100 przez 20 minut.</li>
	<li>Przygotować pierwszorzędową mieszaninę przeciwciał w PBS zawierającą 5% NDS. Przeciwciało anty-nestynowe może być używane do identyfikacji SC, podczas gdy przeciwciała TuJ1 (klasa III β-tubulina), GFAP i CNPaza mogą być używane razem do potrójnego barwienia markerów różnicowania.</li>
	<li>Odessać roztwór blokujący i dodać 1,5 ml mieszaniny przeciwciał pierwszorzędowych do każdej studzienki. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 90 minut.</li>
	<li>Usunąć przeciwciała pierwszorzędowe i przemyć 2x 3 ml PBS i 1x 3 ml PBS zawierającego 5% NDS przez 5 min każdy.</li>
	<li>Przygotować przeciwciała drugorzędowe w PBS zawierające 5% NDS.</li>
	<li>Odessać ostatnie płukanie i dodać 1,5 ml wtórnego roztworu przeciwciał do każdej studzienki. Inkubować w ciemności przez 40 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Usunąć drugorzędowy roztwór przeciwciała i dodać 2 ml świeżo przygotowanego barwnika DAPI (500 ng/ml w PBS). Inkubować przez 3 minuty.</li>
	<li>Odessać roztwór DAPI, a następnie przemyć 3x 3 ml PBS przez 5 minut każdy. Komórki można teraz uwidocznić za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.</li>
</ol>

<ol><li>Cajal, R. Y. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCajal%2C+RY+%22Comparative+Study+of+Sensory+Areas+of+the+Human+Cortex%22">Comparative Study of Sensory Areas of the Human Cortex</a>. , Harvard University. (1899).</li>
<li>Altman, J., Das, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoradiographic+and+histological+evidence+of+postnatal+hippocampal+neurogenesis+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Autoradiographic and histological evidence of postnatal hippocampal neurogenesis in rats.</a> J. Comp. Neurol. 124, 319-335 (1965).</li>
<li>Kaplan, M. S., Hinds, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenesis+in+the+adult+rat%3A+electron+microscopic+analysis+of+light+radioautographs%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neurogenesis in the adult rat: electron microscopic analysis of light radioautographs.</a> Science. 197, 1092-1094 (1977).</li>
<li>Nottebohm, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+replacement+in+adulthood%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+N.Y.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Neuronal replacement in adulthood.</a> Ann. N.Y. Acad. Sci. 457, 143-161 (1985).</li>
<li>Gould, E., Reeves, A. J., Graziano, M. S., Gross, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenesis+in+the+neocortex+of+adult+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neurogenesis in the neocortex of adult primates.</a> Science. 286, 548-552 (1999).</li>
<li>Kornack, D. R., Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuation+of+neurogenesis+in+the+hippocampus+of+the+adult+macaque+monkey%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Continuation of neurogenesis in the hippocampus of the adult macaque monkey.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 5768-5773 (1999).</li>
<li>Alvarez-Buylla, A., Kohwi, M., Nguyen, T. M., Merkle, F. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+heterogeneity+of+adult+neural+stem+cells+and+the+emerging+complexity+of+their+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb.+Symp.+Quant.+Biol%22%5BJournal%5D)">The heterogeneity of adult neural stem cells and the emerging complexity of their niche.</a> Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 73, 357-365 (2008).</li>
<li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255, 1707-1710 (1992).</li>
<li>Luskin, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restricted+proliferation+and+migration+of+postnatally+generated+neurons+derived+from+the+forebrain+subventricular+zone%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Restricted proliferation and migration of postnatally generated neurons derived from the forebrain subventricular zone.</a> Neuron. 11, 173-189 (1993).</li>
<li>Lendahl, U., Zimmerman, L. B., McKay, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CNS+stem+cells+express+a+new+class+of+intermediate+filament+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">CNS stem cells express a new class of intermediate filament protein.</a> Cell. 60, 585-595 (1990).</li>
<li>Androutsellis-Theotokis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+neural+precursors+in+the+adult+brain+rescues+injured+dopamine+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Targeting neural precursors in the adult brain rescues injured dopamine neurons.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 13570-13575 (2009).</li>
<li>Jin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenesis+in+dentate+subgranular+zone+and+rostral+subventricular+zone+after+focal+cerebral+ischemia+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Neurogenesis in dentate subgranular zone and rostral subventricular zone after focal cerebral ischemia in the rat.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 4710-4715 (2001).</li>
<li>Zhang, R. L., Zhang, Z. G., Chopp, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ischemic+stroke+and+neurogenesis+in+the+subventricular+zone%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Ischemic stroke and neurogenesis in the subventricular zone.</a> Neuropharmacology. 55, 345-352 (2008).</li>
<li>Caplan, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+are+MSCs+therapeutic%3F+New+data%3A+new+insight%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Why are MSCs therapeutic? New data: new insight.</a> J. Pathol. 217, 318-324 (2009).</li>
<li>Goldman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+and+progenitor+cell-based+therapy+of+the+human+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Stem and progenitor cell-based therapy of the human central nervous system.</a> Nat. Biotechnol. 23, 862-871 (2005).</li>
<li>Sun, N., Longaker, M. T., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+iPS+cell-based+therapy%3A+considerations+before+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Human iPS cell-based therapy: considerations before clinical applications.</a> Cell Cycle. 9, 880-885 (2010).</li>
<li>Amariglio, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Donor-derived+brain+tumor+following+neural+stem+cell+transplantation+in+an+ataxia+telangiectasia+patient%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Med%22%5BJournal%5D)">Donor-derived brain tumor following neural stem cell transplantation in an ataxia telangiectasia patient.</a> PLoS Med. 6, e1000029(2009).</li>
<li>Lindvall, O., Bjorklund, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+therapeutics+in+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotherapeutics%22%5BJournal%5D)">Cell therapeutics in Parkinson's disease.</a> Neurotherapeutics. 8, 539-548 (2011).</li>
<li>Kittappa, R., Bornstein, S. R., Androutsellis-Theotokis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+eNSCs+in+Neurodegenerative+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Mo.l+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">The Role of eNSCs in Neurodegenerative Disease.</a> Mo.l Neurobiol. , (2012).</li>
<li>Cattaneo, E., McKay, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+and+manipulating+neuronal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Identifying and manipulating neuronal stem cells.</a> Trends Neurosci. 14, 338-340 (1991).</li>
<li>Jensen, J. B., Parmar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strengths+and+limitations+of+the+neurosphere+culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Strengths and limitations of the neurosphere culture system.</a> Mol. Neurobiol. 34, 153-161 (2006).</li>
<li>Duarte, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dosage-sensitive+requirement+for+mouse+Dll4+in+artery+development%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Dosage-sensitive requirement for mouse Dll4 in artery development.</a> Genes Dev. 18, 2474-2478 (2004).</li>
<li>Maisonpierre, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiopoietin-2%2C+a+natural+antagonist+for+Tie2+that+disrupts+in+vivo+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Angiopoietin-2, a natural antagonist for Tie2 that disrupts in vivo angiogenesis.</a> Science. 277, 55-60 (1997).</li>
<li>Androutsellis-Theotokis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+signalling+regulates+stem+cell+numbers+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Notch signalling regulates stem cell numbers in vitro and in vivo.</a> Nature. 442, 823-826 (2006).</li>
<li>Alderson, R. F., Alterman, A. L., Barde, Y. A., Lindsay, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain-derived+neurotrophic+factor+increases+survival+and+differentiated+functions+of+rat+septal+cholinergic+neurons+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Brain-derived neurotrophic factor increases survival and differentiated functions of rat septal cholinergic neurons in culture.</a> Neuron. 5, 297-306 (1990).</li>
<li>Johe, K. K., Hazel, T. G., Muller, T., Dugich-Djordjevic, M. M., McKay, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+factors+direct+the+differentiation+of+stem+cells+from+the+fetal+and+adult+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Single factors direct the differentiation of stem cells from the fetal and adult central nervous system.</a> Genes Dev. 10, 3129-3140 (1996).</li>
<li>Ourednik, J., Ourednik, V., Lynch, W. P., Schachner, M., Snyder, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem+cells+display+an+inherent+mechanism+for+rescuing+dysfunctional+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Neural stem cells display an inherent mechanism for rescuing dysfunctional neurons.</a> Nat. Biotechnol. 20, 1103-1110 (2002).</li>
<li>Ryu, J. K., Cho, T., Wang, Y. T., McLarnon, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+progenitor+cells+attenuate+inflammatory+reactivity+and+neuronal+loss+in+an+animal+model+of+inflamed+AD+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Neural progenitor cells attenuate inflammatory reactivity and neuronal loss in an animal model of inflamed AD brain.</a> J. Neuroinflammation. 6, 39(2009).</li>
<li>Androutsellis-Theotokis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenic+factors+stimulate+growth+of+adult+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Angiogenic factors stimulate growth of adult neural stem cells.</a> PLoS One. 5, e9414(2010).</li>
<li>Park, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hes3+regulates+cell+number+in+cultures+from+glioblastoma+multiforme+with+stem+cell+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Hes3 regulates cell number in cultures from glioblastoma multiforme with stem cell characteristics.</a> Sci. Rep. 3, 1095-1010 (2013).</li>
<li>Poser, S. W., et al. Ch. 5. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPoser%2C+SW+%22Cancer+Stem+Cells+-+The+Cutting%22">Cancer Stem Cells - The Cutting</a>. Shostak, S. , InTech. Europe, Rijeka, Croatia. 89-110 (2011).</li>
<li>Androutsellis-Theotokis, A., Rueger, M. A., Mkhikian, H., Korb, E., McKay, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+pathways+controlling+neural+stem+cells+slow+progressive+brain+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb.+Symp.+Quant.+Biol%22%5BJournal%5D)">Signaling pathways controlling neural stem cells slow progressive brain disease.</a> Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 73, 403-410 (2008).</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

Wiele etapów krytycznych dla skutecznej izolacji, ekspansji i różnicowania nerwowych komórek macierzystych z dorosłego mózgu jest wspólnych ze standardowymi technikami hodowli tkankowych. Celem, o którym należy pamiętać, jest to, że NSC wyizolowane z dorosłego mózgu powinny zachować jak najwięcej swoich cech in vivo (Figura 2J). Często trzeba znaleźć równowagę między konieczną ostrożnością a odpowiednią prędkością. Opieka nad izolacją mózgu od czaszki znacznie ułatwi identyfikację obszaru zainte...

Główny dogmat neurobiologii, ustanowiony przez fundamentalne obserwacje cytoarchitektury mózgu dokonane przez Ramóna Y. Cajala ponad sto lat temu, utrzymywał, że neurogeneza jest mało prawdopodobna po okresie dojrzewania, biorąc pod uwagę złożoność sieci neuronowych znajdujących się w OUN1. Pomimo prac Altmana z lat sześćdziesiątych, a później Kaplana, wykazujących, że 3H-tymidynę można znaleźć w dojrzałych neuronach, co wskazuje, że w rzeczywistości neurony są generowane w różnych obszarach dorosłego mózgu, dogmat nadal utrzymywałsię na poziomie 2,3. Dowodów było coraz więcej, a badania Nottebohma opisywały sezonowe zmiany w liczbie neuronów obecnych w mózgach ptaków śpiewających4. Dopiero w 1999 roku, kiedy Gould i in. opublikowali pracę na temat generowania neuronów w hipokampie wraz z wykonywaniem zadań uczenia się asocjacyjnego u szczurów, a także obserwacje Kornacka i Rakicia wykazujące ciągłą neurogenezę u dorosłych makaków, koncepcja mniej sztywnego, bardziej plastycznego mózgu, została rozpoznana 5,6.
Poszukiwanie komórkowego źródła dla tych neuronów generowanych de novo doprowadziło do odkrycia odrębnej populacji komórek macierzystych (SC), które znajdują się w obszarach mózgu określanych jako nisze7. Strefa podkomorowa i strefa subziarnista hipokampa są uważane za dwa główne regiony neurogenne8,9. Komórki wyizolowane z tych lokalizacji wykazują klasyczną cechę zarodkowych lub płodowych SC, potencjał samoodnowy i różnicowania. W przypadku nerwowych komórek macierzystych (NSC) mogą one być różnicowane w neurony, astrocyty i oligodendrocyty. Ponadto te SC są dodatnie pod kątem płodowych markerów NSC, takich jak gniazdo białka pośredniego filamentu10. Nowsze prace podkreślają, że SC mogą nie ograniczać się do tych dwóch obszarów i są w rzeczywistości zlokalizowane w całym mózgu jako w dużej mierze spokojna populacja komórek ściśle związanych z układem naczyniowym.
Obserwacje tego, że SC są mobilizowane w odpowiedzi na uraz, sugerują możliwość wykorzystania tych komórek do celów regeneracyjnych, aby pomóc w powrocie do zdrowia po zaburzeniu neurodegeneracyjnym i udarze12,13. Nie różni się to od roli, jaką mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) odgrywają w gojeniu tkanek łącznych, które znajdują się jako komórki okołonaczyniowe, które mają potencjał, aby stać się osteoblastami, chondrocytami i komórkami tłuszczowymi14. Jednak NSC nie mogą być pobierane ze szpiku kostnego w taki sam sposób, jak MSCs za pomocą rutynowych technik aspiracji i wirowania w gradiacji gęstości, a następnie wykorzystywane w terapiach opartych na autologicznych komórkach. W związku z tym inne źródła komórek, takie jak wykorzystanie płodowych NSC lub prekursorów neuronalnych pochodzących z embrionalnych komórek macierzystych, były szeroko badane w modelach chorób i urazów zwierząt z różnym powodzeniem15. Technologie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych wykorzystujące źródła komórek somatycznych oferują kolejną potencjalną drogę do wytwarzania terapeutycznie użytecznych terapii komórkowych o szerokim zakresie zastosowań, przezwyciężając ograniczoną dostępność i obawy etyczne dotyczące wykorzystania komórek embrionalnych i tkanek płodowych16. Jednak kliniczne przełożenie tych wyników okazało się trudnym zadaniem, co pokazały zmagania z leczeniem różnych schorzeń neurologicznych za pomocą podejść terapeutycznych opartych na SC17,18, a także kręta ścieżka do klirensu regulacyjnego. Jako alternatywne podejście, wprowadzenie specyficznych terapii farmakologicznych może modulować liczbę NSC i ułatwić powrót do zdrowia w modelach choroby Parkinsona i udarumózgu 19. Niezależnie od strategii, zrozumienie, jak skutecznie manipulować tymi komórkami, wymaga dostępnego systemu in vitro.
Hodowle NSC mogą być wykonywane albo jako kultury zbiorcze, znane również jako neurosfery, albo jako monowarstwa8,20. Obie techniki są szeroko stosowane, co pozwala na ustalenie określonych warunków hodowli, tj. wykorzystanie naskórkowego czynnika wzrostu (EGF) lub zasadowego czynnika wzrostu fibroblastów (bFGF) jako źródła mitogenu, które zapewniają ekspansję multipotencjalnych prekursorów. Podczas gdy hodowle neurosfery mogą być lepiej przystosowane do badania zdolności rozmnażania klonów izolowanego typu komórki, wykazano, że system wytwarza mieszaną populację komórek podczas ekspansji21. Ponadto zamknięta struktura neurosfer sprawia, że farmakologiczna manipulacja komórkami jest niepraktyczna, a interpretacja wpływu, jaki mogą mieć te czynniki, może być zagmatwana ze względu na mikrośrodowisko ustanowione w samej neurosferze. Z drugiej strony, hodowle jednowarstwowe mogą być stosowane w wysokoprzepustowych badaniach przesiewowych bibliotek małych cząsteczek, zapewniając potężne narzędzie do badania mechanizmów transdukcji sygnału, które regulują wzrost i różnicowanie SC, a także otwiera możliwość odkrycia nowych związków, które są ukierunkowane na tę populację komórek.
W konsekwencji, zdolność do powtarzalnego generowania kultur dorosłych NSC z różnych regionów mózgu może być wykorzystana w szerokim spektrum zastosowań badawczych, począwszy od badań rozwojowych ośrodkowego układu nerwowego (OUN), a skończywszy na odkrywaniu nowych podejść medycyny regeneracyjnej. Przedstawiony tutaj protokół pokazuje, jak przeprowadzić analizę i ocenę potencjału różnicowania SC OUN wyizolowanych z mózgu dorosłego gryzonia.

<table><tbody><tr><td>6-dołkowe naczynia</td> do <td>hodowli tkankowych BD Biosciences</td><td>353934</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-ornityna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-3655</td><td> 5 mg/ml roztwór podstawowy przygotowany w wodzie podwójnie destylowanej (stabilny przez kilka miesięcy w temperaturze -20 &deg; C). Stężenie robocze 0,5 mg/ml w wodzie (stabilne przez 1 miesiąc w temperaturze 4 & stopni; C). </td></tr><tr><td>Fibronektyna</td><td>R& D Systems</td><td>1030-Fn</td><td>Nie mieszaj roztworu podstawowego</td></tr><tr><td>Aparatura filtracyjna</td><td>Corning Life Sciences</td><td>430769</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Mediatech</td><td>10-090-CV</td><td>Patrz uwaga poniżej, aby zapoznać się z kompletnym przygotowaniem pożywki N2</td></tr><tr><td>Apo-transferyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-2036</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I-0516</td><td></td></tr><tr><td>Putrescyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-5780</td><td>1 M roztwór podstawowy w ddH2O (stabilny przy 20 &deg; C przez 6 miesięcy)</td></tr><tr><td>Selenin sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-5261</td><td>500 &micro; M roztwór podstawowy w ddH2O (stabilny przy -20 &deg; C przez 6 miesięcy)</td></tr><tr><td>Progesteron</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-8783</td><td>100 &mikro; M roztwór podstawowy w etanolu (stabilny przy -20&deg; C przez 6 miesięcy)</td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami</td><td>Mediatech</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów (bFGF)</td><td>R& D Systems</td><td>233-FB</td><td>Stężenie robocze 20 ng/ml&nbsp;</td></tr><tr><td>Delta4 (Dll4)R</td><td>& D Systems</td><td>1389-D4</td><td>Stężenie robocze&nbsp; 500 ng/ml</td></tr><tr><td>Angiopoetyna 2 (Ang2)</td><td>R& D Systems</td><td>623-AN</td><td>Stężenie robocze&nbsp; 500 ng/ml</td></tr><tr><td>Inhibitor JAK</td><td>Calbiochem</td><td>420099</td><td>Stężenie robocze 200 nM&nbsp;</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca Albumina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-2058</td><td></td></tr><tr><td>15- i 50-ml Probówki stożkowe</td><td>Corning Life Sciences</td><td>430053, 430829</td><td></td></tr><tr><td>Inne niezbędne przedmioty to: Ogólne narzędzia preparacyjne, w tym żyletka i kleszcze, Dorosły szczur (3-6 miesięcy; Sprague-Dawley lub Long Evans), komora do intruzji CO2, okap z przepływem laminarnym do hodowli komórkowych i inkubator Inkubator (nawilżany, 37 & C, 5% CO2, 5% O2). Uwaga: Aby przygotować kompletną pożywkę N2, do jednej butelki DMEM/F-12 (500 ml) dodać 0,05 g apotransferyny, 0,0125 g insuliny (świeżo rozpuszczonej w 1 ml 10 mM NaOH), 50 &mu; l putrescyny, 30 &mu; l seleninu sodu, 100 &mu; l zapasów progesteronu i 5 ml roztworu penicyliny/streptomycyny. W razie potrzeby dostosuj pH do 7,2. Filtrować-sterylizować i przechowywać w temperaturze 4 & C do 3 tygodni i chronić przed światłem.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Tabela odczynników immunofluorescencyjnych</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>15719</td><td></td></tr><tr><td>Normalna surowica osła (NDS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-9663</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-8787</td><td></td></tr><tr><td>4,6-Diamidino-2-fenyloindol (DAPI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-8417</td><td>5 mg/ml zapas roztwór w metanolu</td></tr><tr><td colspan="4">Tabela przeciwciał pierwotnych</td></tr><tr><td>Nestin</td><td>Chemicon</td><td>MAB353</td><td> Współczynnik rozcieńczenia: 1:400 Gatunek: Mysz IgG1 </td></tr><tr><td>Hes3</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-25393</td><td> Współczynnik rozcieńczenia: 1:100 Gatunek: Królik IgG </td></tr><tr><td>Sox2</td><td>R& Systemy D</td><td>MAB2018</td><td> Współczynnik rozcieńczenia: 1: 100 Gatunki: Mysz IgG2a </td></tr><tr><td>CNPase</td><td>Chemicon</td><td>MAB326</td><td> Współczynnik rozcieńczenia: 1: 200 Gatunek: Mysz IgG1 </td></tr><tr><td>&beta;-tubulina III (TUJ1)</td><td>R& Systemy D</td><td>MAB1195</td><td> Współczynnik rozcieńczenia: 1: 500 Gatunek: Mysz IgG2a </td></tr><tr><td>Glejowe fibrylarne białko kwasowe (GFAP)</td><td>Dako Ameryka Północna</td><td>Z0334</td><td> Współczynnik rozcieńczenia 1:500 Gatunek: Królik </td></tr><tr><td colspan="4">Tabela przeciwciał wtórnych</td></tr><tr><td>Alexa&nbsp; &nbsp; 568</td><td>Invitrogen</td><td>A-21124</td><td> Współczynnik rozcieńczenia: 1:200 Gatunek: Koza anty mysia IgG1 </td></tr><tr><td>Alexa 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-21131</td><td> Współczynnik rozcieńczenia: 1:200 Gatunek: Koza anty mysia IgG2a </td></tr><tr><td>Cy5</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>59883</td><td> Współczynnik rozcieńczenia: 1:200 Gatunek: Koza anty Królik </td></tr></tbody></table>

hodowla nerwowych komórek macierzystych z konwencjonalnych i niekonwencjonalnych regionów mózgu dorosłego gryzonia

Growing Neural Stem Cells from Conventional and Nonconventional Regions of the Adult Rodent Brain

Ostatnie prace pokazują, że regeneracja i nowotworzenie ośrodkowego układu nerwowego (OUN) obejmuje populacje komórek macierzystych (SC) znajdujących się w dorosłym mózgu. Jednak mechanizmy, które te normalnie spokojne komórki wykorzystują do zapewnienia prawidłowego funkcjonowania sieci neuronowych, a także ich rola w powrocie do zdrowia po urazie i łagodzeniu procesów neurodegeneracyjnych są mało poznane. Komórki te znajdują się w regionach określanych jako "nisze", które zapewniają podtrzymujące środowisko obejmujące sygnały modulacyjne zarówno z układu naczyniowego, jak i odpornościowego. Izolacja, utrzymanie i różnicowanie SC OUN w określonych warunkach hodowli, które wykluczają nieznane czynniki, sprawia, że są one dostępne do leczenia środkami farmakologicznymi lub genetycznymi, zapewniając w ten sposób wgląd w ich zachowanie in vivo. W tym miejscu oferujemy szczegółowe informacje na temat metod generowania kultur SC OUN z różnych regionów dorosłego mózgu oraz podejść do oceny ich potencjału różnicowania w neurony, astrocyty i oligodendrocyty in vitro. Technika ta pozwala uzyskać jednorodną populację komórek w postaci kultury jednowarstwowej, którą można wizualizować w celu zbadania poszczególnych SC i ich potomstwa. Co więcej, może być stosowany w różnych systemach modeli zwierzęcych i próbkach klinicznych, będąc wcześniej wykorzystywanym do przewidywania reakcji regeneracyjnych w uszkodzonym układzie nerwowym dorosłego osobnika.

Zidentyfikowanie obszaru zainteresowania, z którego zostaną pobrane neuralne komórki macierzyste, jest krytycznym pierwszym krokiem i zdeterminuje czas potrzebny na uzyskanie konfluentnej płytki komórek. Na przykład SVZ jest klasycznym obszarem neurogennym, a zatem charakteryzuje się wyższą względną proporcją neuralnych komórek macierzystych. Przedstawiona tutaj technika może być jednak stosowana w odniesieniu do innych regionów, które nie są często uznawane za posiadające silny potencjał neurogenny w wieku dorosłym. Na ...

Neuronalne komórki macierzyste pobrane z dorosłego mózgu są coraz częściej wykorzystywane w różnych zastosowaniach, począwszy od podstawowych badań nad rozwojem układu nerwowego, a skończywszy na odkrywaniu potencjalnych zastosowań klinicznych w medycynie regeneracyjnej. To sprawia, że rygorystyczna kontrola warunków izolacji i hodowli stosowanych do hodowli tych komórek ma kluczowe znaczenie dla uzyskania solidnych wyników eksperymentalnych.

Hodowla nerwowych komórek macierzystych z konwencjonalnych i niekonwencjonalnych regionów mózgu dorosłego gryzonia

Recent work demonstrates that central nervous system (CNS) regeneration and tumorigenesis involves populations of stem cells (SCs) resident within the ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest wygenerowanie kultur nerwowych komórek macierzystych z różnych obszarów mózgu dorosłego gryzonia. Osiąga się to poprzez pobranie tkanki z obszaru zainteresowania w celu zbadania obecności i potencjału nerwowych komórek macierzystych. W drugim etapie przetworzyć tkankę na zawiesinę komórkową w celu posiewu jako hodowli jednowarstwowej.Następnie należy wykorzystać określone warunki hodowli do selektywnej namnażania nerwowych komórek macierzystych, potwierdzając ich potencjał do samoodnawiania. Uzyskano wyniki in vitro pokazujące, że nerwowe komórki macierzyste są wielosilne w oparciu o ich potencjał różnicowania oraz to, jak różne czynniki mogą wpływać na ich samoodnawianie się i los. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie neurobiologii i medycyny regeneracyjnej, takie jak to, gdzie znajdują się endogenne neurokomórki macierzyste i jak nimi manipulować.Po raz pierwszy pomyśleliśmy o tej technice, gdy odkryliśmy ścieżki redukcji sygnałów. Pozwoliło nam to zarówno zidentyfikować przypuszczalne endogenne neuros stemcells, jak i regulować ich liczbę. Zastosowaliśmy więc tę wiedzę do stworzenia solidnych kultur tych ko

growing-neural-stem-cells-from-conventional-nonconventional-regions

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Hodowla komórek macierzystych nerwowych z konwencjonalnych i niekonwencjonalnych regionów mózgu dorosłych gryzoni

Niniejszy protokół wideo demonstruje metodę testu neurosfer w celu generowania i namnażania neuralnych komórek macierzystych z obszaru okołokomorowego dorosłej myszy oraz dostarcza wskazówek technicznych pozwalających na uzyskanie powtarzalnych kultur neurosfer.

Izolacja i ekspansja dorosłych komórek macierzystych układu nerwowego myszy z wykorzystaniem testu neurosferowego

Ten film przedstawia metodę izolowania nerwowych komórek macierzystych/progenitorowych z tkanki okołokomorowej rdzenia kręgowego u dorosłych szczurów. Technika ta obejmuje inkubację fragmentów tkanek w roztworze zawierającym enzymy proteolityczne w celu zakłócenia macierzy zewnątrzkomórkowej i uwolnienia komórek. Następnie uwolnione komórki są siane w pożywce zawierającej specyficzne czynniki wzrostu, które zwiększają proliferację neuronalnych komórek macierzystych / progenitorowych i promują...

Izolacja nerwowych komórek progenitorowych łodygi z obszaru okołokomorowego rdzenia kręgowego dorosłego szczura

Ten protokół opisuje nowatorską metodę mechanicznego siekania, która pozwala na ekspansję sferycznych agregatów nerwowych komórek macierzystych i progenitorowych bez dysocjacji do zawieszenia pojedynczej komórki. Utrzymanie kontaktu komórka/komórka pozwala na szybki i stabilny wzrost przez ponad 40 przejść.

Metoda ekspansji stosowana do cGMP dla agregatów ludzkich nerwowych komórek macierzystych i progenitorowych pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych lub tkanki mózgowej płodu

Tutaj opisujemy szczegółowy protokół jednoczesnego generowania kultur neuronalnych komórek prekursorowych, jako przylegających monowarstw lub neurosfer, ze strefy podkomorowej i zakrętu zębatego poszczególnych dorosłych myszy.

Jedna mysz, dwie kultury: izolacja i hodowla dorosłych nerwowych komórek macierzystych z dwóch stref neurogennych poszczególnych myszy

Rdzeń kręgowy dorosłego ssaka zawiera nerwowe komórki macierzyste/progenitorowe (NSPC), które mogą być izolowane i rozwijane w hodowli. Protokół ten opisuje pobieranie, izolację, hodowlę i pasażowanie NSPC generowanych z obszaru okołokomorowego dorosłego rdzenia kręgowego od szczura i od dawców narządów po przeszczepie.

Izolacja nerwowych komórek macierzystych/progenitorowych z obszaru okołokomorowego dorosłego szczura i ludzkiego rdzenia kręgowego

Opisujemy metodę opartą na Fluorescencyjnym Sortowaniu Komórek Aktywowanych (FACS) w celu izolacji nerwowych komórek macierzystych (NSC) i ich potomstwa ze strefy podkomorowej (SVZ) mózgu dorosłej myszy. Stosowany do transgenicznych myszy z fluorescencyjnym wskaźnikiem ubikwitynacji cyklu komórkowego (FUCCI), umożliwia badanie progresji cyklu komórkowego za pomocą obrazowania na żywo.

Sortowanie komórek nerwowych komórek macierzystych i progenitorowych ze strefy podkomorowej dorosłej myszy i obrazowanie na żywo ich dynamiki cyklu komórkowego

Ustanowienie systemów hodowli do ekspansji dorosłych nerwowych komórek macierzystych (aNSC) pozwala na badanie i zastosowanie aNSC w terapii. Strefa podmodzelowa (SCZ) została niedawno uznana za nowy region tworzący neuroblasty u dorosłych myszy. W tym miejscu opisano metody izolacji, ekspansji i różnicowania SCZ-aNSC.

Izolacja i hodowla dorosłych nerwowych komórek macierzystych ze strefy podmodzelowej myszy

Mózg psa jest cennym modelem do badania neurogenezy dorosłych. Przedstawiono tutaj protokoły izolowania i namnażania nerwowych komórek prekursorowych hipokampa dorosłych psów z pierwotnej tkanki mózgowej.

Izolacja i ekspansja prekursorów neuronalnych hipokampa u dorosłych psów

Tutaj wprowadzamy nowatorską technikę mikrochirurgiczną do izolacji nerwowych komórek macierzystych z wyniosłości zwojowej zarodka myszy E13.

Izolacja i hodowla embrionalnych mysich nerwowych komórek macierzystych

Metoda izolacji nerwowych komórek macierzystych i komórek progenitorowych oligodendrocytów z mózgów żywych szczurów jest tutaj przedstawiona w szczegółach eksperymentalnych. Pozwala to na wielokrotne pobieranie tych komórek od tych samych zwierząt bez uszczerbku dla ich dobrostanu.

Metoda "dojenia mózgu" do izolacji nerwowych komórek macierzystych i komórek progenitorowych oligodendrocytów od żywych szczurów

Tutaj opisujemy system nukleofekcji zaprojektowany w celu zwiększenia efektywności dostarczania genów w rozszerzonych nerwowych komórkach macierzystych (NSC) wyizolowanych z dorosłej mysiej strefy podkomorowej. Wyniki pokazują, że metoda ta znacznie poprawia perturbację genów w NSC, przewyższając skuteczność tradycyjnych protokołów transfekcji i zwiększając wskaźnik przeżywalności komórek.

Izolacja, ekspansja i nukleofekcja nerwowych komórek macierzystych z dorosłej mysiej strefy podkomorowej

Poznaj metodę hodowli nerwowych komórek macierzystych z różnych regionów mózgu dorosłego gryzonia. Technika ta pozwala badać ich potencjał samoodnawiania i różnicowania w kontekście neurobiologii oraz medycyny regeneracyjnej.

Hodowla nerwowych komórek macierzystych z konwencjonalnych i niekonwencjonalnych regionów mózgu dorosłego gryzonia

Przeglądaj więcej filmów