Hodowla nerwowych komórek macierzystych z konwencjonalnych i niekonwencjonalnych regionów mózgu dorosłego gryzonia

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest wygenerowanie kultur nerwowych komórek macierzystych z różnych obszarów mózgu dorosłego gryzonia. Osiąga się to poprzez pobranie tkanki z obszaru zainteresowania w celu zbadania obecności i potencjału nerwowych komórek macierzystych. W drugim etapie przetworzyć tkankę na zawiesinę komórkową w celu posiewu jako hodowli jednowarstwowej.

Następnie należy wykorzystać określone warunki hodowli do selektywnej namnażania nerwowych komórek macierzystych, potwierdzając ich potencjał do samoodnawiania. Uzyskano wyniki in vitro pokazujące, że nerwowe komórki macierzyste są wielosilne w oparciu o ich potencjał różnicowania oraz to, jak różne czynniki mogą wpływać na ich samoodnawianie się i los. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie neurobiologii i medycyny regeneracyjnej, takie jak to, gdzie znajdują się endogenne neurokomórki macierzyste i jak nimi manipulować.

Po raz pierwszy pomyśleliśmy o tej technice, gdy odkryliśmy ścieżki redukcji sygnałów. Pozwoliło nam to zarówno zidentyfikować przypuszczalne endogenne neuros stemcells, jak i regulować ich liczbę. Zastosowaliśmy więc tę wiedzę do stworzenia solidnych kultur tych komórek z różnych obszarów mózgu.

Zbadaj ich właściwości i zadaj pytanie, czy rzeczywiście są to komórki macierzyste? Właściwe przygotowanie naczynia hodowlanego ma kluczowe znaczenie na dwa dni przed planowaną sekcją: posmaruj naczynia poli L ornityną w ilości 75 mikrogramów na mililitr. Następnie inkubować płytki przez noc następnego dnia, odessać poli L ornitynę i umyć każdą studzienkę dwa razy trzema mililitrami PBS przez pięć minut na mycie.

Płytki można następnie przechowywać w inkubatorze przez okres do trzech tygodni Po usunięciu ostatniego płukania dodaj włókno rozcieńczone w ilości 1 do 250 w PBS przez delikatne pipetowanie. Uważaj, aby nie mieszać nadmiernie roztworu. Następnie inkubuj płytki przez noc w dniu sekcji.

Odessać fibronektynę i umyć naczynia dwukrotnie za pomocą PBS. Z powrotem płytki z ostatnim płukaniem PBS należy umieścić w inkubatorze i poczekać, aż tkanka uległa dysocjacji. Niewykorzystane płytki można przechowywać w inkubatorze do tygodnia, ale nie należy dopuścić do ich wyschnięcia i nie wstrząsać.

Demonstracja tego protokołu jest skalowana do trzech dorosłych szczurów. Po pierwsze, pamiętaj, aby schłodzić blok do sekcji mózgu na lodzie przed eutanazją pierwszego szczura. Następnie przygotuj 15-mililitrową stożkową rurkę na lodzie z pięcioma mililitrami N, dwóch średnich i zasadowych FGF.

Po usunięciu mózgu od szczura poddanego eutanazji, umieść mózg na 10-centymetrowej szalce Petriego zawierającej lodowaty PBS. Następnie przenieś mózg do drugiego naczynia z PBS bez żadnych resztek włosów lub krwi. Teraz umieść mózg w schłodzonym bloku sekcyjnym i włóż jedną nową czystą żyletkę do bloku w pobliżu obszaru zainteresowania, z którego zostaną wygenerowane komórki.

Następnie włóż drugą czystą żyletkę. Trzy milimetry rozpieszczają pierwszą żyletkę. Ostrożnie podnieś ostrza z bloku, zabierając ze sobą interesującą Cię sekcję.

Odsuń sekcję od ostrza, zanurzając ją w PBS. Teraz zbierz obszar zainteresowania za pomocą kleszczy numer pięć. W tym przykładzie sekcja zawiera spoidło przednie. Pewny.

Zebrać skrawek do stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów zawierającej pięć mililitrów N dwa podłoża z zasadowym FGF. Następnie zmniejsz objętość roztworu do jednego do dwóch mililitrów. Następnie w kapturze do hodowli komórkowej zanurz jednomililitrową końcówkę pipety na dnie stożka i użyj około 20 przepływów roztworu, aby mechanicznie zdysocjować tkankę.

Przerwij podawanie, gdy roztwór stanie się jednorodny i pozostaw go na kilka minut, aby większe niepowiązane tkanki osiadły na dnie. Teraz przenieś jednorodny supernatant bez żadnych kawałków tkanki do stożkowej probówki zawierającej 8,5 mililitra uzupełnionej pożywki i dwóch pożywki. Wymieszaj zawartość tubki i przygotuj przygotowaną szóstkę.

Talerz studni. Usuń PBS z dołków, a następnie dodaj trzy mililitry mieszaniny komórek na studzienkę do trzech dołków w ciągu następnych 10 do 14 dni hodowli. Zastępować pożywkę świeżo uzupełnionym N dwa co drugi dzień, zaczynając 24 godziny po posianiu co drugi dzień, dodawać nową objętość suplementów w N dwa.

Pożywka do pożywki już na komórkach. Staranność w zakresie warunków pożywki jest niezbędna, aby komórki pozostały niezróżnicowane i umożliwiły ich ekspansję. Po pierwszej zmianie pożywki pozostała duża ilość resztek komórkowych wraz z naczyniami krwionośnymi.

Jednak w ciągu następnych kilku dni widoczne stały się kolonie odrębnych proliferujących komórek macierzystych. Obecne były również bardziej wydłużone populacje komórek wrzecionowatych. Nie są to nerwowe komórki macierzyste i ostatecznie zostały wyprzedzone w miarę namnażania się nerwowych komórek macierzystych.

W ciągu następnych dwóch tygodni nerwowe komórki macierzyste rosły gęściej, aż osiągnęły konfluencję. Kultury te wybarwiały się pozytywnie na obecność wielu markerów komórek macierzystych, w tym SOX 2, hesi i nest. W ten sposób daje pewność, że populacje komórek, które zostały wyselekcjonowane i rozszerzone, są rzeczywiście neuronalnymi komórkami macierzystymi.

Dalsze potwierdzenie pojawiło się po wycofaniu FGF z pożywki, co pozwoliło komórkom różnicować się przez 10 dni w neurony, astrocyty i wszystkie cyty cendra. Wywołanie różnicowania. Zastąp uzupełnione N dwa podłoże nieuzupełnionym N dwa, pożywkę i hoduj komórki w ten sposób przez 10 dni, zastępując N dwa co 48 godzin po 10 dniach zassać pożywkę i utrwalić komórki dwoma mililitrami 4% para formaldehydu na studzienkę przez 20 minut.

Wypłukać utrwalacz trzema mililitrami PBS dwa razy przez pięć minut na pranie. Po zassaniu drugiego płukania dodaj dwa mililitry PBS zawierającego 5% normalnej surowicy osła i 0,1% tritton X 100, aby perme i zablokować komórki, podczas gdy komórki inkubują w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Przygotować pierwszorzędową mieszaninę przeciwciał w PBS zawierającą 5% NDS.

W tym przykładzie przeciwciało anty T UJ one jest stosowane do identyfikacji neuronów, podczas gdy przeciwciała GFAP i CPA są używane do wizualizacji odpowiednio astrocytów i oligodendrocytów. Po 20 minutach odessać roztwór blokujący i dodać do każdego 1,5 mililitra mieszaniny przeciwciał pierwotnych. Dobrze inkubuj komórki.

Dodać temperaturę pokojową przez 90 minut po 90 minutach, przemyć komórki dwiema kąpielami PBS, a następnie jedną aplikacją PBS zawierającą 5% NDS użyć trzech mililitrów roztworu i pięciominutowych kąpieli. Po usunięciu ostatniego płukania nałóż na każdy 1,5 mililitra przeciwciał drugorzędowych w PBS zawierających 5% NDS. Cóż, następnie umieść talerz w ciemności, dodaj temperaturę pokojową i odczekaj 40 minut.

Po 40 minutach zastąp wtórną dwoma mililitrami świeżo przygotowanej plamy DPI i odczekaj trzy minuty. Po zassaniu roztworu DPI umyj komórki trzykrotnie trzema mililitrami PBS przez pięć minut na pranie. Komórki są następnie gotowe do mikroskopii Po wykonaniu tej procedury.

Inne metody, takie jak western blot, można wykonać, aby przyjrzeć się zmianom w ekspresji i fosforylacji białek, które wynikają z leczenia farmakologicznego lub w trakcie różnicowania komórek. Po opracowaniu tej techniki utorowało to drogę naukowcom w dziedzinie neuronauki do testowania nowych metod, które wdrożyli w badaniach na kilku różnych gatunkach, w tym myszach, szczurach, a nawet naczelnych.