Dwufotonowe obrazowanie wapnia u myszy poruszających się w środowisku rzeczywistości wirtualnej
20 lutego 2014
Tutaj opisujemy procedury eksperymentalne związane z dwufotonowym obrazowaniem kory myszy podczas zachowania w środowisku wirtualnej rzeczywistości.
Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest wykonanie kluczowych aspektów przewlekłego obrazowania dwóch fotonów u myszy, badając środowisko rzeczywistości wirtualnej. Osiąga się to poprzez modyfikację mikroskopu dwufotonowego w celu uzyskania szybkiego i stabilnego obrazowania u zachowujących się myszy. Następnie ustawiana jest bieżnia wspomagana powietrzem zdolna do śledzenia lokomocji.
Następnie przygotowywane jest środowisko wirtualnej rzeczywistości, które wykorzystuje projektor LED zsynchronizowany z mikroskopem w celu zminimalizowania wycieku światła. W efekcie uzyskuje się dobre i stabilne nagrania obrazu dzięki redukcji artefaktów ruchu, zmniejszeniu przecieku światła oraz zminimalizowaniu krawędzi uszkodzeń fotograficznych. Chociaż metoda ta może być stosowana do pomiaru neuroaktywności podczas nawigacji w środowisku rzeczywistości wirtualnej, można ją również łatwo dostosować do wielu różnych paradygmatów behawioralnych, które wymagają stymulacji wizualnej.
Wszystkie procedury na zwierzętach zostały zatwierdzone i przeprowadzone zgodnie z wytycznymi działu weterynaryjnego Canton Basil sta. Dwa mikroskopy fotonowe używane w tych eksperymentach składają się z głowicy skanującej składającej się z ośmio- lub dwunastokilohercowego skanera rezonansowego i standardowego galwanometru. Umożliwia to wyświetlanie klatek na sekundę 40 lub 60 Hz przy rozdzielczości 750 razy 400 pikseli i zmniejsza zniekształcenia obrazu wywołane ruchem mózgu, fotowybielanie i fototoksyczność.
Piezoelektryczny krokowiec Z o dużej prędkości służy do sekwencyjnego pozyskiwania obrazów z przeplotem czasu na wielu głębokościach. Mechaniczny wykrawacz służy do zmniejszania ekspozycji lasera na tkankę w punktach zwrotnych ścieżki skanowania, wykrawacz musi być regulowany, aby ustawić jego szerokość. W zależności od amplitudy skanera rezonansowego podłącz rurkę doprowadzającą powietrze o średnicy wewnętrznej co najmniej 10 milimetrów do uchwytu kuli bieżni i umieść rurkę BLE między głównym dopływem powietrza a uchwytem piłki, aby zmniejszyć hałas.
Umieść kulkę z pianki polistyrenowej o średnicy 20 centymetrów w specjalnie zaprojektowanym i wydrukowanym w 3D uchwycie na kulki. Jeśli paradygmat behawioralny wymaga tylko poruszania się do przodu i do tyłu, włóż szpilkę, taką jak igła podskórna o rozmiarze 19, z boku piłki. Aby ograniczyć ruch piłki w osi poziomej, użyj jednej lub dwóch optycznych myszy komputerowych do śledzenia ruchu piłki odpowiednio wokół dwóch lub wszystkich trzech osi.
Aby przygotować środowisko wirtualnej rzeczywistości, użyj projektorów LED lub ekranów komputerowych z podświetleniem LED do wyświetlania. Zintegruj obwód bramkowania w celu szybkiego migotania diod LED podczas obrazowania. Częstotliwość migotania 24 kiloherców jest o rzędy wielkości wyższa od progu fuzji migotania, powyżej którego migotanie nie jest już odczuwalne przez zwierzę.
Dostosuj dokładną częstotliwość migotania i cykl pracy, aby zsynchronizować strumień świetlny projektora z punktami obrotu skanera rezonansowego w celu śledzenia źrenicy, użyj kamery wideo opartej na CMO. Upewnij się, że kamera nie zawiera filtra blokującego podczerwień. Około dwa do trzech tygodni po wstrzyknięciu genetycznego wskaźnika wapnia i wszczepieniu okienka czaszkowego, użyj oświetlenia fluorescencyjnego epi, aby sprawdzić implant okna czaszki pod kątem jasności i ekspresji.
Wyraźnie widoczne i ostro zarysowane. Granice powierzchownych naczyń krwionośnych są dobrą wskazówką, że implant okienny nadaje się do obrazowania jeden do dwóch dni później. Aby przeprowadzić eksperyment z dwoma fotonami, zmierz i dostosuj moc lasera do wartości poniżej 50 miliwatów w próbce.
Następnie włącz dopływ powietrza do bieżni sferycznej. Następnie przymocuj zwierzę do kulistej bieżni. Pierwsze kilka razy mysz jest zamocowana w głowicy.
Proces ten można złagodzić, krótko uspokajając zwierzę izofluorem. Gdy zwierzę przyzwyczai się do zabiegu, montaż można zwykle wykonać bez sedacji. Należy pamiętać, że bardzo ważne jest, aby zminimalizować stres zwierzęcia podczas tej procedury.
Następnie umieść system wyświetlania obrazu jak najbliżej zwierzęcia, aby nadal umożliwiać dostęp do zwierzęcia. Upewnij się, że implant okna czaszki jest wolny od brudu i w razie potrzeby wyczyść go wodą, nałóż przezroczysty żel ultradźwiękowy jako medium zanurzeniowe między oknem czaszki a obiektywem zanurzenia w wodzie, aby osłonić światło. Owiń kawałek czarnej taśmy wokół celu i drążka na głowę.
Przesuń arenę środowiska wirtualnego do jej ostatecznej pozycji i dostosuj kamerę wideo do śledzenia uczniów. Na koniec ustaw blanker laserowy tak, aby odpowiadał amplitudzie skanowania używanej podczas eksperymentu i rozpocznij rejestrowanie danych po zakończeniu eksperymentów. Poddaj zwierzę eutanazji zgodnie z wytycznymi swojej instytucji.
Jakość obrazu w dwufotonowym obrazowaniu wapniowym populacji komórek znakowanych genetycznym wskaźnikiem wapnia w dużej mierze zależy od jakości implantu okna czaszkowego, jak wykazano tutaj podczas sprawdzania okna czaszki pod kątem jasności po wstrzyknięciu wirusa, nie powinna być widoczna ziarnina tkanki ani odrost kości. Ponadto wzór powierzchownych naczyń krwionośnych powinien pozostać niezmieniony, a granice układu krwionośnego powinny być ostro określone. Jednocześnie BOI znakowanych komórek powinno być wyraźnie widoczne pod mikroskopem epifluorescencyjnym.
Idealnie byłoby, gdyby preparat był na tyle stabilny, że zniekształcenia dwóch obrazów fotonowych wywołane lokomocją, jaką porusza mysz, nie są widoczne na obrazie po rejestracji klatki. Wyciek światła z systemu stymulacji wizualnej można całkowicie wyeliminować, prawidłowo synchronizując strumień świetlny projektora z punktami obrotu skanera rezonansowego. Gdy dane nie są pozyskiwane, częstotliwość migotania źródła światła powinna być dwukrotnie większa niż częstotliwość skanowania.
W tym przykładzie blanker został usunięty, aby zilustrować efekt wycieku światła pokazany w pomarańczowych polach podczas stymulacji wizualnej. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykonywać podwójne czynności w obrazowaniu, zachowaniu myszy, poruszaniu się w środowisku rzeczywistości wirtualnej. Oprócz skonfigurowania systemów obrazowania i rzeczywistości wirtualnej, jak opisano tutaj, kluczem do sukcesu w tych eksperymentach jest opanowanie techniki implantacji okien czaszkowych.
Czysty implant jest warunkiem wstępnym wysokiej jakości obrazów i stabilnych nagrań.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł opisuje procedury eksperymentalne dotyczące przewlekłego obrazowania dwufotonowego kory mózgu myszy podczas nawigowania zwierząt w środowisku wirtualnej rzeczywistości. Metodologia koncentruje się na minimalizacji artefaktów i poprawie jakości obrazu podczas badań behawioralnych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Techniki obrazowania
- Badania behawioralne
Wprowadzenie
- Przewlekłe obrazowanie dwufotonowe umożliwia obserwację aktywności neuronalnej u żywych osobników.
- Środowiska rzeczywistości wirtualnej mogą dostarczać kontrolowane bodźce do eksperymentów behawioralnych.
- Minimalizacja przecieków światła i artefaktów ruchowych jest kluczowa dla uzyskania wysokiej jakości obrazowania.
- Metody adaptacyjne mogą być stosowane w różnych paradygmatach behawioralnych.
Cel badania
- Zbadanie neuroaktywności u myszy podczas nawigacji w środowisku rzeczywistości wirtualnej.
- Opracowanie stabilnego układu obrazowania umożliwiającego ruch.
- Pogłębienie zrozumienia funkcji mózgu w odpowiedzi na bodźce wzrokowe.
Zastosowane metody
- Modyfikacja mikroskopu dwufotonowego w celu szybkiego obrazowania.
- Konfiguracja bieżni z poduszką powietrzną do śledzenia lokomocji.
- Przygotowanie zsynchronizowanego środowiska wirtualnej rzeczywistości z wykorzystaniem projektora LED.
- Wdrożenie technik redukcji artefaktów ruchowych i przecieków światła.
Główne wyniki
- Uzyskano stabilne i wysokiej jakości nagrania obrazów.
- Ograniczenie artefaktów ruchowych poprawiło wiarygodność pomiarów aktywności neuronalnej.
- Metoda jest wszechstronna i może być dostosowana do różnych badań behawioralnych.
- Pomyślnie zademonstrowano pomiar aktywności neuronalnej podczas zadań nawigacyjnych.
Wnioski
- Zmodyfikowany układ obrazowania jest skuteczny w badaniu aktywności mózgu u myszy w trakcie wykonywania zadań.
- Środowiska wirtualnej rzeczywistości dostarczają cennych informacji na temat odpowiedzi neuronalnych na bodźce.
- Podejście to może być wykorzystane w szerokim zakresie paradygmatów eksperymentalnych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Metoda ta umożliwia chroniczny, wysokiej wierności monitoring aktywności neuronalnej u myszy w trakcie zachowań, wspierając walidację celu oraz ograniczanie ryzyka mechanistycznego w procesie odkrywania leków w neurobiologii. Dzięki stabilizacji obrazowania dwufotonowego podczas lokomocji, metoda ta zwiększa pewność prognostyczną w badaniach nad modulacją szlaków. Podejście to łączy wyniki in vitro z funkcjonalnymi odczytami in vivo, zwiększając ciągłość translacyjną terapii ukierunkowanych na ośrodkowy układ nerwowy.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biopharmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez analizę dynamiki wapnia specyficznej dla danego typu komórek podczas nawigacji ukierunkowanej na cel.
- Wartość operacyjna: Redukuje niejednoznaczność mechanistyczną poprzez powiązanie aktywności populacji neuronów z określonymi wynikami behawioralnymi w kontrolowanym paradygmacie VR.
- Wartość prognostyczna: Wspiera selekcję projektów w portfolio, dostarczając mierzalnych i powtarzalnych odczytów neurofizjologicznych dotyczących zaangażowania celu.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Gotowość do analizy: Przygotowuje zwalidowane systemy biologiczne do późniejszego przesiewania związków poprzez ustanowienie stabilnych okien obrazowania z minimalną liczbą artefaktów.
- Wynik ilościowy: Umożliwia pomiary zmiennych zależnych w oparciu o fluorescencję (ΔF/F), co wspiera analizę kinetyczną oraz analizę zależności dawka-odpowiedź.
- Skalowalność: Pozwala na ponowne wykorzystanie platformy w różnych paradygmatach behawioralnych dzięki zsynchronizowanej projekcji LED i infrastrukturze śledzenia ruchu.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie dla chorób: Umożliwia badanie dysfunkcji obwodów neuronalnych w modelach istotnych dla wskazań neuropsychiatrycznych i neurodegeneracyjnych.
- Ciągłość translacyjna: Łączy mechanizmy wczesnego odkrywania z walidacją przedkliniczną poprzez spójne, podłużne odczyty aktywności neuronalnej.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Wspiera podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go), wykazując, czy modulacja celu wywołuje oczekiwane efekty na poziomie obwodów podczas zachowania.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z kontinuum procesu odkrywania leków – od weryfikacji hipotez po optymalizację wiodących związków – dostarczając odczytów mechanistycznych, które pomagają w wyborze celu terapeutycznego oraz priorytetyzacji związków.
- Biologia odkrywcza: Wspiera wyjaśnianie szlaków sygnałowych i walidację celów poprzez umożliwienie mapowania aktywności specyficznej dla poszczególnych komórek podczas zadań nawigacyjnych.
- Przesiewanie: Zapewnia gotowość testów oraz powtarzalne wyniki ilościowe, niezbędne do wiarygodnej oceny związków w programach dotyczących OUN.
- Analityka: Dostarcza pomiary ΔF/F oraz zsynchronizowane w czasie korelacje behawioralne, które umożliwiają statystyczne porównanie warunków eksperymentalnych.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość od etapu odkryć do prac przedklinicznych dzięki stabilnemu, przewlekłemu obrazowaniu genetycznie zdefiniowanych populacji neuronów.
- Wykorzystanie w skali przedsiębiorstwa: Tworzy wielokrotnego użytku platformę obrazowania, którą można dostosować do różnorodnych paradygmatów stymulacji wizualnej w wielu projektach.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w zakresie modulacji celu poprzez redukcję szumu wynikającego z artefaktów ruchowych i przecieków światła.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność i standaryzację dzięki zsynchronizowanemu wygaszaniu lasera oraz śledzeniu źrenicy.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową poprzez zmniejszenie odsetka niepowodzeń w późniejszych etapach programów CNS dzięki wczesnemu ograniczaniu ryzyka mechanistycznego.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację związków z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o funkcjonalne efekty w obwodach neuronalnych, a nie tylko o powinowactwo wiązania.
Uwagi dotyczące implementacji
- Wymaga doświadczenia w chirurgii okna czaszkowego, ekspresji genetycznych wskaźników wapnia oraz kalibracji systemu dwufotonowego.
- Zależne od wysokiej prędkości skanowania rezonansowego, piezoelektrycznego przesuwania w osi Z oraz systemów projekcji LED z układami bramkowania.
- Wymaga standaryzacji międzyzespołowej w zakresie przygotowania chirurgicznego, treningu behawioralnego i potoków przetwarzania obrazu.
- Należy uwzględnić adaptacje specyficzne dla modelu w zakresie unieruchomienia głowy, mechaniki bieżni oraz zakresu pola widzenia.
- Ograniczenia praktyczne obejmują okno żywotności chirurgicznej, stabilność ekspresji wskaźnika oraz podatność na resztkowe artefakty ruchowe pomimo korekcji.
