Name: Dwufotonowe obrazowanie wapnia u myszy poruszających się w środowisku rzeczywistości wirtualnej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-20T22:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: Poznaj dwufotonowe obrazowanie wapnia u myszy w rzeczywistości wirtualnej. Ta metoda pozwala na stabilne rejestrowanie aktywności neuronowej podczas nawigacji, minimalizując artefakty ruchu i przecieki światła.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Instytut Badań Biomedycznych im. Friedricha Mieschera, Towarzystwo Maxa Plancka oraz Human Frontiers Science Program.

Wszystkie procedury na zwierzętach zostały zatwierdzone i przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Departamentu Weterynaryjnego Kantonu Bazylea-Miasto.
1. Konfiguracja sprzętu i oprogramowania
<ol>
	<li>Konfiguracja dwufotonowego mikroskopu skaningowego:
	<ol>
		<li>Użyj impulsowego lasera na podczerwień jako źródła oświetlenia (szerokość impulsu <120 fs).</li>
		<li>Użyj głowicy skanującej składającej się ze skanera rezonansowego 8 lub 12 kHz i standardowego galwanometru. nuta: Umożliwia to częstotliwość odświeżania 40 lub 60 Hz przy rozdzielczości 750 x 400 pikseli. Wysoka liczba klatek na sekundę ma kluczowe znaczenie dla zminimalizowania zniekształceń obrazu wywołanych ruchem mózgu. Co więcej, szybkie skanowanie rezonansowe skutkuje wyższą wydajnością sygnału i zmniejszafotobielenie16 i fototoksyczność.</li>
		<li>Użyj piezoelektrycznego szybkiego krokowca Z, aby sekwencyjnie rejestrować obrazy z przeplotem czasowym na wielu głębokościach. nuta: Jest to opcjonalne i służy do zwiększenia wydajności danych kosztem liczby klatek na sekundę.</li>
		<li>Użyj mechanicznego wykrawacza, aby zmniejszyć ekspozycję lasera na tkankę. Dostosuj szerokość zaślepiacza w zależności od amplitudy skanera rezonansowego. nuta: Ze względu na sinusoidalny charakter ścieżki skanowania skanera rezonansowego, wiązka laserowa porusza się stosunkowo wolno w punktach realizacji skanowania. Aby zapobiec uszkodzeniu tkanki w tych punktach zwrotnych, w których ekspozycja lasera jest największa, do płaszczyzny ogniskowej między skanem a soczewkami rurki wprowadza się mechaniczny wygaszacz, który zatrzymuje wiązkę laserową. </li>
		<li>Do akwizycji danych należy użyć szybkiego digitizera (800 MHz) w połączeniu z programowalną matrycą bramek (FPGA). nuta: Górnoprzepustowy układ FPGA filtruje i dzieli sygnał PMT na piksele. Połączenie filtra górnoprzepustowego w FPGA i skutecznego filtra dolnoprzepustowego we wzmacniaczu PMT daje w efekcie filtr pasmowo-przepustowy wyśrodkowany mniej więcej wokół częstotliwości powtarzania lasera (80 MHz). Przykładowy kod FPGA jest dostarczany jako uzupełnienie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Konfiguracja bieżni wspomaganej powietrzem w oparciu o projekt Dombeck i współpracowników2
	<ol>
		<li>Podłącz uchwyt kulowy do przewodu doprowadzającego powietrze za pomocą rurki doprowadzającej powietrze o średnicy wewnętrznej co najmniej 10 mm. Zmaksymalizuj przekrój wlotu powietrza do uchwytu kulowego i umieść wystarczającą ilość rurki między głównym dopływem powietrza a uchwytem kulowym. nuta: Zwiększony przekrój i zwiększona długość przewodu doprowadzającego powietrze zmniejsza generowanie hałasu.</li>
		<li>Umieść kulkę z pianki polistyrenowej (o średnicy 20 cm) w specjalnie zaprojektowanym i wydrukowanym w 3D uchwycie na kulki.</li>
		<li>Jeśli paradygmat behawioralny wymaga tylko poruszania się do przodu (i do tyłu), ogranicz ruch piłki do osi poziomej (skoku), wbijając szpilkę (np. igłę podskórną 19 G) z boku piłki. nuta: Zazwyczaj zwierzęta znacznie szybciej przystosowują się do konfiguracji w tym paradygmacie zmniejszonej rotacji.</li>
		<li>Śledź ruch piłki za pomocą jednej lub dwóch optycznych myszy komputerowych w celu wykrycia ruchu wokół odpowiednio dwóch lub wszystkich trzech osi. nuta: Myszy komputerowe powinny w idealnym przypadku działać z diodą podczerwieni, aby jak najmniejsze zakłócenia w obrazowaniu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Konfiguracja środowiska rzeczywistości wirtualnej
	<ol>
		<li>Przygotuj środowisko wirtualnej rzeczywistości. nuta: Jako uzupełnienie dostarczane jest przykładowe środowisko oparte na Panda3D, darmowym silniku gry. Obiekty środowiska wirtualnego są generowane za pomocą Wings3D, narzędzia do modelowania 3D o otwartym kodzie źródłowym. Przykładowy program odczytuje informacje o położeniu na karcie akwizycji danych i przekształca je w ruch w środowisku wirtualnym. Kod wykonuje również transformację nieliniową niezbędną do rzutowania środowiska na ekran toroidalny. Szczegółowa budowa ekranu toroidalnego została opisana w innym miejscu14,17. </li>
		<li>Użyj projektorów LED lub ekranów komputerowych z podświetleniem LED do wyświetlania środowiska wirtualnego. Zintegruj obwód bramkowania w celu szybkiego migotania diod LED podczas obrazowania. nuta: Nieodłącznym problemem w obrazowaniu dwufotonowym podczas stymulacji wzrokowej jest wyciek światła pochodzący z systemu stymulacji wzrokowej, który można zredukować poprzez osłonę obiektywu. Jednak wyciek światła z systemu stymulacji wizualnej może być całkowicie wyeliminowany poprzez synchronizację strumienia świetlnego projektora z punktami zwrotnymi skanera rezonansowego (gdy dane nie są pozyskiwane), tak jak ma to miejsce w przypadku aren LED używanych do stymulacji wzrokowej podczas obrazowania u Drosophila18. Powoduje to efektywną, szybką zmianę stymulacji wzrokowej i akwizycji danych (patrz rysunek 2). Częstotliwość migotania (24 kHz) jest o rzędy wielkości wyższa od progu fuzji migotania, powyżej którego migotanie nie jest już odczuwalne przez zwierzę. Schemat obwodu elektronicznego tej modyfikacji komercyjnego projektora LED pokazano na rysunku 3.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Śledzenie źrenic
	<ol>
		<li>Użyj kamery wideo opartej na CMOS (30 kl./s) do śledzenia pozycji źrenicy. Upewnij się, że kamera nie zawiera filtra blokującego podczerwień. nuta: Źrenica jest widoczna z wysokim kontrastem podczas nagrań ze względu na rozproszone światło z dwufotonowego lasera wzbudzającego wychodzącego przez oko. Położenie i średnica źrenicy są uzyskiwane w czasie rzeczywistym za pomocą specjalnie zaprogramowanego oprogramowania opartego na projekcie Sakatani i Isa19. </li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Wstrzyknięcie genetycznego wskaźnika wapnia i implantu okiennego
Wstrzyknięcie wskaźnika wapnia20 i implantacja okna czaszkowego21 są wykonywane zgodnie z wcześniejszym opisem z następującymi dodatkami:
<ol>
	<li>Wstrzyknąć wirusa do obszaru zainteresowania za pomocą szklanej pipety iniekcyjnej wypełnionej roztworem wirusa i podłączonej do ciśnieniowego systemu iniekcyjnego. Dostosuj ciśnienie w zależności od średnicy wewnętrznej pipety, zwykle ok. 70-140 mbar, aby wstrzyknąć około 100 nl roztworu wirusa w ciągu 1-2 minut. Należy stosować impulsy iniekcyjne o małej objętości dostarczane z niską częstotliwością (impulsy 0,05 sekundy przy 2 Hz), aby zapobiec przelaniu się wirusa wzdłuż pipety podczas wstrzykiwania. nuta: W celu monitorowania objętości wstrzyknięcia, pipetę można oznaczyć pod mikroskopem stereoskopowym na małych, równomiernie rozmieszczonych odcinkach (np. 0,5 mm). Przemieszczenie menisku między oznaczeniami można następnie wykorzystać do oszacowania wstrzykniętej objętości.</li>
	<li>Kilka tygodni po wstrzyknięciu powinno to spowodować powstanie bolusa z gęsto znakowanych komórek o średnicy około 500 μm. Skuteczność ekspresji GECI w obszarze zainteresowania zależy od wyboru kombinacji GECI i promotora, a także od zakaźnego miana i serotypu zastosowanego rekombinowanego AAV. nuta: Jako reprezentatywny przykład, wstrzyknięcie AAV2 / 1-EF1α-GCaMP5 z mianem wirusa 8 x 1012 GC / ml do pierwszorzędowej kory wzrokowej myszy powoduje zadowalającą ekspresję po około dwóch tygodniach od wstrzyknięcia (Figura 1).</li>
	<li>Pałąk na głowę nie powinien zasłaniać pola widzenia myszy, ale powinien być wystarczająco sztywny, aby umożliwić stabilne obrazowanie podczas zachowania. Zazwyczaj wymaga to dwóch punktów mocowania po obu stronach pałąka górnego (patrz rysunek 1). Aby mocno przymocować pałąk do czaszki, upewnij się, że zmaksymalizujesz i wysuszysz obszar odsłoniętej czaszki, w którym zostanie przymocowany pałąk. Dodatkowo za pomocą skalpela lub strzykawki podrap czaszkę, aby utworzyć powierzchowne rowki, zwiększając w ten sposób powierzchnię do klejenia. Przykryj kość klejem tkankowym cyjanoakrylowym przed przymocowaniem pręta do głowy cementem dentystycznym.</li>
</ol>
3. Procedura eksperymentalna
<ol>
	<li>Dwa do trzech tygodni po wstrzyknięciu wirusa sprawdź implant okna czaszki pod kątem jasności i ekspresji w oświetleniu epifluorescencyjnym. Wyraźnie widoczne i ostro zaznaczone granice powierzchownych naczyń krwionośnych są dobrą wskazówką, że implant okienka nadaje się do obrazowania (patrz ryc. 1).</li>
	<li>Zmierz i dostosuj moc lasera do wartości poniżej 50 mW na próbce.</li>
	<li>Włącz dopływ powietrza do bieżni sferycznej.</li>
	<li>W celu unieruchomienia głowy pod mikroskopem należy krótko znieczulić zwierzę izofluranem, aby zmniejszyć stres. Umieść zwierzę w pojemniku do znieczulenia izofluranem i poczekaj, aż zwierzę przestanie się poruszać (około 10 sekund). Usuń zwierzę i natychmiast przymocuj je głową pod mikroskopem.</li>
	<li>Ustawić system wyświetlania obrazu jak najbliżej zwierzęcia, aby nadal umożliwiać dostęp do zwierzęcia. Im mniej kontaktu wzrokowego zwierzę ma z eksperymentatorem, tym mniej będzie zestresowane zwierzę w początkowej fazie eksperymentu.</li>
	<li>Upewnij się, że implant okna czaszkowego jest wolny od kurzu i brudu. W razie potrzeby wyczyść wodą.</li>
	<li>Nałóż przezroczysty żel ultradźwiękowy jako medium zanurzeniowe między oknem czaszki a obiektywem zanurzonym w wodzie. Rozwiązuje to problemy związane z powolną degradacją obrazu spowodowaną parowaniem lub wyciekiem wody i łagodzi potrzebę montowania stożka na głowicy w celu zatrzymania wody. nuta: Przed użyciem odwirować żel, aby usunąć wszystkie pęcherzyki powietrza i uważać, aby podczas nakładania żelu nie tworzyć żadnych pęcherzyków powietrza. Pęcherzyki powietrza mogą poważnie pogorszyć jakość obrazu.</li>
	<li>Owiń kawałek czarnej taśmy wokół celu i pałąka na głowę, aby osłonić światło.</li>
	<li>Przesuń arenę środowiska wirtualnego do jej ostatecznej pozycji i dostosuj kamerę wideo do śledzenia uczniów.</li>
	<li>Ustaw wykrawacz laserowy tak, aby odpowiadał amplitudzie skanowania używanej podczas eksperymentu.</li>
	<li>Rozpocznij rejestrowanie danych.</li>
</ol>

<ol><li>Helmchen, F., Fee, M. S., Tank, D. W., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Miniature+Head-Mounted+Two-Photon+MicroscopeHigh-Resolution+Brain+Imaging+in+Freely+Moving+Animals%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A Miniature Head-Mounted Two-Photon MicroscopeHigh-Resolution Brain Imaging in Freely Moving Animals.</a> Neuron. 31 (6), 903-912 (2001).</li>
<li>Dombeck, D. A., Khabbaz, A. N., Collman, F., Adelman, T. L., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+large-scale+neural+activity+with+cellular+resolution+in+awake%2C+mobile+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging large-scale neural activity with cellular resolution in awake, mobile mice.</a> Neuron. 56, 43-57 (2007).</li>
<li>Dombeck, D. A., Harvey, C. D., Tian, L., Looger, L. L., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+imaging+of+hippocampal+place+cells+at+cellular+resolution+during+virtual+navigation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Functional imaging of hippocampal place cells at cellular resolution during virtual navigation.</a> Nat. Neurosci. 13 (11), 1433-1440 (2010).</li>
<li>Harvey, C. D., Coen, P., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choice-specific+sequences+in+parietal+cortex+during+a+virtual-navigation+decision+task%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Choice-specific sequences in parietal cortex during a virtual-navigation decision task.</a> Nature. 484 (7395), 62-68 (2012).</li>
<li>Huber, D., Gutnisky, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+dynamic+representations+in+the+motor+cortex+during+sensorimotor+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Multiple dynamic representations in the motor cortex during sensorimotor learning.</a> Nature. 484 (7395), 473-478 (2012).</li>
<li>Keller, G. B., Bonhoeffer, T., Hübener, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensorimotor+mismatch+signals+in+primary+visual+cortex+of+the+behaving+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Sensorimotor mismatch signals in primary visual cortex of the behaving mouse.</a> Neuron. 74 (5), 809-815 (2012).</li>
<li>Akerboom, J., Chen, T. -W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+a+GCaMP+Calcium+Indicator+for+Neural+Activity+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Optimization of a GCaMP Calcium Indicator for Neural Activity Imaging.</a> J. Neurosci. 32 (40), 13819-13840 (2012).</li>
<li>Zhao, Y., Araki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+expanded+palette+of+genetically+encoded+Ca2%2B+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">An expanded palette of genetically encoded Ca2+ indicators.</a> Science. 333 (6051), 1888-1891 (2011).</li>
<li>Mittmann, W., Wallace, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+calcium+imaging+of+evoked+activity+from+L5+somatosensory+neurons+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Two-photon calcium imaging of evoked activity from L5 somatosensory neurons in vivo.</a> Nat. Neurosci. 14 (8), 1089-1893 (2011).</li>
<li>Katona, G., Szalay, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+two-photon+in+vivo+imaging+with+three-dimensional+random-access+scanning+in+large+tissue+volumes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Fast two-photon in vivo imaging with three-dimensional random-access scanning in large tissue volumes.</a> Nat. Methods. 9 (2), 201-208 (2012).</li>
<li>Mank, M., Santos, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetically+encoded+calcium+indicator+for+chronic+in+vivo+two-photon+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">A genetically encoded calcium indicator for chronic in vivo two-photon imaging.</a> Nat. Methods. 5 (9), 805-811 (2008).</li>
<li>Margolis, D. J., Lütcke, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reorganization+of+cortical+population+activity+imaged+throughout+long-term+sensory+deprivation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Reorganization of cortical population activity imaged throughout long-term sensory deprivation.</a> Nat. Neurosci. 15 (11), 1539-1546 (2012).</li>
<li>Zariwala, H. A., Borghuis, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Cre-dependent+GCaMP3+reporter+mouse+for+neuronal+imaging+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A Cre-dependent GCaMP3 reporter mouse for neuronal imaging in vivo.</a> J. Neurosci. 32 (9), 3131-3141 (2012).</li>
<li>Harvey, C. D., Collman, F., Dombeck, D. A., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+dynamics+of+hippocampal+place+cells+during+virtual+navigation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Intracellular dynamics of hippocampal place cells during virtual navigation.</a> Nature. 461 (7266), 941-946 (2009).</li>
<li>Hölscher, C., Schnee, A., Dahmen, H., Setia, L., Mallot, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rats+are+able+to+navigate+in+virtual+environments%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Rats are able to navigate in virtual environments.</a> J. Exp. Biol. 208, 561-5519 (2005).</li>
<li>Borlinghaus, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MRT+letter%3A+high+speed+scanning+has+the+potential+to+increase+fluorescence+yield+and+to+reduce+photobleaching%29%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc.+Res.+Tech%22%5BJournal%5D)">MRT letter: high speed scanning has the potential to increase fluorescence yield and to reduce photobleaching).</a> Microsc. Res. Tech. 69 (9), 689-692 (2006).</li>
<li>Reiff, D. F., Plett, J., Mank, M., Griesbeck, O., Borst, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virtual+Reality+for+Mice%2C+mousevr.blogspot.com%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Virtual Reality for Mice, mousevr.blogspot.com.</a> Nat. Neurosci. 13, 973-978 (2010).</li>
<li>Sakatani, T., Isa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+spontaneous+saccade-like+rapid+eye+movements+in+C57BL%2F6+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of spontaneous saccade-like rapid eye movements in C57BL/6 mice.</a> Neurosci. Res. 58, 324-331 (2007).</li>
<li>Golshani, P., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+2-photon+calcium+imaging+in+layer+2%2F3+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">In vivo 2-photon calcium imaging in layer 2/3 of mice.</a> J. Vis. Exp. (13), (2008).</li>
<li>Holtmaat, A., Bonhoeffer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term%2C+high-resolution+imaging+in+the+mouse+neocortex+through+a+chronic+cranial+window%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window.</a> Nat. Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).</li>
<li>Schmidt-Hieber, C., Häusser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+mechanisms+of+spatial+navigation+in+the+medial+entorhinal+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cellular mechanisms of spatial navigation in the medial entorhinal cortex.</a> Nat. Neurosci. 16 (3), 325-331 (2013).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Kluczem do sukcesu behawioralnego obrazowania dwufotonowego jest stabilność preparatu na dwa sposoby:
<ol>
	<li>W ciągu kilku dni po implantacji okienka reakcje zapalne tkanki mogą prowadzić do zwiększenia tworzenia się ziarniny i chrząstki, co utrudni lub nawet uniemożliwi obrazowanie.</li>
	<li>Podczas eksperymentu mózg musi być wystarczająco stabilny, aby zapobiec zakłóceniu sygnału fluorescencji związanego z aktywnością neuronalną.</li>
</ol>
Aby ograniczyć do minimum zapalną odpowiedź imm...

Dwufotonowe obrazowanie wskaźników wapnia (genetycznie kodowanych jak GCaMP57 lub R-GECO8, lub syntetycznych barwników, takich jak OGB lub Fluo4) okazało się potężną metodą pomiaru aktywności neuronalnej u zachowujących się myszy1-6. Umożliwia jednoczesny pomiar aktywności setek komórek z rozdzielczością zbliżoną do pojedynczego potencjału czynnościowego, do około 800 μm poniżej powierzchni mózgu9,10. Co więcej, za pomocą genetycznie kodowanych wskaźników wapnia (GECI) aktywność neuronalna może być mierzona przewlekle5,11,12 oraz w genetycznie zdefiniowanych typach komórek13. Razem metody te zapewniają pewien stopień rozdzielczości czasowej i przestrzennej, który otwiera wiele nowych możliwości w badaniu obliczeń neuronalnych in vivo.
Interwencja chirurgiczna jest konieczna, aby ujawnić i oznaczyć mózg myszy do obrazowania. Komórki są zazwyczaj transfekowane za pomocą rekombinowanego systemu wirusa związanego z adenowirusem (AAV) do dostarczania GECI, a okno czaszkowe jest wszczepiane w miejsce wstrzyknięcia, aby uzyskać optyczny dostęp do mózgu. Następnie do czaszki mocuje się pręt na głowę w celu unieruchomienia głowy pod mikroskopem dwufotonowym. Zaprojektowanie i wdrożenie tych kroków ma kluczowe znaczenie, ponieważ większość problemów z obrazowaniem w stanie czuwania wynika z niestabilności preparatu. Idealnie byłoby, gdyby opisana tutaj procedura pozwalała na przewlekłe obrazowanie przez okres do kilku miesięcy po operacji.
Aby umożliwić wizualne sterowanie zachowaniem podczas obrazowania dwufotonowego, mysz z głową umieszczoną na podtrzymywanej przez powietrze sferycznej bieżni, której może używać do poruszania się w środowisku wirtualnej rzeczywistości. Poruszanie się myszy na bieżni jest sprzężone z ruchem w środowisku wirtualnym, które jest wyświetlane na toroidalnym ekranie otaczającym mysz14,15. Zmienne behawioralne, takie jak lokomocja, bodziec wzrokowy i pozycja źrenicy, mogą być rejestrowane6.
Opisujemy procedury związane z przewlekłym obrazowaniem dwufotonowym u myszy eksplorujących środowisko wirtualnej rzeczywistości. Kluczowymi punktami, o których mowa, są: redukcja artefaktów ruchu, redukcja wycieku światła, maksymalizacja liczby jednocześnie nagrywanych komórek oraz minimalizacja uszkodzeń fotograficznych. Podajemy również szczegółowe informacje na temat konfiguracji bieżni pneumatycznej, śledzenia uczniów i środowiska rzeczywistości wirtualnej. Opisane tutaj procedury mogą być wykorzystane do obrazowania fluorescencyjnie znakowanych populacji komórek u myszy z unieruchomioną głową w potencjalnie szerokiej gamie paradygmatów behawioralnych.

<table><tbody><tr><td>Szkiełka nakrywkowe (średnica = 3-5 mm)</td><td>Implant okienny</td> <td>Menzel</td><td></td></tr><tr><td>InSight DeepSee laser</td><td>Mikroskop Spectra-Physics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>12 kHz Skaner rezonansowy</td><td>Mikroskop Cambridge Technology</td><td>G1-003-30026</td><td></td></tr><tr><td>Galwometr</td><td>Mikroskop Cambridge Technology</td><td>G6215H</td><td></td></tr><tr><td>Digitizer</td><td>National Instruments</td><td>NI 5772</td><td>mikroskop</td></tr><tr><td>FPGA</td><td>National Instruments</td><td>Mikroskop</td><td>PXIe 7965R</td></tr><tr><td>Karta akwizycyjna</td><td>Mikroskop National</td><td>Instruments PCIe 6363</td><td></td></tr><tr><td>Filtr emisyjny 525/50</td><td>Mikroskop Semrock</td><td>FF03-525/50-25</td><td></td></tr><tr><td>Piezoelektryczny z-drive</td><td>Mikroskop Physikinstrumente</td><td>P-726.1CD</td><td></td></tr><tr><td>Sterownik do piezoelektrycznego napęd</td><td>Mikroskop Physikinstrumente</td><td>E665 LVPZT</td><td></td></tr><tr><td>Obiektyw 16X, 0,8NA</td><td>Mikroskop</td><td>Nikon</td><td>CFI75</td></tr><tr><td>Wzmacniacz prądu</td><td>Mikroskop</td><td>Femto</td><td>DHPCA-100</td></tr><tr><td>Tubus powielacza zdjęć</td><td>Mikroskop</td><td>Hamamatsu</td><td></td></tr><tr><td>Kamera USB bez filtra podczerwieni</td><td>ObrazowanieŹródło</td><td>DMK22BUC03</td><td>śledzenie</td></tr> <tr><td>źrenicyObiektyw 50 mm</td><td>ImagingSource</td><td>M5018-MP</td><td>śledzenie źrenic</td></tr><tr><td>Pierścienie adaptera makro</td><td>Śledzenie źrenic</td><td>ImagingSource</td><td>LAexSet</td></tr><tr><td>Optyczna mysz komputerowa</td><td>Logitech</td><td>G500</td><td>śledzenie ruchu</td></tr><tr><td>Kula styropianowa 20 cm</td><td>np. idee-shop.de</td><td>08797.00.15</td><td>środowisko wirtualne</td></tr><tr><td>Projektor LED</td><td>Samsung</td><td>SP-F10M</td><td>wirtualny środowisko</td></tr><tr><td>Karta akwizycyjna</td><td>National Instruments</td><td>NI 6009</td><td>środowisko wirtualne</td></tr><tr><td>Silnik gry</td><td></td> Panda3D<td><a href="http://www.panda3d.org/">www.panda3d.org</a></td><td>środowisko wirtualne</td></tr><tr><td>Biblioteka Numpy dla Pythona</td><td></td><td><a href="http://www.scipy.org/">www.scipy.org</a></td><td>środowisko wirtualne</td></tr><tr><td>Scipy biblioteka dla Pythona</td><td></td><td><a href="http://www.scipy.org/">www.scipy.org</a></td><td>środowisko wirtualne</td></tr><tr><td>Sterownik NI-DAQmx</td><td>National Instruments</td><td><a href="http://www.ni.com/">www.ni.com</a></td><td>środowisko wirtualne</td></tr><tr><td>Żel ultrasonograficzny</td><td>Dahlhausen</td><td>5701.0342.10</td><td></td></tr></tbody></table>

dwufotonowe obrazowanie wapnia u myszy poruszających się w środowisku rzeczywistości wirtualnej

Two-photon Calcium Imaging in Mice Navigating a Virtual Reality Environment

W ostatnich latach obrazowanie dwufotonowe stało się nieocenionym narzędziem w neurobiologii, ponieważ pozwala na przewlekły pomiar aktywności genetycznie zidentyfikowanych komórek podczas zachowania1-6. W tym miejscu opisujemy metody wykonywania obrazowania dwufotonowego w korze myszy, podczas gdy zwierzę porusza się w środowisku rzeczywistości wirtualnej. Skupiamy się na aspektach procedur eksperymentalnych, które są kluczowe dla obrazowania zachowującego się zwierzęcia w jasno oświetlonym środowisku wirtualnym. Kluczowe problemy, które pojawiają się w tej eksperymentalnej konfiguracji, którą tutaj omawiamy, to: minimalizacja artefaktów związanych z ruchem mózgu, minimalizacja wycieku światła z systemu projekcji rzeczywistości wirtualnej oraz minimalizacja uszkodzeń tkanek wywołanych laserem. Dostarczamy również przykładowe oprogramowanie do sterowania środowiskiem wirtualnej rzeczywistości i śledzenia uczniów. Dzięki tym procedurom i zasobom powinno być możliwe przekształcenie konwencjonalnego mikroskopu dwufotonowego do użytku u zachowujących się myszy.

Jakość obrazowania w dwufotonowym obrazowaniu wapnia populacji komórek znakowanych GECI zależy w głównej mierze od jakości implantu okna czaszkowego. Dwa tygodnie po iniekcji wirusa należy sprawdzić przejrzystość okna czaszkowego. Nie powinno być widocznej tkanki ziarninowej ani odrostu kości (Rycina 1A). Ponadto wzór powierzchownych naczyń krwionośnych powinien pozostać niezmieniony, a granice układu naczyniowego powinny być ostro zarysowane. Jednocześnie można sprawdzić ekspresję GECI. Grupy znakowanyc...

Tutaj opisujemy procedury eksperymentalne związane z dwufotonowym obrazowaniem kory myszy podczas zachowania w środowisku wirtualnej rzeczywistości.

Dwufotonowe obrazowanie wapnia u myszy poruszających się w środowisku rzeczywistości wirtualnej

In recent years, two-photon imaging has become an invaluable tool in neuroscience, as it allows for chronic measurement of the activity of genetically ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest wykonanie kluczowych aspektów przewlekłego obrazowania dwóch fotonów u myszy, badając środowisko rzeczywistości wirtualnej. Osiąga się to poprzez modyfikację mikroskopu dwufotonowego w celu uzyskania szybkiego i stabilnego obrazowania u zachowujących się myszy. Następnie ustawiana jest bieżnia wspomagana powietrzem zdolna do śledzenia lokomocji.Następnie przygotowywane jest środowisko wirtualnej rzeczywistości, które wykorzystuje projektor LED zsynchronizowany z mikroskopem w celu zminimalizowania wycieku światła. W efekcie uzyskuje się dobre i stabilne nagrania obrazu dzięki redukcji artefaktów ruchu, zmniejszeniu przecieku światła oraz zminimalizowaniu krawędzi uszkodzeń fotograficznych. Chociaż metoda ta może być stosowana do pomiaru neuroaktywności podczas nawigacji w środowisku rzeczywistości wirtualnej, można ją również łatwo dostosować do wielu różnych paradygmatów behawioralnych, które wymagają stymulacji wizualnej.Wszystkie procedury na zwierzętach zostały zatwierdzone i przeprowadzone zgodnie z wytycznymi działu weterynaryjnego Canton Basil sta. Dwa mikroskopy fotonowe używane w tych eksperymentach składają się z głowicy skanującej składającej się z ośmio- lub dwunastokilohercowego skanera rezonansowego i standardowego galwanometru. Umożliwia to wyświetlanie klatek na sekundę 40 lub 60 Hz przy rozdzielczości 750 razy 400 pikseli i zmniejsza zniekształcenia obrazu wywołane ruchem mózgu, fotowybielanie i fototoksyczność.Piezoelektryczny krokowiec Z o dużej prędkości służy do sekwencyjnego pozyskiwania obrazów z przeplotem czasu na wielu głębokościach. Mechaniczny wykrawacz służy do zmniejszania ekspozycji lasera na tkankę w punktach zwrotnych ścieżki skanowania, wykrawacz musi być regulowany, aby ustawić jego szerokość. W zależności od amplitudy skanera rezonansowego podłącz rurkę doprowadzającą powietrze o średnicy wewnętrznej co najmniej 10 milimetrów do uchwytu kuli bieżni i umieść rurkę BLE między głównym dopływem powietrza a uchwytem piłki, aby zmniejszyć hałas.Umieść kulkę z pianki polistyrenowej o średnicy 20 centymetrów w specjalnie zaprojektowanym i wydrukowanym w 3D uchwycie na kulki. Jeśli paradygmat behawioralny wymaga tylko poruszania się do przodu i do tyłu, włóż szpilkę, taką jak igła podskórna o rozmiarze 19, z boku piłki. Aby ograniczyć ruch piłki w osi poziomej, użyj jednej lub dwóch optycznych myszy komputerowych do śledzenia ruchu piłki odpowiednio wokół dwóch lub wszystkich trzech osi.Aby przygotować środowisko wirtualnej rzeczywistości, użyj projektorów LED lub ekranów komputerowych z podświetleniem LED do wyświetlania. Zintegruj obwód bramkowania w celu szybkiego migotania diod LED podczas obrazowania. Częstotliwość migotania 24 kiloherców jest o rzędy wielkości wyższa od progu fuzji migotania, powyżej którego migotanie nie jest już odczuwalne przez zwierzę.Dostosuj dokładną częstotliwość migotania i cykl pracy, aby zsynchronizować strumień świetlny projektora z punktami obrotu skanera rezonansowego w celu śledzenia źrenicy, użyj kamery wideo opartej na CMO. Upewnij się, że kamera nie zawiera filtra blokującego podczerwień. Około dwa do trzech tygodni po wstrzyknięciu genetycznego wskaźnika wapnia i wszczepieniu okienka czaszkowego, użyj oświetlenia fluorescencyjnego epi, aby sprawdzić implant okna czaszki pod kątem jasności i ekspresji.Wyraźnie widoczne i ostro zarysowane. Granice powierzchownych naczyń krwionośnych są dobrą wskazówką, że implant okienny nadaje się do obrazowania jeden do dwóch dni później. Aby przeprowadzić eksperyment z dwoma fotonami, zmierz i dostosuj moc lasera do wartości poniżej 50 miliwatów w próbce.Następnie włącz dopływ powietrza do bieżni sferycznej. Następnie przymocuj zwierzę do kulistej bieżni. Pierwsze kilka razy mysz jest zamocowana w głowicy.Proces ten można złagodzić, krótko uspokajając zwierzę izofluorem. Gdy zwierzę przyzwyczai się do zabiegu, montaż można zwykle wykonać bez sedacji. Należy pamiętać, że bardzo ważne jest, aby zminimalizować stres zwierzęcia podczas tej procedury.Następnie umieść system wyświetlania obrazu jak najbliżej zwierzęcia, aby nadal umożliwiać dostęp do zwierzęcia. Upewnij się, że implant okna czaszki jest wolny od brudu i w razie potrzeby wyczyść go wodą, nałóż przezroczysty żel ultradźwiękowy jako medium zanurzeniowe między oknem czaszki a obiektywem zanurzenia w wodzie, aby osłonić światło. Owiń kawałek czarnej taśmy wokół celu i drążka na głowę.Przesuń arenę środowiska wirtualnego do jej ostatecznej pozycji i dostosuj kamerę wideo do śledzenia uczniów. Na koniec ustaw blanker laserowy tak, aby odpowiadał amplitudzie skanowania używanej podczas eksperymentu i rozpocznij rejestrowanie danych po zakończeniu eksperymentów. Poddaj zwierzę eutanazji zgodnie z wytycznymi swojej instytucji.Jakość obrazu w dwufotonowym obrazowaniu wapniowym populacji komórek znakowanych genetycznym wskaźnikiem wapnia w dużej mierze zależy od jakości implantu okna czaszkowego, jak wykazano tutaj podczas sprawdzania okna czaszki pod kątem jasności po wstrzyknięciu wirusa, nie powinna być widoczna ziarnina tkanki ani odrost kości. Ponadto wzór powierzchownych naczyń krwionośnych powinien pozostać niezmieniony, a granice układu krwionośnego powinny być ostro określone. Jednocześnie BOI znakowanych komórek powinno być wyraźnie widoczne pod mikroskopem epifluorescencyjnym.Idealnie byłoby, gdyby preparat był na tyle stabilny, że zniekształcenia dwóch obrazów fotonowych wywołane lokomocją, jaką porusza mysz, nie są widoczne na obrazie po rejestracji klatki. Wyciek światła z systemu stymulacji wizualnej można całkowicie wyeliminować, prawidłowo synchronizując strumień świetlny projektora z punktami obrotu skanera rezonansowego. Gdy dane nie są pozyskiwane, częstotliwość migotania źródła światła powinna być dwukrotnie większa niż częstotliwość skanowania.W tym przykładzie blanker został usunięty, aby zilustrować efekt wycieku światła pokazany w pomarańczowych polach podczas stymulacji wizualnej. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykonywać podwójne czynności w obrazowaniu, zachowaniu myszy, poruszaniu się w środowisku rzeczywistości wirtualnej. Oprócz skonfigurowania systemów obrazowania i rzeczywistości wirtualnej, jak opisano tutaj, kluczem do sukcesu w tych eksperymentach jest opanowanie techniki implantacji okien czaszkowych.Czysty implant jest warunkiem wstępnym wysokiej jakości obrazów i stabilnych nagrań.

two-photon-calcium-imaging-mice-navigating-virtual-reality

Research

JoVE Journal

Behavior

Zachowanie

Obrazowanie wapnia dwufotonowym u myszy poruszających się w wirtualnym środowisku rzeczywistości

Aby zrozumieć dynamikę sieci mikroukładów w neocortex, niezbędne jest jednoczesne rejestrowanie aktywności dużej liczby neuronów. Dwufotonowy obrazowanie wapnia in-vivo jest jedyną metodą pozwalającą na rejestrację aktywności gęstej populacji neuronów z rozdzielczością pojedynczych komórek.

Obrazowanie wapnia metodą dwufotonową in vivo w warstwie 2/3 kory mózgowej myszy

Źródło: Maruoka, H., et. al. Jednoczesne obrazowanie dynamiki mikrogleju i aktywności neuronalnej u obudzonych myszy. J. Vis. Exp. (2022) Ten film przedstawia procedurę mikroskopii dwufotonowej do obrazowania aktywności neuronalnej i dynamiki mikrogleju u obudzonej myszy podczas stymulacji wzrokowej, podkreślając stany przejściowe wapnia i interakcje komórkowe.

Jednoczesne obrazowanie dynamiki mikrogleju i aktywności neuronalnej u wybudzonej myszy

Źródło: Lee, H. et. al., Udane obrazowanie wapnia in vivo za pomocą zminiaturyzowanego mikroskopu montowanego na głowie w ciele migdałowatym swobodnie zachowującej się myszy. J. Vis. Exp. (2020)Ten film pokazuje obrazowanie wapnia in vivo u myszy przy użyciu gradientowego współczynnika załamania światła lub soczewki GRIN i zminiaturyzowanego mikroskopu. Konfiguracja łączy mocowanie głowy w beztarciowym mobilnym systemie klatek, stymulując neurony i wyzwalając napływ jonów wapnia. Soczewka GRIN...

Mikroendoskopowe obrazowanie wapnia w czasie rzeczywistym u swobodnie poruszającej się myszy

Źródło: Thapa, R., et. al., Stereotaktyczne wstrzyknięcie wirusa i implantacja soczewki o indeksie gradientowym dla głębokiego mózgu In vivo Obrazowanie wapnia.  J. Vis. Exp. (2021)Film demonstruje obrazowanie wapnia w czasie rzeczywistym za pomocą miniskopu u transdukowanej myszy, korelując aktywność neuronów z zachowaniem.

Obrazowanie wapnia w czasie rzeczywistym przyśrodkowej kory przedczołowej myszy za pomocą miniskopu

Ten film pokazuje procedurę kraniotomii, która umożliwia przewlekłe obrazowanie neuronów w korze zaśledziony myszy za pomocą mikroskopii dwufotonowej in vivo w linii transgenicznej Thy1-GFP. Podejście to łączy się z wstrzyknięciem do grzbietowego hipokampa wirusa związanego z ekspresją mCherry. Techniki te pozwalają na długoterminowe monitorowanie plastyczności strukturalnej zależnej od doświadczenia w RSC.

Jednoczesne dwufotonowe obrazowanie in vivo wejść synaptycznych i celów postsynaptycznych w korze zaśledzinowej myszy

Przedstawiamy protokół odsłaniania pnia mózgu dorosłej myszy od strony brzusznej. Dzięki zastosowaniu soczewki o indeksie gradientowo-refrakcyjnym z miniaturowym mikroskopem, obrazowanie wapnia można wykorzystać do zbadania aktywności somatów nerwowych dolnych oliwek in vivo.

In vivo (in vivo) Obrazowanie wapnia u myszy z oliwek dolnych

Miniskopowe obrazowanie wapnia in vivo to potężna technika do badania dynamiki neuronów i mikroobwodów u swobodnie zachowujących się myszy. Protokół ten opisuje wykonywanie operacji mózgu w celu uzyskania dobrego obrazowania wapnia in vivo za pomocą miniskopu.

Stereotaktyczne wstrzyknięcie wirusa i implantacja soczewek o indeksie gradientowym w celu obrazowania głębokiego mózgu in vivo wapnia

Tutaj opisujemy protokół łączący wstrzyknięcie wirusa związanego z adenowirusem z implantacją okna czaszkowego w celu jednoczesnego obrazowania dynamiki mikrogleju i aktywności neuronalnej u obudzonych myszy.

Jednoczesne obrazowanie dynamiki mikrogleju i aktywności neuronalnej u obudzonych myszy

Obecny protokół opisuje wykonanie dużego (6 x 3 mm2) okna czaszki przy użyciu folii spożywczej, przezroczystego silikonu i szkła nakrywkowego. To okno czaszkowe pozwala na eksperymenty in vivo z obrazowaniem wapnia w szerokim polu i z dwoma fotonami na tej samej myszy.

In vivo (in vivo) Szerokokątne i dwufotonowe obrazowanie wapnia za pomocą myszy przy użyciu dużego okna czaszki

Tutaj prezentujemy uproszczoną konfigurację sprzętu i oprogramowania open-source do badania uczenia przestrzennego myszy za pomocą wirtualnej rzeczywistości (VR). System ten wyświetla wirtualną ścieżkę liniową do myszy z ograniczeniem głowy działającej na kole, wykorzystując sieć mikrokontrolerów i komputer jednopłytkowy z łatwym w użyciu pakietem oprogramowania graficznego Python.

System rzeczywistości wirtualnej typu open source do pomiaru uczenia się przestrzennego u myszy z unieruchomioną głową

Ten protokół szczegółowo opisuje procedurę obrazowania reakcji wapnia w górnym wzgórku (SC) obudzonych myszy, w tym obrazowanie aktywności pojedynczego neuronu za pomocą mikroskopii dwufotonowej przy jednoczesnym pozostawieniu nienaruszonej kory mózgowej u myszy typu dzikiego, oraz obrazowanie całego SC za pomocą mikroskopii szerokiego pola u myszy z mutacją częściowej kory  mózgowej.

Obrazowanie wapnia u myszy Superior Colliculus

Poznaj dwufotonowe obrazowanie wapnia u myszy w rzeczywistości wirtualnej. Ta metoda pozwala na stabilne rejestrowanie aktywności neuronowej podczas nawigacji, minimalizując artefakty ruchu i przecieki światła.

Dwufotonowe obrazowanie wapnia u myszy poruszających się w środowisku rzeczywistości wirtualnej

Przeglądaj więcej filmów