Name: Wspomagana mikrofalami funkcjonalizacja peptydów poli(glikolu etylenowego) i żywicy do stosowania w polimeryzacji łańcuchowej i tworzeniu hydrożelu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-29T18:30:00.000+00:00
Duration: 15 min 33 s
Description: Naucz się szybkiej funkcjonalizacji poli(glikolu etylenowego) i peptydów przy użyciu energii mikrofalowej do syntezy hydrożeli. Metoda umożliwia efektywne tworzenie biomateriałów do zastosowań w inżynierii tkankowej i dostarczaniu leków.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została częściowo sfinansowana przez stypendium Howard Hughes Med-into-Grad (AVH), przez fundusze początkowe przekazane dr Danielle Benoit z University of Rochester oraz Orthopaedic Research and Education Foundation/Musculoskeletal Transplant Foundation (OREF/MTF). Autorzy pragną podziękować dr Jamesowi L. McGrathowi za wykorzystanie jego sprzętu.

1. Synteza PEGDM wspomagana mikrofalowo
<ol>
	<li>Aby zapobiec zanieczyszczeniu wodą, należy wstępnie wysuszyć całą używaną szklaną aparaturę w piekarniku (&gt;60 ºC) przez 1 godzinę. 
	Uwaga: Wymagana aparatura szklana obejmuje: dwa zlewki 100 ml, zlewkę 250 ml, 3 szpatułki, kolbę Büchnera 250 ml, lejek Büchnera 7 cm, szkło zegarkowe 10 cm.</li>
	<li>Wstępnie schłodzić 100-150 ml bezwodnego eteru etylowego (74,12 g/mol) do wytrącenia, które zostanie przeprowadzone w kroku 1.6, poprzez przelanie go do zlewki, przykrycie zlewki szkłem zegarkowym i umieszczenie zlewki w naczyniu do rekrystalizacji wypełnionym lodem. Przenieść mikrofalówkę i wirówkę typu vortex do dygestorium. 
	Uwaga: Eter etylowy można również wstępnie schłodzić, umieszczając zlewkę w zamrażarce laboratoryjnej. Niższa temperatura eteru etylowego osiągnięta dzięki chłodzeniu w zamrażarce zwiększy szybkość i wydajność wytrącania.</li>
	<li>W małej łódzce ważnej odważyć 5 g poli(glikolu etylenowego) (PEG) o wybranej masie cząsteczkowej (1 000-100 000 Da).
	<ol>
		<li>Jeśli jest obecna, usunąć plastikową wkładkę z zakrętki fiolki scyntylacyjnej. Tarować fiolkę i odmierzyć do niej w dygestorium 10-krotny nadmiar molowy bezwodnika metakrylowego (MA, 154,16 g/mol) zgodnie z równaniem 1. Dodać PEG do fiolki scyntylacyjnej. 
		<img alt="Równanie składu polimeru, M_MA do obliczania mas cząsteczkowych, reprezentacja wzoru." fo:content-width="200px" src="/files/ftp_upload/50890/50890eq1.jpg" width="250px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Równanie 1"> (1) 
		gdzie <img alt="Symbol formatu MPEG, reprezentujący cyfrowe standardy kompresji wideo." fo:content-width="30px" src="/files/ftp_upload/50890/50890eq1.1.jpg" width="30px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Równanie 1.1"> to masa PEG w g, <img alt="Wzór równowagi statycznej, ΣFx=0, przedstawiony jako równanie tekstowe, użytek edukacyjny w fizyce." fo:content-width="30px" src="/files/ftp_upload/50890/50890eq1.2.jpg" width="40px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Równanie 1.2"> to masa cząsteczkowa PEG w g/mol, <img alt="Końce NPEG; koncepcja równowagi statycznej na schemacie; ΣFx=0, wzór fizyczny do analizy równowagi." fo:content-width="40px" src="/files/ftp_upload/50890/50890eq1.3.jpg" width="40px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Równanie 1.3"> to liczba terminalnych grup OH w PEG, a <img alt="Równanie spektrometrii mas, obliczanie masy cząsteczkowej (MW i MA) do zastosowań w chemii analitycznej." fo:content-width="30px" src="/files/ftp_upload/50890/50890eq1.4.jpg" width="40px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Równanie 1.4"> to masa cząsteczkowa MA w g/mol.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Luźno zakręcić zakrętkę fiolki scyntylacyjnej. Ustawić mikrofalówkę na 5 min na maksymalnej mocy. Używając rękawic odpornych na wysoką temperaturę, wyjmować fiolkę z mikrofalówki co 30 s.
	<ol>
		<li>Dokładnie dokręcić zakrętkę i wymieszać wirówką vortex przez 30 s. Powtarzać czynność, aż roztwór zostanie poddany działaniu mikrofal przez pełne 5 min. W trakcie procedury może być konieczna wymiana zakrętki w przypadku jej pęknięcia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po poluzowaniu zakrętki pozwolić PEGDM ochłodzić się do temperatury pokojowej. Rozpuścić PEGDM w niewielkiej ilości (10-15 ml) dichlorometanu (DCM, 84,93 g/mol). 
	Uwaga: Zaleca się, aby PEGDM znacząco ostygł (~5 min) przed dodaniem DCM, aby zapobiec wrzeniu DCM (podejrzewanego o działanie rakotwórcze) z powodu ciepła resztkowego. PEGDM można rozbić na małe kawałki za pomocą szpatułki i wymieszać wirówką vortex, aby ułatwić rozpuszczanie.</li>
	<li>Wytrącić PEGDM w 10-krotnym nadmiarze lodowatego eteru etylowego przez 20 min. 
	Uwaga: W przypadku PEG o niższej masie cząsteczkowej (2 500 Da) może być konieczne zadrapanie ścianki zlewki szpatułką w celu zainicjowania krystalizacji i wytrącenia; jednakże PEG o masie cząsteczkowej poniżej 1 000 Da nie wytrąci się mimo zadrapywania.</li>
	<li>Używając lejka Büchnera i kolby, zebrać PEGDM poprzez filtrację próżniową. Nie filtrować do całkowitej suchości, ponieważ sprzyja to adsorpcji wody przez PEGDM. 
	Uwaga: Jeśli jest to wymagane dla konkretnego systemu próżniowego, między zestawem do filtracji a źródłem próżni można umieścić pułapkę próżniową, aby chronić pompę próżniową przed uszkodzeniem przez opary rozpuszczalnika.</li>
	<li>Przenieść przefiltrowany PEGDM do probówki stożkowej 50 ml z igłą o dużym rozmiarze przebitą przez zakrętkę w celu wentylacji. Przechowywać przez noc w komorze próżniowej w celu wysuszenia.</li>
	<li>Ponownie rozpuścić PEGDM w DCM i ponownie wytrącić (jak w krokach 1.5-1.7) jako końcowy etap w celu usunięcia nieprzereagowanego MA. Wysuszyć ponownie zgodnie z krokiem 1.8.</li>
</ol>
2. Charakterystyka funkcjonalizacji PEGDM
<ol>
	<li>Przygotować próbki do 1H-NMR, wykorzystując w tym celu zdeuteryzowany chloroform (120,38 g/mol) jako rozpuszczalnik. Małą próbkę PEGDM (≈10 mg) umieścić w fiolce scyntylacyjnej z niewielką ilością rozpuszczalnika (≈1,0 ml). Docelowe stężenie wynosi 10 mg/ml.
	<ol>
		<li>Po rozpuszczeniu próbki przenieść ją do czystej probówki NMR. Próbka powinna wypełniać dolne 4-5 cm probówki NMR.</li>
	</ol>
	</li>
	<li> Zebrać widma protonowego NMR. Nasze dane zostały zebrane przy użyciu spektrometru 400 MHz. Próbki należy analizować w temperaturze pokojowej, wykonując co najmniej 64 skanowania w celu uzyskania wystarczającej rozdzielczości danych.</li>
	<li>Jeśli analiza NMR (Rysunek 4) wykaże, że stopień funkcjonalizacji PEGDM jest niższy niż 90%, należy powtórzyć procedurę metakrylowania. Dostosować masę użytego MA, biorąc pod uwagę zmniejszoną ilość niefunkcjonalizowanego PEG.</li>
</ol>
Uwaga: Procent PEG funkcjonalizowanego do PEGDM można obliczyć z zaobserwowanego teoretycznego stosunku protonów końcowych grupy metakrylanowej (a, b i c) do protonów centralnych PEG (d) (Rysunek 4). Dla liniowego PEG teoretyczna liczba centralnych protonów PEG jest obliczana zgodnie z równaniem 2:
<img alt="równowaga statyczna, wzór łańcucha polimeru d_theo=4*(MW_PEG/MW_PEG repeat−1), obliczenia teoretyczne" fo:content-width="150px" src="/files/ftp_upload/50890/50890eq2.jpg" width="200px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Równanie 2"> (2) 
gdzie <img alt="Oznaczenie masy cząsteczkowej (MW), pojęcie chemii organicznej, symbol edukacyjny." fo:content-width="30px" src="/files/ftp_upload/50890/50890eq2.1.jpg" width="40px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Równanie 2.1"> to masa cząsteczkowa PEG w g/mol, a <img alt="Analiza powtórzeń MW PEG, tekst wzoru; pojęcie chemii polimerów, badanie masy cząsteczkowej." fo:content-width="30px" src="/files/ftp_upload/50890/50890eq2.2.jpg" width="70px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Równanie 2.2"> to masa cząsteczkowa pojedynczego powtórzenia PEG (44 g/mol). W przypadku nieliniowego PEG równanie to musi zostać zmodyfikowane, aby odzwierciedlić specyficzną strukturę rozgałęzień (Rysunek 1). Procent funkcjonalizacji można następnie obliczyć za pomocą równania 3: 
<img alt="Równanie funkcjonalizacji dla chemicznej analizy powierzchni." fo:content-width="150px" src="/files/ftp_upload/50890/50890eq3.jpg" width="300px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Równanie 3">(3) 
gdzie <img alt="Symbol różniczkowego elementu pola, powiązany z równaniami rachunku różniczkowego lub fizyki." fo:content-width="30px" src="/files/ftp_upload/50890/50890eq3.1.jpg" width="40px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Równanie 3.1"> to obserwowana powierzchnia pod pikiem d (δ=6,63 ppm), <img alt="Wzór na przewagę mechaniczną (MA=powierzchnia); kluczowe pojęcie w analizie fizycznej i inżynieryjnej." fo:content-width="40px" src="/files/ftp_upload/50890/50890eq3.2.jpg" width="40px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Równanie 3.2"> to obserwowana powierzchnia pod pikami protonów metakrylanu (a, δ=1,94 ppm; b i c, δ=5,57 i 6,12 ppm), a <img alt="Równanie reprezentujące statyczną równowagę momentów, MA=0, przedstawiające zasadę równowagi obrotowej." fo:content-width="40px" src="/files/ftp_upload/50890/50890eq3.3.jpg" width="40px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Równanie 3.3"> to teoretyczna liczba protonów metakrylanu (odpowiednio a=3*<img alt="Końce NPEG; pojęcie równowagi statycznej na schemacie; ΣFx=0, wzór fizyczny dla analizy równowagi." fo:content-width="40px" src="/files/ftp_upload/50890/50890eq1.3.jpg" width="60px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Równanie 1.3">, b=1*<img alt="Końce NPEG; pojęcie równowagi statycznej na schemacie; ΣFx=0, wzór fizyczny dla analizy równowagi." fo:content-width="40px" src="/files/ftp_upload/50890/50890eq1.3.jpg" width="60px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Równanie 1.3"> i c=1*<img alt="Końce NPEG; pojęcie równowagi statycznej na schemacie; ΣFx=0, wzór fizyczny dla analizy równowagi." fo:content-width="40px" src="/files/ftp_upload/50890/50890eq1.3.jpg" width="60px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Równanie 1.3"> - 6, 2 i 2 dla liniowego PEG). Obliczenia procentu funkcjonalizacji należy przeprowadzić oddzielnie dla pików a, b i c, a następnie wyciągnąć z nich średnią, aby uzyskać całkowity procent funkcjonalizacji.
Uwaga: Wystarczająco funkcjonalizowany PEGDM można następnie poddać dializie (w wodzie, przeciwko wodzie) i zebrać poprzez liofilizację w celu usunięcia resztek bezwodnika metakrylowego i kwasu metakrylowego. Produkt końcowy należy zmieszać z niewielką ilością (0,01% mas.) inhibitora, takiego jak kwas cytrynowy lub witamina C, i przechowywać z osuszaczem w temperaturze -20 °C do momentu użycia. Końcowy produkt PEGDM może być wykorzystany do wytwarzania hydrożeli, zgodnie ze szczegółami opisanymi w artykule JoVE autorstwa Khetana i Burdicka22.
3. Funkcjonalizacja peptydów na żywicy wspomagana mikrofalowo
Uwaga: Nasze peptydy są syntetyzowane przy użyciu żywicy Fmoc-Gly-Wang, z wykorzystaniem zautomatyzowanego syntezatora peptydów z monitorowaniem UV oraz 0,2 M roztworów aminokwasów w N-metylo-pirolidonie (NMP, 99,1 g/mol). Do deprotekcji stosuje się 5% piperazynę (86,1 g/mol) w dimetyloformamidzie (DMF, 73,1 g/mol), jako aktywator wykorzystuje się 0,5 M O-benzotriazol-N,N,N’,N’-tetrametylouronyum-heksafluoro-fosforan (HBTU, 379,3 g/mol) w DMF, a jako zasadę aktywującą 2 M diizopropyloetyloaminę (DIEA, 129,3 g/mol) w NMP. Peptydy można również pozyskać od komercyjnego dostawcy peptydów. Przy korzystaniu ze źródeł komercyjnych kluczowe jest, aby peptydy były nabywane na żywicy, z zachowaniem grup ochronnych łańcuchów bocznych aminokwasów, a nie w formie całkowicie odszczepionej, co jest standardową praktyką.
Uwaga: Ważne jest, aby wszelkie aminokwasy z reaktywnymi łańcuchami bocznymi były chronione, aby zapewnić, że funkcjonalizacja metakryloamidem zachodzi wyłącznie w obrębie grupy aminowej pierwotnej N-końca sekwencji. Patrz Tabela 1 w celu zapoznania się z aminokwasami z reaktywnymi grupami bocznymi oraz typowymi grupami ochronnymi. Aminokwasy z grupami ochronnymi są włączane do sekwencji podczas syntezy peptydów w ten sam sposób, co aminokwasy niechronione i często są dostępne u tych samych dostawców aminokwasów.
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="502">
	<colgroup>
		<col>
		<col>
		<col>
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:144px;">Aminokwas</td>
			<td style="width:163px;">Grupa reakcyjna</td>
			<td style="width:196px;">Grupa ochronna</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:144px;">Lizyna</td>
			<td style="width:163px;">amina pierwszorzędowa</td>
			<td style="width:196px;">tert-butylokarbonylo- (Boc)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:144px;">Seryna</td>
			<td style="width:163px;">Alkohol pierwszorzędowy</td>
			<td style="width:196px;">tert-butyl (tBu)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:144px;">Treonina</td>
			<td style="width:163px;">Alkohol wtórny</td>
			<td style="width:196px;">tBu</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:144px;">Tyrozyna</td>
			<td style="width:163px;">Fenol</td>
			<td style="width:196px;">tBu</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Reaktywne aminokwasy i typowe grupy ochronne.
<ol>
	<li>Zsyntetyzować peptydy za pomocą standardowej syntezy peptydów w fazie stałej i przechowywać je na żywicy w temperaturze 4 °C w DMF do momentu użycia.</li>
	<li>Używając lejka Büchnera o średnicy 7 cm z papierem filtrującym i kolby o objętości 250 ml, zebrać żywicę peptydową z DMF poprzez filtrację.</li>
	<li>Jeśli jest obecny, usunąć plastikowy element z zakrętki fiolki scyntylacyjnej. Przenieść żywicę do fiolki scyntylacyjnej. Używając jednorazowej pipety, dodać niewielką ilość MA, aby pokryć żywicę w fiolce scyntylacyjnej.</li>
	<li>Luźno nałożyć zakrętkę na fiolkę scyntylacyjną. Ustawić mikrofalę na 3 min w maksymalnej mocy. Nosząc rękawice odporne na wysoką temperaturę, wyjmować fiolkę z mikrofalówki co 15-20 s.
	<ol>
		<li>Mocno dokręcić zakrętkę i mieszać w wirówce typu vortex przez 15 s. Powtarzać czynność, aż roztwór zostanie poddany działaniu mikrofal przez pełne 3 min.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przy poluzowanej zakrętce pozwolić roztworowi peptydowemu ochłodzić się do temperatury pokojowej. Używając niewielkiej ilości DMF oraz lejka Büchnera z papierem filtrującym i kolby, zebrać żywicę peptydową z fiolki.</li>
	<li>Przenieść żywicę peptydową do nowej fiolki scyntylacyjnej, a następnie przeprowadzić odszczepienie i deprotekcję peptydu.
	<ol>
		<li>Na każde 0,25 mmol żywicy zastosować 2-godzinną reakcję w temperaturze pokojowej z rotacją, używając koktajlu do odszczepiania składającego się z 18,5 ml kwasu trifluorooctowego (TFA, 114,02 g/mol) oraz po 0,5 ml triizopropylosilanu (TIPS, 158,36 g/mol), 3,6-dioksa-1,8-oktanodiotiolu (DODT, 182,30 g/mol) i wody dejonizowanej (18,02 g/mol). 
		Uwaga: Koktajl ten jest wystarczający dla większości peptydów, ale nie zdeprotektuje aminokwasów chronionych grupą 2,2,4,6,7-pentametylodihydrobenzofuran-5-sulfonylową (Pbf) (często stosowaną do ochrony łańcuchów bocznych argininy). Jeśli sekwencja zawiera grupy chronione Pbf, 0,5 ml TFA należy zastąpić 0,5 ml tioanizolem (124,20 g/mol), a czas odszczepiania wydłużyć do 4 h. 
		Uwaga: Jeśli w koktajlu do odszczepiania utworzy się mętna, krystaliczna substancja, prawdopodobnie dochodzi do wytrącania się peptydu z roztworu i należy podwoić objętość koktajlu do odszczepiania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Schłodzić 400 ml bezwodnego eteru dietylowego w kąpieli lodowej w zlewce przykrytej szkłem zegarkowym.</li>
	<li>Wytrącić peptyd w 10-krotnej nadwyżce eteru dietylowego i rozdzielić roztwór równomiernie pomiędzy cztery probówki stożkowe o pojemności 50 ml. Odwirować przy 3 200 ×g przez 10 min w celu zebrania peptydowego osadu.
	<ol>
		<li>Zlać eter i resuspender peptyd w 100 ml świeżego eteru dietylowego, podzielonego pomiędzy dwie probówki stożkowe o pojemności 50 ml. Powtórzyć proces wirowania, resuspenderując dwukrotnie w 50 ml świeżego eteru, aby łącznie przeprowadzić 4 przemycia eterem. 
		Uwaga: Pozwala to usunąć z ciało stałego peptydy odczynniki użyte w koktajlu do odszczepiania oraz odszczepione grupy ochronne.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po ostatnim etapie wirowania zlać zużyty eter i suszyć peptyd przez noc w próżni.</li>
</ol>
4. Charakterystyka funkcjonalizacji peptydowej
<ol>
	<li>W analizie próbek peptydów metodą MALDI-ToF jako rozpuszczalnik należy zastosować mieszaninę H2O:Acetonitryl (41,05 g/mol) w stosunku 50:50 z dodatkiem 0,1% TFA. Niewielką ilość próbki peptydowej (1 – 2 mg) należy umieścić w probówce Eppendorfa o pojemności 1,5 ml i rozpuścić w 1 ml rozpuszczalnika MALDI.</li>
	<li>Przygotować roztwór matrycy. Jako matrycy powszechnie stosuje się kwas α-cyjano-4-hydroksycynnamowy (CHCA, 189,2 g/mol). Rozpuścić matrycę w stężeniu 10 mg/ml w rozpuszczalniku MALDI, tworząc roztwór stokowy matrycy. 
	Uwaga: Roztwór stokowy matrycy można przechowywać w temperaturze pokojowej do jednego tygodnia w celu przeprowadzenia kolejnych analiz.</li>
	<li>Połączyć peptyd i roztwór matrycy w stosunku 1:1. Nanosić taką mieszaninę w trzech osobnych punktach na płytkę do próbek MALDI, aplikując 1 μl na punkt.
	<ol>
		<li>Wysuszyć punkty, pozostawiając je do wyschnięcia na powietrzu lub używając opalarki. Ponowić naniesienie i wysuszyć każdą próbkę. 
		Uwaga: Ponowne naniesienie pozwala uzyskać bardziej jednorodną próbkę peptyd/matryca i ułatwia uzyskanie wyraźnego sygnału. Standardową mieszaninę peptydów należy również połączyć z roztworem matrycy w stosunku 1:1 i nanieść (tylko raz) na płytkę MALDI.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zebrać dane MALDI-ToF. Ze względu na wprowadzenie grupy metakryloamidowej do N-końca peptydydu, masa cząsteczkowa powinna zwiększyć się o 68 g/mol w stosunku do masy samego peptydu. 
	Uwaga: W przeciwieństwie do syntezy PEGDM, peptydy nie mogą być poddawane ponownej funkcjonalizacji, ponieważ podczas odszczuplania usuwane są grupy ochronne z aminokwasów o reaktywnych łańcuchach bocznych, co uniemożliwia zapewnienie selektywnej funkcjonalizacji N-końców.
	<ol>
		<li>Jeśli analiza MALDI (Rycina 5) wykaże, że peptyd został prawidłowo sfunkcjonalizowany, a wszystkie grupy ochronne zostały odpowiednio usunięte, peptyd można poddać dializie (w wodzie, przeciwko wodzie) i zebrać poprzez liofilizację w celu usunięcia pozostałych zanieczyszczeń (koktajlu do odszczuplania, eteru, usuniętych grup ochronnych itp.). Produkt w postaci stałej należy przenieść do małej probówki Eppendorfa i przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu użycia.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Lin, C. C., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PEG+Hydrogels+for+the+Controlled+Release+of+Biomolecules+in+Regenerative+Medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm.+Res%22%5BJournal%5D)">PEG Hydrogels for the Controlled Release of Biomolecules in Regenerative Medicine.</a> Pharm. Res. 26, 631-643 (2009).</li>
<li>Ifkovits, J. L., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review%3A+Photopolymerizable+and+degradable+biomaterials+for+tissue+engineering+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Review: Photopolymerizable and degradable biomaterials for tissue engineering applications.</a> Tissue Eng. 13, 2369-2385 (2007).</li>
<li>Peppas, N. A., Hilt, J. Z., Khademhosseini, A., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogels+in+biology+and+medicine%3A+From+molecular+principles+to+bionanotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Mater%22%5BJournal%5D)">Hydrogels in biology and medicine: From molecular principles to bionanotechnology.</a> Adv. Mater. 18, 1345-1360 (2006).</li>
<li>Lutolf, M. P., Hubbell, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+biomaterials+as+instructive+extracellular+microenvironments+for+morphogenesis+in+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Synthetic biomaterials as instructive extracellular microenvironments for morphogenesis in tissue engineering.</a> Nat. Biotechnol. 23, 47-55 (2005).</li>
<li>Benoit, D. S., Durney, A. R., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+heparin-functionalized+PEG+hydrogels+on+three-dimensional+human+mesenchymal+stem+cell+osteogenic+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The effect of heparin-functionalized PEG hydrogels on three-dimensional human mesenchymal stem cell osteogenic differentiation.</a> Biomaterials. 28, 66-77 (2007).</li>
<li>Benoit, D. S., Collins, S. D., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multifunctional+hydrogels+that+promote+osteogenic+human+mesenchymal+stem+cell+differentiation+through+stimulation+and+sequestering+of+bone+morphogenic+protein+2%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Funct.+Mater%22%5BJournal%5D)">Multifunctional hydrogels that promote osteogenic human mesenchymal stem cell differentiation through stimulation and sequestering of bone morphogenic protein 2.</a> Adv. Funct. Mater. 17, 2085-2093 (2007).</li>
<li>Fairbanks, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Versatile+Synthetic+Extracellular+Matrix+Mimic+via+Thiol-Norbornene+Photopolymerization%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Mater%22%5BJournal%5D)">A Versatile Synthetic Extracellular Matrix Mimic via Thiol-Norbornene Photopolymerization.</a> Adv. Mater. 21, 5005(2009).</li>
<li>Moon, J. J., Hahn, M. S., Kim, I., Nsiah, B. A., West, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micropatterning+of+Poly%28Ethylene+Glycol%29+Diacrylate+Hydrogels+with+Biomolecules+to+Regulate+and+Guide+Endothelial+Morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+A%22%5BJournal%5D)">Micropatterning of Poly(Ethylene Glycol) Diacrylate Hydrogels with Biomolecules to Regulate and Guide Endothelial Morphogenesis.</a> Tissue Eng. A. 15, 579-585 (2009).</li>
<li>Burdick, J. A., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoencapsulation+of+osteoblasts+in+injectable+RGD-modified+PEG+hydrogels+for+bone+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Photoencapsulation of osteoblasts in injectable RGD-modified PEG hydrogels for bone tissue engineering.</a> Biomaterials. 23, 4315-4323 (2002).</li>
<li>Yanez-Soto, B., Liliensiek, S. J., Murphy, C. J., Nealey, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemically+and+topographically+engineered+poly%28ethylene+glycol%29+diacrylate+hydrogels+with+biomimetic+characteristics+as+substrates+for+human+corneal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res.+A%22%5BJournal%5D)">Biochemically and topographically engineered poly(ethylene glycol) diacrylate hydrogels with biomimetic characteristics as substrates for human corneal epithelial cells.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 101A, 1184-1194 (2013).</li>
<li>Benoit, D. S. W., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heparin+functionalized+PEG+gels+that+modulate+protein+adsorption+for+hMSC+adhesion+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Heparin functionalized PEG gels that modulate protein adsorption for hMSC adhesion and differentiation.</a> Acta Biomater. 1, 461-470 (2005).</li>
<li>Lin-Gibson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+characterization+of+PEG+dimethacrylates+and+their+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Synthesis and characterization of PEG dimethacrylates and their hydrogels.</a> Biomacromolecules. 5, 1280-1287 (2004).</li>
<li>Anseth, K. S., Wang, C. M., Bowman, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reaction+Behavior+and+Kinetic+Constants+for+Photopolymerizations+of+Multi%28Meth%29Acrylate+Monomers%5BTitle%5D)+AND+%22Polymer%22%5BJournal%5D)">Reaction Behavior and Kinetic Constants for Photopolymerizations of Multi(Meth)Acrylate Monomers.</a> Polymer. 35 (94), 3243-3250 (1994).</li>
<li>Bencherif, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((End-group+effects+on+the+properties+of+PEG-co-PGA+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">End-group effects on the properties of PEG-co-PGA hydrogels.</a> Acta Biomater. 5, 1872-1883 (1016).</li>
<li>Rydholm, A. E., Bowman, C. N., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Degradable+thiol-acrylate+photopolymers%3A+polymerization+and+degradation+behavior+of+an+in+situ+forming+biomaterial%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Degradable thiol-acrylate photopolymers: polymerization and degradation behavior of an in situ forming biomaterial.</a> Biomaterials. 26, 4495-4506 (2005).</li>
<li>Zustiak, S. P., Leach, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrolytically+Degradable+Poly%28Ethylene+Glycol%29+Hydrogel+Scaffolds+with+Tunable+Degradation+and+Mechanical+Properties%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Hydrolytically Degradable Poly(Ethylene Glycol) Hydrogel Scaffolds with Tunable Degradation and Mechanical Properties.</a> Biomacromolecules. 11, 1348-1357 (2010).</li>
<li>Malkoch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+well-defined+hydrogel+networks+using+Click+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Commun%22%5BJournal%5D)">Synthesis of well-defined hydrogel networks using Click chemistry.</a> Chem. Commun. , 2774-2776 (2006).</li>
<li>Hoffman, M. D., Benoit, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+Ideas%3A+Engineering+the+Periosteum%3A+Revitalizing+Allografts+by+Mimicking+Autograft%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Emerging Ideas: Engineering the Periosteum: Revitalizing Allografts by Mimicking Autograft.</a> , (2012).</li>
<li>Hoffman, M. D., Xie, C., Zhang, X., Benoit, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+mesenchymal+stem+cells+delivered+via+hydrogel-based+tissue+engineered+periosteum+on+bone+allograft+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The effect of mesenchymal stem cells delivered via hydrogel-based tissue engineered periosteum on bone allograft healing.</a> Biomaterials. , (2013).</li>
<li>Hubbell, J. A., Lutolf, M. P., Raeber, G. P., Zisch, A. H., Tirelli, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-responsive+synthetic+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Mater%22%5BJournal%5D)">Cell-responsive synthetic hydrogels.</a> Adv. Mater. 15, 888-892 (2003).</li>
<li>Lidstrom, P., Tierney, J., Wathey, B., Westman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microwave+assisted+organic+synthesis+-+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Tetrahedron%22%5BJournal%5D)">Microwave assisted organic synthesis - a review.</a> Tetrahedron. 57, 9225-9283 (2001).</li>
<li>Khetan, S., Burdick, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+encapsulation+in+3D+hydrogels+for+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Cellular encapsulation in 3D hydrogels for tissue engineering.</a> J. Vis. Exp. (32), e1590(2009).</li>
<li>Antonios, M., Kurtis, K., Lucas, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drying+poly%28ethylene+glycol%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc.+Exchange%22%5BJournal%5D)">Drying poly(ethylene glycol).</a> Nat. Protoc. Exchange. , (2012).</li>
<li>Nicolas, J., Mantovani, G., Haddleton, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Living+radical+polymerization+as+a+tool+for+the+synthesis+of+polymer-protein%2Fpeptide+bioconjugates%5BTitle%5D)+AND+%22Macromol.+Rapid+Comm%22%5BJournal%5D)">Living radical polymerization as a tool for the synthesis of polymer-protein/peptide bioconjugates.</a> Macromol. Rapid Comm. 28, 1083-1111 (2007).</li>
<li>Nuttelman, C. R., Benoit, D. S. W., Tripodi, M. C., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+ethylene+glycol+methacrylate+phosphate+in+PEG+hydrogels+on+mineralization+and+viability+of+encapsulated+hMSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The effect of ethylene glycol methacrylate phosphate in PEG hydrogels on mineralization and viability of encapsulated hMSCs.</a> Biomaterials. 27, 1377-1386 (2006).</li>
<li>Hern, D. L., Hubbell, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporation+of+adhesion+peptides+into+nonadhesive+hydrogels+useful+for+tissue+resurfacing%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res%22%5BJournal%5D)">Incorporation of adhesion peptides into nonadhesive hydrogels useful for tissue resurfacing.</a> J. Biomed. Mater. Res. 39, 266-276 (1998).</li>
<li>Andreopoulos, F. M., Beckman, E. J., Russell, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-induced+tailoring+of+PEG-hydrogel+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Light-induced tailoring of PEG-hydrogel properties.</a> Biomaterials. 19, 1343-1352 (1998).</li>
<li>Merrill, E. W., Dennison, K. A., Sung, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partitioning+and+Diffusion+of+Solutes+in+Hydrogels+of+Poly%28Ethylene+Oxide%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Partitioning and Diffusion of Solutes in Hydrogels of Poly(Ethylene Oxide).</a> Biomaterials. 14, 1117-1126 (1993).</li>
<li>Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+elasticity+directs+stem+cell+lineage+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Matrix elasticity directs stem cell lineage specification.</a> Cell. 126, 677-689 (2006).</li>
<li>Weber, L. M., Lopez, C. G., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+PEG+hydrogel+crosslinking+density+on+protein+diffusion+and+encapsulated+islet+survival+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res.+A%22%5BJournal%5D)">Effects of PEG hydrogel crosslinking density on protein diffusion and encapsulated islet survival and function.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 90A, 720-729 (2009).</li>
<li>Mellott, M. B., Searcy, K., Pishko, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Release+of+protein+from+highly+cross-linked+hydrogels+of+poly%28ethylene+glycol%29+diacrylate+fabricated+by+UV+polymerization%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Release of protein from highly cross-linked hydrogels of poly(ethylene glycol) diacrylate fabricated by UV polymerization.</a> Biomaterials. 22, 929-941 (2001).</li>
<li>Watkins, A. W., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+molecular+transport+and+distributions+in+poly%28ethylene+glycol%29+hydrogels+with+confocal+laser+scanning+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Investigation of molecular transport and distributions in poly(ethylene glycol) hydrogels with confocal laser scanning microscopy.</a> Macromolecules. 38, 1326-1334 (2005).</li>
<li>Anseth, K. S., Benoit, D. S. W., Durney, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manipulations+in+hydrogel+degradation+behavior+enhance+osteoblast+function+and+mineralized+tissue+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Manipulations in hydrogel degradation behavior enhance osteoblast function and mineralized tissue formation.</a> Tissue Eng. 12, 1663-1673 (2006).</li>
<li>Hillwest, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevention+of+Postoperative+Adhesions+in+the+Rat+by+in-Situ+Photopolymerization+of+Bioresorbable+Hydrogel+Barriers%5BTitle%5D)+AND+%22Obstet.+Gynecol%22%5BJournal%5D)">Prevention of Postoperative Adhesions in the Rat by in-Situ Photopolymerization of Bioresorbable Hydrogel Barriers.</a> Obstet. Gynecol. 83, 59-64 (1994).</li>
<li>Sawhney, A. S., Pathak, C. P., Hubbell, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioerodible+Hydrogels+Based+on+Photopolymerized+Poly%28Ethylene+Glycol%29-Co-Poly%28Alpha-Hydroxy+Acid%29+Diacrylate+Macromers%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Bioerodible Hydrogels Based on Photopolymerized Poly(Ethylene Glycol)-Co-Poly(Alpha-Hydroxy Acid) Diacrylate Macromers.</a> Macromolecules. 26, 581-587 (1993).</li>
<li>Skaalure, S. C., Milligan, I. L., Bryant, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age+impacts+extracellular+matrix+metabolism+in+chondrocytes+encapsulated+in+degradable+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Mater%22%5BJournal%5D)">Age impacts extracellular matrix metabolism in chondrocytes encapsulated in degradable hydrogels.</a> Biomed. Mater. 7, 024111-0210 (2012).</li>
<li>Hoffman, M. D., Benoit, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agonism+of+Wnt-beta-catenin+signalling+promotes+mesenchymal+stem+cell+%28MSC%29+expansion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Tissue.+Eng.+Regen.+Med%22%5BJournal%5D)">Agonism of Wnt-beta-catenin signalling promotes mesenchymal stem cell (MSC) expansion.</a> J. Tissue. Eng. Regen. Med. , (2013).</li>
<li>Sawhney, A. S., Pathak, C. P., Vanrensburg, J. J., Dunn, R. C., Hubbell, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+Photopolymerized+Bioerodible+Hydrogel+Properties+for+Adhesion+Prevention%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res%22%5BJournal%5D)">Optimization of Photopolymerized Bioerodible Hydrogel Properties for Adhesion Prevention.</a> J. Biomed. Mater. Res. 28, 831-838 (1994).</li>
<li>Methacrylic Anhydride [Internet]. , Available from:
		
	 <a target="_blank" href="https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=AAAL14357-18">https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=AAAL14357-18</a> (2013).</li>
<li>Acrylic Anhydride [Internet]. , Available from:
		
	 <a target="_blank" href="http://www.polysciences.com/Catalog/Department/Product/98/productid--40/">http://www.polysciences.com/Catalog/Department/Product/98/productid--40/</a> (2013).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Hydrożele na bazie poli(glikolu etylenu) (PEG) są powszechnie stosowanymi biomateriałami w medycynie regeneracyjnej oraz w aplikacjach dostarczania leków1-3. Hydrożele te oferują znaczące zalety w porównaniu z innymi biomateriałami. Hydrożele PEG są syntetyczne, co w przeciwieństwie do ich naturalnych odpowiedników zapewnia wysoki stopień kontroli nad właściwościami inżynieryjnymi, takimi jak moduł sprężystości i szybkość degradacji1. Ponieważ są one pochodzenia syntetycznego, PEG charakteryzuje się znacznie mniejszą zmiennością między partiami niż materiały pochodzenia naturalnego4. Dzięki składowi chemicznemu PEG hydrożele te są silnie hydrofilowe, odporne na adsorpcję białek i biokompatybilne3. Ta odporność na adsorpcję białek sprawia, że hydrożele PEG mogą służyć jako „czysta karta”, umożliwiając badaczom analizowanie i badanie konkretnych czynników biologicznych lub chemicznych (leków, biomolekuł, peptydów adhezyjnych komórek, itp.) oraz specyficznych ról, jakie czynniki te odgrywają w kontrolowaniu zachowania komórek i/lub tkanek.
<img alt="Schemat struktur polimerów: polimery A-D; wiązania chemiczne; reprezentacja wzoru cząsteczkowego." fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50890/50890fig1.jpg" width="600px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
<a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50890/50890fig1highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz</a>.
Rysunek 1: Przykłady architektur poli(glikolu etylowego) (PEG). A) Liniowy PEG. B) PEG 4-ramienny z rdzeniem pentaerytrytolowym. C) PEG 8-ramienny z rdzeniem heksaglicerolowym. D) PEG 8-ramienny z rdzeniem tripentaerytrytolowym. n oznacza liczbę powtórzeń PEG w każdym ramieniu. Każde powtórzenie ma masę cząsteczkową 44 g/mol, zatem n można obliczyć na podstawie całkowitej masy cząsteczkowej oraz struktury/liczby ramion.
Prekursory PEG są dostępne w różnych architekturach i masach cząsteczkowych (Rycina 1). Zmiana architektury (liczby ramion) i liczby powtórzeń glikolu etylowego (n) w PEG może służyć do kontrolowania właściwości sieci hydrożelowych tworzonych z tych makromerów. Niemodyfikowany PEG zawiera terminalne grupy hydroksylowe, które przed formowaniem sieci hydrożelowych muszą zostać zastąpione inną funkcjonalnością, aby umożliwić kowalencyjne sieciowanie poprzez polimeryzację, która jest najczęściej stosowaną strategią sieciowania hydrożeli PEG. Istnieje wiele grup chemicznych, które można włączyć do makromerów PEG w celu ułatwienia polimeryzacji i sieciowania sieci (akrylan, metakrylan, eter winylowy, norbornen itp.). Pomimo różnorodności dostępnych funkcjonalności terminalnych ułatwiających sieciowanie, istnieją tylko dwa mechanizmy, według których może zachodzić polimeryzacja: wzrost stopniowy i wzrost łańcuchowy (lub mieszanka obu, tryb mieszany).
<img alt="Schemat sieci polimerowej: sieciowanie w poli(metakrylanie) a poli(glikol etylenowy)." fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50890/50890fig2.jpg" width="600px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
<a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50890/50890fig2highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz</a>.
Rysunek 2: Schemat teoretycznej sieci hydrożelowej. A) Tradycyjna polimeryzacja z przyrostami łańcucha prowadzi do powstania niejednorodnych sieci zawierających gęste obszary sieciowania poli(metakrylanu) oraz zwiększoną liczbę nieidealności sieci, takich jak pętle, niezareagowane prekursory i trwałe sploty. B) Polimeryzacja stopniowa prowadzi do powstania znacznie bardziej jednorodnych struktur sieciowych (nie w skali).
Funkcje, które sieciują poprzez polimeryzację z przyrostami łańcucha, nie wymagają obecności dodatkowego sieciowania. Jednakże hydrożele polimeryzowane łańcuchowo tworzą heterogeniczne struktury sieci zawierające obszary o gęstym sieciowaniu (Rysunek 2A)1. W przeciwieństwie do tego, polimeryzacja stopniowa wymaga zastosowania sieciowca lub komonomeru, który jest reaktywny względem końcowych grup funkcyjnych makromerów PEG. Ponieważ końcowe grupy funkcyjne w PEG mogą reagować tylko z sieciowcem, a sieciowiec może reagować tylko z końcowymi grupami funkcyjnymi w PEG, prowadzi to do większej homogeniczności struktury sieci (Rysunek 2B)1. Polimeryzacje stopniowe zazwyczaj prowadzą również do wyższego stopnia konwersji grup funkcyjnych, co zmniejsza ilość niereagujących prekursorów oraz potencjał do odpowiedzi immunologicznych/zapalnych wywołanych przez rozpuszczalne, nieinkorporowane makromery1. Opracowano również metody polimeryzacji mieszanej, które łączą polimeryzację stopniową i łańcuchową poprzez zastosowanie makromerów zdolnych zarówno do samoreakcji (przyrost łańcucha), jak i do reakcji z sieciowcem (polimeryzacja stopniowa). Pozwala to na wytwarzanie hydrożeli o charakterystyce obu mechanizmów polimeryzacji i umożliwia tworzenie bardziej złożonych, zróżnicowanych struktur sieci niż w przypadku samych sieci tworzonych metodą stopniową lub łańcuchową1.
Choć istnieje wiele grup funkcyjnych, które można wykorzystać do funkcjonalizacji PEG i ułatwienia tworzenia hydrożeli, metakrylany i norborneny są odpowiednio jednymi z najczęstszych motywów polimeryzacji wzrostu łańcuchowego i wzrostu stopniowego. Obie te funkcjonalności oferują doskonałą kontrolę spatiotemporalną nad polimeryzacją sieci, a w przypadku enkapsulacji komórek sieci te wspierają wysoką ogólną przeżywalność komórek5-7. PEG funkcjonalizowany dimetakrylanem (PEGDM) sieciuje poprzez polimeryzację łańcuchową i pozwala na włączenie biomolekuł lub innych czynników poprzez kopolimeryzację z biomolekułami funkcjonalizowanymi akrylanami, metakrylanami lub podobnymi grupami5,6. Hydrożele PEGDM mają znaczące zalety nad alternatywnymi systemami polimeryzacji wzrostu łańcuchowego, takimi jak PEG funkcjonalizowany akrylanem (PEGDA). Stosując tradycyjne metody, PEGDA może być syntetyzowany szybciej niż PEGDM; jednak przy zastosowaniu syntezy wspomaganej mikrofalowo, synteza PEGDM jest jeszcze bardziej efektywna. PEGDA jest często syntetyzowany w reakcjach trwających całą noc8 lub 24 h9, ale może być również syntetyzowany w ciągu czterech godzin w podwyższonych temperaturach10. PEGDM jest również tradycyjnie syntetyzowany poprzez reakcję trwającą całą noc11 lub 24 h5, przy czym niektóre metody wydłużają czas reakcji do 4 dni12. Stosując zaprezentowaną tutaj metodę wspomaganą mikrofalowo, PEGDM może zostać otrzymany w reakcji trwającej 5 min. Chociaż PEGDM wykazuje wolniejszą kinetykę reakcji niż PEGDA13, reakcja sieciowania PEGDM jest nadal szybka, zachodzi w ciągu kilku minut i osiąga większą konwersję makromerów niż PEGDA, ponieważ zwiększona hydrofobowość grupy metakrylanowej zwiększa agregację grup funkcyjnych w roztworze, co tym samym zwiększa prawdopodobieństwo przeniesienia rodnika i konwersji metakrylanu14. Hydrożele PEGDM wiążą się również ze zwiększoną żywotnością i wzrostem komórek w porównaniu z hydrożelami PEGDA, prawdopodobnie z powodu zmniejszenia szybkości reakcji w dowolnym momencie, co redukuje stężenie rodników i obecność nieprzereagowanych makromerów14. Polimeryzacje tiol-en, takie jak te z wykorzystaniem PEG funkcjonalizowanego norbornenem (PEGN), tworzą hydrożele poprzez polimeryzację wzrostu stopniowego i wymagają użycia PEGN oraz sieciującego, które zawierają średnio więcej niż dwie grupy funkcyjne. Ponieważ rodniki tiylowe reagują z wiązaniami podwójnymi węgiel-węgiel norbornenu, do sieciowania hydrożeli PEGN powszechnie stosuje się sieciujące zawierające wiele grup tiolowych, co umożliwia łatwe włączenie peptydów z funkcjonalnościami aminokwasów cysteiny7. Choć istnieje wiele innych metod chemicznych reagujących poprzez polimeryzację wzrostu stopniowego (reakcje addycji Michaela, takie jak tiol-akrylan15 i tiol-winylo sulfon16, reakcje „Click”, takie jak alkiniowo-azydkowe17 itp.), hydrożele tiol-norbornenowe są bardzo powszechne, ponieważ naprężenie pierścienia norbornenowego znacząco zwiększa szybkość reakcji i zmniejsza szansę na polimeryzację łańcuchową wiązania podwójnego norbornenu7.
Wybór pomiędzy funkcjonalizacją metakrylanową, norbornenową lub alternatywną w celu ułatwienia tworzenia hydrożelu zależy w dużej mierze od przyjętego podejścia. Na przykład wykazano, że sieci PEGDM polimeryzowane z wzrostem łańcucha są odpowiednie do kontrolowania lokalizacji komórek podczas opracowywania periostum w inżynierii tkankowej18,19. Sieci PEG polimeryzowane ze wzrostem stopniowym lepiej nadają się do włączania sekwencji peptydowych w celu ułatwienia enzymatycznej degradacji hydrożelu, ze względu na łatwość wprowadzania sekwencji substratów enzymatycznych z wykorzystaniem peptydów zawierających tiol (cysteinę) oraz makromerów funkcjonalizowanych norbornenem20. Jeśli postawione pytanie badawcze będzie najlepiej rozwiązane poprzez zastosowanie hydrożeli o polimeryzacji stopniowej, Fairbanks et al. przedstawiają szczegółowy opis strategii funkcjonalizacji PEG norbornenem7. Niniejszy artykuł szczegółowo opisze, w jaki sposób PEG i sekwencje peptydowe mogą zostać funkcjonalizowane (metakrylanem w przypadku PEG i metakryloamidem w przypadku peptydów) na potrzeby reakcji polimeryzacji z wzrostem łańcucha.
Tradycyjnie PEGDM otrzymuje się w reakcji PEG z chlorkiem metakryloilu i trietyloaminą w dichlorometanie. Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez noc11 lub 24 h5, a w niektórych metodach czas reakcji wydłuża się do 4 dni12 przed filtracją, wytrąceniem w eterze dietylowym i zebraniem produktu. Choć istnieje wiele wariantów tego podejścia, wszystkie są czasochłonne, wymagają szerokiego zaplecza aparatury do syntezy chemicznej i nie są przyjazne dla środowiska, ponieważ wiążą się z użyciem stosunkowo dużych ilości wysokiej czystości odczynników i rozpuszczalnika. Aby obejść te ograniczenia, Lin-Gibson et al. opracowali metodę funkcjonalizacji PEG końcowymi grupami metakrylanowymi (Rysunek 3A) z wykorzystaniem mikrofal i bez użycia rozpuszczalnika12. W tej reakcji końcowe grupy alkoholowe PEG reagują z jednym z atomów karbonylowych bezwodnika metakrylowego, tworząc grupę karboksylową. W ten sposób powstaje produkt PEGDM, a produktem ubocznym jest kwas metakrylowy. Synteza ta posiada wiele charakterystycznych zalet syntezy mikrofalowej, w tym skrócony czas reakcji oraz bezrozpuszczalnikowy przebieg procesu21. Synteza mikrofalowa jest preferowana względem omówionych wcześniej metod, ponieważ jest znacznie szybsza, wymaga mniej rozbudowanej aparatury do syntezy (np. szkła laboratoryjnego, płyt reakcyjnych) oraz zużywa mniejsze całkowite ilości odczynników i rozpuszczalników, gdyż rozpuszczalniki są potrzebne jedynie do oczyszczania/zbierania produktu, a nie do syntezy, co czyni ją bardziej ekonomiczną i przyjazną dla środowiska.
<img alt="Równania syntezy polimerów z wykorzystaniem mikrofal dla reakcji bezwodnika metakrylowego; schemat procesu chemicznego." fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50890/50890fig3.jpg" width="600px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> 
<a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50890/50890fig3highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększony obraz</a>.
Rysunek 3: Schematy funkcjonalizacji. A) Poli(glikol etylenowy) jest poddawany reakcji z 10-krotnym nadmiarem molowym bezwodnika metakrylowego w celu otrzymania metakrylanu poli(glikolu etylenowego). B) Tę samą metodę można zastosować do funkcjonalizacji N-końca sekwencji peptydowych, tworząc peptyd funkcjonalizowany metakryloamidem. Poprzez przeprowadzenie tej procedury przed odszczepieniem peptydu z żywicy, możliwa jest selektywna funkcjonalizacja N-końca, ponieważ grupy boczne aminokwasów pozostają chronione. n: liczba powtórzeń PEG w makromerze (odpowiednio n=45,5, 227 i 455 dla użytych liniowych PEG o masach 2, 10 i 20 kDa). R1 do RN: łańcuchy boczne aminokwasów. PG1 do PGN: grupy chroniące łańcuchy boczne. TFA: kwas trifluorooctowy. TIPS: triizopropylosilan. DODT: 3,6-doksa-1,8-oktanoditiol. H2O: woda.
Metoda metakrylowania wspomaganego mikrofalowo została niedawno zaadaptowana przez nasz zespół w celu funkcjonalizacji N-końca peptydów grupami metakryloamidowymi (Rycina 3B), aby ułatwić włączanie peptydów do różnych polimerów i sieci polimerowych. W tej reakcji amina pierwszorzędowa N-końca peptydu reaguje z atomem karbonylu w bezwodniku metakrylowym, tworząc amid. W wyniku tego procesu powstaje funkcjonalizowany metakryloamidem peptyd, a jako produkt uboczny powstaje kwas metakrylowy. Podczas stosowania tej procedury do funkcjonalizacji N-końca sekwencji peptydowych ważne jest, aby aminokwasy zawierające reaktywne łańcuchy boczne (aminy pierwszorzędowe (lizyna), alkohole (seryna, treonina) oraz fenole (tyrozyna)) były chronione podczas funkcjonalizacji, a grupy ochronne były usuwane dopiero po włączeniu grupy metakryloamidowej.
W niniejszym artykule zaprezentowano obie wspomagane mikrofalowo metody syntezy PEGDM oraz funkcjonalizacji sekwencji peptydowych na żywicy, zwracając uwagę na częste błędy i sugerując metody rozwiązywania problemów. W artykule szczegółowo opisano metody przeprowadzania analitycznych technik chemicznych powszechnie stosowanych do oceny funkcjonalizacji produktu oraz przedstawiono sugestie i zasoby dotyczące przeprowadzania bardziej zaawansowanych modyfikacji. Zaprezentowano typowe wyniki, obejmujące wykorzystanie zsyntetyzowanego PEGDM do tworzenia sieci hydrożelowych, wykorzystanie powstałych hydrożeli do kontrolowanego uwalniania leku modelowego oraz zastosowanie funkcjonalizowanych peptydów w celu ułatwienia oddziaływań komórka-hydrożel. Szczególną uwagę poświęcono charakterystyce rozmiaru oczek hydrożelu oraz omówieniu sposobów dostrajania składu hydrożelu w celu wpływania na tę podstawową właściwość fizyczną, która z kolei kontroluje właściwości materiału w skali makroskopowej, takie jak sztywność i profil uwalniania leku.

<table><tbody><tr><td>3,6-dioksa-1,8-oktanedithiol</td><td>Tokyo Chemical Industry Co, LTD</td><td>D2649</td><td>CAS 14970-87-7</td></tr><tr><td>Acetonitryl</td><td>J.T. Baker</td><td>UN1648</td><td>CAS 75-05-8</td></tr><tr><td>Aminokwasy</td><td>AAPPTech</td><td>Glicyna: AFG101</td><td>CAS 29022-11-5</td></tr><tr><td> </td><td></td><td>Arginina: AFR105</td><td>CAS 154445-77-9</td></tr><tr><td> </td><td></td><td>Asparagina: AFD105</td><td>CAS 71989-14-5</td></tr><tr><td> </td><td></td><td>Seryna: AFS105</td><td>CAS 71989-33-8</td></tr><tr><td>Bezwodny eter dietylowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>UN1155</td><td>CAS 60-29-7</td></tr><tr><td>Kwas cytrynowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C1857</td><td>CAS 77-92-9</td></tr><tr><td>Deuterowany chloroform</td><td>Cambridge Isotope Laboratories Inc.</td><td>DLM-7-100</td><td>CAS 865-49-6</td></tr><tr><td>Dichlorometan</td><td>Fisher Scientific</td><td>UN1593</td><td>CAS 75-09-2</td></tr><tr><td>Diizopropyloetyloamina</td><td>Alfa Aesar</td><td>A1181</td><td>CAS 7087-68-5</td></tr><tr><td>Dimetyloformamid</td><td>Fisher Scientific</td><td>D119-4</td><td>CAS 68-12-2</td></tr><tr><td>Peptydy</td><td>z żywicy Fmoc-Gly-Wang</td> International <td>RGF-1301-PI</td><td>100-200 rozmiar oczek</td></tr><tr><td>Metakryl bezwodnik</td><td>Alfa Aesar</td><td>L14357</td><td>CAS 760-93-0</td></tr><tr><td>N-metylopirolidon</td><td>VWR</td><td>BDH1141-4LG</td><td>CAS 872-80-4</td></tr><tr><td>Peptydy żywiczne</td><td>Syntetyzowane we własnym zakresie</td><td></td><td>peptydy żywiczne można również kupić w Peptides International, GenScript, AAPPTec, etc.</td></tr><tr><td>O-benzotriazol-N,N,N',N',N'--tetrametylo-uronowo-heksafluorofosforan</td><td>AnaSpec Inc</td><td>510/791-9560</td><td>CAS 94790-37-1</td></tr><tr><td>Kalibracja peptydów Standardowa</td><td>pielęgnacja</td><td>206195</td><td></td></tr><tr><td>Piperazyna</td><td>Alfa Aesar</td><td>A15019</td><td>CAS 11-85-0</td></tr><tr><td>Poli(glikol etylenowy) 2 kDa</td><td>liniowy Alfa Aesar</td><td>B22181</td><td>CAS 25322-68-3</td></tr><tr><td>Poli(glikol etylenowy) 10 kDa liniowy</td><td>Alfa Aesar</td><td>B21955</td><td></td></tr><tr><td>Poli(glikol etylenowy) 20 kDa linear</td><td>Sigma Aldrich</td><td>81300</td><td>JenKem Technologies USA jest alternatywnym dostawcą liniowego i wieloramiennego PEG</td></tr><tr><td>Tioanizol</td><td>Alfa Aesar</td><td>L5464</td><td>CAS 100-68-5</td></tr><tr><td>Kwas trifluorooctowy</td><td>Alfa</td><td>Aesar A12198</td><td>CAS 76-05-1</td></tr><tr><td>Triizopropylosilan</td><td>Alfa Aesar</td><td>L09585</td><td>CAS 6485-79-6</td></tr><tr><td>&alfa;-cyjano-4-hydroksycynamonowy kwas</td><td>Tokio Przemysł chemiczny Co, LTD</td><td>C1768</td><td>CAS 28166-41-8</td></tr></tbody></table>

wspomagana mikrofalami funkcjonalizacja peptydów poli(glikolu etylenowego) i żywicy do stosowania w polimeryzacji łańcuchowej i tworzeniu hydrożelu

Microwave-assisted Functionalization of Poly(ethylene glycol) and On-resin Peptides for Use in Chain Polymerizations and Hydrogel Formation

Jedną z głównych zalet stosowania makromerów poli(glikolu etylenowego) (PEG) w tworzeniu hydrożeli jest uniwersalność syntezy. Możliwość czerpania z szerokiej gamy mas molekularnych i konfiguracji PEG (liczba ramion, długość ramienia i wzór rozgałęzień) zapewnia naukowcom ścisłą kontrolę nad uzyskanymi strukturami i właściwościami hydrożelu, w tym modułem Younga i rozmiarem oczek. Ten film zilustruje szybką, wydajną, bezrozpuszczalnikową, wspomaganą mikrofalami metodę metakrylanowania prekursorów PEG do dimetakrylanu poli(glikolu etylenowego) (PEGDM). Ta syntetyczna metoda zapewnia bardzo potrzebne materiały wyjściowe do zastosowań w dostarczaniu leków i medycynie regeneracyjnej. Przedstawiona metoda jest lepsza od tradycyjnych metod metakrylacji, ponieważ jest znacznie szybsza i prostsza, a także bardziej ekonomiczna i przyjazna dla środowiska, przy użyciu mniejszych ilości odczynników i rozpuszczalników. Zademonstrujemy również adaptację tej techniki do funkcjonalizacji peptydów metakrylamidem na żywicy. Ta metoda na żywicy pozwala na funkcjonalizację N-końca peptydów grupami metakrylamidowymi przed deprotekcją i rozszczepieniem z żywicy. Pozwala to na selektywne dodawanie grup metakryloamidowych do N-końców peptydów, podczas gdy aminokwasy z reaktywnymi grupami bocznymi (np. pierwszorzędowa amina lizyny, pierwszorzędowy alkohol seryny, drugorzędowe alkohole treoniny i fenol tyrozyny) pozostają chronione, zapobiegając funkcjonalizacji w wielu miejscach. W tym artykule szczegółowo omówiono popularne metody analityczne (spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego protonów (;H-NMR) i spektrometria mas czasu przelotu z desorpcją laserową wspomaganą matrycą (MALDI-ToF)) w celu oceny efektywności funkcjonalizacji. Omówione zostaną typowe pułapki i sugerowane metody rozwiązywania problemów, a także modyfikacje techniki, które można wykorzystać do dalszego dostrajania funkcjonalności makromerów oraz wynikających z nich właściwości fizycznych i chemicznych hydrożelu. Zademonstrowane zostanie zastosowanie syntetyzowanych produktów do tworzenia hydrożeli do dostarczania leków i badań interakcji komórka-materiał, ze szczególnym uwzględnieniem modyfikacji składu hydrożelu w celu wpływu na rozmiar siatki, kontrolowania sztywności hydrożelu i uwalniania leku.

Protonowy rezonans magnetyczny jądra (¹H-NMR) jest jedną z najczęściej stosowanych technik analitycznych do oceny wydajności reakcji chemicznej, ponieważ pole pod każdym pikiem widma jest proporcjonalne do względnej zawartości danego protonu w próbce, co pozwala na określenie stosunku produktu do substratu. W przypadku tej reakcji analizę 1H-NMR (Rysunek 4) można wykorzystać do obliczenia % funkcjonalizacji na podstawie zaobserwowanego stosunku teoretycznego protonów końcowych grup metakrylanowych (a, b i c) do centralnych protonów PEG (d). PEGDM przedstawiony na Rysunku 4 przed funkcjonalizacją miał masę 2 000 Da; zatem n=2 000 Da/(44 Da/powtórzenie PEG) = 45,5, więc d=4*(n-1)=178, co daje stosunek protonów do jednostki NMR wynoszący 178/102,16=1,74. W tym przypadku piku a nie można wykorzystać do oceny % funkcjonalizacji, ponieważ obecność wody w próbce sztucznie zwiększa pole pod pikiem. Przy użyciu piku b % funkcjonalizacji wynosi 1,00*1,74/2*100%=87,1%; przy użyciu piku c % funkcjonalizacji wynosi 1,08*1,74/2*100%=94,1%. Zatem całkowita % funkcjonalizacja wynosi 91% i ten PEGDM jest odpowiednio funkcjonalizowany do zastosowania w syntezie hydrożelu. Typowo po jednej rundzie metakrylowania osiąga się około 90% funkcjonalizacji.
Ze względu na mnogość sygnałów protonowych pojawiających się w analizie 1H-NMR peptydów, funkcjonalizację peptydów łatwiej badać za pomocą spektrometrii mas MALDI-ToF. Zostało to zademonstrowane na Rysunku 5, gdzie zsyntetyzowano peptyd GKRGDSG i poddano go funkcjonalizacji metakryloamidem. Niewielką frakcję peptydu odszczepiono w celu oceny masy cząsteczkowej przed funkcjonalizacją (Rysunek 5A), co wykazało wystąpienie piku masy cząsteczkowej przy 676 g/mol, co odpowiada oczekiwanej masie cząsteczkowej peptydu i wskazuje na poprawną syntezę sekwencji peptydowej. Pozostała część peptydu została poddana funkcjonalizacji metakryloamidem przed odszczepieniem. Ponieważ peptyd ten zawiera aminokwasy R chronione grupą Pbf, odszczepianie przeprowadzono w koktajlu zawierającym tioanizol przez 4 hr. Po funkcjonalizacji metakryloamidem obserwowany pik masy cząsteczkowej pojawia się przy 744 g/mol (Rysunek 5B), co jest oczekiwaną masą peptydu funkcjonalizowanego metakryloamidem (676+68 g/mol), a nie oczekiwaną masą cząsteczkową peptydu niefunkcjonalizowanego, co wskazuje na poprawną funkcjonalizację.
Aby zademonstrować funkcjonalność zarówno PEG, jak i funkcjonalizowanego metakrylamidem peptydy, przygotowano hydrożele PEGDM z dodatkiem oraz bez dodatku 0,5 mM funkcjonalizowanego metakrylamidem GKRGDSG (Rycina 6). Hydrożele przygotowano z zastosowaniem 10% masowo liniowego PEGDM 10 kDa w PBS, z dodatkiem 0,05% masowo fenylo-2,4,6-trimetylobenzoilofosfinianu litu (LAP) jako fotoinicjatora. Roztwór prekursorowy hydrożelu wstrzyknięto pomiędzy dwa szkiełka przedmiotowe oddzielone dystanserem ze szkiełka i zabezpieczono zaciskami biurowymi. Następnie roztwór prekursorowy naświetlano światłem UV o długości fali 365 nm z mocą 2 mW/cm2 przez 10 min w celu wywołania sieciowania, po czym za pomocą wycinaka cylindrycznego pobrano żele o średnicy 8 mm. Żele przepłukano w PBS i pozostawiono do pęcznienia przez 2 dni, aby zapewnić osiągnięcie warunków równowagi pęcznienia16,20. Ludzkie MSC (pasaż 3) hodowano do 80% konfluencji, a następnie wysiano na hydrożele w zagęszczeniu 15 000 komórek/cm2. Pozwolono komórkom przytwierdzić się przez 48 h przed przeniesieniem do świeżego medium zawierającego 0,5 µl/ml kalceiny AM oraz 2 µl/ml etydium homodimeru (zestaw LIVE/DEAD Viability od Invitrogen) i obrazowano w kontraście fazowym oraz fluorescencyjnym przy powiększeniu 10X przy użyciu mikroskopu Nikon Eclipse Ti 2000. MSC nie były w stanie przytwierdzić się do niefunkcjonalizowanych hydrożeli PEG (Rycina 6A), lecz po dodaniu peptydy adhezyjnego RGD były w stanie przytwierdzić się i rozprzestrzenić na powierzchni hydrożelu (Rycina 6B). Przedstawione obrazy LIVE/DEAD nie reprezentują żywotności wysianej populacji MSC, ponieważ MSC są komórkami zależnymi od adhezji, które po obumarciu odrywają się od powierzchni żelu i zostaną usunięte podczas procesu wymiany medium, co prowadzi do sztucznego zawyżenia żywotności wysianych komórek. Obrazy fluorescencyjne mają raczej służyć do odróżnienia przytwierdzonych komórek od niewielkich różnic w topografii hydrożelu, co może być trudne przy zastosowaniu samego kontrastu fazowego. Co ciekawe, nieprzylegające komórki wysiane na żele zawierające tylko PEG barwią się dodatnio zarówno na kalceinę AM, jak i na etydium homodimer, co wskazuje, że komórki obumierały w momencie obrazowania.
Jedną z wielu zalet hydrożeli PEG jest ich wysoka możliwość dostrojenia. Modyfikacja konkretnego składu hydrożelu PEG zapewnia badaczom wysoki stopień kontroli nad właściwościami takimi jak moduł sprężystości. Jak pokazano na Rysunku 7, zarówno masa cząsteczkowa PEG (Rysunek 7A), jak i zawartość procentowa masy (Rysunek 7B) wpływają na rozmiar oczek hydrożelu (ξ) oraz wynikową sztywność hydrożelu i szybkość uwalniania enkapsulowanych leków. Wykazano to poprzez wytworzenie hydrożeli z PEGDM o różnej masie cząsteczkowej i zbadanie wynikowego modułu oraz rozmiaru oczek hydrożelu (Rysunek 8). Wszystkie hydrożele zostały przygotowane z 10 wt% liniowego PEGDM w PBS, z zastosowaniem 0,05 wt% LAP jako fotoinicjatora. 40 µl roztworu prekursora hydrożelu umieszczono w strzykawkach o pojemności 1 ml z odciętymi końcówkami i naświetlano światłem UV o długości fali 365 nm przy natężeniu 2 mW/cm2 przez 10 min w celu utworzenia hydrożeli, uzyskując geometrie cylindryczne o średnicy około 5 mm i wysokości 2 mm. Żele pozostawiono do pęcznienia w PBS przez 2 dni przed badaniami mechanicznymi. Moduł hydrożelu określono za pomocą urządzenia MTS QT/5 z ogniwem obciążeniowym 5 N, kompresując od 5 do 10% początkowej wysokości hydrożelu z prędkością 0,1 mm/sec. Po zakończeniu badań mechanicznych rozmiar oczek określono poprzez pomiar masy hydrożelu przed (Ms) i po (MD) 24 h liofilizacji za pomocą równania Flory-Rehnera, zgodnie z opisem w sekcji dyskusji, a obliczenia wykonano w programie MATLAB. Zgodnie z hipotezą, zwiększenie masy cząsteczkowej makromeru PEG spowodowało zwiększenie rozmiaru oczek hydrożelu (Rysunek 8A) i zmniejszenie jego sztywności (Rysunek 8B). Rozmiar oczek hydrożelu i wynikowa sztywność żelu mogą być również kontrolowane poprzez zmianę zawartości procentowej masy PEG. Wytworzono hydrożele o różnym wt% liniowego PEGDM 10 kDa, a sztywność i rozmiar oczek hydrożelu określono w sposób opisany wcześniej (Rysunek 9). Jak pokazano na Rysunku 7B, zwiększenie wt% PEG powoduje znaczny spadek rozmiaru oczek (Rysunek 9A) i wzrost sztywności hydrożelu (Rysunek 9B).
Hydrożele zawierające enkapsulowaną albuminę surowiczą bydlęcą (BSA) utworzono przy użyciu PEG o różnej masie cząsteczkowej (2, 10 i 20 kDa). Wszystkie hydrożele przygotowano z 10% wagowo PEGDM w PBS zawierającym 50 µg/ml BSA, zgodnie z opisem dla Rysunku 6. Żele inkubowano w 1 ml PBS w temperaturze 37 °C i przenoszono do świeżego PBS w każdym punkcie czasowym. Ilość uwolnionej BSA oznaczono za pomocą testu Bradforda firmy Thermo Scientific. Rozmiar oczek hydrożelu określono zgodnie z opisem dla Rysunku 8. Jak pokazano na Rysunku 7A, uwalnianie BSA zachodzi szybciej z hydrożeli utworzonych przy użyciu PEGDM o wyższej masie cząsteczkowej, co jest wynikiem większego rozmiaru oczek wewnątrz hydrożelu (Rysunek 10).
<img alt="Widmo NMR, diagram przesunięcia chemicznego, struktura cząsteczkowa, analiza protonowa, wynik spektroskopii" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50890/50890fig4.jpg" width="500px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Reprezentatywne widmo 1H-NMR liniowego PEGDM o masie 2 kDa funkcjonalizowanego metodą wspomaganą mikrofalowo. Procent funkcjonalizacji można obliczyć na podstawie zaobserwowanego teoretycznego stosunku protonów końcowych grupy metakrylowej (a, b i c) do protonów centralnego łańcucha PEG (d). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50890/50890fig4highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz</a>.
<img alt="Wykres rozkładu masy cząsteczkowej; intensywność względem masy; wartości oczekiwane 676, 744 g/mol; analiza." fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50890/50890fig5.jpg" width="500px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5. Reprezentatywne widmo MALDI-ToF peptydu GKRGDSG (A) przed i (B) po funkcjonalizacji z wykorzystaniem metody wspomaganej mikrofalowo. Należy zauważyć, że obserwowany pik masy cząsteczkowej po funkcjonalizacji występuje przy 744 g/mol, co jest oczekiwaną masą peptydu funkcjonalizowanego metakryloamidem (676+68 g/mol), a nie przy oczekiwanej masie cząsteczkowej peptydu niefunkcjonalizowanego (676 g/mol). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50890/50890fig5highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz</a>.
<img alt="Badanie komórek PEGDM; kontrast fazowy, test LIVE/DEAD, obraz mikroskopowy; ocena żywotności komórek." fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50890/50890fig6.jpg" width="500px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6. Reprezentatywne obrazy w kontraście fazowym (lewo) oraz fluorescencyjne obrazy z testu LIVE/DEAD (zielony/czerwony) (prawo) MSCs hodowanych na A) samych żelach PEG oraz B) żelach PEG zawierających 0,5 mM funkcjonalizowanego metakryloamidem GKRGDSG. MSCs nie są w stanie przytwierdzić się ani rozprzestrzenić na samych żelach PEGDA, natomiast po włączeniu peptydu adhezyjnego RGD są one w stanie przytwierdzić się i rozprzestrzenić na powierzchni hydrożelu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50890/50890fig6highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz</a>.
<img alt="Schematy sieci polimerowych przedstawiają sztywność w stosunku do szybkości uwalniania leku; lek zamknięty w kapsułce, metakrylan, glikol." fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50890/50890fig7.jpg" width="500px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 7"> 
Rysunek 7. A) Masa cząsteczkowa PEG oraz B) procent wagowy PEG użytego do tworzenia sieci hydrożelowych wpływają na rozmiar oczek hydrożelu (ξ) oraz wynikową sztywność hydrożelu i szybkość uwalniania zamkniętych w nim leków. A) Zwiększenie masy cząsteczkowej PEG (od lewej do prawej) przy stałym procencie wagowym zwiększa rozmiar oczek hydrożelu, zmniejszając sztywność hydrożelu i zwiększając szybkość uwalniania leku. B) Zmniejszenie procentu wagowego PEG (od lewej do prawej) użytego do tworzenia hydrożeli zwiększa rozmiar oczek hydrożelu, podobnie zmniejszając sztywność hydrożelu i zwiększając szybkość uwalniania leku (skala umowna). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50890/50890fig7highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy obraz</a>.
<img alt="Masa cząsteczkowa makromeru PEG w relacji do nanometrów i elastyczności, porównanie na wykresie słupkowym, istotność statystyczna." fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50890/50890fig8.jpg" width="500px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 8"> 
Rycina 8. A) Wraz ze wzrostem masy cząsteczkowej makromeru PEG zwiększa się rozmiar oczek sieci, a B) zmniejsza się sztywność hydrożelu. n=10, słupki błędu = SEM, *** p&lt;0.001 w analizie jednoczynnikowej ANOVA z testem post-hoc Tukey's HSD. Wszystkie analizy statystyczne wykonano przy użyciu programu Prism 5. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50890/50890fig8highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz</a>.
<img alt="Wykres słupkowy przedstawiający wielkość cząsteczek i moduł sprężystości w zależności od procentowej zawagi masowej PEG." fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50890/50890fig9.jpg" width="500px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 9"> 
Rysunek 9. A) Wielkość oczek sieci maleje, a B) sztywność hydrożelu wzrasta wraz ze wzrostem wt% PEG. n = 9-10, słupki błędów = SEM, ** p&lt;0.01, *** p&lt;0.001 przy zastosowaniu jednoczynnikowej analizy wariancji (ANOVA) z testem post-hoc Tukeya (HSD). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50890/50890fig9highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz</a>.
<img alt="Kinetyka uwalniania BSA, wykres, polimery PEG, wpływ masy cząsteczkowej, badania nad dostarczaniem leków." fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50890/50890fig10.jpg" width="500px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 10"> 
Rycina 10. Uwalnianie enkapsulowanego modelowego leku – albuminy surowicy bydlęcej (BSA) z hydrożeli utworzonych z PEG o masie cząsteczkowej 2 kDa, 10 kDa i 20 kDa. Uwalnianie BSA następuje szybciej z hydrożeli utworzonych z PEGDM o wyższej masie cząsteczkowej, co jest wynikiem większego rozmiaru oczek sieci wewnątrz hydrożelu. n=6, słupki błędu = SEM. Procent uwolnionej BSA różni się istotnie (p&lt;0.0001) pomiędzy wszystkimi trzema grupami w każdym punkcie czasowym, z wyjątkiem t=1 i 2,5 hr, gdy uwalnianie z żeli 2 i 10 kDa jest równoważne, według dwuczynnikowej analizy wariancji ANOVA z powtarzanymi pomiarami i testem post-hoc Bonferroniego. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50890/50890fig10highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz</a>.

Ten film zilustruje szybką, efektywną metodę metakrylanowania poli(glikolu etylenowego), umożliwiając polimeryzację łańcuchową i syntezę hydrożelu. Pokaże, w jaki sposób w podobny sposób wprowadzić funkcje metakryloamidu do peptydów, szczegółowo omówi typowe metody analityczne do oceny wydajności funkcjonalizacji, przedstawi sugestie dotyczące rozwiązywania problemów i zaawansowanych modyfikacji oraz zademonstruje typowe techniki charakteryzacji hydrożelu.

Wspomagana mikrofalami funkcjonalizacja peptydów poli(glikolu etylenowego) i żywicy do stosowania w polimeryzacji łańcuchowej i tworzeniu hydrożelu

One of the main benefits to using poly(ethylene glycol) (PEG) macromers in hydrogel formation is synthetic versatility. The ability to draw from a large ...

Ogólnym celem tej procedury jest funkcjonalizacja glikolu polietylenowego i peptydów grupami metakrylanu w celu późniejszej polimeryzacji łańcuchowej i syntezy hydrożelu. Osiąga się to poprzez pierwsze połączenie bezwodnika akrylowego metamfetaminy i funkcjonalizowanego prekursora UN w fiolce scyntylacyjnej. Drugim krokiem jest wykorzystanie energii mikrofalowej do funkcjonalizacji pegu lub peptydu.Następnie PEG DM rozpuszcza się w chlorometanie lub peptyd jest odłupywany od żywicy. A wszystkie grupy chroniące łańcuch boczny są usuwane w koktajlu na bazie kwasu. Ostatnim krokiem jest wytrącenie peptydu PEG DM lub peptydu funkcjonalizowanego metametakrylamidem w eterze.Ostatecznie spektrometria mas czasu przelotu protonów NMR lub Maldi służy do wykazania pomyślnej funkcjonalizacji peg lub makro peptydu. Cześć, nazywam się Amy Van Hove. Jestem doktorantem na wydziale inżynierii biomedycznej na Uniwersytecie w Rochester.Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak reakcja PEG z fluorkiem metamfetaminy, jest to, że reakcja jest znacznie szybsza i bardziej przyjazna dla środowiska. Cześć, nazywam się Brandon Wilson. Uczę się inżynierii chemicznej na Uniwersytecie w Rochester.Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biomateriałów, takie jak to, w jaki sposób hydrożele produkowane przy użyciu PEG dimetylu mogą być wykorzystywane do kontrolowania dostarczania komórek terapeutycznych w cząsteczkach. Cześć, nazywam się Danielle Benoit i jestem adiunktem na Wydziale Inżynierii Biomedycznej Uniwersytetu w Rochester. Implikacje tej techniki mają wpływ na opracowywanie terapii różnych chorób, ponieważ zsyntetyzowane związki mogą być wykorzystywane do zastosowań związanych z dostarczaniem komórek i leków.Przed rozpoczęciem tej procedury należy wysuszyć wymagane szkło w piekarniku przez godzinę, aby zapobiec zanieczyszczeniu wodą w dużej łodzi serwatkowej. Wyciągnij pięć gramów kołka o masie cząsteczkowej od 1000 do 100 000 daltonów. Jeśli jest obecny, usuń plastikowy kawałek z pokrywki fiolki scyntylacyjnej w kapturze chemicznym.Dozować 10 molowy nadmiar bezwodnika akrylowego metamfetaminy do rozerwanej fiolki scyntylacyjnej. Następnie dodać PEG do fiolki. Następnie luźno przekręcić nakrętkę na fiolkę i umieścić fiolkę w kuchence mikrofalowej.Ustaw kuchenkę mikrofalową na pięć minut na maksymalną moc w rękawicach żaroodpornych. Wyjmować fiolkę z kuchenki mikrofalowej co 30 sekund. Następnie całkowicie dokręć nakrętkę i wiruj próbkę przez 30 sekund.Poluzować nakrętkę przed włożeniem fiolki do kuchenki mikrofalowej. Powtarzaj te kroki, aż roztwór będzie podgrzewany w kuchence mikrofalowej przez pełne pięć minut. Po wyjęciu fiolki z kuchenki mikrofalowej należy poluzować nakrętkę i pozostawić PEG DM do ostygnięcia do temperatury pokojowej.Następnie rozpuść PEG DM w 10 do 15 mililitrach di chlorometanu. Wytrącić PEG DM w 10-krotnym nadmiarze eteru predathylu przez 20 minut. Za pomocą siedmiocentymetrowego lejka Bucknera i kolby o pojemności 500 mililitrów.Zebrać PEG DM przez filtrację próżniową. Następnie przenieś przefiltrowany PEG DM do stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów z igłą o dużej średnicy przebitą przez nasadkę w celu wentylacji. Umieść rurkę w komorze próżniowej i wysusz PEG DM przez noc.Po wyjęciu rurki z komory próżniowej, na czerwono rozpuść PEG DM w osadzie DI chlorometanu z lodowatym eterem dathylowym. Aby usunąć niereaktywny bezwodnik akrylowy metamfetaminy po filtracji i zbieraniu, wysusz PEG DM w komorze próżniowej w taki sam sposób, jak wcześniej. W celu analizy protonowego NMR umieść około 10 miligramów PEG DM w fiolce scyntylacyjnej i dodaj około jednego mililitra deuterowanego chloroformu.Po rozpuszczeniu próbki przenieś ją do czystej probówki NMR. Następnie zbierz widma protonowego NMR i uruchom próbki w temperaturze pokojowej przez co najmniej 64 skany, aby uzyskać wystarczającą rozdzielczość danych. Po zsyntetyzowaniu interesującego peptydu przez syntezę w fazie stałej, przechowuj go na żywicy w DMF w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aż będzie gotowy do użycia.Następnie zebrać żywicę peptydową poprzez filtrację za pomocą siedmiocentymetrowego lejka bucknera z bibułą filtracyjną i kolbą o pojemności 250 mililitrów. Usunąć plastikowy kawałek z wieczka fiolki scyntylacyjnej i przenieść żywicę do fiolki. Za pomocą jednorazowej pipety dodaj tylko tyle bezwodnika akrylowego metamfetaminy, aby pokryć żywicę Po luźnym przekręceniu nakrętki na fiolkę, umieść ją w kuchence mikrofalowej i ustaw minutnik na trzy minuty.Przy maksymalnej mocy w rękawicach żaroodpornych należy wyjmować fiolkę z kuchenki mikrofalowej co 15 do 20 sekund. Po całkowitym dokręceniu nakrętki należy wirować próbkę przez 15 sekund. Poluzować nakrętkę przed włożeniem fiolki do kuchenki mikrofalowej.Powtarzaj to, aż roztwór będzie podgrzewany w kuchence mikrofalowej przez pełne trzy minuty. Po poluzowaniu nakrętki fiolki pozwól roztworowi peptydu ostygnąć do temperatury pokojowej, używając niewielkiej ilości DMF i siedmiocentymetrowego lejka bucknera. Z bibułą filtracyjną i kolbą o pojemności 250 mililitrów.Zebrać żywicę peptydową z fiolki w celu rozszczepienia i głębokiej ochrony. Przenieś żywicę peptydową do świeżej fiolki scyntylacyjnej na 0,25 milimola peptydu zawierającego argininę. Dodaj po 0,25 mililitra tri ISO propylenu, trzech dwutlenku sześciu, jednego ośmiooktanowo-diolowego, tiolu, wody dejonizowanej i 18,0 mililitrów TFA.Następnie obracaj mieszaninę reakcyjną na rotatorze laboratoryjnym do trzęsień ziemi przez cztery godziny w temperaturze pokojowej. Po zakończeniu wytrącić peptyd w 10-krotnym nadmiarze eteru etylowego przed schłodzeniem. Podzielić roztwór równomiernie na cztery 50-mililitrowe stożkowe probówki, odwirować cztery próbki przy 3,200 G przez 10 minut, aby zebrać peptyd po odwirowaniu, zdekantować eter, ponownie zawiesić peptyd w 100 mililitrach świeżego eteru etylowego podzielonego między dwie 50-mililitrowe stożkowe probówki.Powtórz proces wirowania. Resus zawieszając peptyd w 50 mililitrach świeżego eteru dwukrotnie, w sumie cztery płucze eter po ostatnim etapie wirowania, zdekantować odpadowy eter i wysuszyć peptyd przez noc w próżni. Aby przygotować próbkę do analizy czasu lotu Maldi, umieść od jednego do dwóch miligramów peptydu w 1,5-mililitrowej probówce einor i rozpuść próbkę w jednym mililitrze rozpuszczalnika maldi.Następnie przygotuj 10 miligramów na mililitr roztworu matrycowego czterowodorotlenkowego kwasu ceramicznego Alpha Sano w rozpuszczalniku wieloskładnikowym. Połącz roztwory peptydów i matryc w stosunku jeden do jednego, umieść jeden mikrolitr połączonego roztworu w trzech oddzielnych miejscach na płytce próbki MALDI. Osusz plamy za pomocą opalarki.Następnie ponownie umieść i wysusz każdą próbkę. Na koniec zbierz dane dotyczące czasu lotu MALDI i potwierdź wzrost masy cząsteczkowej o 68 gramów na mol spowodowany dodaniem grupy metamarmianowo-akrylowej do końcowego końca peptydu. Pokazano tutaj widmo NMR dwukilodaltonowego liniowego PEG DM funkcjonalizowanego przy użyciu metody wspomaganej mikrofalami dla tej reakcji.Analiza proton NMR może być wykorzystana do obliczenia procentowej funkcjonalizacji na podstawie obserwowanego do teoretycznego stosunku końcowych protonów metakrylanu do centralnych protonów PEG. Ogólna funkcjonalizacja procentowa wynosi 91%, a ten PEG DM jest odpowiednio funkcjonalizowany do stosowania w syntezie hydrożelu. Zobacz protokół tekstowy, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat obliczania procentowej funkcjonalizacji spowodowanej mnogością pików protonów, które powstają w analizie peptydów peptydów proton NMR.Funkcjonalizacja peptydów jest łatwiejsza do zbadania za pomocą spektrometrii mas czasu przelotu maldi. Pokazano to tutaj, gdzie peptyd G-K-R-G-D-S-G został zsyntetyzowany i poddany funkcjonalizacji metakryloamidu, niewielka frakcja peptydu została rozszczepiona w celu oceny masy cząsteczkowej przed funkcjonalizacją, która wykazała obserwowany szczyt masy cząsteczkowej występujący przy 676 gramach na mol, oczekiwana masa cząsteczkowa peptydu, pozostała część peptydu przeszła funkcjonalizację metamarmianu akrylamidu przed rozszczepieniem po funkcjonalizacji metamfetamidu. Obserwowany szczyt masy cząsteczkowej występuje przy 744 gramach na mol, oczekiwanej masie peptydu funkcjonalizowanego metamfetamidem akrylamidem.Aby zademonstrować funkcjonalność zarówno peptydów PEG DM, jak i peptydów funkcjonalizowanych metamfetamidem i akrylamidem, wyprodukowano hydrożele PEG z 0,5 milimolową metamfetaminą i bez niej. Funkcjonalizowane akrylamidem GK R-G-D-S-G pokazane tutaj są reprezentatywnymi kontrastowymi i żywymi martwymi obrazami fluorescencyjnymi MSC na samych żelach peg i na żelach peg zawierających peptyd funkcjonalizowany metamfetaminą. MSCs nie były w stanie przylegać do funkcjonalizowanych przez ONZ hydrożeli pegowych, ale po włączeniu peptydu adhezyjnego RGD były w stanie przylegać i rozprzestrzeniać się na powierzchni hydrożelu.Żywe martwe obrazy nie reprezentują żywotności zasianej populacji MSC. Obrazy fluorescencyjne mają raczej na celu rozgraniczenie między komórkami przylegającymi a niewielkimi zmianami w topologii hydrożelu, co może być trudne w przypadku samego kontrastu fazowego. Co ciekawe, nierozsiewane komórki wysiane na PEG tylko żele barwią dodatnio zarówno dla homodimeru wapnia AM, jak i AUM, co wskazuje, że komórki umierały w czasie obrazowania.Jedną z wielu zalet hydrożeli PEG jest ich wysoce przestrajalna natura, która modyfikuje specyficzny skład pegu. Hydrożel zapewnia naukowcom wysoki stopień kontroli nad właściwościami, takimi jak moduł sprężystości, jak pokazano tutaj. Wiadomo, że zarówno masa cząsteczkowa PEG, jak i procent wagowy kontrolują rozmiar siatki hydrożelu, wynikowy hydrożel, sztywność i szybkość uwalniania leków w kapsułkach.Wykazano to, wytwarzając hydrożele o różnej masie cząsteczkowej PEG dm i badając wynikowy moduł hydrożelu i rozmiar oczek zgodnie z hipotezą zwiększającą masę cząsteczkową kołka. Macer spowodował wzrost rozmiaru siatki hydrożelowej i spadek sztywności hydrożelu, rozmiar siatki hydrożelowej i wynikającą z tego sztywność żelu można również kontrolować poprzez zmianę masy. Procent hydrożeli PEG został wyprodukowany o różnej wadze.Procent liniowego 10 kilodaltonowego PEG DM i sztywności hydrożelu oraz rozmiar oczek określono tak, jak pokazano tutaj, zwiększenie procentu wagowego PEG powoduje znaczny spadek rozmiaru oczek i wzrost sztywności hydrożelu. Hydrożele zawierające kapsułkowaną albuminę surowicy bydlęcej zostały utworzone przy użyciu kołka o różnej masie cząsteczkowej, jak pokazano tutaj. Uwalnianie albuminy surowicy bydlęcej zachodzi szybciej z hydrożeli utworzonych przy użyciu PEG DM o większej masie cząsteczkowej w wyniku większego rozmiaru oczek w hydrożelu.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak zsyntetyzować wyróżnienie PEG DME przy użyciu metody wspomaganej mikrofalami oraz jak ocenić funkcjonalizację za pomocą protonowego NMR. Po opanowaniu tej procedury można również wykorzystać otwarcie pierścienia grup ulegających degradacji hydrolitycznej, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące tego, jak degradacja hydrożelu wpływa na funkcję komórki. Powinieneś również dobrze zrozumieć, w jaki sposób ta technika może być wykorzystana do selektywnego włączania funkcji metamfetamidu akrylamidu do końcowych sekwencji peptydowych i jak ocenić tę funkcjonalizację za pomocą spektrometrii mas w czasie lotu.Dzięki za oglądanie.

microwave-assisted-functionalization-poly-ethylene-glycol-on-resin

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Funkcjonalizacja poli(etylenoglikolu) i peptydów na żywicy przy użyciu mikrofal oraz ich zastosowanie w polimeryzacjach łańcuchowych i formowaniu hydrożeli

Poniższy protokół dostarcza techniki kapsułkowania komórek β trzustki w hydrożelach peptydowych PEG powstałych w wyniku reakcji fotoklikania tiolowo-enowego. Ta platforma materiałowa nie tylko oferuje cytokompatybilne mikrośrodowisko do enkapsulacji komórek, ale także umożliwia kontrolowane przez użytkownika szybkie odzyskiwanie struktur komórkowych utworzonych w hydrożelach.

Wytwarzanie i odzyskiwanie sferoid β-komórkowych z hydrożeli peptydowych PEG o skokowym wzroście

Ta praca opisuje tworzenie mikrożeli z poli(glikolu etylenowego) (PEG) poprzez fotopolimeryzowaną reakcję wytrącania. Zwiększenie masy cząsteczkowej PEG zwiększyło średnicę mikrożelu i współczynnik pęcznienia. Badane są proste adaptacje do reakcji wytrącania mikrożelu PEG pod kątem przyszłych zastosowań mikrożeli jako nośników leków i rusztowań inżynierii tkankowej.

Charakterystyka mikrożeli glikolu polietylenowego tworzonych przez wytrącanie jest kontrolowana przez masę cząsteczkową reagentów

Nasze laboratorium opracowało usieciowane DNA hydrożele poliakrylamidowe, dynamiczny system hydrożelowy, aby lepiej zrozumieć wpływ modulacji sztywności tkanek na funkcjonowanie komórek. Tutaj podajemy schematy, opisy i protokoły przygotowania tych hydrożeli.

Otrzymywanie usieciowanych DNA hydrożeli poliakrylamidowych

Adhezyjna komórka jest kluczem do wielu podejść w badaniach nad biomateriałami i inżynierii tkankowej. Przedstawiono technikę krok po kroku wykorzystującą chemię mokrą do modyfikacji powierzchni ważnego polimeru PTFE za pomocą peptydów.

Chemia mokra i immobilizacja peptydów na politetrafluoroetylenie w celu poprawy adhezji komórek

Kluczowe etapy żywej anionowej polimeryzacji eteru fenyloglicydylowego (PheGE) na glikolu metoksy-polietylenowym (mPEG-b-PPheGE) są opisane. Otrzymane micele kopolimeru blokowego (BCM) obciążono doksorubicyną w 14% (wag.) i uzyskano trwałe uwalnianie leku przez 4 dni w fizjologicznie istotnych warunkach.

Polimeryzacja anionowa kopolimeru amfifilowego do otrzymywania miceli kopolimeru blokowego stabilizowanego oddziaływaniami π-π stacking

Przedstawiamy protokół syntezy hydrożeli funkcjonalizowanych RGD jako urządzeń do dostarczania komórek i leków. Procedura polega na katalizowanej miedzią cykloaddycji alkinowo-azydkowej (CuAAC) pomiędzy modyfikowanym alkinami kwasem poliakrylowym (PAA) a pochodną azydku RGD. Hydrożele powstają w procesie polikondensacji wspomaganej mikrofalami i badane są ich właściwości fizykochemiczne.

Synteza hydrożeli funkcjonalizowanych RGD jako narzędzie do zastosowań terapeutycznych

Opisujemy sekwencyjny proces tworzenia za pośrednictwem światła i późniejszego biochemicznego wzorcowania syntetycznych matryc hydrożelowych do zastosowań w trójwymiarowych hodowlach komórkowych. Przedstawiono budowę i modyfikację hydrożeli za pomocą cytokompatybilnej chemii photoclick. Ponadto przedstawiono łatwe techniki ilościowego określania i obserwacji wzorców oraz określania żywotności komórek w tych hydrożelach.

Tworzenie i modelowanie hydrożeli za pośrednictwem światła do zastosowań w hodowlach komórkowych

Opisane są protokoły wytwarzania degradowalnych termoresponsywnych hydrożeli opartych na sieciowaniu hydrazonów polimerowych oligomerów na skalę masową, mikroskalową i nanoskalę, przy czym ta ostatnia służy do przygotowania zarówno nanocząstek żelowych, jak i nanowłókien.

Wytwarzanie degradowalnych termoczułych hydrożeli w różnych skalach długości za pomocą wytłaczania reaktywnego, mikrofluidyki, samoorganizacji i elektroprzędzenia

Ta praca przedstawia przygotowanie biokompatybilnych kopolimerów blokowych (mBG) funkcjonalizowanych metioniną metodą odwracalnego transferu łańcucha addycyjno-fragmentacyjnego (RAFT). Zbadano również zdolność do kompleksowania plazmidowego DNA otrzymanych mBG oraz skuteczność ich transfekcji. Metoda RAFT jest bardzo korzystna w przypadku polimeryzacji monomerów zawierających specjalne grupy funkcyjne.

Biokompatybilne kopolimery blokowe funkcjonalizowane metioniną do celowanego dostarczania plazmidowego DNA

Ten protokół przedstawia trzy szybkie i proste metody przygotowania, które wykorzystują warunki środowiskowe do wywołania samoorganizacji peptydów w hydrożele. Dodatkowo opisano charakterystykę hydrożeli peptydowych, wykazując, że w tych prostych warunkach mogą powstawać mechanicznie stabilne hydrożele peptydowe.

Przygotowanie stabilnych mechanicznie samoorganizujących się hydrożeli peptydowych

Naucz się szybkiej funkcjonalizacji poli(glikolu etylenowego) i peptydów przy użyciu energii mikrofalowej do syntezy hydrożeli. Metoda umożliwia efektywne tworzenie biomateriałów do zastosowań w inżynierii tkankowej i dostarczaniu leków.

Wspomagana mikrofalami funkcjonalizacja peptydów poli(glikolu etylenowego) i żywicy do stosowania w polimeryzacji łańcuchowej i tworzeniu hydrożelu (Wideo) | JoVE Journal

Wspomagana mikrofalami funkcjonalizacja peptydów poli(glikolu etylenowego) i żywicy do stosowania w polimeryzacji łańcuchowej i tworzeniu hydrożelu

Przeglądaj więcej filmów