Wspomagana mikrofalami funkcjonalizacja peptydów poli(glikolu etylenowego) i żywicy do stosowania w polimeryzacji łańcuchowej i tworzeniu hydrożelu

Ogólnym celem tej procedury jest funkcjonalizacja glikolu polietylenowego i peptydów grupami metakrylanu w celu późniejszej polimeryzacji łańcuchowej i syntezy hydrożelu. Osiąga się to poprzez pierwsze połączenie bezwodnika akrylowego metamfetaminy i funkcjonalizowanego prekursora UN w fiolce scyntylacyjnej. Drugim krokiem jest wykorzystanie energii mikrofalowej do funkcjonalizacji pegu lub peptydu.

Następnie PEG DM rozpuszcza się w chlorometanie lub peptyd jest odłupywany od żywicy. A wszystkie grupy chroniące łańcuch boczny są usuwane w koktajlu na bazie kwasu. Ostatnim krokiem jest wytrącenie peptydu PEG DM lub peptydu funkcjonalizowanego metametakrylamidem w eterze.

Ostatecznie spektrometria mas czasu przelotu protonów NMR lub Maldi służy do wykazania pomyślnej funkcjonalizacji peg lub makro peptydu. Cześć, nazywam się Amy Van Hove. Jestem doktorantem na wydziale inżynierii biomedycznej na Uniwersytecie w Rochester.

Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak reakcja PEG z fluorkiem metamfetaminy, jest to, że reakcja jest znacznie szybsza i bardziej przyjazna dla środowiska. Cześć, nazywam się Brandon Wilson. Uczę się inżynierii chemicznej na Uniwersytecie w Rochester.

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biomateriałów, takie jak to, w jaki sposób hydrożele produkowane przy użyciu PEG dimetylu mogą być wykorzystywane do kontrolowania dostarczania komórek terapeutycznych w cząsteczkach. Cześć, nazywam się Danielle Benoit i jestem adiunktem na Wydziale Inżynierii Biomedycznej Uniwersytetu w Rochester. Implikacje tej techniki mają wpływ na opracowywanie terapii różnych chorób, ponieważ zsyntetyzowane związki mogą być wykorzystywane do zastosowań związanych z dostarczaniem komórek i leków.

Przed rozpoczęciem tej procedury należy wysuszyć wymagane szkło w piekarniku przez godzinę, aby zapobiec zanieczyszczeniu wodą w dużej łodzi serwatkowej. Wyciągnij pięć gramów kołka o masie cząsteczkowej od 1000 do 100 000 daltonów. Jeśli jest obecny, usuń plastikowy kawałek z pokrywki fiolki scyntylacyjnej w kapturze chemicznym.

Dozować 10 molowy nadmiar bezwodnika akrylowego metamfetaminy do rozerwanej fiolki scyntylacyjnej. Następnie dodać PEG do fiolki. Następnie luźno przekręcić nakrętkę na fiolkę i umieścić fiolkę w kuchence mikrofalowej.

Ustaw kuchenkę mikrofalową na pięć minut na maksymalną moc w rękawicach żaroodpornych. Wyjmować fiolkę z kuchenki mikrofalowej co 30 sekund. Następnie całkowicie dokręć nakrętkę i wiruj próbkę przez 30 sekund.

Poluzować nakrętkę przed włożeniem fiolki do kuchenki mikrofalowej. Powtarzaj te kroki, aż roztwór będzie podgrzewany w kuchence mikrofalowej przez pełne pięć minut. Po wyjęciu fiolki z kuchenki mikrofalowej należy poluzować nakrętkę i pozostawić PEG DM do ostygnięcia do temperatury pokojowej.

Następnie rozpuść PEG DM w 10 do 15 mililitrach di chlorometanu. Wytrącić PEG DM w 10-krotnym nadmiarze eteru predathylu przez 20 minut. Za pomocą siedmiocentymetrowego lejka Bucknera i kolby o pojemności 500 mililitrów.

Zebrać PEG DM przez filtrację próżniową. Następnie przenieś przefiltrowany PEG DM do stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów z igłą o dużej średnicy przebitą przez nasadkę w celu wentylacji. Umieść rurkę w komorze próżniowej i wysusz PEG DM przez noc.

Po wyjęciu rurki z komory próżniowej, na czerwono rozpuść PEG DM w osadzie DI chlorometanu z lodowatym eterem dathylowym. Aby usunąć niereaktywny bezwodnik akrylowy metamfetaminy po filtracji i zbieraniu, wysusz PEG DM w komorze próżniowej w taki sam sposób, jak wcześniej. W celu analizy protonowego NMR umieść około 10 miligramów PEG DM w fiolce scyntylacyjnej i dodaj około jednego mililitra deuterowanego chloroformu.

Po rozpuszczeniu próbki przenieś ją do czystej probówki NMR. Następnie zbierz widma protonowego NMR i uruchom próbki w temperaturze pokojowej przez co najmniej 64 skany, aby uzyskać wystarczającą rozdzielczość danych. Po zsyntetyzowaniu interesującego peptydu przez syntezę w fazie stałej, przechowuj go na żywicy w DMF w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aż będzie gotowy do użycia.

Następnie zebrać żywicę peptydową poprzez filtrację za pomocą siedmiocentymetrowego lejka bucknera z bibułą filtracyjną i kolbą o pojemności 250 mililitrów. Usunąć plastikowy kawałek z wieczka fiolki scyntylacyjnej i przenieść żywicę do fiolki. Za pomocą jednorazowej pipety dodaj tylko tyle bezwodnika akrylowego metamfetaminy, aby pokryć żywicę Po luźnym przekręceniu nakrętki na fiolkę, umieść ją w kuchence mikrofalowej i ustaw minutnik na trzy minuty.

Przy maksymalnej mocy w rękawicach żaroodpornych należy wyjmować fiolkę z kuchenki mikrofalowej co 15 do 20 sekund. Po całkowitym dokręceniu nakrętki należy wirować próbkę przez 15 sekund. Poluzować nakrętkę przed włożeniem fiolki do kuchenki mikrofalowej.

Powtarzaj to, aż roztwór będzie podgrzewany w kuchence mikrofalowej przez pełne trzy minuty. Po poluzowaniu nakrętki fiolki pozwól roztworowi peptydu ostygnąć do temperatury pokojowej, używając niewielkiej ilości DMF i siedmiocentymetrowego lejka bucknera. Z bibułą filtracyjną i kolbą o pojemności 250 mililitrów.

Zebrać żywicę peptydową z fiolki w celu rozszczepienia i głębokiej ochrony. Przenieś żywicę peptydową do świeżej fiolki scyntylacyjnej na 0,25 milimola peptydu zawierającego argininę. Dodaj po 0,25 mililitra tri ISO propylenu, trzech dwutlenku sześciu, jednego ośmiooktanowo-diolowego, tiolu, wody dejonizowanej i 18,0 mililitrów TFA.

Następnie obracaj mieszaninę reakcyjną na rotatorze laboratoryjnym do trzęsień ziemi przez cztery godziny w temperaturze pokojowej. Po zakończeniu wytrącić peptyd w 10-krotnym nadmiarze eteru etylowego przed schłodzeniem. Podzielić roztwór równomiernie na cztery 50-mililitrowe stożkowe probówki, odwirować cztery próbki przy 3,200 G przez 10 minut, aby zebrać peptyd po odwirowaniu, zdekantować eter, ponownie zawiesić peptyd w 100 mililitrach świeżego eteru etylowego podzielonego między dwie 50-mililitrowe stożkowe probówki.

Powtórz proces wirowania. Resus zawieszając peptyd w 50 mililitrach świeżego eteru dwukrotnie, w sumie cztery płucze eter po ostatnim etapie wirowania, zdekantować odpadowy eter i wysuszyć peptyd przez noc w próżni. Aby przygotować próbkę do analizy czasu lotu Maldi, umieść od jednego do dwóch miligramów peptydu w 1,5-mililitrowej probówce einor i rozpuść próbkę w jednym mililitrze rozpuszczalnika maldi.

Następnie przygotuj 10 miligramów na mililitr roztworu matrycowego czterowodorotlenkowego kwasu ceramicznego Alpha Sano w rozpuszczalniku wieloskładnikowym. Połącz roztwory peptydów i matryc w stosunku jeden do jednego, umieść jeden mikrolitr połączonego roztworu w trzech oddzielnych miejscach na płytce próbki MALDI. Osusz plamy za pomocą opalarki.

Następnie ponownie umieść i wysusz każdą próbkę. Na koniec zbierz dane dotyczące czasu lotu MALDI i potwierdź wzrost masy cząsteczkowej o 68 gramów na mol spowodowany dodaniem grupy metamarmianowo-akrylowej do końcowego końca peptydu. Pokazano tutaj widmo NMR dwukilodaltonowego liniowego PEG DM funkcjonalizowanego przy użyciu metody wspomaganej mikrofalami dla tej reakcji.

Analiza proton NMR może być wykorzystana do obliczenia procentowej funkcjonalizacji na podstawie obserwowanego do teoretycznego stosunku końcowych protonów metakrylanu do centralnych protonów PEG. Ogólna funkcjonalizacja procentowa wynosi 91%, a ten PEG DM jest odpowiednio funkcjonalizowany do stosowania w syntezie hydrożelu. Zobacz protokół tekstowy, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat obliczania procentowej funkcjonalizacji spowodowanej mnogością pików protonów, które powstają w analizie peptydów peptydów proton NMR.

Funkcjonalizacja peptydów jest łatwiejsza do zbadania za pomocą spektrometrii mas czasu przelotu maldi. Pokazano to tutaj, gdzie peptyd G-K-R-G-D-S-G został zsyntetyzowany i poddany funkcjonalizacji metakryloamidu, niewielka frakcja peptydu została rozszczepiona w celu oceny masy cząsteczkowej przed funkcjonalizacją, która wykazała obserwowany szczyt masy cząsteczkowej występujący przy 676 gramach na mol, oczekiwana masa cząsteczkowa peptydu, pozostała część peptydu przeszła funkcjonalizację metamarmianu akrylamidu przed rozszczepieniem po funkcjonalizacji metamfetamidu. Obserwowany szczyt masy cząsteczkowej występuje przy 744 gramach na mol, oczekiwanej masie peptydu funkcjonalizowanego metamfetamidem akrylamidem.

Aby zademonstrować funkcjonalność zarówno peptydów PEG DM, jak i peptydów funkcjonalizowanych metamfetamidem i akrylamidem, wyprodukowano hydrożele PEG z 0,5 milimolową metamfetaminą i bez niej. Funkcjonalizowane akrylamidem GK R-G-D-S-G pokazane tutaj są reprezentatywnymi kontrastowymi i żywymi martwymi obrazami fluorescencyjnymi MSC na samych żelach peg i na żelach peg zawierających peptyd funkcjonalizowany metamfetaminą. MSCs nie były w stanie przylegać do funkcjonalizowanych przez ONZ hydrożeli pegowych, ale po włączeniu peptydu adhezyjnego RGD były w stanie przylegać i rozprzestrzeniać się na powierzchni hydrożelu.

Żywe martwe obrazy nie reprezentują żywotności zasianej populacji MSC. Obrazy fluorescencyjne mają raczej na celu rozgraniczenie między komórkami przylegającymi a niewielkimi zmianami w topologii hydrożelu, co może być trudne w przypadku samego kontrastu fazowego. Co ciekawe, nierozsiewane komórki wysiane na PEG tylko żele barwią dodatnio zarówno dla homodimeru wapnia AM, jak i AUM, co wskazuje, że komórki umierały w czasie obrazowania.

Jedną z wielu zalet hydrożeli PEG jest ich wysoce przestrajalna natura, która modyfikuje specyficzny skład pegu. Hydrożel zapewnia naukowcom wysoki stopień kontroli nad właściwościami, takimi jak moduł sprężystości, jak pokazano tutaj. Wiadomo, że zarówno masa cząsteczkowa PEG, jak i procent wagowy kontrolują rozmiar siatki hydrożelu, wynikowy hydrożel, sztywność i szybkość uwalniania leków w kapsułkach.

Wykazano to, wytwarzając hydrożele o różnej masie cząsteczkowej PEG dm i badając wynikowy moduł hydrożelu i rozmiar oczek zgodnie z hipotezą zwiększającą masę cząsteczkową kołka. Macer spowodował wzrost rozmiaru siatki hydrożelowej i spadek sztywności hydrożelu, rozmiar siatki hydrożelowej i wynikającą z tego sztywność żelu można również kontrolować poprzez zmianę masy. Procent hydrożeli PEG został wyprodukowany o różnej wadze.

Procent liniowego 10 kilodaltonowego PEG DM i sztywności hydrożelu oraz rozmiar oczek określono tak, jak pokazano tutaj, zwiększenie procentu wagowego PEG powoduje znaczny spadek rozmiaru oczek i wzrost sztywności hydrożelu. Hydrożele zawierające kapsułkowaną albuminę surowicy bydlęcej zostały utworzone przy użyciu kołka o różnej masie cząsteczkowej, jak pokazano tutaj. Uwalnianie albuminy surowicy bydlęcej zachodzi szybciej z hydrożeli utworzonych przy użyciu PEG DM o większej masie cząsteczkowej w wyniku większego rozmiaru oczek w hydrożelu.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak zsyntetyzować wyróżnienie PEG DME przy użyciu metody wspomaganej mikrofalami oraz jak ocenić funkcjonalizację za pomocą protonowego NMR. Po opanowaniu tej procedury można również wykorzystać otwarcie pierścienia grup ulegających degradacji hydrolitycznej, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące tego, jak degradacja hydrożelu wpływa na funkcję komórki. Powinieneś również dobrze zrozumieć, w jaki sposób ta technika może być wykorzystana do selektywnego włączania funkcji metamfetamidu akrylamidu do końcowych sekwencji peptydowych i jak ocenić tę funkcjonalizację za pomocą spektrometrii mas w czasie lotu.

Dzięki za oglądanie.