Nowatorskie badanie ilościowe poziomu tlenku azotu w odpowiedzi neurozapalnej na całej pulce

Protokół ten zapewnia badaczom małych organizmów czułą, ilościową i opłacalną metodę wykrywania indukcji aktywności syntazy tlenku azotu. Najpierw wypreparuj całą tkankę, taką jak dorosła drosophila mózgu, inkubuj nienaruszoną tkankę w pożywce do hodowli owadów, aby umożliwić dyfuzję tlenku azotu. Teraz oddziel pożywkę hodowlaną i próbkę tkanki.

Następnie wymieszaj kondycjonowaną pożywkę hodowlaną ze zmodyfikowanym odczynnikiem do smarowania, aby wykryć poziom azotynów i wskaźnik produkcji tlenku azotu. Następnie zmierz absorpcję kolorowego produktu reakcji i określ ilościowo wartości w stosunku do krzywej standardowej stężenia azotynów. Ostatecznie te testy metryki kolorów służyły do wykazania endogennej aktywności katalitycznej syntazy tlenku azotu.

Chociaż metoda ta została zaprojektowana, aby zapewnić użyteczny wgląd w gsof i neurobiologię oraz wrodzoną odporność, można ją również zastosować do innych systemów modelowych, takich jak bezkręgowe modele chorób i rozwoju człowieka, a także tkanek poza ośrodkowym układem nerwowym. Porcjować 50 mikrolitrów pożywki dla owadów Grace's do odpowiedniej liczby dołków na 96-dołkowej płytce do mikromiareczkowania lub w probówkach wirówkowych, jak pokazano tutaj, i odpowiednio oznaczyć muchy w pełni. Następnie przenieś kilka much na szkiełko mikroskopowe.

Dodaj niewielką ilość PBS jako bufor do preparacji, a następnie odetnij głowy much pod mikroskopem preparacyjnym, unikając wysuszenia, wyrzuć ciała much. Teraz wyekstrahuj cały mózg, ostrożnie usuwając naskórek, cząstki stałe i wszelkie tkanki niemózgowe, takie jak tkanka pigmentowa oka. Przenieś wypreparowany mózg do odpowiednio oznakowanej probówki i powtórz sekcje dla co najmniej 20 mózgów na grupę.

Trzymając próbki na lodzie po zakończeniu zbioru zestawu roboczego, inkubuj próbki mózgu przez sześć godzin w temperaturze 25 stopni Celsjusza pod lekkim potrząsaniem. Przygotuj zmodyfikowany odczynnik do smarowania zgodnie z zaleceniami producenta i przechowuj w ciemności do czasu użycia. Następnie skonstruuj krzywą wzorcową azotynów, używając serii ośmiu szeregowych rozcieńczeń azotynu sodu.

Oznacz również dwie sterylne probówki wirówkowe o pojemności 0,5 mililitra dla każdej grupy badanej, a także kontrolę w odpowiednich punktach czasowych. Przenieś pożywkę z każdej próbki z mikromiarecznika do odpowiedniego osadu z probówki mikrowirówkowej wszelkie cząstki mózgu lub tkanek przez odwirowanie przy 8, 175-krotności grawitacji przez dwie minuty bez przerywania osadu. Przenieść 30 mikrolitrów supernatantów do drugiego zestawu odpowiednich probówek.

Dodaj równą objętość odczynnika do smaru do każdej studzienki po pięciu do 10 minutach, ale w ciągu 30 minut. Zmierz absorbancję przy 548 nanometrach. Powtórz każdy odczyt co najmniej trzy razy i uśrednij trzy outy.

Upewnij się, że maszyna jest ślepa między każdymi sześcioma do 10 odczytami i uruchamia ślepą kontrolę w celu określenia odchylenia standardowego. Teraz obliczymy względny poziom azotynów w każdej próbce. Najpierw należy wykreślić wartości znanych stężeń z krzywej wzorcowej azotynów, stosując chłonność na osi Y w stężeniu na osi x.

Określ nachylenie linii najlepszego dopasowania i rozwiąż równanie dla X.Teraz po prostu zastąp wartości absorbancji dla Y i rozwiąż dla X, co reprezentuje stężenie. Ten dorosły mózg samca Drosophila został wypreparowany dwa do trzech dni po eclo z nienaruszonym śródmózgowiem i płatem wzrokowym. Typowa krzywa toksyczności parakwatu ustala skuteczną dawkę śmiertelną i zakres leczenia toksycznego między 1,25 a 10 milimolowym COT.

Współleczenie much z parakwatem i lną. Kompetycyjny inhibitor syntazy tlenku azotu przyczynił się do znacznego wydłużenia życia. Tacja spowodowana spożyciem parakwatu u much leczonych parakwatem i nieaktywnym izomerem DA nie wykazała poprawy przeżywalności.

Łącznie wyniki te potwierdzają hipotezę, że tłumienie stanu zapalnego poprzez hamowanie NOS zwiększa przeżywalność much leczonych parakwatem, co stanowi dalszą walidację odpowiedzi parakwatowej za pośrednictwem NOS. Zmiany w poziomach białka NOS mierzono bezpośrednio. Poziom białka NOS wzrastał w sposób zależny od stężenia parakwatu.

Traktowanie muszek 10-milimolowym parakwatem przez czas ekspozycji wynoszący od sześciu godzin do 30 godzin powoduje początkowy wzrost, a następnie spadek wraz ze wzrostem czasu ekspozycji. Dane te są zgodne z wzorcami poziomów azotynów obserwowanymi w naszym wariancie testu smaru. Co ciekawe, istnieje liniowa zależność między wzrostem stężenia parakwatu a wielkością odpowiedzi zapalnej zdefiniowanej przez wydzielanie i wykrywanie tlenku azotu.

Poniżej poziomów podstawowych heterozygotyczne mutanty stempla, które wytwarzają mniejszą ilość kofaktora NOS BH cztery, wydzielają nieco niższe poziomy tlenku azotu. Zmiana, która byłaby trudna do wykrycia przy użyciu poprzednich metod wykrywania, takich jak NAD pH, diafrowy test histochemiczny. Po podaniu parakwatu zaobserwowano wyraźny wzrost poziomu tlenku azotu w mutancie ponczu, jednak znacznie mniejszy niż u much traktowanych dzikim typem podczas pracy z toksynami lub chemikaliami.

Istotne jest ustalenie zarówno krzywej czasu narażenia, jak i krzywej toksyczności opartej na stężeniu, ponieważ warunki te mogą radykalnie zmienić czułość testu. Na przykład leczenie pięcioma milimolami lub parakwatem powoduje maksymalne wykrycie NO po 24 godzinach od ekspozycji. Dla porównania, ekspozycja na 10-milimolowy parakwat powodowała szybszą indukcję, ale także szybszy spadek aktywności podczas dłuższych ekspozycji.

Żadne cząsteczki nie są niestabilne i wysoce reaktywne. Udany test musi zatem obejmować warunki inkubacji, które zapewniają optymalną równowagę między ciągłą indukcją NOS a szybkim wymianą NOS. W tym eksperymencie, w którym wypreparowane mózgi inkubowano w pożywce hodowlanej przed dodaniem odczynnika do smaru, sześciogodzinna inkubacja w temperaturze pokojowej wytworzyła maksymalny poziom azotynów w późniejszej reakcji tłuszczu.

Podczas próby wykonania tej procedury należy pamiętać, że tlenek azotu jest wyjątkowo niestabilny i ulega szybkiej rotacji, co może prowadzić do utraty czułości testu. Jeśli czasy inkubacji nie są dokładnie kontrolowane i monitorowane, należy przetestować wiele warunków w modelu, aby uzyskać powtarzalne i wiarygodne wyniki.