Name: In vivo (in vivo) Poporodowa elektroporacja i obrazowanie poklatkowe migracji neuroblastów w ostrych wycinkach mózgu myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-25T21:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 51 s
Description: Poznaj metodę elektroporacji in vivo i obrazowania poklatkowego do wizualizacji migracji neuroblastów w mózgu myszy. Technika ta umożliwia szczegółową analizę dynamiki komórkowej w neurogenezie poporodowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

M.S. i Y.Z. są wspierane przez stypendia doktoranckie KCL i KCL-China. M.O. zostało sfinansowane przez stypendium doktoranckie Rady ds. Badań Biotechnologii i Nauk Biologicznych. Dziękujemy Masaru Okabe i Jun-ichi Miyazaki za plazmid pCX-EGFP oraz Alainowi Chedotalowi i Atenie Ypsilanti za cenne porady dotyczące elektroporacji.

Ta procedura jest zgodna z przepisami brytyjskiego Ministerstwa Spraw Wewnętrznych (Animal Scientific Procedures Act, 1986). Naukowcy powinni postępować zgodnie z wytycznymi ustanowionymi i zatwierdzonymi przez ich instytucje i krajowe organizacje regulacyjne zajmujące się zwierzętami.
1. Elektroporacja poporodowa
1.1. Przygotowanie szklanych kapilarn, roztworu DNA i elektroporatora
<ol>
	<li>Przygotuj wyciągnięte szklane naczynia włosowate (średnica zewnętrzna: 1,5 mm, średnica wewnętrzna: 0,86 mm) do wstrzyknięcia DNA. (Orientacyjne ustawienia ściągacza kapilarnego Sutter P-97 to: Ciepło 283; Pociągnij 50; Prędkość 90; Czas 50). Na kapilarze należy umieścić znak odpowiadający objętości około 2 μl.</li>
	<li>Ustaw napięcie elektroporatora na 5 impulsów kwadratowych, 50 ms/impuls przy 100 V, w odstępach 850 ms (100 V, impuls WŁĄCZONY 50 ms, impuls WYŁĄCZONY 850 ms, impuls 5).</li>
	<li>Rozcieńczyć plazmidowe DNA wolne od endotoksyn (OD 260/280 > 1,80) do końcowego stężenia 1-2 μg/μl za pomocą wolnego od endotoksyn buforu Tris-EDTA lub PBS. Zaleca się dodanie 0,1% Fast Green do roztworu DNA (barwnik powinien rozprzestrzenić się w komorze po pomyślnym wstrzyknięciu).</li>
	<li>Przygotuj elektrody 5-7 mm, żel elektrod i rozgrzej poduszkę grzewczą.</li>
</ol>
1.2. Elektroporacja
<ol>
	<li>Wyjmij młode myszy w 2 dniu po porodzie z klatki i znieczul je przez inhalację izofluranu (przy przepływie ~0,6 l/min).</li>
	<li>Po około 1 minucie określ stan znieczulenia, korzystając z reakcji na uszczypnięcie stopy. Jeśli nie wystąpi żaden ruch, należy wykonać wstrzyknięcie dokomorowe.</li>
	<li>Napełnij igłę kapilarną 1-2 μl DNA za pomocą rurki aspiratora podłączonej do kapilary.</li>
	<li>Pod zimnym źródłem światła trzymaj głowę szczeniaka między kciukiem a palcem wskazującym mniej dominującej ręki. Lekko odciągnąć skórę do tyłu głowy, aby ułatwić identyfikację właściwego miejsca wstrzyknięcia.</li>
	<li>Rozważmy wirtualną linię między okiem a kraniometrycznym punktem orientacyjnym lambda (ryc. 1A). Wprowadzić igłę kapilarną w odległości około jednej trzeciej długości tej linii od lambda (około 1 mm od punktu środkowego linii)15. Włóż kapilarnę na głębokość około 2 mm, uważając, aby uniknąć głębokiej penetracji w mózgu.</li>
	<li>Wstrzyknąć plazmid, powoli przedmuchując przez usta (można również użyć strzykawki podłączonej do naczynia włosowatego). Podczas tej procedury upewnij się, że palce nie wywierają zbyt dużego nacisku na mózg, ponieważ może to uniemożliwić udane wstrzyknięcie plazmidu.</li>
	<li>Należy przerwać wstrzykiwanie, gdy w naczyniach włosowatych pozostanie minimalna ilość roztworu DNA. Zaleca się wstrzykiwanie mniej niż 1 μl, aby uniknąć szkodliwego wzrostu ciśnienia śródczaszkowego.</li>
	<li>Pokryj obie elektrody żelem i umieść je stroną dodatnią po bocznej stronie półkuli, w której wstrzyknięto DNA (ryc. 1A). W celu włączenia DNA do rostralnego SVZ, umieść elektrody lekko rostralne do punktu wstrzyknięcia. Zmienne położenie elektrody może osiągnąć regionalną specyficzność elektroporacji w różnych obszarach SVZ22,25.</li>
	<li>Zainicjuj transfer prądu, naciskając pedał przełącznika nożnego impulsu. Po zakończeniu elektroporacji sprawdź napięcie na wyświetlaczu elektroporatora (wartości napięcia nie powinny być niższe niż 90 V, ponieważ niższe wartości napięcia korelują ze słabą wydajnością elektroporacji).</li>
	<li>Reanimuj szczeniaka pod tlenem na poduszce grzewczej przez kilka minut i włóż go z powrotem do klatki, umieszczając go z dala od matki. Upewnij się, że matka aportuje młode i łączy je z resztą miotu. Po elektroporacji pozostaw szczenięta z matką na 4-7 dni przed kolejnym krokiem.</li>
</ol>
2. Przygotowanie ostrych kultur wycinków mózgu
2.1. Przygotowanie rozwiązań i narzędzi
<ol>
	<li>Wymagane są następujące roztwory (możliwe jest również użycie DMEM o wysokiej zawartości glukozy do preparowania i obrazowania17): 
	Podłoże preparacyjne (500 ml) 
	Pożywki Gey's Balanced - 500ml 
	45% Glukozy - 5ml 
	Medium filmowe (10 ml) 
	45% Glukoza - 0,110 ml 
	HEPESY 1 M - 0,100 ml 
	Wstrzykiwacz/paciorkowiec - 0,100 ml 
	FCS - 0,500 ml 
	B27 - 0,100 ml 
	Glutamina - 0.200 ml 
	Dulbecco Modified Eagle Medium (bez czerwieni fenolowej) - 8,89 ml</li>
	<li>Rozgrzej podłoże filmowe w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Umieścić wkładki Millicell w naczyniu hodowlanym ze szklanym dnem o średnicy 35 mm zawierającym 1 ml pożywki filmowej i umieścić w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C/5% CO2 .</li>
	<li>Przygotuj akcesoria do wibratomu (śrubokręt, komora, żyletki, klej).</li>
	<li>Przygotuj narzędzia do preparacji: nożyczki, małą szpatułkę, kleszcze proste.</li>
	<li>Przygotuj narzędzia do przenoszenia plastrów: mały pędzel lub miękką pętelkę do zaszczepiania (rozmiar: 10 μl), plastikowe pipety Pasteura, pojemnik na lód i kilka plastikowych naczyń o średnicy 6 cm.</li>
	<li>Schłodzić pożywkę preparacyjną w temperaturze 2-4 °C.</li>
</ol>
2.2. Przygotowanie wycinków mózgu
<ol>
	<li>Napełnij naczynie o średnicy 6 cm schłodzonym podłożem preparacyjnym i umieść je na lodzie (aby zachować świeżo pokrojone plastry).</li>
	<li>Po zwichnięciu szyjki macicy użyj nożyczek, aby odciąć głowę szczeniakowi myszy. Usuń skórę głowy skalpelem, przetnij czaszkę wzdłuż szwu środkowego strzałkowego od OB do móżdżku i delikatnie usuń płaty czaszki za pomocą kleszczy. Upewnij się, że cały mózg jest odsłonięty i ostrożnie wypreparuj go za pomocą szpatułki, zwracając szczególną uwagę, aby nie uszkodzić tkanki. Sekcja musi być wykonana ostrożnie, ale jednocześnie bardzo szybko (mniej niż minuta, jeśli to możliwe). Zwichnięcie szyjki macicy jest naszą preferowaną metodą, ponieważ znieczulenie końcowe lekami/środkami znieczulającymi gazami może wpływać na właściwości migracyjne neuroblastów i zdrowy stan kultur wycinków mózgu, które muszą być zobrazowane stosunkowo szybko po uśmierceniu zwierząt.</li>
	<li>Wyciąć mózg za pomocą żyletki (ryc. 2). Wyrzuć niewstrzykniętą półkulę lub użyj do innych eksperymentów.</li>
	<li>Umieść mały kawałek taśmy na uchwycie wibratomu i użyj minimalnej niezbędnej ilości kleju, aby przymocować do niego półkulę mózgu (ryc. 2). Zapobiega to uszkodzeniom powierzchni uchwytu w wyniku wielokrotnego nakładania kleju.</li>
	<li>Pozostaw klej do wyschnięcia na kilka sekund.</li>
	<li>Umieść uchwyt w tacce z wibratomem wypełnionej wstępnie schłodzonym roztworem preparacyjnym. Skieruj opuszkę węchową w stronę ostrza (ryc. 2).</li>
	<li>Rozpocznij przecinanie półkuli mózgu przy użyciu odpowiednich ustawień. Zalecane są następujące parametry: grubość plastra 300 μm; prędkość ~3-5; Częstotliwość ~9. Zalecana jest wysoka częstotliwość i niska prędkość, aby zapobiec uszkodzeniu plastra.</li>
	<li>Zbieraj plasterki za pomocą małego pędzla lub miękkiej pętli do zaszczepiania. Trzymaj tylko plastry z widocznym OB (zwykle 2-3 plasterki/mózg). Zazwyczaj wycinek zawierający większość RMS można znaleźć w odległości ~300 μm od dolnej powierzchni.</li>
	<li>Sprawdź plastry pod standardowym mikroskopem fluorescencyjnym pod kątem sygnału GFP (pamiętaj, aby je odwrócić, aby sprawdzić fluorescencję po obu stronach) i wybierz te, które pokazują jasną fluorescencję wzdłuż większości RMS.</li>
</ol>
2.3. Hodowla wycinków mózgu
<ol>
	<li>W kapturze do hodowli komórkowej odetnij najbardziej ogonową trzecią część wycinka mózgu i usuń wszelkie ślady kleju za pomocą cienkiej prostej pęsety lub skalpela do mikrodysekcji.</li>
	<li>Delikatnie zassaj plasterek za pomocą plastikowej pipety Pasteura (odetnij końcówkę pipety, aby utworzyć większy otwór, pozwoli to uniknąć uszkodzenia plasterka) i umieść go na środku podgrzanej wkładki Millicell.</li>
	<li>Upewnij się, że strona z najjaśniejszym sygnałem fluorescencyjnym styka się z wkładką Millicell (do obrazowania za pomocą mikroskopu odwróconego).</li>
	<li>Usunąć nadmiar roztworu preparacyjnego z wkładki za pomocą pipety.</li>
	<li>Pozostawić kultury w plastrach do osadzenia w inkubatorze o temperaturze 37 °C/5% CO2 na co najmniej 1 godzinę przed obrazowaniem.</li>
</ol>
3. Obrazowanie poklatkowe migracji neuroblastów
<ol>
	<li>Co najmniej 2 godziny przed obrazowaniem włącz konfokalny system wirującego dysku Perkin Elmer UltraViewVoX, odwrócony mikroskop Nikon Ti-E, chłodzoną cyfrową kamerę CCD Hamamatsu C10600-10B (ORCA-R2) oraz system grzewczy (Solent Scientific) ustawiony na stałą temperaturę 37 °C.</li>
	<li>Otwórz moduł akwizycji oprogramowania Volocity i kliknij przycisk "VIz" i wybierz laser(y) do obrazowania.</li>
	<li>W ciągu 2 godzin od przygotowania wycinka mózgu umieść naczynie ze szklanym dnem zawierające wycinek mózgu w komorze obrazowania na stoliku mikroskopu.</li>
	<li>Użyj obiektywu Nikon CFI Super Plan Fluor ELWD 20X/0.45 w odpowiednim świetle fluorescencyjnym, aby wybrać i ustawić ostrość na obszarze wycinka, który będzie obrazowany (np. pierwsza zstępująca część RMS tuż po miejscu wstrzyknięcia lub obszar łokcia RMS lub tuż za łokciem, zanim neuroblasty dostaną się do OB).</li>
	<li>Skonfiguruj obrazowanie poklatkowe, wykonując następujące czynności:
	<ol>
		<li>W mikroskopie kliknij przycisk L100, aby umożliwić skanowanie laserowe próbki.</li>
		<li>W Volocity otwórz zmieniacz laserowy UltraVIEW, wybierając odpowiedni laser (np. laser 488 nm dla GFP).</li>
		<li>Ustaw czas naświetlania (zwykle w zakresie 100-500 ms) i intensywność lasera (zwykle 20-30%) w zależności od intensywności sygnału fluorescencyjnego.</li>
		<li>Dostosuj cyfrowe wzmocnienie obrazu, aby poprawić wizualizację komórek.</li>
		<li>Wybierz interwał stosu z, aby zobrazować wnętrze wycinka mózgu (zwykle w odstępie 100-120 μm). Wybierz interwał z odpowiednią liczbą izolowanych komórek, aby w jak największym stopniu uniknąć ewentualnego nakładania się (ułatwi to późniejszą analizę śledzenia).</li>
		<li>Wybierz odstępy między każdym obrazem stosu z (zwykle 2-4 μm).</li>
		<li>Wybierz odstęp czasu między każdym przechwyceniem stosu z użyciem (np. 3 min) i całkowity czas trwania obrazowania (np. 3 godziny).</li>
		<li>Kliknij ikonę "zapisz", aby zapisać zmiany parametrów obrazowania.</li>
		<li>Naciśnij przycisk nagrywania, aby rozpocząć obrazowanie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Naprzemienne obrazowanie próbek kontrolnych i eksperymentalnych (na przykład leczenie nośnikiem/lekiem lub różne elektroporowane plazmidy) w ciągu tego samego dnia.</li>
</ol>
4. Analiza migracji neuroblastów
<ol>
	<li>W module Kwantyfikacja objętości otwórz żądaną bibliotekę utworzoną po zakończeniu eksperymentu poklatkowego. Wybierz "Rozszerzone ustawianie ostrości" w lewym górnym polu (Rysunek 4A, krok 1).</li>
	<li>Kliknij zakładkę "Pomiary", aby wyświetlić okno Pomiar (Rysunek 4A, krok 2).</li>
	<li>Lista zadań jest widoczna w lewym dolnym rogu ekranu. Przeciągnij "Ścieżka" (znajdująca się pod nagłówkiem "Różne" na dole listy) w miejscu powyżej. Spowoduje to otwarcie nowego okna o nazwie "Ścieżka" w lewej górnej części ekranu (Rysunek 4A, krok 3).</li>
	<li>Wybierz "Punkty" z zakładki "Wejście" w oknie Ścieżka (Rysunek 4A, krok 4).</li>
	<li>Kliknij narzędzie Punkt (Rysunek 4A, krok 5).</li>
	<li>Rozpocznij śledzenie migrującego neuroblastu, klikając myszką na centralny obszar ciała komórki i śledź ruch komórki, aż zostanie osiągnięty ostatni punkt czasowy poklatkowy (na przykład punkt numer 61 dla 3-godzinnego filmu).</li>
	<li>Aby uzyskać dane, wybierz "Wykonaj element pomiaru" z menu pomiarów (Rysunek 4B, kroki 6-7). Na środku ekranu pojawi się okno.</li>
	<li>W tym oknie wybierz "Nowy element pomiaru o nazwie:" i wpisz nazwę (Rysunek 4C, krok 8). Pamiętaj, aby wybrać opcję "Wszystkie punkty czasowe" przed naciśnięciem przycisku OK (Rysunek 4C, krok 9). Pod plikiem poklatkowym pojawi się plik elementu pomiaru, który będzie zawierał parametry do analizy ilościowej (np. odległość migracji, prędkość, przemieszczenie i szybkość przemieszczenia).</li>
	<li>Kliknij dwukrotnie plik elementu pomiaru, aby otworzyć go jako okno (Rysunek 4D, krok 10).</li>
	<li>Aby zobrazować pojedyncze ścieżki analizowanych komórek, wybierz "Śledzony punkt" z opcji "Wyświetlanie" (Rysunek 4D, krok 11).</li>
	<li>Kliknij prawym przyciskiem myszy plik elementu pomiarowego i wyeksportuj go jako plik tekstowy, który można następnie zaimportować do programów takich jak Excel w celu przeanalizowania parametrów migracji.</li>
	<li>Aby zmierzyć ruchy między kolejnymi klatkami i pauzy wykonane przez każdą komórkę w okresie filmowania, w pliku elementu pomiaru wybierz z opcji "Wyświetlanie" "Punkt" lub "Populacje" i kliknij ID (każda ścieżka ma unikalny identyfikator). Wyeksportuj plik wynikowy, postępując zgodnie z opisem w kroku 4.10.</li>
</ol>

<ol><li>Ming, G. L., Song, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+neurogenesis+in+the+mammalian+brain%3A+significant+answers+and+significant+questions%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Adult neurogenesis in the mammalian brain: significant answers and significant questions.</a> Neuron. 70, 687-702 (2011).</li>
<li>Deng, W., Aimone, J. B., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+neurons+and+new+memories%3A+how+does+adult+hippocampal+neurogenesis+affect+learning+and%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">New neurons and new memories: how does adult hippocampal neurogenesis affect learning and.</a> 11, 339-350 (2010).</li>
<li>Lazarini, F., Lledo, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+adult+neurogenesis+essential+for+olfaction%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Is adult neurogenesis essential for olfaction?</a> Trends Neurosci. 34, 20-30 (2011).</li>
<li>Arvidsson, A., Collin, T., Kirik, D., Kokaia, Z., Lindvall, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+replacement+from+endogenous+precursors+in+the+adult+brain+after+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Neuronal replacement from endogenous precursors in the adult brain after stroke.</a> Nat. Med. 8, 963-970 (2002).</li>
<li>Emsley, J. G., Hagg, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((alpha6beta1+integrin+directs+migration+of+neuronal+precursors+in+adult+mouse+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">alpha6beta1 integrin directs migration of neuronal precursors in adult mouse forebrain.</a> Exp. Neurol. 183, 273-285 (2003).</li>
<li>Sundholm-Peters, N. L., Yang, H. K., Goings, G. E., Walker, A. S., Szele, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subventricular+zone+neuroblasts+emigrate+toward+cortical+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuropathol.+Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Subventricular zone neuroblasts emigrate toward cortical lesions.</a> J. Neuropathol. Exp. Neurol. 64, 1089-1100 (2005).</li>
<li>Doetsch, F., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Network+of+tangential+pathways+for+neuronal+migration+in+adult+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Network of tangential pathways for neuronal migration in adult mammalian brain.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 14895-14900 (1996).</li>
<li>Ming, G. L., Song, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+neurogenesis+in+the+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Adult neurogenesis in the mammalian central nervous system.</a> Annu. Rev. Neurosci. 28, 223-250 (2005).</li>
<li>Pathania, M., Yan, L. D., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+symphony+of+signals+conducts+early+and+late+stages+of+adult+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">A symphony of signals conducts early and late stages of adult neurogenesis.</a> Neuropharmacology. 58, 865-876 (2010).</li>
<li>Belvindrah, R., Nissant, A., Lledo, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormal+neuronal+migration+changes+the+fate+of+developing+neurons+in+the+postnatal+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Abnormal neuronal migration changes the fate of developing neurons in the postnatal olfactory bulb.</a> J. Neurosci. 31, 7551-7562 (2011).</li>
<li>Gotts, J. E., Chesselet, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+subventricular+zone+expansion+after+focal+cortical+ischemic+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of subventricular zone expansion after focal cortical ischemic injury.</a> J. Comp. Neurol. 488, 201-214 (2005).</li>
<li>Goings, G. E., Sahni, V., Szele, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migration+patterns+of+subventricular+zone+cells+in+adult+mice+change+after+cerebral+cortex+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Migration patterns of subventricular zone cells in adult mice change after cerebral cortex injury.</a> Brain Res. 996, 213-226 (2004).</li>
<li>Romanko, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+the+mammalian+subventricular+zone+in+cell+replacement+after+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Roles of the mammalian subventricular zone in cell replacement after brain injury.</a> Prog. Neurobiol. 74, 77-99 (2004).</li>
<li>Saito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+electroporation+in+the+embryonic+mouse+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system.</a> Nat. Protoc. 1, 1552-1558 (2006).</li>
<li>Boutin, C., Diestel, S., Desoeuvre, A., Tiveron, M. C., Cremer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+in+vivo+electroporation+of+the+postnatal+rodent+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Efficient in vivo electroporation of the postnatal rodent forebrain.</a> PloS One. 3, e1883(2008).</li>
<li>Barnabe-Heider, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+manipulation+of+adult+mouse+neurogenic+niches+by+in+vivo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Genetic manipulation of adult mouse neurogenic niches by in vivo electroporation.</a> Nat. Methods. 5, 189-196 (2008).</li>
<li>Platel, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMDA+receptors+activated+by+subventricular+zone+astrocytic+glutamate+are+critical+for+neuroblast+survival+prior+to+entering+a+synaptic+network%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">NMDA receptors activated by subventricular zone astrocytic glutamate are critical for neuroblast survival prior to entering a synaptic network.</a> Neuron. 65, 859-872 (2010).</li>
<li>Pathania, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-132+enhances+dendritic+morphogenesis%2C+spine+density%2C+synaptic+integration%2C+and+survival+of+newborn+olfactory+bulb+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">miR-132 enhances dendritic morphogenesis, spine density, synaptic integration, and survival of newborn olfactory bulb neurons.</a> PloS One. 7, e38174(2012).</li>
<li>dal Maschio, M., M,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-performance+and+site-directed+in+utero+electroporation+by+a+triple-electrode+probe%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">High-performance and site-directed in utero electroporation by a triple-electrode probe.</a> Nat. Commun. 3, 960(2012).</li>
<li>Oudin, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocannabinoids+regulate+the+migration+of+subventricular+zone-derived+neuroblasts+in+the+postnatal+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Endocannabinoids regulate the migration of subventricular zone-derived neuroblasts in the postnatal brain.</a> J. Neurosci. 31, 4000-4011 (2011).</li>
<li>Lacar, B., Young, S. Z., Platel, J. C., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+and+recording+subventricular+zone+progenitor+cells+in+live+tissue+of+postnatal+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Imaging and recording subventricular zone progenitor cells in live tissue of postnatal mice.</a> Front. Neurosci. 4, (2010).</li>
<li>Feliciano, D. M., Lafourcade, C. A., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatal+subventricular+zone+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Neonatal subventricular zone electroporation.</a> J. Vis. Exp. (72), e50197(2013).</li>
<li>Nam, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+features+of+postnatal+subventricular+zone+cell+motility%3A+a+two-photon+time-lapse+study%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Dynamic features of postnatal subventricular zone cell motility: a two-photon time-lapse study.</a> J. Comp. Neurol. 505, 190-208 (2007).</li>
<li>James, R., Kim, Y., Hockberger, P. E., Szele, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subventricular+zone+cell+migration%3A+lessons+from+quantitative+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Subventricular zone cell migration: lessons from quantitative two-photon microscopy.</a> Front. Neurosci. 5, 30(2011).</li>
<li>Fernandez, M. E., Croce, S., Boutin, C., Cremer, H., Raineteau, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+electroporation+of+defined+lateral+ventricular+walls%3A+a+novel+and+rapid+method+to+study+fate+specification+during+postnatal+forebrain+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Dev%22%5BJournal%5D)">Targeted electroporation of defined lateral ventricular walls: a novel and rapid method to study fate specification during postnatal forebrain neurogenesis.</a> Neural Dev. 6, 13(2011).</li>
<li>Saha, B., Ypsilanti, A. R., Boutin, C., Cremer, H., Chedotal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plexin-b2+regulates+the+proliferation+and+migration+of+neuroblasts+in+the+postnatal+and+adult+subventricular+zone%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Plexin-b2 regulates the proliferation and migration of neuroblasts in the postnatal and adult subventricular zone.</a> J. Neurosci. 32, 16892-16905 (2012).</li>
<li>Sanai, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corridors+of+migrating+neurons+in+the+human+brain+and+their+decline+during+infancy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Corridors of migrating neurons in the human brain and their decline during infancy.</a> Nature. 478, 382-386 (2011).</li>
<li>Tattersfield, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenesis+in+the+striatum+of+the+quinolinic+acid+lesion+model+of+Huntington%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neurogenesis in the striatum of the quinolinic acid lesion model of Huntington's disease.</a> Neuroscience. 127, 319-332 (2004).</li>
<li>Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+selection+for+high-expression+transfectants+with+a+novel+eukaryotic+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector.</a> Gene. 108, 193-199 (1991).</li>
<li>Lledo, P. M., Alonso, M., Grubb, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+neurogenesis+and+functional+plasticity+in+neuronal+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Adult neurogenesis and functional plasticity in neuronal circuits.</a> Nat. Rev. Neurosci. 7, 179-193 (2006).</li>
<li>Khlghatyan, J., Saghatelyan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-lapse+imaging+of+neuroblast+migration+in+acute+slices+of+the+adult+mouse+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Time-lapse imaging of neuroblast migration in acute slices of the adult mouse forebrain.</a> J. Vis. Exp. (67), e4061(2012).</li>
<li>Snapyan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vasculature+guides+migrating+neuronal+precursors+in+the+adult+mammalian+forebrain+via+brain-derived+neurotrophic+factor+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Vasculature guides migrating neuronal precursors in the adult mammalian forebrain via brain-derived neurotrophic factor signaling.</a> J. Neurosci. 29, 4172-4188 (2009).</li>
<li>Platel, J. C., Heintz, T., Young, S., Gordon, V., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tonic+activation+of+GLUK5+kainate+receptors+decreases+neuroblast+migration+in+whole-mounts+of+the+subventricular+zone%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Tonic activation of GLUK5 kainate receptors decreases neuroblast migration in whole-mounts of the subventricular zone.</a> J. Physiol. 586, 3783-3793 (2008).</li>
<li>Schaar, B. T., McConnell, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoskeletal+coordination+during+neuronal+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Cytoskeletal coordination during neuronal migration.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 13652-13657 (2005).</li>
<li>Valiente, M., Marin, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+migration+mechanisms+in+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.Opin.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Neuronal migration mechanisms in development and disease.</a> Curr.Opin. Neurobiol. 20, 68-78 (2010).</li>
<li>Comte, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Galectin-3+maintains+cell+motility+from+the+subventricular+zone+to+the+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Galectin-3 maintains cell motility from the subventricular zone to the olfactory bulb.</a> J. Cell Sci. 124, 2438-2447 (2011).</li>
<li>Sonego, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fascin+regulates+the+migration+of+subventricular+zone-derived+neuroblasts+in+the+postnatal+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Fascin regulates the migration of subventricular zone-derived neuroblasts in the postnatal brain.</a> J. Neurosci. 33, 12171-12185 (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Efektywna migracja neuronalnych komórek progenitorowych wzdłuż RMS zapewnia ich późniejsze dojrzewanie do funkcjonalnych neuronów10. Wyraźne strumienie neuronalnych komórek progenitorowych skierowanych w stronę OB są widoczne w okresie niemowlęcym u człowieka i prawdopodobnie odgrywają ważną rolę we wczesnym rozwoju mózgu człowieka po urodzeniu27. Co więcej, komórki te są w stanie celować w miejsca mózgu dotknięte urazem i neurodegeneracją4,28. Możliwość monitorowania w czasie rzeczywisty...

W mózgu ssaków tworzenie nowych neuronów (neurogeneza) następuje po urodzeniu głównie w dwóch regionach, strefie podkomorowej (SVZ) komór bocznych i strefie podziarnistej w zakręcie zębatym hipokampa1. Liczne dowody zebrane w ostatnich latach potwierdzają kluczową rolę neurogenezy pourodzeniowej w funkcjach pamięci hipokampa i opuszki węchowej1-3. Co ważne, neurogeneza poporodowa ma również potencjał terapeutyczny ze względu na jej związek z zwyrodnieniowymi zaburzeniami neurologicznymi oraz zdolność neuroblastów do migracji do uszkodzonych miejsc w mózgu4-6.
Strefa podkomorowa (SVZ) stała się ostatnio kluczową niszą neurogenną. Neuroblasty pochodzące z SVZ migrują w kierunku opuszki węchowej (OB) za pośrednictwem rostralnego strumienia migracyjnego (RMS), co sprawia, że jest to najdłuższy proces migracji w mózgu postnatalnym1,7,8. System SVZ/RMS/OB u ssaków stał się użytecznym modelem do badania różnych etapów neurogenezy, takich jak proliferacja, migracja i różnicowanie1,8. Wiele czynników wzrostu i sygnałów zewnątrzkomórkowych reguluje neurogenezę SVZ i migrację wzdłuż RMS, ale wewnątrzkomórkowe mechanizmy molekularne są dalekie od pełnego zrozumienia1,9. Właściwa migracja wzdłuż RMS ma kluczowe znaczenie dla późniejszego dojrzewania nowo narodzonych neuronów10. Ponadto niektóre badania wykazały, że neuroblasty pochodzące z SVZ mogą migrować z RMS do miejsc uszkodzenia mózgu4-6,11-13. W związku z tym badanie mechanizmów sygnalizacyjnych regulujących migrację neuroblastów ma zasadnicze znaczenie nie tylko dla zrozumienia neurogenezy, ale także dla potencjalnych zastosowań terapeutycznych.
Tutaj opisujemy szczegółowy protokół oznaczania progenitorów neuronalnych SVZ za pomocą elektroporacji in vivo postnatalnej i monitorowania ich migracji wzdłuż RMS w ostrych kulturach wycinków mózgu za pomocą poklatkowej mikroskopii konfokalnej z wirującym dyskiem. Elektroporacja jest szeroko stosowana w badaniach rozwojowych od stadium embrionalnego do dorosłego14-18. Jest to potężne narzędzie do namierzania i manipulowania neuronalnymi progenitorami SVZ i stanowi tańszą i znacznie szybszą alternatywę dla stereotaktycznego wstrzykiwania wektorów wirusowych lub generowania modeli transgenicznych1,15,19,20. Jest to stosunkowo prosta procedura, która nie wymaga operacji i ma wysokie wskaźniki przeżycia. Elektroporacja plazmidów eksprymujących rekombinazę shRNA lub CRE w mysich modelach genetycznych wykorzystujących system LoxP może być wykorzystana do celowania w geny będące przedmiotem zainteresowania lub do uzyskania trwałego znakowania progenitorów SVZ, stanowiąc w ten sposób użyteczne narzędzie do badań neurogenezy dorosłych21,22.
Obrazowanie migracji neuroblastów RMS w nienaruszonym mózgu jest nadal trudne ze względu na obecne ograniczenia techniczne. Jednak proces ten może być monitorowany za pomocą konfokalnej mikroskopii poklatkowej z wirującym dyskiem ostrych wycinków mózgu, które zapewniają odpowiedni system bardzo podobny do stanu in vivo, który jest również podatny na manipulację farmakologiczną23,24. Sprzężenie elektroporacji poporodowej in vivo z obrazowaniem poklatkowym ułatwi zrozumienie mechanizmów molekularnych kontrolujących ruchliwość neuroblastów i przyczyni się do opracowania nowatorskich podejść wspomagających naprawę mózgu.

<table><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Millicell</td><td>Millipore</td><td>PICM0RG50</td><td></td></tr><tr><td>35 mm Naczynie hodowlane ze szklanym dnem</td><td>MatTek</td><td>P35G-0-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Gey's Balanced Media</td><td>Sigma</td><td>G9779-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Glukoza, 45%</td><td>Sigma</td><td>G8769-100ML</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375-25G</td><td></td></tr><tr><td>Długopis/ Strep</td><td>GIBCO</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>GIBCO</td><td>10109-163</td><td></td></tr><tr><td>B27 suplement</td><td><a>Invitrogen Life Technologies</a></td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td><a>Invitrogen Life Technologies</a></td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (bez czerwieni fenolowej)</td><td>GIBCO</td><td>31053-028</td><td></td></tr><tr><td>Fast Green</td><td>Sigma</td><td>F7252-5G</td><td></td></tr><tr><td>Szklane kapilary do wstrzykiwań</td><td>Aparat Harvard</td><td>30-0057</td><td></td></tr><tr><td>Rurka aspiratora</td><td>Sigma</td><td>A5177</td><td></td></tr><tr><td>Ściągacz kapilar Sutter P-97</td><td>Instrument Sutter</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>ECM830 Elektroporator prostokątny</td><td>Aparat Harvard</td><td>45-0052</td><td></td></tr><tr><td>Platynowa pęseta 7 mm</td><td>Aparat Harvard</td><td>45-0488</td><td></td></tr><tr><td>Przełącznik nożny model 1250F</td><td>Aparatura Harvarda</td><td>45-0211</td><td></td></tr><tr><td>Żel do elektrod</td><td>Cefar Compex</td><td>6602048</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Merial</td><td>AP/DRUGS/220/96</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>VT1000S</td><td></td></tr><tr><td>Klej</td><td>Roti coll</td><td>Roti coll 1</td><td></td></tr><tr><td>System wirujących dysków UltraViEW VoX</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td>Indywidualna konfiguracja (można użyć wielu źródeł lasera) wyposażona w kamerę CCD Hamamatsu ORCA R2 C10600-10B</td></tr><tr><td>Oprogramowanie Volocity</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td>Moduły akwizycji, kwantyfikacji, wizualizacji</td></tr><tr><td>Komora środowiskowa do mikroskopii</td><td>Solent Scientific</td><td></td><td>Wykonany na zamówienie</td></tr><tr><td>mikroskop odwrócony Ti-E</td><td>Nikon</td><td></td><td>Obiektyw CFI Super Plan Fluor ELWD 20X/0,45 NA jest zalecany do zastosowań opisanych w tym artykule</td></tr></tbody></table>

in vivo (in vivo) poporodowa elektroporacja i obrazowanie poklatkowe migracji neuroblastów w ostrych wycinkach mózgu myszy

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

Strefa podkomorowa (SVZ) jest jedną z głównych nisz neurogennych w mózgu po urodzeniu. W tym przypadku neuronalne komórki progenitorowe namnażają się i dają początek neuroblastom zdolnym do poruszania się wzdłuż rostralnego strumienia migracyjnego (RMS) w kierunku opuszki węchowej (OB). Ta długodystansowa migracja jest niezbędna do późniejszego dojrzewania nowo narodzonych neuronów w OB, ale mechanizmy molekularne regulujące ten proces są nadal niejasne. Badanie szlaków sygnałowych kontrolujących ruchliwość neuroblastów może nie tylko pomóc w zrozumieniu podstawowego etapu neurogenezy, ale także mieć terapeutyczny potencjał regeneracyjny, biorąc pod uwagę zdolność tych neuroblastów do celowania w miejsca mózgu dotknięte urazem, udarem lub zwyrodnieniem.
W tym manuskrypcie opisujemy szczegółowy protokół elektroporacji in vivo i późniejszego obrazowania poklatkowego migracji neuroblastów w RMS myszy. Elektroporacja poporodowa może skutecznie transfekować komórki progenitorowe SVZ, które z kolei generują neuroblasty migrujące wzdłuż RMS. Korzystając z konfokalnej mikroskopii poklatkowej z wirującym dyskiem na ostrych kulturach wycinków mózgu, migracja neuroblastów może być monitorowana w środowisku bardzo przypominającym w warunkach in vivo. Co więcej, ruchliwość neuroblastów może być śledzona i analizowana ilościowo. Jako przykład opisujemy, jak wykorzystać elektroporację in vivo plazmidu wykazującego ekspresję GFP do znakowania i wizualizacji neuroblastów migrujących wzdłuż RMS. Elektroporacja plazmidów eksprymujących rekombinazę shRNA lub CRE u myszy z warunkowym nokautem wykorzystujących system LoxP może być również wykorzystana do celowania w interesujące geny. Można przeprowadzić farmakologiczną manipulację ostrymi kulturami wycinków mózgu w celu zbadania roli różnych cząsteczek sygnałowych w migracji neuroblastów. Łącząc elektroporację in vivo z obrazowaniem poklatkowym, mamy nadzieję zrozumieć mechanizmy molekularne kontrolujące ruchliwość neuroblastów i przyczynić się do rozwoju nowych podejść wspomagających naprawę mózgu.

Znakowanie migrujących neuroblastów pochodzących z SVZ można obserwować wzdłuż RMS, zazwyczaj 4-8 dni po udanej elektroporacji (Rysunek 1B). Można wybrać dłuższe punkty czasowe, jednak w RMS znajdzie się mniej komórek, ponieważ większość z nich przeniknie do OB. Neuroblasty zaczynają nabierać typowej morfologii i cech dojrzałych komórek ziarnistych w OB około 2-3 tygodni po elektroporacji (nie pokazano). Po hodowli przez ~1 hr, skrawki mózgu z elektroporowanych mysich piskląt można wiarygodnie obrazować ...

Migracja neuroblastów jest fundamentalnym wydarzeniem w neurogenezie poporodowej. Opisujemy protokół skutecznego znakowania neuroblastów za pomocą elektroporacji poporodowej in vivo i późniejszej wizualizacji ich migracji za pomocą obrazowania poklatkowego ostrych wycinków mózgu. Dołączamy opis do ilościowej analizy dynamiki neuroblastów za pomocą śledzenia wideo.

In vivo (in vivo) Poporodowa elektroporacja i obrazowanie poklatkowe migracji neuroblastów w ostrych wycinkach mózgu myszy

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to ...

Ogólnym celem tej procedury jest wizualizacja i analiza migracji neuroblastów wzdłuż rostralnego strumienia migracyjnego w postnatalnym mózgu myszy. Osiąga się to poprzez pierwsze elektroporowane, plazmid DNA ENC pokrywający zielone białko fluorescencyjne w bocznej komorze myszy wyskakują. Drugim krokiem jest przygotowanie wycinków mózgu z myszy poddanych elektropoterapii.Następnie do hodowli wybierane są wycinki z najlepszym sygnałem GFP. Ostatnim krokiem jest obrazowanie poklatkowe wycinków mózgu zawierających neuroblast migracyjny oznaczony GFP za pomocą mikroskopu konfokalnego z wirującym dyskiem. Ostatecznie filmy poklatkowe są wykorzystywane do śledzenia komórek i analizy ilościowej migracji neuroblastów.Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie neurogenezy, takie jak to, w jaki sposób ruch neuroblastów pochodzących z komórek macierzystych jest kierowany i regulowany w mózgu po urodzeniu. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak dostarczanie wektorów wirusowych, jest to, że jest łatwiejsza, tańsza i mniej czasochłonna. Ponadto umożliwia rzadkie znakowanie neuroblastów, umożliwiając w ten sposób szczegółową analizę ich dynamiki migracji.Rozpocznij tę procedurę od ustawienia napięcia elektroporowanego na pięć impulsów kwadratowych, 50 milisekund na impuls przy 100 woltach w odstępach 850 milisekund. Następnie załaduj igłę kapilarną jednym do dwóch mikrolitrów DNA za pomocą rurki aspiratora podłączonej do kapilary. Następnie wyjmij z klatki młode myszy w drugim dniu po urodzeniu i znieczul je przez inhalację fluoru.Następnie przytrzymaj głowę szczeniaka między kciukiem a palcem wskazującym mniej dominującej ręki. Lekko odciągnąć skórę do tyłu głowy, aby ułatwić identyfikację właściwego miejsca wstrzyknięcia. Weźmy pod uwagę wirtualną linię między okiem a punktem orientacyjnym metrycznym czaszki Lambda.Następnie włóż igłę kapilarną na około jednej trzeciej długości tej linii od Lambda do około dwóch milimetrów głębokości, a następnie wstrzyknij plazmid, powoli wdmuchując przez usta. Podczas tej procedury upewnij się, że palce nie wywierają zbyt dużego nacisku na mózg. Należy przerwać wstrzykiwanie, gdy w naczyniach włosowatych pozostanie minimalna ilość roztworu DNA.Następnie pokryj obie elektrody żelem i umieść je stroną dodatnią po bocznej stronie półkuli, do której wstrzyknięto DNA. W celu włączenia DNA do Rostral SVZ umieść elektrody lekko rostralne do punktu wstrzyknięcia. Następnie zainicjuj transfer prądu, naciskając pedał przełącznika nożnego impulsu.Następnie zetrzyj żel z głowy szczeniaka, reanimuj szczeniaka tlenem na poduszce grzewczej przez kilka minut. Następnie włóż go z powrotem do klatki i umieść z dala od matki. Upewnij się, że matka aportuje młode i łączy je z resztą miotu.W tej procedurze umieść wkładki milikomórkowe w 35-milimetrowym naczyniu hodowlanym ze szklanym dnem zawierającym jeden mililitr pożywki filmowej. Następnie umieść naczynie hodowlane w nawilżonym inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% dwutlenku węgla. Po ścięciu głowy szczeniaka myszy usuń skórę głowy skalpelem.Następnie przetnij czaszkę wzdłuż środkowego szwu strzałkowego od móżdżku do opuszki węchowej. Wykonaj kilka dodatkowych poprzecznych nacięć na czaszce i delikatnie usuń płaty czaszki za pomocą kleszczy. Upewnij się, że cały mózg jest odsłonięty i ostrożnie wypreparuj go za pomocą szpatułki, zwracając szczególną uwagę, aby nie uszkodzić tkanki.Następnie hemis wypreparuj mózg żyletką i wyrzuć wstrzykniętą półkulę. Następnie umieściłem mały kawałek taśmy na uchwycie vibram. Użyj minimalnej ilości kleju niezbędnego do przymocowania do niego półkuli mózgu.Rozpocznij cięcie półkuli mózgu do plasterków o grubości 300 mikronów. Następnie zbierz plasterki za pomocą małego pędzla lub miękkiej pętli do zaszczepiania. Następnie sprawdź obie strony plasterków pod standardowym mikroskopem fluorescencyjnym pod kątem sygnału GFP i wybierz te, które wykazują jasną fluorescencję wzdłuż większości rostralnego strumienia migracyjnego.W kapturze do samodzielnej hodowli odetnij najbardziej rozpieszczoną trzecią część wycinka mózgu i usuń wszelkie ślady kleju. Następnie odessaj plasterek za pomocą plastikowej pipety i umieść go na środku wstępnie podgrzanej wkładki milikomórkowej. Usuń nadmiar roztworu preparacyjnego z wierzchu wkładki za pomocą pipety Gilsona.Następnie pozostaw kultury w plastrach do osadzenia w inkubatorze dwutlenku węgla o temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% na co najmniej godzinę. Przed obrazowaniem w ciągu dwóch godzin od przygotowania wycinka mózgu. Umieść naczynie ze szklanym dnem zawierające wycinek mózgu w komorze obrazowania na stoliku mikroskopu.Następnie użyj obiektywu o wymiarach 20 x 0,45 w odpowiednim świetle fluorescencyjnym, aby wybrać i ustawić ostrość na obszarze przekroju, który zostanie sfotografowany. Aby skonfigurować obrazowanie poklatkowe w mikroskopie, kliknij przycisk L 100, aby umożliwić skanowanie laserowe próbki. Następnie pod względem prędkości otwórz zmieniacz lasera ultra view, wybierając odpowiedni laser.Ustaw wzmocnienie czasu ekspozycji i intensywność lasera. Następnie wybierz interwał Zacka, aby zobrazować wnętrze mózgu. Następnie wybierz odstępy między każdym obrazem stosu ZS.Wybierz przedział czasu między każdym przechwyceniem stosu ZS a całkowitym czasem trwania obrazowania. Następnie kliknij ikonę zapisywania, aby zapisać zmiany parametrów obrazowania. Na koniec naciśnij przycisk nagrywania, aby rozpocząć obrazowanie w module kwantyfikacji prędkości.Otwórz pożądaną utworzoną bibliotekę. Po zakończeniu eksperymentu poklatkowego wybierz opcję rozszerzona ostrość w lewym górnym polu. Kliknij zakładkę pomiarów, aby wyświetlić okno pomiaru.Lista zadań jest widoczna w lewym dolnym rogu ekranu. Przeciągnij ścieżkę w miejscu powyżej. Spowoduje to otwarcie nowego okna o nazwie ścieżka.W lewej górnej części ekranu wybierz punkty z zakładki wprowadzania w oknie ścieżki. Kliknij narzędzie punktowe, kliknij kartę narzędzi i wybierz opcję ręcznego śledzenia obiektów, pojawi się okno, w którym operator może rozpocząć śledzenie komórek. Rozpocznij śledzenie migrującego neuroblastu, klikając myszką na centralny obszar ciała komórki i śledź ruch komórki, aż do osiągnięcia ostatniego punktu czasowego upływu.Aby uzyskać dane, wybierz opcję Utwórz element pomiaru. Z menu pomiarów na środku ekranu pojawi się okno. W tym oknie wybierz nowy element miary o nazwie i wpisz nazwę elementu pomiaru.Plik zawierający parametry do analizy ilościowej pojawi się pod plikiem poklatkowym. Kliknij dwukrotnie ten plik elementu pomiaru, aby otworzyć go jako okno do wizualizacji pojedynczych ścieżek analizowanych komórek. Wybierz śledzony punkt z opcji wyświetlania i wybierz komórki, które mają zostać zwizualizowane dla ich ścieżki migracji.Aby przeanalizować parametry migracji, kliknij prawym przyciskiem myszy plik elementu pomiarowego i wyeksportuj go jako plik tekstowy, który można następnie zaimportować w programach takich jak Excel. Są to poklatkowe obrazy neuroblastu z obracającym się dyskiem, wykonane z wycinka mózgu myszy w strzałkowym kąsce. Pięć dni po elektroporacji GFP obrazy plazmidowe wykazujące ekspresję są oddalone od siebie o godzinę.Każdy panel to projekcja Zacka składająca się z 28 kolejnych obrazów oddalonych od siebie o cztery mikrony. Groty strzałek wskazują cztery reprezentatywne neuroblasty migrujące wzdłuż RMS w kierunku opuszki węchowej. Są to reprezentatywne ścieżki migracji uzyskane z obrazowania poklatkowego czterech neuroblastów.Wykres ten pokazuje odległość, jaką przebyły w czasie dwa reprezentatywne neuroblasty. Komórki te wykazują typowe zachowanie ruchliwe solne. Ten film przedstawia sekcję RMS myszy z GFP oznaczoną jako migracja.Neuroblast uzyskany pięć dni po elektroporacji plazmidu eksprymującego GFP. Opuszka węchowa znajduje się poza zasięgiem wzroku w prawym dolnym rogu. Konfokalne stosy Z zostały uchwycone na wirującym dysku konfokalnym.Przy 20-krotnym obiektywie co trzy minuty przez trzy godziny w odstępach 120 mikronów, prędkość gry wynosi 10 klatek na sekundę. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o przećwiczeniu elektroporacji przed rozpoczęciem eksperymentów, a także o starannym przygotowaniu ostrych kultur wycinków mózgu w jak najkrótszym czasie. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wizualizować i analizować migrację neuroblastów w postnatalnym mózgu myszy.

in-vivo-postnatal-electroporation-time-lapse-imaging-neuroblast

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

In vivo Postnatalna Elektroporacja i Obrazowanie Z Kolokwialnym Przeglądem Migracji Neuroblastów w Ostrych Wycinkach Mózgu Myszy

Opisujemy protokół obrazowania wideo w czasie rzeczywistym migracji neuronów w przedmózgowiu myszy. Migrację prekursorów neuronalnych oznakowanych wirusowo lub przeszczepionych rejestrowano w ostrych żywych skrawkach, wykorzystując szerokopolowe obrazowanie fluorescencyjne z relatywnie krótkim odstępem między akwizycjami, aby zbadać różne fazy migracji komórek, w tym czas trwania fazy stacjonarnej i migracyjnej oraz prędkość migracji.

Obrazowanie time-lapse migracji neuroblastów w ostrych skrawkach przedmózgowia dorosłej myszy

Źródło: Wiegreffe, C., et. al.,  Poklatkowe obrazowanie konfokalne migrujących neuronów w organotypowej kulturze warstwowej embrionalnego mózgu myszy przy użyciu {{}}W macicy elektroporacji. J. Vis. exp.{{TAG_ 44}} (2017) Ten film przedstawia poklatkową mikroskopię konfokalną w celu obserwacji radialnej migracji neuronów korowych ze strefy podkomorowej do płytki korowej za pomocą promieniowych rusztowań glejowych w transdukowanych wycinkach mózgu myszy embrionalnych.

Obrazowanie poklatkowe migracji radialnej neuronów korowych w transdukowanych wycinkach mózgu embrionalnego myszy

Migracja neuroblastów jest kluczowym krokiem w neurogenezie poporodowej. Opisany tutaj protokół może być wykorzystany do zbadania roli kandydatów na regulatory migracji neuroblastów poprzez zastosowanie nukleofekcji DNA/małego RNA spinki do włosów (shRNA) oraz testu migracji 3D z neuroblastami wyizolowanymi z pourodzeniowego strumienia migracyjnego rostralnego gryzoni.

Nukleofekcja neuroblastów gryzoni do badania migracji neuroblastów in vitro

Ten protokół dostarcza instrukcji do bezpośredniej obserwacji promieniście migrujących neuronów korowych. Elektroporacja in utero, organotypowa hodowla plastrów i poklatkowe obrazowanie konfokalne są łączone w celu bezpośredniego i dynamicznego badania skutków nadekspresji lub regulacji w dół genów będących przedmiotem zainteresowania w migrujących neuronach oraz analizy ich różnicowania podczas rozwoju.

Poklatkowe obrazowanie konfokalne migrujących neuronów w organotypowej kulturze warstwowej embrionalnego mózgu myszy przy użyciu elektroporacji in utero

Tutaj oferujemy tanią i niezawodną metodę generowania elektroporowanych organicznych kultur warstwowych mózgu z mysich zarodków, odpowiednich do mikroskopii konfokalnej i technik obrazowania na żywo.

Ex Utero Elektroporacja i organotypowe kultury warstwowe embrionalnych mózgów myszy do obrazowania na żywo migrujących interneuronów GABA-ergicznych

Ten protokół demonstruje prostą i solidną metodę badania dynamiki wzrostu aksonów in situ i stożka wzrostu. Opisano w nim, w jaki sposób przygotować ex vivo fizjologicznie istotne ostre wycinki mózgu i przedstawiono przyjazny dla użytkownika potok analizy.

In Situ Wizualizacja wzrostu aksonów i dynamiki stożków wzrostu w ostrych kulturach embrionalnych wycinków mózgu ex vivo

Podczas rozwoju kory mózgowej, neurony i komórki glejowe pochodzą ze strefy komorowej wyściełającej komorę i migrują w kierunku powierzchni mózgu. W proces ten zaangażowanych jest wiele genów. Protokół ten wprowadza technikę obrazowania poklatkowego migrujących neuronów i komórek progenitorowych glejowych.

Obrazowanie poklatkowe migrujących neuronów i progenitorów glejowych w embrionalnych wycinkach mózgu myszy

Niniejszy protokół opisuje test z wykorzystaniem organotypowych przekrojów zoptymalizowany dla mózgu postnatalnego oraz wysokorozdzielcze obrazowanie time-lapse migracji neuroblastów w rostralnym prądzie migracyjnym.

Organotypowy test skrawkowy do wysokorozdzielczego obrazowania poklatkowego migracji neuronalnej w mózgu postnatalnym

Niniejszy film prezentuje metodę wykorzystującą połączenie elektroporacji i mikroskopii konfokalnej do obrazowania na żywo pojedynczych komórek progenitorowych neuronów w rozwijającym się przedmózgowiu danio pręgowanego. W ten sposób można przeprowadzić analizę in vivo rozwoju komórek progenitorowych neuronów przedmózgowia na poziomie klonalnym.

Obrazowanie live w trybie time-lapse klonalnie powiązanych komórek progenitorowych neuronów w rozwijającym się przedmózgowiu danio pręgowanego

Prezentujemy protokół elektroporacji in vivo do transfekcji pojedynczych komórek lub małych skupisk komórek zwojowych siatkówki (RGCs) oraz innych typów komórek siatkówki u myszy postnatalnych w szerokim zakresie wieku. Zdolność do znakowania i genetycznej manipulacji postnatalnymi RGCs in vivo stanowi potężne narzędzie w badaniach nad rozwojem.

Transfekcja komórek zwojowych siatkówki myszy za pomocą elektroporacji in vivo

Poznaj metodę elektroporacji in vivo i obrazowania poklatkowego do wizualizacji migracji neuroblastów w mózgu myszy. Technika ta umożliwia szczegółową analizę dynamiki komórkowej w neurogenezie poporodowej.

In vivo (in vivo) Poporodowa elektroporacja i obrazowanie poklatkowe migracji neuroblastów w ostrych wycinkach mózgu myszy

Przeglądaj więcej filmów