Name: Pikoiniekcja kropli mikroprzepływowych bez elektrod metalowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-18T18:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Poznaj technikę pikoiniekcji kropli mikroprzepływowych bez elektrod metalowych, umożliwiającą precyzyjną kontrolę wstrzykiwanych reagentów. Ta metoda upraszcza produkcję urządzeń i zwiększa ich niezawodność w zastosowaniach biochemicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Wydział Bioinżynierii i Nauk Terapeutycznych UCSF, Kalifornijski Instytut Nauk Ilościowych (QB3) oraz Bridging the Gap Award od Rogers Family Foundation.

1. Projektowanie wymiarów i topologii urządzeń w oparciu o potrzeby eksperymentalne za pomocą oprogramowania do projektowania wspomaganego komputerowo (CAD)
Uwaga: Wybierz średnice kanałów emulsji mniejsze niż średnice sferycznych kropel. Zmusza to kropelki do uzyskania cylindrycznego lub "kiełbasianego" kształtu i pozwala na bardziej efektywną pikoiniekcję. Na nasze potrzeby zaprojektowaliśmy kanały 30 x 30 μm dla kropel o średnicy 50 μm.
<ol>
	<li>Modelowe miejsce (miejsca) iniekcji pikoiniekcyjnej na wzór opisanych przez Abate i wsp. 3 z wyjątkiem tego, że kanały dla elektrod metalowych są usuwane, ponieważ są one niepotrzebne.</li>
	<li>Dodaj kanały, które będą służyć jako fosa Faradaya (rysunek 1), które biegną między miejscem (miejscami) pikoiniekcji a emulsją przed nim, tak aby osłaniały kropelki przed polem elektrycznym. 
	Uwaga: Zapobiega to niezamierzonemu scalaniu.</li>
</ol>
2. Wytwarzanie urządzeń przy użyciu miękkich technik fotolitograficznych
<ol>
	<li>Wygeneruj przezroczystą maskę fotolitograficzną na podstawie pliku CAD, korzystając z istniejących usług komercyjnych.</li>
	<li>Za pomocą fotomaski utwardź fotorezystor na płytkach krzemowych, aby uzyskać mistrza urządzenia, jak opisano wcześniej4.</li>
	<li>Mieszaninę PDMS z utwardzaczem (w proporcji 11:1) zalać wzorcem urządzenia znajdującym się w 5 cm polistyrenowej szalce Petriego.</li>
	<li>Umieść urządzenie wzorcowe z PDMS w eksykatorze próżniowym na około 15 minut, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza.</li>
	<li>Utwardź urządzenie PDMS, umieszczając je w piekarniku o temperaturze 95 °C na 1 godzinę. Alternatywnie, PDMS utwardza się w temperaturze pokojowej po 24 godzinach.</li>
	<li>Usuń urządzenie, przecinając obwód ostrzem chirurgicznym i ostrożnie odrywając urządzenie od mistrza.</li>
	<li>Przebić otwory wlotowe i wylotowe w PDMS za pomocą dziurkacza biopsyjnego 0,5 mm.</li>
	<li>Przymocuj urządzenie do szklanego szkiełka mikroskopowego za pomocą spawarki plazmowej4.</li>
</ol>
3. Przygotuj pompę do kontroli ciśnienia powietrza do zwiększania ciśnienia w zbiorniku zawierającym płyn
<ol>
	<li>Zmodyfikuj wydajność pompy w taki sposób, aby sprężone powietrze wydostawało się przez rurkę polietylenową o średnicy wewnętrznej 2.7 mm.</li>
	<li>Skonstruuj go w taki sposób, aby rurka kończyła się na końcówce strzykawki typu luer-lock, umieszczając światło nad smoczkiem z tyłu luer-locka.</li>
	<li>Uszczelnić, wypełniając przestrzeń między gwintami luer-lock a rurką epoksydową.</li>
	<li>Założyć igłę o masie 27,5 g.</li>
</ol>
4. Przygotuj monodyspersyjną emulsję kropelek wodnych (woda w oleju) zawieszonych w obojętnym fluorowanym oleju nośnikowym z 2% (wagowo) rozpuszczonym biokompatybilnym środkiem powierzchniowo czynnym7
Konkretne odczynniki zawarte w tych kropelkach zależą od zastosowania
<ol>
	<li>Przygotowując się do ponownego wstrzyknięcia, należy umieścić emulsję w strzykawce o pojemności 1 ml z igłą o sile 27,5 g.</li>
	<li>Zabezpiecz strzykawkę w pompce strzykawkowej i ustaw pompę pionowo (igła do góry). 
	Uwaga: Ta orientacja powoduje, że kropelki pakują się w warstwę nad olejem nośnikowym. Po uruchomieniu pompy kropelki zostaną wypchnięte ze strzykawki przy dużej frakcji objętościowej przez warstwę oleju pod nimi.</li>
</ol>
5. Przygotuj odczynniki do wprowadzenia do chipa mikroprzepływowego
<ol>
	<li>Wbij trzy otwory 0,5 mm w nasadce probówki wirówkowej o pojemności 15 ml (wystarczy dowolny pojemnik z zakrętką) za pomocą dziurkacza do biopsji, igły lub wiertła.</li>
	<li>Przełóż drut elektrodowy o średnicy 0,5 mm i rurkę PE-2 o długości ~20 cm przez dwa otwory tak, aby dotarły do dna rurki.</li>
	<li>W pozostałym otworze nawlecz rurkę PE o długości ~2,5 cm tak, aby spoczywała powyżej poziomu płynu.</li>
	<li>Uszczelnij wszelkie szczeliny w górnej części nasadki żywicą epoksydową utwardzaną promieniami UV.</li>
	<li>Napełnić rurkę płynem do wstrzykiwań pikoiniekcyjnych i zakręcić nakrętkę.</li>
	<li>Podłącz wyjście z pompy sterującej ciśnieniem powietrza do krótszej długości rurki, wkładając igłę do światła. Igła powinna ściśle przylegać.</li>
	<li>Napełnij strzykawkę o pojemności 1 ml 1 M NaCl, aby służyła jako fosa Faradaya.</li>
	<li>Podłączyć igłę 27,5 G i zamocować strzykawkę w pompie strzykawkowej.</li>
	<li>Napełnij kolejną strzykawkę o pojemności 1 ml olejem do przenoszenia/przekładki, podłącz igłę 27,5 G i zabezpiecz ją w pompce strzykawkowej.</li>
</ol>
6. Przygotowanie urządzenia mikroprzepływowego do iniekcji pikowtrysku
<ol>
	<li>Podłącz rurkę wyjściową (o większej długości) od pojemnika płynu iniekcyjnego do portu wlotowego płynu do iniekcji pikoiniekcyjnej na chipie mikroprzepływowym.</li>
	<li>Podłączyć strzykawkę zawierającą 1 M NaCl do portu wlotowego fosy Faradaya na chipie mikroprzepływowym z rurką PE o długości</li>
	<li>Podłączyć strzykawkę zawierającą olej nośnikowy do portu wlotowego chipa mikroprzepływowego za pomocą rurki PE.</li>
	<li>Włóż rurkę PE do portu wylotowego emulsji w chipie mikroprzepływowym. Rurka powinna kończyć się w naczyniu na emulsję, zwykle w probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Włóż rurkę PE do portu wylotowego fosy Faradaya na chipie mikroprzepływowym. Rurka powinna być zakończona w nieprzewodzącym i elektrycznie izolowanym pojemniku, aby zapobiec zwarciu.</li>
	<li>Podłącz wyjście wzmacniacza wysokiego napięcia (HV) za pomocą zacisku krokodylkowego do metalowej elektrody zanurzonej w płynie pikoiniekcyjnym.</li>
	<li>Podłączyć elektrodę masową wzmacniacza wysokiego napięcia za pomocą zacisku krokodylkowego do metalu igły strzykawki zawierającej 1 M NaCl.</li>
</ol>
7. Wprowadź odczynniki do chipa mikroprzepływowego
<ol>
	<li>Wprowadzić 1 M NaCl (fosa Faradaya) do urządzenia z szybkością 100 μl/h.</li>
	<li>Wprowadzić emulsję kropelkową i olej nośnikowy w ilościach odpowiednich do wymiarów urządzenia. W naszym urządzeniu demonstracyjnym wprowadzamy krople i olej w dawkach odpowiednio 200 i 400 μl/h. Natężenia przepływu powinny umożliwiać kropelkom przechodzenie przez pikowtryskiwacz w regularnych odstępach czasu, oddzielonych szczeliną oleju nośnikowego.</li>
	<li>Wyregulować ciśnienie przyłożone do płynu do iniekcji pikoiniekcyjnej w taki sposób, aby ciśnienie płynu w kryzie pikoiniekcyjnej było w równowadze mechanicznej z kanałem kroplowym. 
	Uwaga: Przy tym ciśnieniu (ciśnieniu Laplace'a) płyn do wstrzykiwań powinien wybrzuszać się w kanale kropelkowym, nie pączkując i nie tworząc własnych kropel (rysunek 2). Przy tych opisanych powyżej natężeniach przepływu przykładamy ciśnienie ~13 psi do płynu iniekcyjnego, aby osiągnąć równowagę w miejscu wstrzyknięcia.</li>
</ol>
8. Rozpocznij wstrzykiwanie pikowtrysku
<ol>
	<li>Gdy kropelki przechodzą przez otwór iniekcyjny, należy zastosować sygnał prądu przemiennego 0-10 V, 10 kHz wzmocniony 1000 razy przez wzmacniacz wysokiego napięcia (ilustracja 3).</li>
	<li>Moduluj objętość wtrysku, zmieniając amplitudę przyłożonego napięcia. 
	Uwaga: Wyższe napięcia powinny pozwolić na wprowadzenie większej ilości płynu do kropel. W naszych testach obserwujemy stabilne i spójne wstrzykiwanie przy napięciach od 100 do 3 000 V przy użyciu roztworów iniekcyjnych NaCl w zakresie od 10 do 500 mM (ilustracja 4).</li>
</ol>

<ol><li>Kritikou, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((It%27s+cheaper+in+the+Picolab%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">It's cheaper in the Picolab.</a> Nat. Rev. Genet. 6 (9), (2005).</li>
<li>Ahn, K., Agresti, J., Chong, H., Marquez, M., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrocoalescence+of+drops+synchronized+by+size-dependent+flow+in+microfluidic+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Phys.+Lett%22%5BJournal%5D)">Electrocoalescence of drops synchronized by size-dependent flow in microfluidic channels.</a> Appl. Phys. Lett. 88 (26), (2006).</li>
<li>Abate, A. R., Hung, T., Mary, P., Agresti, J. J., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+injection+with+microfluidics+using+picoinjectors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U+S+A%22%5BJournal%5D)">High-throughput injection with microfluidics using picoinjectors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 107, 19163-19166 (2010).</li>
<li>Harris, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+a+microfluidic+device+for+the+compartmentalization+of+neuron+soma+and+axons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Fabrication of a microfluidic device for the compartmentalization of neuron soma and axons.</a> J. Vis. Exp. (7), (2007).</li>
<li>Duffy, D. C., McDonald, J. C., Schueller, O. J., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+prototyping+of+microfluidic+systems+in+poly%28dimethylsiloxane%29%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Rapid prototyping of microfluidic systems in poly(dimethylsiloxane).</a> Anal. Chem. 70 (23), 4974-4984 (1998).</li>
<li>O'Donovan, B., Eastburn, D. J., Abate, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrode-free+picoinjection+of+microfluidic+drops%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Electrode-free picoinjection of microfluidic drops.</a> Lab on a Chip. 12 (20), 4029-4032 (2012).</li>
<li>Holtze, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biocompatible+surfactants+for+water-in-fluorocarbon+emulsions%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Biocompatible surfactants for water-in-fluorocarbon emulsions.</a> Lab on a Chip. 8 (10), 1632-1639 (2008).</li>
<li>Chung, C., Lee, M., Char, K., Ahn, K., Lee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+dynamics+passing+through+obstructions+in+confined+microchannel+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Microfluid.+Nanofluid%22%5BJournal%5D)">Droplet dynamics passing through obstructions in confined microchannel flow.</a> Microfluid. Nanofluid. 9, 1151-1163 (2010).</li>
<li>Herminghaus, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamical+instability+of+thin+liquid+films+between+conducting+media%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+Lett%22%5BJournal%5D)">Dynamical instability of thin liquid films between conducting media.</a> Phys. Rev. Lett. 83 (12), 2359-2361 (1999).</li>
<li>Priest, C., Herminghaus, S., Seemann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+electrocoalescence+in+microfluidics%3A+Targeting+a+single+lamella%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Phys.+Lett%22%5BJournal%5D)">Controlled electrocoalescence in microfluidics: Targeting a single lamella.</a> Appl. Phys. Lett. 89 (13), 134101-134103 (2006).</li>
<li>Florent, M., Siva, A. V., Hao, G., Dirk, E., Frieder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrowetting-controlled+droplet+generation+in+a+microfluidic+flow-focusing+device%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys%3A+Condens.+Matter%22%5BJournal%5D)">Electrowetting-controlled droplet generation in a microfluidic flow-focusing device.</a> J. Phys: Condens. Matter. 19 (46), (2007).</li>
<li>Eastburn, D. J., Sciambi, A., Abate, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Picoinjection+enables+digital+detection+of+RNA+with+droplet+rt-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Picoinjection enables digital detection of RNA with droplet rt-PCR.</a> PLoS ONE. 8 (4), (2013).</li>
</ol>

Nie do końca rozumiemy dokładny mechanizm fizyczny stojący za związkiem między przyłożonym napięciem a objętością wtrysku obserwowany w naszych eksperymentach. Zainteresowania laboratorium i odpowiednie obszary wiedzy specjalistycznej nie są dobrze przystosowane do zajmowania się tym wciąż utrzymującym się pytaniem. Zachęcamy osoby z większą wiedzą fizyczną i inżynierską do zbadania tego zjawiska.

Zależność między objętością wtrysku a przyłożonym napięciem zależy od wielu czynników, w tym wymiarów urządzenia, długości rurki transportującej płyn pikoiniekcyjny do urządzenia, molowości płynu pikoiniekcyjnego oraz prędkości kropelek przepływających przez wtryskiwacz. Z tego powodu zalecamy, aby przed każdym uruchomieniem pikoiniekcji scharakteryzować stosunek objętości do napięcia poprzez pomiar objętości wtrysku na krawędziach roboczych zakresów napięcia i molowości. Dodatkowo przy wyższych napięciach i molowcach pł...

W mikrofluidyce opartej na kropelkach, kropelki wodne w skali mikronowej są używane jako "probówki" do reakcji biologicznych. Zaletą przeprowadzania reakcji w maleńkich kropelkach jest to, że każda kropla zużywa tylko kilka pl odczynnika, a dzięki mikrofluidyce krople mogą być formowane i przetwarzane z szybkością kiloherców1. W połączeniu właściwości te pozwalają na przeprowadzenie milionów reakcji z pojedynczymi komórkami, cząsteczkami kwasu nukleinowego lub związkami w ciągu minuty z μl całkowitego materiału.
Aby używać kropli do takich zastosowań, potrzebne są techniki dodawania kontrolowanych ilości odczynników do kropli; takie operacje są analogiczne do pipetowania do probówek. Jedną z metod osiągnięcia tego celu jest elektrokoalescencja, w której kropla odczynnika łączy się z kroplą docelową poprzez zastosowanie pola elektrycznego. Pole elektryczne zaburza ułożenie cząsteczek środków powierzchniowo czynnych na granicy faz kropli, wywołując niestabilność cienkiej warstwy i wywołując koalescencję w emulsjach, które poza tym są stabilne2. Elektrycznie indukowane łączenie jest również wykorzystywane w konstrukcji pikowtryskiwacza, urządzenia, które wstrzykuje odczynniki do kropli, gdy przepływają one przez kanał3 pod ciśnieniem. Aby zastosować pole elektryczne, urządzenia pikowtryskowe wykorzystują elektrody metalowe, ale integracja elektrod metalowych z chipami mikroprzepływowymi jest często złożonym i podatnym na błędy procesem, ponieważ druty lutownicze w cieczy są łatwo naruszane przez pęcherzyki powietrza lub kurz i inne zanieczyszczenia w kanale, a także pęknięcia spowodowane naprężeniami lub zginaniem podczas konfiguracji urządzenia.
Tutaj prezentujemy metodę wykonywania picoiniekcji bez użycia metalowych elektrod, dzięki czemu produkcja jest prostsza i bardziej solidna. Aby wywołać picoiniekcję, zamiast tego używamy samego płynu iniekcyjnego jako elektrody, ponieważ większość odczynników biologicznych zawiera rozpuszczone elektrolity i przewodzi prąd. Dodajemy również "fosę Faradaya", aby chronić wrażliwe obszary urządzenia i działać jako uniwersalne podłoże (ilustracja 1). Fosa elektrycznie izoluje kropelki przed miejscem iniekcji pikoinicji, zapewniając uziemienie, zapobiegając niezamierzonemu łączeniu się kropel. Dodatkową zaletą naszej techniki jest to, że objętość wstrzykiwana do kropli zależy od wielkości przyłożonego napięcia, co pozwala na jego regulację poprzez dostrojenie zastosowanego sygnału.
Produkujemy nasze urządzenia z poli(dimetylosiloksanu) (PDMS) przy użyciu miękkich technik fotolitograficznych4,5. Nasze podejście jest kompatybilne z urządzeniami wykonanymi z innych materiałów, takich jak żywice, tworzywa sztuczne i żywice epoksydowe. Kanały mają wysokość i szerokość 30 μm, które są optymalne do pracy z kroplami o średnicy 50 μm (65 pl). Odczynniki wprowadzamy za pomocą rurki polietylenowej (średnica wewnętrzna/zewnętrzna 0,3/1,09 mm) wprowadzane do portów utworzonych podczas produkcji urządzenia za pomocą stempli biopsyjnych 0,50 mm, podobnie jak w metodach opisanych wcześniej5. Dokładny skład płynu iniekcyjnego zależy od konkretnego zastosowania. Płyn musi zawierać tylko rozpuszczone elektrolity w stężeniach wystarczająco wysokich, aby zapewnić wystarczającą przewodność, aby sygnał elektryczny mógł zostać przesłany do pikowtryskiwacza. W testach laboratoryjnych stwierdziliśmy, że stężenia jonów większe niż 10 mM powinnywystarczyć 6, chociaż ta wartość i przewodność płynu zależą od konkretnych wymiarów urządzenia i wielkości przyłożonego napięcia.

<table><tbody><tr><td>Strzykawki 1 ml Luer-Lok&trade; BD</td><td>Medical</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>LocTite Klej utwardzany promieniami UV</td><td>Henkel</td><td>35241</td><td></td></tr><tr><td>Rurki PE-2</td><td>Towary naukowe</td><td>BB31695-PE/2</td><td></td></tr><tr><td>Novec HFE-7500</td><td>3M</td><td>98-0212-2928-5</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml probówki</td> <td>wirówkoweEppendorf</td><td>22363531</td><td></td></tr><tr><td>BD Falcon 15 ml tubka</td><td>BD Biosciences</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>Pompa kontroli ciśnienia powietrza</td><td>Control Air Inc.</td><td></td><td>Polecamy jeden pod kontrolą DAQ i oprogramowania sterującego</td></tr><tr><td>Pompy strzykawkowe</td><td>New Era</td><td></td><td>Muszą być w stanie pomieścić strzykawki o pojemności 1 ml i płynąć z prędkością tak niską, jak 100 &#956; l/hr</td></tr><tr><td>Wzmacniacz</td><td></td><td></td> HV <td>Musi być zdolny do 1,000-krotnego wzmocnienia sygnałów od 0,01 do 10 V</td></tr><tr><td>Spajacz/czyścik plazmowy</td><td>Harrick Plasma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3" wafle krzemowe</td><td>Sigma Aldrich</td><td>647535</td><td></td></tr><tr><td>PDMS</td><td>Dow Corning</td><td></td><td>Sylgard 184 ze środkiem utwardzającym powinny być dołączone</td></tr><tr><td>SU-8 fotorezystor</td><td>MicroChem</td><td></td><td>Lepkość zależy od wymiarów urządzenia</td></tr></tbody></table>

pikoiniekcja kropli mikroprzepływowych bez elektrod metalowych

Picoinjection of Microfluidic Drops Without Metal Electrodes

Istniejące metody wstrzykiwania odczynników pikometrycznych do kropli mikroprzepływowych wymagają metalowych elektrod zintegrowanych z chipem mikroprzepływowym. Integracja tych elektrod dodaje uciążliwe i podatne na błędy etapy procesu produkcji urządzenia. Opracowaliśmy technikę, która eliminuje potrzebę stosowania metalowych elektrod podczas pikoiniekcji. Zamiast tego wykorzystuje sam płyn iniekcyjny jako elektrodę, ponieważ większość odczynników biologicznych zawiera rozpuszczone elektrolity i przewodzi prąd. Eliminując elektrody, skracamy czas i złożoność produkcji urządzeń oraz zwiększamy ich wytrzymałość. Ponadto, przy naszym podejściu, objętość wtrysku zależy od napięcia przyłożonego do roztworu pikoiniekcyjnego; Dzięki temu możemy szybko dostosować wstrzykiwaną głośność poprzez modulację przyłożonego napięcia. Wykazujemy, że nasza technika jest kompatybilna z odczynnikami zawierającymi popularne związki biologiczne, w tym, enzymy i kwasy nukleinowe.

Obrazy mikroskopowe wykonane w miejscu piko-iniekcji pokazują, że elektryfikacja płynu do piko-iniekcji jest wystarczająca, aby wywołać iniekcję (Rysunek 2)). Objętość wstrzykiwaną można kontrolować poprzez modulowanie amplitudy przyłożonego napięcia, przy czym wyższe napięcia pozwalają na wstrzykiwanie większych objętości. Na (Rysunku 3)) przedstawiono zależność objętości iniekcji od wartości przyłożonego napięcia dla trzech reprezentatywnych stężeń molowych płynu do iniekcji. Aby zadem...

Opracowaliśmy technikę pikoiniekcji kropli mikroprzepływowych, która nie wymaga metalowych elektrod. W związku z tym urządzenia wykorzystujące naszą technikę są prostsze w produkcji i obsłudze.

Pikoiniekcja kropli mikroprzepływowych bez elektrod metalowych

Existing methods for picoinjecting reagents into microfluidic drops require metal electrodes integrated into the microfluidic chip. The integration of ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zaprojektowanie, wykonanie i wykorzystanie chipów mikroprzepływowych umożliwiających precyzyjne i kontrolowane wstrzykiwanie odczynników do kropel wody w oleju, proces znany jako piko-wstrzykiwanie. Cel ten osiąga się poprzez zaprojektowanie urządzenia z kanałem emulsyjnym, którego średnica zwęża się do wartości mniejszej niż średnica sferycznych kropel, co pozwala na ich równomierne rozmieszczenie w obojętnym oleju nośnym. W drugim kroku krople wody i oleju są wprowadzane do urządzenia i przepływają do miejsca wstrzykiwania.Kanał prostopadły zawierający odczynniki do wstrzyknięcia. Następnie do cieczy wtryskiwanej przyłożone jest wysokie napięcie w momencie, gdy krople mijają miejsce wtrysku, aby doprowadzić do połączenia się kropli z cieczą wtryskiwaną. Uzyskane wyniki wykazują, że poprzez dostrojenie wartości przyłożonego napięcia można precyzyjnie kontrolować objętość wstrzykiwanego odczynnika z rozdzielczością pikolitrową. Technika ta powstała z potrzeby uproszczenia procesu wytwarzania naszych urządzeń poprzez wyeliminowanie konieczności stosowania elektrod metalowych.Zalety w porównaniu z istniejącymi technikami obejmują łatwość i prostotę projektowania, wykonania oraz użytkowania urządzenia. Elektrody metalowe stosowane w poprzednich metodach były podatne na uszkodzenia oraz wrażliwe na obecność kurzu i zanieczyszczeń w kanałach podczas procesu produkcji. Poprzez wyeliminowanie elektrod sprawiliśmy, że nasze urządzenia są bardziej wytrzymałe, a efektywność ich wytwarzania uległa poprawie. Pierwszym krokiem jest zaprojektowanie chipa mikrofluidycznego w oparciu o potrzeby eksperymentu.Do tego celu należy użyć oprogramowania do projektowania wspomaganego komputerowo (CAD), aby móc później wykorzystać techniki fotolitograficzne. Projekt tego chipa zawiera kanały emulsyjne, które są mniejsze niż stosowane krople sferyczne, co pozwala na bardziej efektywną pikoinkiekcję. Miejsce pikoinkiekcji oparto na projekcie opisanym w literaturze, z pominięciem elektrod metalowych.Dodatkowe kanały pełnią funkcję fosy Faradaya, aby ekranować krople znajdujące się powyżej przed polem elektrycznym. Po zakończeniu projektu należy zastosować miękkie techniki fotolitograficzne do wykonania urządzeń, a następnie przytwierdzić je do szklanego przedmiotu szkiełka mikroskopowego, przygotowując urządzenie do użycia. Przygotuj pompę do kontroli ciśnienia powietrza w celu podciśnienia zbiornika zawierającego ciecz.Aby to osiągnąć, zmodyfikuj wyjście pompy tak, aby sprężone powietrze wypływało przez odcinek rurki polietylenowej o średnicy wewnętrznej 2,7 mm. Zakończ rurkę, nakładając ją na wypustkę z tyłu końcówki strzykawki. Po uszczelnieniu przestrzeni między strzykawką a rurką za pomocą epoksydu, przymocuj igłę o rozmiarze 27,5 G, używając odczynników odpowiednich dla danego eksperymentu.Przygotuj jednorodną emulsję kropel wodnych zawieszonych w oleju nośnym. Nalej emulsję do strzykawki o pojemności jednego mililitra wyposażonej w igłę o rozmiarze 27,5 G. Następnie zamocuj strzykawkę w pompie strzykawkowej i ustaw ją tak, aby igła była skierowana do góry.Kolejnym krokiem jest przygotowanie odczynników do wprowadzenia do urządzenia mikroprzepływowego oraz ich zbiorników. Należy użyć probówki do wirowania o pojemności 15 ml wraz z zakrętką. Za pomocą puncha do biopsji lub innego odpowiedniego narzędzia należy wykonać w zakrętce trzy otwory o średnicy 0,5 mm.Przygotuj elektrodę drucianą o średnicy 0,5 mm i długości o kilka centymetrów większej niż długość probówki do wirówki. Włóż elektrodę do jednego z otworów w zakrętce. Upewnij się, że elektroda sięga dna probówki i wystaje o kilka centymetrów ponad jej górną krawędź.Następnie przygotuj odcinek rurki polietylenowej o długości około 20 centymetrów. Włóż ją do drugiego otworu. Rurka ta również powinna sięgać dna probówki w pozostałym otworze.Przewlecz około 2,5 centymetra rurki polietylenowej. Rurka ta powinna znajdować się powyżej poziomu cieczy. Nałóż utwardzaną promieniami UV żywicę epoksydową, aby uszczelnić szczeliny na górnej części nakrętki.Po zakończeniu utwardzania należy napełnić probówkę odpowiednim płynem do piko-wtryskiwania, tutaj 100 millimolar sodium chloride, a następnie zakręcić nakrętką. Wyjście z pompy sterującej ciśnieniem powietrza należy podłączyć do krótszego odcinka rurki w nakrętce. Po włożeniu igły do światła rurki powinna ona ściśle do niej przylegać.Umieść probówkę wirówkową w uchwycie. Następnie napełnij strzykawkę o pojemności 1 mL roztworem NaCl o stężeniu 1 M. Aby stworzyć płynną fosę Faradaya, podłącz igłę o rozmiarze 27,5 G i zamocuj strzykawkę w pompie strzykawkowej.Napełnij kolejną strzykawkę o pojemności 1 ml olejem do przekładki nośnej. Podłącz igłę o rozmiarze 27,5 G i zamocuj ją w pompie strzykawkowej. Na tym etapie można nawiązać połączenia z układem mikroprzepływowym.Najpierw należy upewnić się, że chip jest stabilnie zamocowany na płaskiej powierzchni. Następnie należy doprowadzić otwarty koniec długiej rurki z pojemnika z cieczą wtryskową do chipa. Podłącz rurkę do portu wlotowego cieczy do piko-wtrysku na chipie mikrofluidycznym.Następnie podłącz rurkę polietylenową do strzykawki zawierającej chlorek sodu i poprowadź ją do chipa. Podłącz rurkę do portu wlotowego fosy Faradaya. Użyj również rurki, aby połączyć strzykawkę z olejem nośnym z odpowiednim portem wlotowym w urządzeniu.Zakończ rurkę prowadzącą z portu wylotowego emulsji w naczyniu zbiorczym. Na koniec użyj rurki, aby połączyć port wylotowy rowu Faradaya z nieprzewodzącym, elektrycznie izolowanym pojemnikiem. Ostatecznie chip mikroprzepływowy wygląda w następujący sposób.Następnie należy pobrać przewód z uziemienia wzmacniacza wysokiego napięcia i poprowadzić go do igły strzykawki z chlorkiem sodu. Aby przymocować przewód do igły, należy użyć klipsa krokodylka. Kolejny przewód należy poprowadzić z wyjścia wysokiego napięcia wzmacniacza do elektrody zanurzonej w płynie do piko-iniekcji.Użyj klipsa krokodylkowego, aby wykonać połączenie wejściowe do wzmacniacza. Wykorzystaj wyjście komputerowe generatora przebiegów sterowanego programowo. Rozpocznij infuzję w układzie, wprowadzając do urządzenia płyn do motu Faradaya zawierający 1 M NaCl z prędkością 100 µL/h.Następnie uruchom przepływ kropel, emulsji i oleju nośnego, aby krople przechodziły przez piko-inżektor w regularnych odstępach, przedzielone warstwą oleju nośnego. Dostosuj ciśnienie przyłożone do cieczy piko-inżekcyjnej w taki sposób, aby ciecz w otworze piko-inżektora wybrzuszała się do kanału z kroplami, ale nie odrywała, tworząc własne krople. Użyj generatora przebiegów do wygenerowania sygnału AC o częstotliwości 10 kHz i amplitudzie od 0 do 10 V, który zostanie wzmocniony tysiąckrotnie przez wzmacniacz wysokiego napięcia.Aby przeprowadzić piko-iniekcję, należy przyłożyć ten sygnał do kropel w momencie, gdy przechodzą one przez otwór wtryskowy, i wykorzystać amplitudę jako parametr. Film ten przedstawia selektywną iniekcję kropel w zależności od obecności barwnika fluorescencyjnego.W tym przypadku przez wtryskiwacz przepływało 200 kropli na sekundę, jednak przy zastosowaniu odpowiedniego mechanizmu detekcji kropli możliwe są wartości do 10 000 na sekundę. Powyższe wykresy przedstawiają wstrzykniętą frakcję objętościową w funkcji przyłożonego napięcia dla cieczy wtryskowych o różnej molarności. Przypuszcza się, że wyższe napięcia powodują wcześniejszy początek koalescencji, co prowadzi do wydłużenia czasu wtrysku oraz zwiększenia objętości.Ta dwuwymiarowa mapa ciepła przedstawia zależność między molowością roztworu jonowego a napięciem wymaganym do uzyskania określonych objętości iniekcji. Roztwory o niższej molowości wymagają wyższych napięć, ponieważ łatwiej redukują pole elektryczne w miejscu iniekcji. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak szybko i skutecznie projektować oraz wytwarzać urządzenia mikroprzepływowe, które umożliwiają precyzyjną i kontrolowaną iniekcję reagentów do kropel.Należy pamiętać, że praca z wysokim napięciem może być niezwykle niebezpieczna; zawsze należy stosować środki ostrożności, takie jak odpowiednie uziemienie, osobiste środki ochrony indywidualnej oraz wbudowane systemy zabezpieczeń.

picoinjection-of-microfluidic-drops-without-metal-electrodes

Research

JoVE Journal

Engineering

Inżynieria

Wtryskiwanie mikropłynów bez metalowych elektrod

Opracowano nowy system mikrofluidyczny wykorzystujący zjawisko pompowania pasywnego oraz sterowany przez użytkownika system dostarczania płynów. Ze względu na niski koszt, łatwość obsługi, precyzję objętościową, wysoką prędkość, powtarzalność i automatyzację, system mikrofluidyczny ten ma potencjał do zastosowania w szerokim zakresie aplikacji biologicznych.

Szybki system dostarczania oparty na kropelkach do pompowania pasywnego w urządzeniach mikroprzepływowych

Źródło: Vanegas, M. I., et al. System mikroiniekcji do skojarzonego wlewu leków i elektrofizjologii. J. Vis. Exp. (2019 rok)Ten film przedstawia urządzenie mikroprzepływowe oparte na mikroelektrodach, które dostarcza roztwór leku przez rurkę kapilarną, wykorzystując roztwór markera na bazie oleju do precyzyjnego śledzenia objętości i umożliwiając jednoczesny zapis neuronowy i wlew leku.

System mikroiniekcji mikroprzepływowej do skojarzonego infuzji leków i elektrofizjologii

Opisano protokół produkcji i obsługi urządzeń do odwadniania pól (Field-DW), a także wstępne badania wpływu pól elektrycznych na zawartość kropel.

Wykorzystanie zmniejszonej interakcji kropelka-powierzchnia w celu optymalizacji transportu bioanalitów w cyfrowej mikrofluidyce

Prezentujemy dyskretny system wprowadzania próbek kropel do spektrometrii mas z plazmą sprzężoną indukcyjnie (ICPMS). Opiera się na tanim i jednorazowym chipie mikroprzepływowym, który generuje wysoce monodyspersyjne kropelki w zakresie wielkości 40−60 μm przy częstotliwościach od 90 do 7 000 Hz.

Układ mikroprzepływowy do próbki ICPMS Wprowadzenie

Prezentujemy metodę kontrolowania energii międzyfazowej ciekłego metalu w elektrolicie poprzez elektrochemiczne osadzanie (lub usuwanie) powierzchniowej warstwy tlenku. Ta prosta metoda może kontrolować zachowanie kapilarne ciekłych metali na bazie galu poprzez szybkie, znaczące i odwracalne dostrajanie energii międzyfazowej przy użyciu skromnych napięć.

Metoda manipulowania napięciem powierzchniowym ciekłego metalu poprzez utlenianie i redukcję powierzchni

Prezentujemy platformę mikroprzepływową ze zintegrowaną siecią elektrod powierzchniowych, która łączy rezystancyjne wykrywanie impulsów (RPS) z wielokrotnym dostępem z podziałem kodu (CDMA), do wielokrotnego wykrywania i wymiarowania cząstek w wielu kanałach mikroprzepływowych.

Platforma mikroprzepływowa z multipleksowaną detekcją elektroniczną do przestrzennego śledzenia cząstek

Prezentujemy system mikroiniekcji przeznaczony do elektrofizjologii i wspomaganego dostarczania eksperymentalnych sond (tj. nanosensorów, mikroelektrod), z opcjonalnym wlewem leku. Powszechnie dostępne składniki mikroprzepływowe są sprzężone z kaniulą zawierającą sondę. Dołączony jest protokół krok po kroku dotyczący budowy mikroiniekcji, z wynikami podczas infuzji muscymolu w korze makaka.

System mikroiniekcji do skojarzonego wlewu leków i elektrofizjologii

Opisujemy zestaw edukacyjny, który pozwala użytkownikom przeprowadzać wiele eksperymentów i zdobywać praktyczne doświadczenie w zakresie cyfrowej mikrofluidyki.

Wszechstronny zestaw oparty na cyfrowym uruchamianiu kropelkowym mikrofluidyki do nauczania przedmiotów ścisłych

Tutaj przedstawiono protokół produkcji urządzeń mikroprzepływowych na bazie szkła, używanych do generowania wysoce monodyspersyjnych emulsji o kontrolowanej wielkości kropli.

Urządzenia na bazie szkła do generowania kropli i emulsji

Prezentacja dwuwarstwowego urządzenia opartego na polidimetylosiloksanie (PDMS) do produkcji bibliotek kombinatorycznych w emulsjach (korkach) typu woda w oleju jest przedstawiona. Niezbędny sprzęt i oprogramowanie wymagane do automatyzacji produkcji zatyczek jest szczegółowo opisane w protokole, a także pokazano produkcję ilościowej biblioteki zatyczek fluorescencyjnych.

Dwuwarstwowe urządzenie mikroprzepływowe do kombinatorycznej produkcji korków

Protokół opisuje zaawansowaną platformę mikroprzepływową do ilościowego pomiaru dynamiki wydzielania cytokin w pojedynczych ludzkich komórkach jednojądrzastych krwi obwodowej. Platforma mierzy równolegle do trzech cytokin (IL-6, TNFα i IL-1β) dla każdej pojedynczej komórki stymulowanej lipopolisacharydem, na przykład.

Podejście mikroprzepływowe do rozwiązywania jednoczesnego i sekwencyjnego wydzielania cytokin w poszczególnych komórkach wielofunkcyjnych

Poznaj technikę pikoiniekcji kropli mikroprzepływowych bez elektrod metalowych, umożliwiającą precyzyjną kontrolę wstrzykiwanych reagentów. Ta metoda upraszcza produkcję urządzeń i zwiększa ich niezawodność w zastosowaniach biochemicznych.

Pikoiniekcja kropli mikroprzepływowych bez elektrod metalowych

Przeglądaj więcej filmów