Name: Jednoroślinne, sterylne mikrokosmosy do brodawkowania i wzrostu rośliny strączkowej Medicago truncatula z symbiontem ryzobialnym Sinorhizobium meliloti (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-01T09:00:00.000+00:00
Duration: 20 min 1 s
Description: Poznaj metodę jednoroslinnych mikrokosmów do badania symbiozy Medicago truncatula z Sinorhizobium meliloti. Technika umożliwia ilościową ocenę fenotypów symbiotycznych przy zachowaniu sterylności.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca została sfinansowana przez USDA National Institute of Food and Agriculture, Agriculture and Food Research Initiative grant 2010-65108- 20582 dla K.M.J. Dziękujemy Brianowi K. Washburnowi za krytyczną recenzję manuskryptu.

Zaleca się wykonanie kroków 1, 2, 4 i 6 w sterylnym okapie z przepływem laminarnym.
1. Przygotowanie sadzonek M. truncatula A17
Uwaga: Nasiona M. truncatula A17 używane w tych badaniach są produkowane w chłodnych warunkach szklarniowych w temperaturze ~22 °C, lub w pomieszczeniu do wzrostu roślin utrzymywanym w temperaturze 22-26 °C przy świetle ~150-400 mmol/m2 s-1.
<ol>
	<li>Wlać płytki do kiełkowania nasion: Użyj kwadratowych płytek 100 mm (głębokość 15 mm) i wlej autoklawowany 1,1-1,2% w/v oczyszczony agar10 na głębokość 3-5 mm. Każda płytka zostanie użyta do wykiełkowania ~0,25-0,5 g nasion (co odpowiada 63-125 nasionom/talerz). 
	Uwaga: Bardzo ważne jest, aby używać oczyszczonego agaru przetestowanego pod kątem hodowli komórek roślinnych dla wszystkich płytek opisanych w tym protokole. Informacje o dostawcy i numerze katalogowym agaru są wymienione w Tabeli określonych odczynników i sprzętu.</li>
	<li>Wertykulacja/sterylizacja nasion M. truncatula A17: Zważ wystarczającą ilość nasion na żądaną liczbę siewek. (Nasiona M. truncatula A17 mają po ~4 mg każdy) Umieścić nasiona w sterylnych kolbach o pojemności 125 ml ze sterylnymi pokrywkami z folii (0,25-0,5 g nasion/kolbę; jest to ~63-125 nasion) i odpipetować 20 ml skoncentrowanego (96%) H2SO4 wzdłuż boków kolby. 
	Uwaga: Wertykulacja kwasem wysterylizuje nasiona. Ponadto, odpipetowując kwas wzdłuż boków kolby, ponownie wysterylizuje wnętrze kolby, która miała kontakt z niewysterylizowanymi nasionami.</li>
	<li>Rozbij grudki nasion sterylną szklaną pipetą. Obracaj każdą kolbę często przez 10-12 minut. Na nasionach pojawią się małe, brązowe pestki. Są to maleńkie dziurki w okrywie nasiennej11. 
	Uwaga: Podczas pracy ze skoncentrowanymH2SO4 należy nosić okulary ochronne i rękawice.</li>
	<li>UsunąćH2SO4 i opłukać nasiona: Gdy co najmniej 10% nasion ma małe brązowe pestki lub minęło 12 minut, w zależności od tego, co nastąpi wcześniej, usuń CAŁY kwas z kolb za pomocą sterylnej szklanej pipety. (Umieść kwas odpadowy w 1-2 litrowej zlewce zawierającej co najmniej 300 ml wody z kranu. Spowoduje to rozcieńczenie kwasu i zapobiegnie przegrzaniu.) Przechylić kolbę, aby zebrać pozostały kwas w krzywiźnie kolby i użyć małej szklanej pipety do usunięcia całego pozostałego kwasu. Jeśli resztki kwasu pozostaną, zareagują z wodą do płukania, podgrzeją nasiona i zabiją je.
	<ol>
		<li>Opłucz nasiona, szybko wlewając 100 ml sterylnej ultraczystej wody do każdej kolby. Nadmierna objętość wody rozcieńczy kwas i zapobiegnie przegrzaniu i uszkodzeniu nasion podczas reakcji kwasu z wodą. Odlej wodę i wysterylizuj ogniowo krawędź kolby.</li>
		<li>Opłucz nasiona 8-10x w 50 ml sterylnej ultraczystej wody. Obracać kolbą podczas każdego płukania. W tym momencie kolbę należy uznać za sterylną, a krawędź kolby powinna być spalona przed każdym płukaniem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pozwól nasionom wchłonąć się przez noc: Po ostatnim płukaniu wlać 50 ml sterylnej ultraczystej wody do każdej kolby, założyć sterylną osłonę foliową na każdą kolbę i umieścić na noc w ciemności w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Umieść nasiona na płytce do kiełkowania: Po pozostawieniu nasion do wchłonięcia przez noc, odlej wodę, spłucz 2x ~25 ml ultraczystej wody, następnie dodaj 20 ml sterylnej ultraczystej wody, zamieszaj w celu ponownego zawieszenia nasion i wlej je na 1,1-1,2% agarową płytkę do kiełkowania z kroku 1.1. Jeśli nasiona pozostaną w kolbie, dodaj więcej wody i wlej ponownie. Rozprowadzić nasiona z każdej kolby na jedną płytkę (63-125 nasion/talerz).
	<ol>
		<li>Zakręć talerzem, aby rozprowadzić nasiona. Nasiona należy równomiernie rozprowadzić w pasie 4-5 cm na jednym końcu talerza. To będzie "góra" talerza. "Dolne" 5-6 cm powinno być wolne od nasion (ryc. 2A).</li>
		<li>Odciągnij wodę sterylną pipetą. Przechyl płytkę pod kątem 45°, aby pozostała woda spłynęła na spód płyty. Załóż pokrywę na przechyloną płytę i chroń przed światłem. Talerze powinny spłynąć przez 10-20 minut (Rysunek 2B).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj kiełkowanie: Usuń całą wodę, która zebrała się na dnie przechylonej płytki za pomocą sterylnej pipety.
	<ol>
		<li>Załóż pokrywkę i uszczelnij płytkę parafilmem. Nosić rękawice i utrzymywać sterylność (Rysunek 2C).</li>
		<li>Ułóż płytki kiełkowe w stos, a następnie obróć je wszystkie pod kątem 90°. Nasiona będą leżeć na pionowej powierzchni agaru. W pełni wchłonięte nasiona powinny łatwo przylegać do agaru. Korzenie będą rosły w dół (rysunek 2D).</li>
		<li>Owinąć stos płytek do kiełkowania folią, aby zablokować światło i przechowywać w temperaturze 25 °C przez 3 dni.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
Uwaga: Jeśli kiełkowanie trwa krócej niż 3 dni, korzenie mogą być zbyt krótkie, aby dotrzeć do agaru w mikrokosmosach. Jeśli kiełkowanie będzie przebiegać dłużej niż 4 dni przed przeniesieniem na płytki mikrokosmosu, przeżywalność sadzonek będzie słaba. Jeżeli ma być porównany ekotyp M. truncatula lub mutanty o wolniejszym tempie kiełkowania, wolno kiełkujący ekotyp powinien mieć możliwość kiełkowania dłużej niż 3 dni.
2. Przygotowanie indywidualnych mikrokosmosów płyt
<ol>
	<li>Przygotuj pożywkę Jensena12 (patrz Tabela 1 dla składu), pozwalając na ~70 ml pożywki na każdy mikrokosmos. Przygotuj w dzbankach lub kolbach, które są wygodne do szybkiego nalewania (nie więcej niż 1-2 l na dzbanek) i pozostaw mieszadło magnetyczne w dzbanku podczas autoklawowania.
	<ol>
		<li>Po schłodzeniu pożywki do temperatury ~55-65 °C, dodaniu suplementów i sprawdzeniu pH (patrz Tabela 1), rozlać do okrągłych płytek o średnicy 100 mm i głębokości 15 mm. Talerze należy wsypywać na głębokość ~0,9-1 cm (~70 ml/talerz).</li>
		<li>Składniki pożywki Jensena mogą tworzyć mętny osad, dlatego ważne jest, aby okresowo wkładać dzbanek do magnetycznej płytki mieszającej, aby zapobiec osiadaniu składników. Osady mogą być widoczne na płytce po zestaleniu się i nie wpływają na wydajność, o ile są równomiernie rozłożone między płytkami.</li>
		<li>Podczas nalewania ułóż talerze w stos, aby zapobiec tworzeniu się kondensatu na pokrywkach talerzy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po zestaleniu się płytek Jensena naciąć zarówno płytki, jak i pokrywki szpatułką wagową, która została wygięta w kształt litery U5 (Rysunek 3A). Podgrzej zagięcie szpatułki palnikiem, aż będzie rozgrzane do czerwoności, naciąć 5-6 płytek, a następnie ponownie podgrzej. Gdy karbowana pokrywka zostanie umieszczona na karbowanej płycie, utworzy to owalny portal, przez który wyrośnie pęd sadzonki (ryc. 3B). Jeśli mają być przechowywane płyty zębate, owiń je pojedynczo folią parafinową.</li>
</ol>
3. Przygotowanie kultur Sinorhizobium meliloti 
Dwa dni przed inokulacją roślin, rozpocznij hodowle wszystkich szczepów S. meliloti, które mają być zaszczepione na sadzonkach. Kultury powinny być hodowane w pożywce LBMC (Luria-Bertani [Miller])13 uzupełnionej 2,5 mM MgSO4, 2,5 mM CaCl2 i odpowiednimi antybiotykami (dobrze sprawdza się również pożywka TY). Wystarczy zaledwie 2-3 ml każdej kultury.
<ol>
	<li>Rosnąć w temperaturze 30 °C z potrząsaniem przez 2 dni, aż komórki staną się gęste.</li>
	<li>W przypadku większości inokulacji roślinnych faza wzrostu S. meliloti nie jest krytyczna. Zazwyczaj stosuje się ogniwa późnej logarytmu lub wczesnej fazy stacjonarnej.</li>
</ol>
4. Układanie sadzonek M. truncatula na indywidualnych mikrokosmosach
<ol>
	<li>Po 3 dniach otwórz płytkę do kiełkowania (przygotowaną w kroku 1) i natychmiast zalej sterylną ultraczystą wodą. Zanurz kleszcze w etanolu i krótko podpal, aby wysterylizować. Użyj sterylnych kleszczy, aby delikatnie wepchnąć końcówki korzeni wszystkich sadzonek pod wodę, aby zapobiec wysuszeniu. Korzenie będą miały od 2 do 6 cm długości. Większość będzie miała 3-4 cm. Wybierz sadzonki z prostymi korzeniami i bez widocznych wad.</li>
	<li>Sprawdź pokrywy pośrednich mikrokosmosów Jensena pod kątem nagromadzenia się kondensacji. Przesuń pokrywę, aby usunąć kondensację lub zastąp ją nową pokrywką z karbem. Jeśli na pokrywie znajduje się nadmiar kondensacji, korzeń sadzonki może przylgnąć do pokrywki, a następnie umrzeć po wyschnięciu kondensacji.</li>
	<li>Za pomocą kleszczy delikatnie zbierz sadzonkę z płytki kiełkowej przy liścieniach i połóż korzeń na podłożu Jensena mikrokosmosie. Upewnij się, że końcówka korzenia styka się z agarem.</li>
	<li>Delikatnie usuń okrywę nasienną, jeśli jest nadal otoczka. Okrywy nasienne powinny być luźne po namoczeniu w wodzie przez 5-10 min. Delikatnie drażnij okrywę nasienną kleszczami, aż ustąpi, i wyrzuć. Liścienie i około 0,5 cm pędu powinny wystawać z wycięcia w kształcie litery U w płytce (ryc. 4A). Ostrożnie załóż pokrywkę płytki na wycięcie w kształcie litery U pokrywki nad sadzonką, tworząc portal dla sadzonki (Rysunek 4B). Odłóż talerze w poziome stosy, aż wszystkie sadzonki zostaną umieszczone na mikrokosmosach.</li>
	<li>Użyj wszystkich sadzonek z każdej płytki kiełkowej, które wyglądają na żywotne i mają prosty korzeń. (Jeśli to możliwe, pozostaw jedną płytkę sadzonek nieotwartą, aby użyć jej jako zamiennika zwiędłych sadzonek tuż przed inokulacją.)</li>
	<li>Po ułożeniu wszystkich sadzonek pozwól im usiąść na poziomych mikrokosmosach Jensena, podczas gdy przygotowywane są zawiesiny inokulum S. meliloti.</li>
</ol>
5. Przygotowanie zawiesin inokulum S. meliloti
<ol>
	<li>Okresowo sprawdzaj kultury S. meliloti po inokulacji, aby upewnić się, że rosną. Po 2 dniach wzrostu OD600 powinien wynosić od 2 do 4.</li>
	<li>Odpipetować 0,5 ml każdej kultury do sterylnej probówki o pojemności 1,5 ml i odwirować do osadzania. Usunąć supernatant.</li>
	<li>Umyj komórki dwa razy w 0,85% sterylnym NaCl lub sterylnej ultraczystej wodzie. Zawieś komórki w 0,5 ml 0,85% sterylnego NaCl lub ultraczystej wodzie.</li>
	<li>Zmierzyć OD600 w rozcieńczeniu 1:10 ponownie zawieszonych kultur S. meliloti od kroku 5.3. Na podstawie tego odczytu wykonaj zawiesinę każdej kultury w sterylnej ultraczystej wodzie o OD600 = 0,05. Jeśli gęstość komórek jest zbyt duża, guzkowanie może zostać zahamowane. Uzupełnić rozcieńczoną zawiesinę w takiej ilości, aby można było zaszczepić 100 μl na każdej sadzonce. Zmętnienie zawiesiny OD600 = 0,05 powinno być ledwo wyczuwalne gołym okiem.</li>
</ol>
6. Inokulacja i uszczelnianie mikrokosmosów
<ol>
	<li>Bezpośrednio przed rozpoczęciem inokulacji należy sprawdzić, czy nie ma zwiędłych siewek, które nie przetrwały przeniesienia do pożywki Jensena. Zastąp te sadzonki świeżymi sadzonkami z płytek do kiełkowania.</li>
	<li>Otwórz każdy mikrokosmos i zaszczepij 100 μl odpowiedniej zawiesiny S. meliloti na korzeń sadzonki. Załóż pokrywkę i odłóż na bok w poziomych stosach po 6-10 mikrokosmosów. Dla każdego szczepu S. meliloti, który ma być porównany, należy zaszczepić co najmniej 15 roślin. W przypadku szczepów, które mają subtelne różnice w produktywności symbiozy, zaszczepij 30-35 roślin. Pozostaw co najmniej 10 roślin niezaszczepionych jako kontrolę negatywną. Zaszczepić 30-35 roślin S. meliloti 1021 lub innym odpowiednim szczepem typu dzikiego, aby służyły jako kontrola pozytywna.</li>
	<li>Po tym, jak zawiesina S. meliloti zdąży się zaadsorbować na powierzchni korzenia, a ciecz zawiesinowa wsiąknie w agar (co najmniej 20 minut), owiń każdą płytkę indywidualnie folią parafinową. Talerze należy zawinąć do samej krawędzi wcięcia, ale folia parafinowa nie powinna blokować wzrostu sadzonki (ryc. 4C).</li>
	<li>W momencie owijania należy po raz ostatni sprawdzić, czy korzenie nie przylegają do wewnętrznej strony pokrywki płytki. Aby usunąć przylegające korzenie z pokrywki, połóż płytkę płasko na ławce i postukaj lub przesuń pokrywkę, aby strącić korzeń z powrotem na powierzchnię agaru.</li>
	<li>Wyrównaj portale sadzonek w każdym stosie 6-10 talerzy. Ułóż stos pod kątem 90° z sadzonkami skierowanymi do góry (Rysunek 4D). Lepkość folii parafinowej utrzyma płytki na miejscu wystarczająco długo, aby owinąć cały stos folią, pozostawiając nieodwinięty pasek o długości 1-2 cm w miejscu, w którym wyłaniają się sadzonki (ryc. 4E). Folia ochroni korzenie przed światłem.</li>
	<li>Umieść owinięte folią stosy w oświetlonej komorze wzrostowej lub pomieszczeniu do wzrostu w temperaturze 21-25 °C, wilgotności względnej 60-70% i świetle 100-175 μmol/m2 s-1 w 16-godzinnym cyklu świetlnym/8-godzinnym cyklu ciemnym (Rysunek 1A). W tych warunkach wzrostu długotrwała inkubacja przy natężeniu światła wyższym niż 200 μmol/m-2 s-1 może mieć szkodliwy wpływ na wzrost roślin.</li>
</ol>
7. Badanie systemów korzeniowych i kwantyfikacja symbiotycznych fenotypów
Rośliny mogą być utrzymywane w mikrokosmosach przez okres do 9 tygodni.
<ol>
	<li>Liczbę guzków można określić ilościowo w szeregu punktów czasowych, odwijając folię z każdego stosu i licząc guzki. Rozwijające się guzki na roślinach zaszczepionych S. meliloti 1021 typu dzikiego są widoczne po 10-14 dniach od inokulacji.</li>
	<li>Produktywność symbiozy można również mierzyć w każdym punkcie czasowym, mierząc długość wschodzącego pędu.</li>
	<li>Ostateczna ocena ilościowa produktywności symbiozy jest zwykle przeprowadzana po 7 tygodniach od inokulacji poprzez oderwanie pędu i zmierzenie świeżej masy pędu. Ten krok można wykonać dopiero po 9 tygodniach, jeśli pożądany jest dłuższy wzrost.</li>
</ol>

<ol><li>Galibert, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+composite+genome+of+the+legume+symbiont+Sinorhizobium+meliloti%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The composite genome of the legume symbiont Sinorhizobium meliloti.</a> Science. 293, 668-672 (2001).</li>
<li>Young, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Medicago+genome+provides+insight+into+the+evolution+of+rhizobial+symbioses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The Medicago genome provides insight into the evolution of rhizobial symbioses.</a> Nature. 480, 520-524 (2011).</li>
<li>Glazebrook, J., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+techniques+in+Rhizobium+meliloti%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Genetic techniques in Rhizobium meliloti.</a> Methods Enzymol. 204, 398-418 (1991).</li>
<li>Cheng, X., Wen, J., Tadege, M., Ratet, P., Mysore, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse+genetics+in+medicago+truncatula+using+Tnt1+insertion+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Reverse genetics in medicago truncatula using Tnt1 insertion mutants.</a> Methods Mol Biol. 678, 179-190 (2011).</li>
<li>Leigh, J. A., Signer, E. R., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exopolysaccharide-deficient+mutants+of+Rhizobium+meliloti+that+form+ineffective+nodules%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Exopolysaccharide-deficient mutants of Rhizobium meliloti that form ineffective nodules.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82, 6231-6235 (1985).</li>
<li>Wong, K. K. Y., Fortin, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Petri+Dish+Technique+for+the+Aseptic+Synthesis+of+Ectomycorrhizae%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Botany-Revue+Canadienne+De+Botanique%22%5BJournal%5D)">A Petri Dish Technique for the Aseptic Synthesis of Ectomycorrhizae.</a> Canadian Journal of Botany-Revue Canadienne De Botanique. 67, 1713-1716 (1989).</li>
<li>Barker, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBarker%2C+DG+%22The+Medicago+truncatula+handbook%22">The Medicago truncatula handbook</a>. Mathesius, U., Journet, E. P., Sumner, L. W. , (2006).</li>
<li>Leonard, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+Assembly+for+Use+in+the+Testing+of+Cultures+of+Rhizobia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">A Simple Assembly for Use in the Testing of Cultures of Rhizobia.</a> J Bacteriol. 45, 523-527 (1943).</li>
<li>Trung, B. C., Yoshida, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvement+of+Leonard+jar+assembly+for+screening+of+effective+rhizobium%5BTitle%5D)+AND+%22Soil+Sci+Plant+Nutr%22%5BJournal%5D)">Improvement of Leonard jar assembly for screening of effective rhizobium.</a> Soil Sci Plant Nutr. 29, 97-100 (1983).</li>
<li>Penmetsa, R. V., Cook, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+characterization+of+diverse+developmental+mutants+of+Medicago+truncatula%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Production and characterization of diverse developmental mutants of Medicago truncatula.</a> Plant Physiol. 123, 1387-1398 (2000).</li>
<li>Garcia, J., Barker, D. G., Journet, E. P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGarcia%2C+J+%22The+Medicago+truncatula+handbook%22">The Medicago truncatula handbook</a>. Mathesius, U., Journet, E. P., Sumner, L. W. , (2006).</li>
<li>Vincent, J. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aVincent%2C+JM+%22A+Manual+for+the+Practical+Study+of+the+Root-Nodule+Bacteria%22">A Manual for the Practical Study of the Root-Nodule Bacteria</a>. , Blackwell. (1970).</li>
<li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+cloning%3A+a+laboratory+manual%22">Molecular cloning: a laboratory manual</a>. , 2nd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1982).</li>
<li>Pladys, D., Vance, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteolysis+during+Development+and+Senescence+of+Effective+and+Plant+Gene-Controlled+Ineffective+Alfalfa+Nodules%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Proteolysis during Development and Senescence of Effective and Plant Gene-Controlled Ineffective Alfalfa Nodules.</a> Plant Physiology. 103, 379-384 (1993).</li>
<li>Vasse, J., de Billy, F., Truchet, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abortion+of+infection+during+the+Rhizobium+meliloti-alfalfa+symbiotic+interaction+is+accompanied+by+a+hypersensitive+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+J%22%5BJournal%5D)">Abortion of infection during the Rhizobium meliloti-alfalfa symbiotic interaction is accompanied by a hypersensitive reaction.</a> The Plant J. 4, 555-566 (1993).</li>
<li>Johnson, L. E. B., Vance, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histological+and+Biochemical+Comparisons+of+Plant+Induced+Ineffective+Nodules%5BTitle%5D)+AND+%22Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Histological and Biochemical Comparisons of Plant Induced Ineffective Nodules.</a> Phytopathology. 71, 884(1981).</li>
<li>Vance, C. P., Johnson, L. E. B., Hardarson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histological+Comparisons+of+Plant+and+Rhizobium+Induced+Ineffective+Nodules+in+Alfalfa%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">Histological Comparisons of Plant and Rhizobium Induced Ineffective Nodules in Alfalfa.</a> Physiological Plant Pathology. 17, 167(1980).</li>
<li>Van de Velde, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+in+legume+symbiosis.+A+molecular+view+on+nodule+senescence+in+Medicago+truncatula%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Aging in legume symbiosis. A molecular view on nodule senescence in Medicago truncatula.</a> Plant Physiol. 141, 711-720 (2006).</li>
<li>Jones, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+production+of+the+exopolysaccharide+succinoglycan+enhances+Sinorhizobium+meliloti+1021+symbiosis+with+the+host+plant+Medicago+truncatula%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Increased production of the exopolysaccharide succinoglycan enhances Sinorhizobium meliloti 1021 symbiosis with the host plant Medicago truncatula.</a> J Bacteriol. 194, 4322-4331 (2012).</li>
<li>Queiroux, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+genomics+screen+identifies+a+Sinorhizobium+meliloti+1021+sodM-like+gene+strongly+expressed+within+host+plant+nodules%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A comparative genomics screen identifies a Sinorhizobium meliloti 1021 sodM-like gene strongly expressed within host plant nodules.</a> BMC Microbiol. 12, 74(2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Istnieje kilka etapów protokołu, które mają kluczowe znaczenie dla sukcesu: 1) Nie można przecenić konieczności stosowania oczyszczonego, przetestowanego na kulturach komórkowych roślinnych agaru. Nie jest to krytyczne dla sadzonek lucerny, ale ma kluczowe znaczenie dla wzrostu M. truncatula A17. 2) Ważne jest, aby kiełkować sadzonki na pionowych płytkach agarowych, jak opisano w kroku 1. Szeroko stosowana technika kiełkowania sadzonek na odwróconej poziomej powierzchni na płytce7 o głębokości 15 mm ...

Interakcja między rośliną żywicielską rośliny strączkowej Medicago truncatula A17 a bakterią ryzobialną Sinorhizobium meliloti 1021 jest jednym z najbardziej elastycznych systemów modelowych do badania rozwoju guzków korzeniowych i symbiozy wiązania azotu. Genomy obu symbiotycznych partnerów zostały zsekwencjonowane1,2 i zarówno rośliny, jak i bakterie są podatne na manipulacje genetyczne3,4 . Analiza fenotypów mutantów zarówno roślinnych, jak i bakteryjnych wymaga umiejętności obserwacji etapów rozwoju guzków i ilościowego określenia produktywności symbiozy w czasie. W niniejszej pracy opisano metodę obserwacji rozwoju guzków korzeniowych M. truncatula cv. Jemalong A17 zaszczepionego S. meliloti 1021 w obrębie indywidualnych mikrokosmosów wykonanych ze standardowych, okrągłych płytek laboratoryjnych o średnicy 100 mm i głębokości 15 mm (ryc. 1A). Pęd jest odsłonięty i wyrasta przez karbowany portal z boku płytki (ryc. 1B, 1C i 1E). Korzenie są zawarte w mikrokosmosach i utrzymywane w sterylności, umożliwiając jednocześnie obserwację przez pokrywę płytki (ryc. 1D). Ponieważ pęd jest dostępny, jego wzrost nie jest ograniczony i można go mierzyć w okresowych odstępach czasu bez uszczerbku dla sterylności korzenia. Metoda tworzenia mikrokosmosów z płytą karbowaną została pierwotnie opracowana przez Leigh i wsp.5 do uprawy lucerny, ale nie był powszechnie stosowany pomimo wielu zalet w porównaniu z innymi metodami. Opracowano również odmianę tej metody do analizy interakcji między korzeniami roślin a mikoryzą6. Teraz dostosowaliśmy i zoptymalizowaliśmy tę metodę do wzrostu roślin M. truncatula. Zalety tego protokołu w porównaniu z częściej stosowanymi metodami opisano poniżej.
Istnieje kilka metod, które są obecnie szeroko stosowane do badań nad nodulacją M. truncatula zaszczepionego S. meliloti7. Najczęściej stosowaną metodą preparatyki korzeni brodawkowych na dużą skalę jest wzrost w kesonach aeroponicznych7. W tej metodzie rośliny zawiesza się nad dużym naczyniem, a korzenie napowietrza się mieszaniną S. meliloti i pożywki7. Metoda ta jest praktyczna, jeżeli badany ma być tylko jeden genotyp S. meliloti. Ponieważ wymaga aerozolowania wysokich stężeń bakterii, istnieje duże prawdopodobieństwo zanieczyszczenia krzyżowego między kesonami zaszczepionymi różnymi szczepami bakterii. Inną metodą, która jest często stosowana do przygotowania dużych ilości zaszczepionych roślin, jest wzrost w pojemnikach lub doniczkach z perlitu, wermikulitu, piasku lub kalcynowanej gliny, które są nasycane pożywką i zaszczepiane S. meliloti7. Ta metoda wymaga użycia otwartych wanien lub doniczek oraz wymaga podlewania i uzupełniania pożywki. Inną wadą doniczek jest to, że rośliny muszą być usuwane z tej matrycy cząstek stałych w celu zbadania korzeni i guzków. Kolejną wadą tej metody jest to, że wymagana jest duża powierzchnia przestrzeni inkubatora, gdy ma być porównanych wiele różnych genotypów S. meliloti, ponieważ dla każdego genotypu bakteryjnego należy użyć osobnej doniczki. "Słoik Leonarda" jest wariacją na temat tej metody8,9 . Słoik Leonarda składa się z dwóch wysterylizowanych naczyń ułożonych jedno na drugim i połączonych. Pożywkę wzrostową umieszcza się w dolnym naczyniu i wciąga przez przez działanie kapilarne do matrycy wzrostu z perlitu, wermikulitu, piasku lub kalcynowanej gliny w górnym naczyniu. Sadzonkę (sadzonki) umieszcza się w matrycy wzrostu i zaszczepia S. meliloti. Ta metoda nie wymaga podlewania, ale badanie korzeni i guzków wymaga usunięcia sadzonki z matrycy wzrostu cząstek.
Istnieje kilka metod, które pozwalają na łatwe badanie korzeni. Jednym z nich jest przezroczysta plastikowa "torebka wzrostowa"7. Wadą tej metody jest to, że wymagane jest częste podlewanie, ponieważ tylko ≤10 ml płynnego podłoża jest optymalne do uprawy M. truncatula w woreczkach7. Eksperymenty z torebkami są również zwykle ograniczone do ~ 2 tygodni7, ze względu na awarię papierowego w woreczku. Dwie inne metody, które są powszechnie stosowane, są podobne do naszej metody, ponieważ rośliny są uprawiane na agarze i korzenie są widoczne, ale te metody mają również wady, których nasza procedura unika. W tych metodach rośliny są całkowicie zamknięte w płytkach agarowych o wymiarach 24,5 cm x 24,5 cm, uszczelnionych wokół góry porowatą taśmą chirurgiczną lub uprawiane w ukośnych probówkach zakręconych bawełnianymi zatyczkami lub plastikowymi nakrętkami7. Obie te metody pozwalają na łatwe badanie korzeni i mogą być utrzymywane w sterylności. Jednak probówki skośne agaru są zwykle uprawiane z zaledwie 20 ml podłoża agarowego7 i wymagają podlewania i dodawania składników odżywczych dla długotrwałego wzrostu roślin. Rośliny uprawiane w mikrokosmosach płytki agarowej o wymiarach 24,5 cm x 24,5 cm mają wystarczającą ilość wilgoci i składników odżywczych do długotrwałego wzrostu, ale rosnący pęd szybko zostaje ograniczony w zamkniętym mikrokosmosie płytkowym, a gaz etylenowy może tworzyć zahamowanie brodawkowania7. W opisanej tutaj procedurze pęd jest naświetlany i rośnie swobodnie poza mikrokosmosem, który zawiera ~70 ml pożywki, co pozwala na długotrwały wzrost.
Procedura opisana tutaj może być przydatna nie tylko do badania guzkowania roślin strączkowych, ale także do badania fenotypów korzeni innych roślin średniej wielkości. Różnica między tymi mikrokosmosami a tradycyjnym słoikiem do hodowli tkanek roślinnych z poliwęglanu polega na tym, że korzenie w opisanych tutaj mikrokosmosach płytkowych rosną na pionowej powierzchni agaru, a nie w dół do poziomej warstwy agaru na dnie słoika. Pozwala to na oderwanie korzenia od powierzchni agaru przy minimalnym uszkodzeniu włośników i minimalnym przyleganiu agaru do powierzchni korzenia, co ułatwia badanie włośników pod mikroskopem.

<table><tbody><tr><td>Oczyszczony agar, testowany pod kątem hodowli komórek roślinnych</td><td>Sigma</td><td>A7921</td><td></td></tr></tbody></table>

jednoroślinne, sterylne mikrokosmosy do brodawkowania i wzrostu rośliny strączkowej medicago truncatula z symbiontem ryzobialnym sinorhizobium meliloti

Single-plant, Sterile Microcosms for Nodulation and Growth of the Legume Plant Medicago truncatula with the Rhizobial Symbiont Sinorhizobium meliloti

Bakterie ryzobialne tworzą symbiotyczne, wiążące azot guzki na korzeniach kompatybilnych roślin strączkowych. Jednym z najbardziej rozwiniętych systemów modelowych do badania tych oddziaływań jest roślina Medicago truncatula cv. Jemalong A17 i bakteria ryzobialna Sinorhizobium meliloti 1021. Wielokrotne obrazowanie korzeni roślin i ocena symbiotycznych fenotypów wymaga metod, które nie są niszczące ani dla roślin, ani dla bakterii. Symbiotyczne fenotypy niektórych mutantów roślinnych i bakteryjnych ujawniają się po stosunkowo krótkich okresach wzrostu i nie wymagają długotrwałej obserwacji interakcji gospodarz/symbiont. Jednak subtelne różnice w wydajności symbiozy i fenotypach starzenia się guzków, które nie są widoczne we wczesnych stadiach procesu brodawkowania, wymagają stosunkowo długich okresów wzrostu, zanim będzie można je ocenić. Opracowano kilka metod długoterminowego wzrostu i obserwacji tej pary gospodarz/symbiont. Jednak wiele z tych metod wymaga wielokrotnego podlewania, co zwiększa możliwość zanieczyszczenia innymi drobnoustrojami. Inne metody wymagają stosunkowo dużej przestrzeni do wzrostu dużej liczby roślin. Opisana tu metoda, symbiotyczny wzrost M. truncatula/S. meliloti w sterylnych, jednoroślinnych mikrokosmosach, ma kilka zalet. Rośliny w tych mikrokosmosach mają wystarczającą ilość wilgoci i składników odżywczych, aby zapewnić, że podlewanie nie jest wymagane przez okres do 9 tygodni, co zapobiega zanieczyszczeniu krzyżowemu podczas podlewania. Pozwala to na ilościowe określenie fenotypów, które mogą zostać pominięte w krótkoterminowych systemach wzrostu, takich jak subtelne opóźnienia w rozwoju guzków i wczesne starzenie się guzków. Ponadto korzenie i guzki w mikrokosmosie są łatwo widoczne przez pokrywę płytki, więc wykorzenianie roślin w celu obserwacji nie jest wymagane.

Przygotowanie i inokulacja tych mikrokosmosów szalkowych jest stosunkowo proste w porównaniu z większością innych metod opisanych we Wstępie. Zastosowanie tych mikrokosmosów pozwala również na przedłużony wzrost roślin (do 9 tygodni) bez konieczności podlewania lub uzupełniania składników odżywczych, utrzymanie sterylności korzeni, łatwą obserwację korzeni przy jednoczesnej ich ochronie przed światłem, nieograniczony wzrost pędów roślin, łatwy dostęp do pędów w celu pomiaru ich długości oraz usuwanie roślin z mikrokosmos...

Wzrost roślin Medicago truncatula w symbiozie z bakteriami wiążącymi azot Sinorhizobium meliloti w indywidualnych, sterylnych mikrokosmosach wykonanych ze standardowych płytek laboratoryjnych pozwala na częste badanie systemów korzeniowych i guzków bez uszczerbku dla sterylności. Rośliny można utrzymywać w tych komorach wzrostowych do 9 tygodni.

Jednoroślinne, sterylne mikrokosmosy do brodawkowania i wzrostu rośliny strączkowej Medicago truncatula z symbiontem ryzobialnym Sinorhizobium meliloti

Rhizobial  bacteria form symbiotic, nitrogen-fixing nodules on the roots of compatible host  legume plants.  One  of the most well-developed model systems ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest ilościowe określenie fenotypów symbiotycznych roślin medicargo Tula zaszczepionych różnymi wariantami mutantów bakterii wiążących azot sino oum me latte, z wykorzystaniem sterylnych mikrokosmosów dla pojedynczych roślin wykonanych ze standardowych płytek laboratoryjnych. Cel ten osiąga się poprzez wstępne skaryfikowanie 17 nasion Mula kwasem i wykiełkowanie nasion na płytkach z agarem. Drugim krokiem jest przygotowanie sterylnych mikrokosmosów dla pojedynczych roślin poprzez wykonanie nacięcia w każdej utwardzonej płytce oraz jej pokrywce za pomocą rozgrzanej szpatułki, a następnie zamknięcie płytki.Później wykonamy owalny otwór z boku. Następnie należy ułożyć pojedyncze siewki Mula na mikrokosmosach tak, aby wierzchołek korzenia stykał się z agarem, a 0,5 centymetra pędu wystawało poza wcięcie w kształcie litery U w płytce. Ostatnim krokiem jest inokulacja roztworem SME oraz inkubacja płytek w formie stosów owiniętych folią w oświetlonej komorze wzrostowej.Ostatecznie kwantyfikacja długości i masy pędów rośliny oraz rodzaju brodawek służy do wykazania względnego sukcesu symbiotycznego każdego szczepu o wysokiej zjadliwości S milliot lub muta

single-plant-sterile-microcosms-for-nodulation-growth-legume-plant

Research

JoVE Journal

Environment

Środowisko

Jednoroślinne, sterylne mikrokosmy do wężelkowań i wzrostu rośliny strączkowej Medicago truncatula z ryzobiowym symbiontem Sinorhizobium meliloti

Przedstawiamy sposób wykorzystania kompozytowych roślin z korzeniami włochatymi do badania interakcji między roślinami a ryzobiami oraz procesu nodulacji u gatunku Medicago truncatula, który jest trudny do transformacji.

Generowanie roślin kompozytowych u Medicago truncatula wykorzystywanych w testach nodulacji

Obrazowanie metodą spektrometrii mas (MSI) to potężne narzędzie, które może być używane do odkrywania i identyfikowania różnych związków chemicznych w nienaruszonych tkankach, zachowując związki w ich naturalnym środowisku, co może dostarczyć nowych informacji na temat procesów biologicznych. W niniejszym artykule opisano metodę MSI opracowaną do analizy małych cząsteczek.

Obrazowanie metodą spektrometrii mas MALDI, do badania metabolitów w guzkach korzeniowych Medicago truncatula

Celem jest zilustrowanie, że modelowa roślina strączkowa Medicago truncatula może być łatwo wykorzystana do zbadania regulacji wczesnej embriogenezy roślin, aby uzupełnić model rzodkiewnika nie-strączkowego. Morfologia strąków jest powiązana z etapami embriogenezy zygotycznej, a także opracowano protokół pobierania zarodków za pomocą hodowli tkankowej.

Protokoły pozyskiwania zarodków zygotycznych i somatycznych do badania regulacji wczesnego rozwoju zarodka w modelu rośliny strączkowej Medicago truncatula

Analizy ekspresji promotorów są kluczowe dla lepszego zrozumienia regulacji genów i czasoprzestrzennej ekspresji docelowych genów. W niniejszym artykule przedstawiamy protokół identyfikacji, izolacji i klonowania promotora roślin. Ponadto opisujemy charakterystykę promotora specyficznego dla guzków w owłosionych korzeniach fasoli zwyczajnej.

Analiza promotora roślin: identyfikacja i charakterystyka promotora specyficznego dla brodawek korzeniowych w fasoli zwyczajnej

Ten protokół dostarcza kroków eksperymentalnych i informacji o odczynnikach, sprzęcie i narzędziach analitycznych dla badaczy, którzy są zainteresowani przeprowadzeniem analizy porównawczej hybrydyzacji genomowej (CGH) na bazie całego genomu zmian liczby kopii u roślin.

Oparta na macierzy platforma porównawczej hybrydyzacji genomu do skutecznego wykrywania zmian liczby kopii u prędko indukowanych neutronami mutantów Medicago truncatula

Tutaj opisujemy protokół uzyskiwania danych o sekwencji amplikonów mikrobiomów gleby, ryzosfery i korzeni. Informacje te mogą być wykorzystane do zbadania składu i różnorodności zbiorowisk mikrobiologicznych związanych z roślinami i nadają się do stosowania w odniesieniu do szerokiej gamy gatunków roślin.

Badanie mikrobiomu korzeni: ekstrakcja danych o społeczności bakteryjnej z gleby, ryzosfery i endosfery korzeni

Ten protokół opisuje metodę oczyszczania eukariotycznych polisomów z nienaruszonych guzków soi. Po sekwencjonowaniu można wykorzystać standardowe potoki do analizy ekspresji genów do identyfikacji genów o zróżnicowanej ekspresji na poziomie transkryptomu i translatomiu.

Oczyszczanie polisomów z guzków symbiotycznych soi

Odpady przemysłowe mogą być zbierane i modyfikowane w celu analizy rozwoju mikroorganizmów. Techniki ekstrakcji lignocelulozy dostarczają składników do analizy określonej zdolności biodegradacji. Chromatografia gazowa ze spektrometrią mas identyfikuje produkty fermentacji mikroorganizmów wyhodowanych na odpadach z roztwarzania. Metody te określają zdolność metaboliczną mikroorganizmów do rozkładu odpadów z roztwarzania.

Metody ułatwiania rozwoju mikroorganizmów w strumieniach odpadów z celulozowni i charakterystyka potencjału biodegradacji drobnoustrojów hodowlanych

Biomasa roślinna stanowi źródło odnawialne dla wielu produktów, w tym paliwa, paszy, żywności i różnych materiałów. W artykule badamy właściwości drzewa tytoniowego (Nicotiana glauca) i topoli jako odpowiednich źródeł dla rurociągu biorafineryjnego.

Profilowanie transkryptu i metabolitów w celu oceny drzewa tytoniowego i topoli jako surowca dla przemysłu biotechnologicznego

Opracowano protokoły do efektywnego przygotowania jednorodnych próbek przędziorków, inwazji eksperymentalnych roślin i oceny uszkodzeń roślin, wymaganych do badań interakcji roślina-szkodnik.

Zastosowanie przędziorków dwuplamistych Tetranychus urticae do badań interakcji między roślinami a szkodnikami

Poznaj metodę jednoroslinnych mikrokosmów do badania symbiozy Medicago truncatula z Sinorhizobium meliloti. Technika umożliwia ilościową ocenę fenotypów symbiotycznych przy zachowaniu sterylności.

Jednoroślinne, sterylne mikrokosmosy do brodawkowania i wzrostu rośliny strączkowej Medicago truncatula z symbiontem ryzobialnym Sinorhizobium meliloti (Wideo) | JoVE Journal

Jednoroślinne, sterylne mikrokosmosy do brodawkowania i wzrostu rośliny strączkowej Medicago truncatula z symbiontem ryzobialnym Sinorhizobium meliloti

Przeglądaj więcej filmów