Obserwacja i ilościowe określanie zagęszczenia fibryny w żelu za pośrednictwem fibroblastów

Ogólnym celem niniejszej procedury jest obserwacja i analiza wpływu oddziaływań między komórkami a macierzą na reorganizację włókien oraz aktywność przebudowy macierzy w systemie żelu fibrynowego. Jest to realizowane poprzez polimeryzację trójwymiarowego żelu fibrynowego zawierającego mikrokuleczki na szkiełku podstawowym umieszczonym w bioreaktorze z kontrolowanymi warunkami środowiskowymi. W drugim kroku przygotowywana jest wysoko stężona zawiesina komórkowa, która służy do rozmieszczania skupisk fibroblastów lub eksplantów X w geometrycznych wzorach na powierzchni żelu.

Następnie próbkę obrazuje się co 15 minut przy użyciu mikroskopii kontrastowej interferencyjnej (DIC) przez okres 48 godzin. Ostatnim etapem jest pomiar zakresu reorganizacji i przebudowy fibryny w formie odkształcenia w różnych obszarach żelu z wykorzystaniem cyfrowej korelacji obrazów. W rezultacie system eksplantów ten pozwala na rozmieszczenie komórek w prostych wzorach geometrycznych, co ułatwia wizualizację i badanie mechanizmów leżących u podstaw przebudowy macierzy i realignacji włókien indukowanej przez komórki.

Metoda ta pozwala odpowiedzieć na kluczowe pytania z dziedziny biologii mechanicznej, takie jak wpływ bardzo specyficznych przestrzennych i czasowych bodźców mechanicznych na zachowanie komórek oraz wynikające z nich zmiany w otaczającej macierzy tkankowej. Procedurę tę zaprezentuje Arabic de Jesus, doktorant z mojego laboratorium. Powoli rozpuść fibrynogen w uprzednio ogrzanej soli fizjologicznej w temperaturze 37 °C przez noc, aby przygotować roztwór stokowy o stężeniu 33,3 mg/mL. Przygotuj szablon na profilu, aby wyznaczyć położenie każdego eksplantu x zgodnie z pożądaną geometrią rozmieszczenia.

Każda kropka powinna znajdować się w odległości około jednego do dwóch milimetrów od siebie. Odległość ta odpowiada optymalnemu odstępowi niezbędnemu do wytworzenia wyrównania włókien pomiędzy eksplantami. Następnie należy dokładnie oczyścić wszystkie elementy bioreaktora za pomocą 70% etanolu i umieścić oczyszczone komponenty pod lampą UV w komorze z laminarnym przepływem powietrza na dwie do trzech godzin przed rozpoczęciem inkubacji.

Po wysterylizowaniu komponentów bioreaktora, przymocuj za pomocą taśmy szablon pod obszarem szkiełka podstawowego o średnicy 60 milimetrów, w którym przygotowana zostanie próbka. Następnie przygotuj zawiesinę mikrokulek, a po niej fibrynogen i trombinę. W celu przygotowania roztworów zapasowych, połącz 0,017 mililitrów roztworu zapasowego mikrokulek oraz 0,149 mililitrów DMEM w probówce do mikrowirówki, aby uzyskać stężenie 10 milionów kulek na mililitr.

Następnie poddaj zawiesinę sonikacji przez 10 minut, aby rozproszyć kuleczki i uhomogenizować roztwór. Do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml dodaj 0,22 ml roztwoku stokowego fibrynogenu, 0,44 ml 20 mM buforu HEPS oraz 0,1667 ml roztworu z mikrokuleczkami. Delikatnie wymieszaj składniki, a następnie umieść probówkę w lodzie, korzystając z oddzielnej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml.

Wymieszać ze sobą: 32,8 µL trombiny rozpuszczonej w soli fizjologicznej w stężeniu 25 units/mL, 131 µL 20 mM buforu HEPES oraz 2,46 µL 2 M chlorku wapnia.

Następnie należy ostrożnie wymieszać przygotowane roztwory trombiny i fibrynogenu, pipetując je w górę i w dół od 5 do 10 razy, aż do uzyskania jednorodnego roztworu. Aby zminimalizować powstawanie pęcherzyków powietrza w mieszaninie, należy unikać całkowitego opróżniania pipety podczas mieszania. Wymieszany roztwór należy jak najszybciej nanieść pipetą do kwadratowych form z PDMS o boku 8 mm umieszczonych na szkiełkach nakrywkowych, a następnie pozostawić żel do polimeryzacji w temperaturze pokojowej.

Dodanie trombiny spowoduje szybkie żelowanie roztworu w ciągu około 30 sekund po polimeryzacji; należy zamknąć bioreaktor i przygotować eksplanty komórkowe. Zbierz ludzkie fibroblasty skórne o konfluencji od 70 do 90% z kolby T 75 za pomocą trypsyny, a następnie odwiruj je z prędkością 200 ×g przez pięć minut. Przenieś bioreaktor do komory z laminarnym przepływem powietrza i ostrożnie zdejmij pokrywkę, zachowując warunki aseptyczne. Następnie odessij medium i resuspenduj osad komórkowy do stężenia końcowego 20 milionów komórek na ml w DMEM z 10% FBS.

Następnie należy przygotować eksplanty, nabrawszy komórki do mikropipety i wstrzykując 0,3 µL zawiesiny komórkowej do spolimeryzowanego żelu fibrynowego. Zgodnie ze wzorem na szablonie, każdy eksplant powinien zawierać około 6 000 komórek. Po rozmieszczeniu eksplantów na żelu należy uszczelnić bioreaktor.

Następnie włóż bloki grzewcze i podłącz termopary do kontrolera temperatury. Ustaw kontroler temperatury na 37 °C i inkubuj żele przez jedną godzinę, aby komórki mogły osiąść i przytwierdzić się do macierzy fibrynowej. Następnie dodaj około 5 mL DMEM, który był kondycjonowany przez dwie do trzech godzin w 5% CO2 i uzupełniony o 10% płodowej surowicy bydlęcej, 1% penicyliny-streptomycyny, 0,1% amfoterycyny B oraz 10 µg/mL aprotininy, bezpośrednio do komory bioreaktora.

Następnie ponownie szczelnie zamknąć bioreaktor. Za pomocą strzykawki wprowadzić dodatkowe pięć mililitrów pożywki kondycjonowanej dwutlenkiem węgla przez kolczasty króciec w porcie wlotowym, aby całkowicie wypełnić bioreaktor, uważnie usuwając wszelkie powstające pęcherzyki powietrza. Przygotować pompę strzykawkową ze strzykawką o pojemności 10 ml lub 30 ml wypełnioną dodatkową pożywką kondycjonowaną 5% dwutlenkiem węgla. Połączyć strzykawkę bezpośrednio z portem wlotowym w pokrywie bioreaktora za pomocą sterylnych przewodów z końcówkami Luer-Lock.

Ustaw prędkość perfuzji w pompie strzykawkowej na 0,01 milliliters per minute. Następnie podłącz zmodyfikowane odcinki drenów do obu portów wylotowych i umieść ich końce w zlewce o pojemności 100 milliliter. Aby zbierać odpady, użyj podnośnika laboratoryjnego do ustawienia wysokości zasilania wlotowego i wylotowego w taki sposób, aby w zasilaniu bioreaktora nie powstała różnica ciśnień.

Przez cały czas trwania eksperymentu do bioreaktora doprowadzaj świeżą pożywkę kondycjonowaną 5% dwutlenkiem węgla. Aby utrzymać pH, dostarczać składniki odżywcze i usuwać produkty przemiany materii, strzykawka o pojemności 10 mililitrów wypełniona pożywką wystarczy na około 16 godzin. Umieść obiektyw 20 XDIC pod okienkiem obserwacyjnym mikroskopu i upewnij się, że polaryzator, analizator oraz pryzmat są na swoich miejscach.

Następnie otwórz oprogramowanie do obrazowania. Ustaw ostrość obiektywu na obszar między trzema x explan i zapisz współrzędne X, Y oraz Z tej lokalizacji w oprogramowaniu do obrazowania. Aby obrazować cały obszar pomiędzy i wokół x explan, wybierz opcję pozyskiwania dużego obrazu i określ rozmiar obszaru.

Pozwoli to na wykonanie wielu obrazów wokół określonego obszaru i stworzenie dużego obrazu mozaikowego; należy ustawić natężenie światła i czas naświetlania na najniższe możliwe wartości. Pomoże to uniknąć śmierci komórek wywołanej fototoksycznością, zapewniając jednocześnie rozdzielczość wystarczającą do rozróżnienia komórek, mikrokulek i włókien fibryny. Należy zauważyć, że w tym konkretnym eksperymencie włókna fibryny nie są widoczne ze względu na wysoką gęstość kulek rozpraszających światło w żelu; aby zaobserwować włókna fibryny, należy zmniejszyć gęstość kulek lub grubość żelu.

Następnie rozpocznij śledzenie odkształceń. Najpierw utwórz lub pobierz niestandardowy kod MATLAB, a następnie zarejestruj obrazy, wykorzystując mikrokulki rozmieszczone w całym żelu jako punkty odniesienia. Rejestracja obrazu zapewni, że wszystkie uzyskane obrazy będą wykonane w dokładnie tym samym miejscu.

Realineację włókien obserwowano pomiędzy eksplanami poprzez rejestrowanie obrazów mozaikowych co 15 minut. W ciągu 48 godzin z obrazów mozaikowych wyodrębniano poszczególne obszary i analizowano je za pomocą algorytmu śledzenia odkształceń. Aby zmierzyć lokalne odkształcenia na podstawie przemieszczenia mikrokulek, wykresy konturowe przedstawiają rozkład maksymalnego odkształcenia głównego w obszarze realineacji włókien odpowiadającym paskowi.

Po opanowaniu techniki, przy prawidłowym wykonaniu, jej realizacja zajmuje około trzech do czterech godzin. Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne metody, takie jak znakowanie fluorescencyjne kolagenu i białek cytoszkieletowych oraz kwantyfikację migracji komórek, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, np. jakie szlaki mechanobiologiczne są zaangażowane w przebudowę tkanki i w jaki sposób procesy te są modulowane przez różne substancje biochemiczne.