Name: Obserwacja i ilościowe określanie zagęszczenia fibryny w żelu za pośrednictwem fibroblastów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-16T13:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 37 s
Description: Poznaj metodę obserwacji i analizy interakcji komórkowo-macierzowych w żelu fibrynowym przy użyciu mikroskopii czasowej oraz korelacji obrazu cyfrowego. Technika ta umożliwia badanie mechanizmów remodelowania macierzy przez fibroblasty.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy George'owi Giudice i Stevenowi Eliasonowi za przekazanie ludzkich fibroblastów skórnych oraz Rameshowi Raghupathy'emu za pomoc w algorytmie śledzenia szczepów. Wsparcie dla tej pracy zostało zapewnione przez U.S. Department of Education Graduate Assistance in Areas of National Need Fellowship (GAANN P200A120071).

1. Przygotowanie szablonu
Przygotuj szablon na Parafilm, aby ułożyć lokalizację każdego eksplantu, zgodnie z pożądaną geometrią (Rysunki 1A i 1B). Odstęp między każdym eksplantatem a około 1-2 mm odstępem. Odległość ta odpowiada idealnemu odstępowi do generowania wyrównania włókien między eksplantatami. Przymocuj szablon pod obszarem szkła nakrywkowego, w którym próbka zostanie przygotowana za pomocą taśmy.
2. Sterylizacja
Dokładnie wyczyść wszystkie elementy bioreaktora przy użyciu 70% etanolu i sterylizuj przez 2-3 godziny w świetle UV przed eksperymentem. Jeśli zamiast bioreaktora używane jest alternatywne naczynie, należy zastosować odpowiednie techniki sterylizacji. Zobacz krok 4.12, aby zapoznać się z uwagami na temat używania szalki Petriego ze szklanym dnem.
3. Przygotowanie żelu fibrynowego
Po wysterylizowaniu elementów bioreaktora, nałóż cienką warstwę żelu fibrynowego na powierzchnię szkła nakrywkowego. Szczegóły dotyczące przygotowania roztworów podstawowych fibrynogenu i trombiny do wytwarzania żeli fibrynowych 6,6 mg/ml opisano w Sander i wsp. 13 Podobny protokół opracowany przez Ye i wsp. 19 do wytwarzania żeli fibrynowych 3,3 mg/ml można również zobaczyć na stronie internetowej JoVE.
<ol>
	<li>Przygotować roztwór mikrogranulek fluorescencyjnych w DMEM o stężeniu 10 milionów kulek/ml. Koraliki będą używane do śledzenia przemieszczeń żelu. Aby osiągnąć to stężenie, należy połączyć 0,017 ml roztworu podstawowego mikrogranulek i 0,149 ml DMEM w probówce do mikrowirówki.</li>
	<li>Sonikować tę zawiesinę przez 10 minut, aby rozproszyć kulki i homogenizować roztwór.</li>
	<li>Roztwór fibryny — W 15 ml probówce c wymieszać 0,22 ml roztworu podstawowego fibrynogenu z 0,44 ml 20 mM buforu HEPES. Dodać 0,1667 ml DMEM z mikrogranulkami utworzonymi w kroku 3.1.</li>
	<li>Roztwór trombiny — W oddzielnej 15 ml probówce C wymieszać 0,0328 ml roztworu podstawowego trombiny, 0,131 ml 20 mM buforu HEPES i 0,00246 ml 2 M CaCl2.</li>
	<li>Ostrożnie wymieszać roztwór trombiny (krok 3.4) z roztworem fibrynogenu (krok 3.3), pipetując w górę i w dół 5-10 razy, aż roztwór zostanie równomiernie rozprowadzony. Unikaj wprowadzania bąbelków tak bardzo, jak to możliwe. Aby zmniejszyć ilość wytwarzanych pęcherzyków, należy uważać, aby nie rozładować całkowicie pipety podczas mieszania.</li>
	<li>Dodanie trombiny spowoduje, że roztwór szybko się zżeluje (~30 sekund). Odpipetować wymieszany roztwór na szkło nakrywkowe tak szybko, jak to możliwe. Pozostawić żel do polimeryzacji w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Uszczelnij bioreaktor, włóż bloki grzewcze i podłącz termopary do regulatora temperatury. Inkubować żel w temperaturze 37 °C przez 15-30 min.</li>
</ol>
4. Przygotowanie eksplantatu komórkowego
<ol>
	<li>Usunąć pożywkę z kolby T-75 zawierającej ludzkie komórki fibroblastów skóry właściwej.</li>
	<li>Ostrożnie spłukać powierzchnię około 5 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) w celu usunięcia białek surowicy. Dodać 1 ml trypsyny-EDTA i inkubować przez 3 minuty lub do momentu, gdy komórki się uniosą.</li>
	<li>Po podniesieniu komórek odwirować zawiesinę w wirówce o sile 200 x g przez 5 minut. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w objętości DMEM, która pozwoli na uzyskanie końcowego stężenia 20 milionów komórek/ml.</li>
	<li>Podczas gdy komórki wirują w wirówce, odłącz bioreaktor od bloków grzewczych i termopar. Przenieś bioreaktor do komory bezpieczeństwa biologicznego i ostrożnie zdejmij pokrywę zgodnie z technikami asceptycznymi.</li>
	<li>Egplantaty należy stworzyć, pipetując 0,3 μl zawiesiny komórkowej na spolimeryzowany żel fibrynowy, postępując zgodnie ze wzorem na szablonie. Każdy eksplant powinien zawierać około 6 000 komórek. Upewnij się, że używane są końcówki do mikropipet o małej objętości (0,1-10 μl).</li>
	<li>Pozostawić komórki do osadzenia się i przyłączyć do matrycy fibrynowej na 1 godzinę w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Gdy bioreaktor jest nadal otwarty, dodać około 5 ml DMEM uzupełnionego 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 1% penicyliny-streptomycyny, 0,1% amfoterycyny B i 10 mg/ml aprotyniny bezpośrednio do komory bioreaktora. DMEM jest buforowany wodorowęglanem i wymaga 5% CO2 do utrzymania neutralnego pH. Ponieważ bioreaktor nie jest zasilany w CO2 , przed użyciem kondycjonuj pożywkę w inkubatorze z 5% CO2 przez 2-3 godziny. Aprotynina jest inhibitorem proteazy seryny, który jest szeroko stosowany w celu zmniejszenia szybkości degradacji fibryny20.</li>
	<li>Ponownie uszczelnić bioreaktor. Za pomocą strzykawki dostarczyć dodatkowe 5 ml pożywki kondycjonowanej CO2 przez złączkę kolczastą na porcie wlotowym. Powoli dozuj pożywkę i upewnij się, że cała objętość komory bioreaktora jest wypełniona. Ostrożnie usuń pęcherzyki, które tworzą się w bioreaktorze.</li>
	<li>Dostarczaj świeżą, kondycjonowaną pożywkę o stężeniu 5% CO2 do bioreaktora przez cały czas trwania eksperymentu, aby utrzymać pH, dostarczyć składniki odżywcze i usunąć produkty przemiany materii. Ustawić pompę strzykawkową ze strzykawką o pojemności 10 ml lub 30 ml wypełnioną pożywką kondycjonowaną w 5% CO2 . Podłączyć strzykawkę bezpośrednio do portu wlotowego na pokrywie bioreaktora za pomocą sterylnego przewodu dopasowanego do Luer-lock. Zdejmij złączkę męską i przymocuj rurkę do złączki kolczastej w bioreaktorze (patrz rysunek 1C).</li>
	<li>Ustaw szybkość perfuzji na 0,01 ml/min. Podłącz zmodyfikowane kawałki rurki do obu portów wylotowych i umieść końce w zlewce o pojemności 100 ml, aby zebrać odpady.</li>
	<li>Użyj podnośnika laboratoryjnego, aby ustawić wysokość kanałów wlotowych i wylotowych, aby w bioreaktorze nie powstała różnica ciśnień (patrz rysunek 1D w celach informacyjnych).</li>
	<li>Jeżeli bioreaktor nie jest dostępny, należy przygotować próbki na szalkach Petriego ze szklanym dnem o średnicy 35 mm ze szklanymi pokrywami. Użyj szkiełka nakrywkowego o rozmiarze zoptymalizowanym pod kątem konkretnego zestawu celów, które mają być użyte. Próbki przygotowane na płytkach Petriego powinny być przechowywane w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2, 
	Uwaga: Polistyren depolaryzuje światło i zakłóca obrazowanie DIC, dlatego jeśli ma być przeprowadzane obrazowanie DIC, należy używać szklanych blatów. Kontrast fazowy jest odpowiednią alternatywną metodą obrazowania. Przenoszenie szalek między inkubatorem a mikroskopem utrudni rejestrację obrazu. Jeśli obrazy nie zostaną prawidłowo zarejestrowane, obciążenie obliczone w sekcji 6 nie będzie dokładne.</li>
</ol>
5. Obrazowanie poklatkowe
<ol>
	<li>Po przygotowaniu próbki należy ponownie uszczelnić bioreaktor, ponownie podłączyć bloki grzewcze i termopary, a następnie ustawić temperaturę bioreaktora na 37 °C.</li>
	<li>Ustaw bioreaktor na zmotoryzowanym stoliku zamontowanym pod mikroskopem. Ustaw obiektyw 20X DIC pod view-port. Obiektyw o mniejszym powiększeniu jest dopuszczalny, szczególnie jeśli precyzyjny stolik z napędem silnikowym nie jest dostępny. Upewnij się, że polaryzator, analizator i pryzmat są na swoim miejscu. Alternatywnie, próbki mogą być również obrazowane przy użyciu kontrastu fazowego.</li>
	<li>Otwórz oprogramowanie do obrazowania.</li>
	<li>Skoncentruj cel na obszarze między trzema eksplantacjami.</li>
	<li>Zapisz współrzędne (x, y i z) tej lokalizacji w oprogramowaniu do obrazowania.</li>
	<li>Aby zobrazować cały obszar pomiędzy eksplantatami i wokół nich, wybierz opcję uzyskania dużego obrazu i określ rozmiar obszaru. Umożliwi to uzyskanie wielu obrazów wokół określonego obszaru i utworzenie obrazu kafelkowego, który reprezentuje większy region próbki.</li>
	<li>Ustaw czas ekspozycji i natężenie światła na najniższe możliwe wartości, aby uniknąć śmierci komórki spowodowanej fototoksycznością, jednocześnie zapewniając wystarczającą rozdzielczość do rozróżnienia komórek, mikrogranulek i włókien fibrynowych.</li>
</ol>
6. Śledzenie szczepów
Aby uzyskać szczegółowe informacje i instrukcje dotyczące używanego oprogramowania do śledzenia odkształceń (Rysunek 2), zobacz Raghupathy et al.21 Algorytm jest niestandardowym kodem MATLAB, który można pobrać ze strony <a href="http://www.license.umn.edu/default.aspx">http://www.license.umn.edu/default.aspx</a>. Należy pamiętać, że obrazy DIC często mają wystarczającą ilość tekstur do śledzenia odkształceń. Mikrokulki są dołączone, aby służyć jako kontrola obliczonych pól odkształceń. Jeśli śledzenie odkształcenia ma być wykonywane, bardzo ważne jest, aby uzyskane obrazy zostały wykonane dokładnie w tym samym miejscu, aby obrazy zostały zarejestrowane. Niezarejestrowane obrazy będą wytwarzać fałszywe szczepy.

<ol><li>Grinnell, F., Petroll WM, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+motility+and+mechanics+in+three-dimensional+collagen+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Cell.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell motility and mechanics in three-dimensional collagen matrices.</a> Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 26, 335-361 (2001).</li>
<li>Sander, E. A., Barocas, V. H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSander%2C+EA+%22Biomimetic+collagen+tissues%3A+collagenous+tissue+engineering+and+other+applications.+In%3A+Collagen%3A+Structure+and+Mechanics%22">Biomimetic collagen tissues: collagenous tissue engineering and other applications. In: Collagen: Structure and Mechanics</a>. , Springer. New York. (2008).</li>
<li>Pedersen JA,, Swartz MA, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanobiology+in+the+third+dimension%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Mechanobiology in the third dimension.</a> Ann. Biomed. Eng. 33 (11), 1469-1490 (2005).</li>
<li>Bell, E., Ivarsson, B., Merrill, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+a+tissue-like+structure+by+contraction+of+collagen+lattices+by+human+fibroblasts+of+different+proliferative+potential+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Production of a tissue-like structure by contraction of collagen lattices by human fibroblasts of different proliferative potential in vitro.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76 (3), 1274 (1979).</li>
<li>Guidry, C., Grinnell, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+the+mechanism+of+hydrated+collagen+gel+reorganization+by+human+skin+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Studies on the mechanism of hydrated collagen gel reorganization by human skin fibroblasts.</a> J. Cell. Sci. 79 (1), 67-81 (1985).</li>
<li>Fluck, J., Querfeld, C., Cremer, A., Niland, S., Krieg, T., Sollberg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+human+primary+fibroblasts+undergo+apoptosis+in+three-dimensional+contractile+collagen+gels%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Invest.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Normal human primary fibroblasts undergo apoptosis in three-dimensional contractile collagen gels.</a> J. Invest. Dermatol. 110 (2), 153-157 (1998).</li>
<li>Rosenfeldt, H., Grinnell, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+quiescence+and+the+disruption+of+ERK+signaling+in+mechanically+unloaded+collagen+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Fibroblast quiescence and the disruption of ERK signaling in mechanically unloaded collagen matrices.</a> J. Biol. Chem. 275 (5), 3088-3092 (2000).</li>
<li>Nakagawa, S., Pawelek, P., Grinnell, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+culture+of+fibroblasts+in+contracted+collagen+gels%3A+Effects+on+cell+growth+and+biosynthetic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Invest.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Long-term culture of fibroblasts in contracted collagen gels: Effects on cell growth and biosynthetic activity.</a> J. Invest. Dermatol. 93 (6), 792-798 (1989).</li>
<li>Harris, A. K., Stopak, D., Wild, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+traction+as+a+mechanism+for+collagen+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fibroblast traction as a mechanism for collagen morphogenesis.</a> Nature. 290, 249-251 (1981).</li>
<li>Stopak, D., Harris AK, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connective+tissue+morphogenesis+by+fibroblast+traction%3A+I.+tissue+culture+observations%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Connective tissue morphogenesis by fibroblast traction: I. tissue culture observations.</a> Dev. Biol. 90 (2), 383-398 (1982).</li>
<li>Sawhney, R. K., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slow+local+movements+of+collagen+fibers+by+fibroblasts+drive+the+rapid+global+self-organization+of+collagen+gels%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Slow local movements of collagen fibers by fibroblasts drive the rapid global self-organization of collagen gels.</a> J. Cell. Biol. 157 (6), 1083-1092 (2002).</li>
<li>Provenzano, P. P., Inman, D. R., Eliceiri, K. W., Trier, S. M., Keely, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contact+guidance+mediated+three-dimensional+cell+migration+is+regulated+by+rho%2FROCK-dependent+matrix+reorganization%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Contact guidance mediated three-dimensional cell migration is regulated by rho/ROCK-dependent matrix reorganization.</a> Biophys. J. 95 (11), 5374 (2008).</li>
<li>Sander, E., Barocas, V., Tranquillo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+fiber+alignment+pattern+alters+extracellular+matrix+synthesis+in+fibroblast-populated+fibrin+gel+cruciforms+and+correlates+with+predicted+tension%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Initial fiber alignment pattern alters extracellular matrix synthesis in fibroblast-populated fibrin gel cruciforms and correlates with predicted tension.</a> Ann. Biomed. Eng. 39 (2), 714-729 (2011).</li>
<li>Barocas, V. H., Tranquillo, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+anisotropic+biphasic+theory+of+tissue-equivalent+mechanics%3A+the+interplay+among+cell+traction%2C+fibrillar+network+deformation%2C+fibril+alignment%2C+and+cell+contact+guidance%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomech.+Eng%22%5BJournal%5D)">An anisotropic biphasic theory of tissue-equivalent mechanics: the interplay among cell traction, fibrillar network deformation, fibril alignment, and cell contact guidance.</a> J. Biomech. Eng. 119, 137-146 (1997).</li>
<li>Neidert, M. R., Tranquillo, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-engineered+valves+with+commissural+alignment%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Tissue-engineered valves with commissural alignment.</a> Tissue Eng. 12 (4), 891-903 (2006).</li>
<li>Robinson PS,, Robinson PS, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Planar+biaxial+behavior+of+fibrin-based+tissue-engineered+heart+valve+leaflets%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Planar biaxial behavior of fibrin-based tissue-engineered heart valve leaflets.</a> Tissue Eng. Part A. 15 (10), 2763-2772 (2009).</li>
<li>Grassl, E., Oegema, T., Tranquillo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrin+as+an+alternative+biopolymer+to+type+I+collagen+for+the+fabrication+of+a+media+equivalent%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res%22%5BJournal%5D)">Fibrin as an alternative biopolymer to type I collagen for the fabrication of a media equivalent.</a> J. Biomed. Mater. Res. 60 (4), 607-612 (2002).</li>
<li>Paten, J. A., Zareian, R., Saeidi, N., Melotti, S. A., Ruberti, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+performance+of+an+optically+accessible%2C+low-volume%2C+mechanobioreactor+for+long-term+study+of+living+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+C+Methods%22%5BJournal%5D)">Design and performance of an optically accessible, low-volume, mechanobioreactor for long-term study of living constructs.</a> Tissue Eng. Part C Methods. 17 (7), 775-788 (2001).</li>
<li>Ye KY,, Sulli van KE,, Black LD, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encapsulation+of+cardiomyocytes+in+a+fibrin+hydrogel+for+cardiac+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Encapsulation of cardiomyocytes in a fibrin hydrogel for cardiac tissue engineering.</a> J. Vis. Exp. (55), (2011).</li>
<li>Ahmann, K. A., Weinbaum, J. S., Johnson, S. L., Tranquillo, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrin+degradation+enhances+vascular+smooth+muscle+cell+proliferation+and+matrix+deposition+in+fibrin-based+tissue+constructs+fabricated+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Fibrin degradation enhances vascular smooth muscle cell proliferation and matrix deposition in fibrin-based tissue constructs fabricated in vitro.</a> Tissue Eng. Part A. 16 (10), 3261-3270 (2010).</li>
<li>Raghupathy, R., Witzenburg, C., Lake, S. P., Sander, E. A., Barocas, V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+regional+mechanical+anisotropy+in+soft+tissue+analogs%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomech.+Eng%22%5BJournal%5D)">Identification of regional mechanical anisotropy in soft tissue analogs.</a> J. Biomech. Eng. 133, (2011).</li>
<li>Robinson, P. S., Johnson, S. L., Evans, M. C., Barocas, V. H., Tranquillo, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+tissue-engineered+valves+from+cell-remodeled+fibrin+with+commissural+alignment+of+cell-produced+collagen%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Functional tissue-engineered valves from cell-remodeled fibrin with commissural alignment of cell-produced collagen.</a> Tissue Eng. Part A. 14 (1), 83-95 (2008).</li>
<li>Gabbiani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+myofibroblast+in+wound+healing+and+fibrocontractive+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">The myofibroblast in wound healing and fibrocontractive diseases.</a> J. Pathol. 200 (4), 500-503 (2003).</li>
<li>PaszeK, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tensional+homeostasis+and+the+malignant+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Tensional homeostasis and the malignant phenotype.</a> Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).</li>
<li>Grinnell, F., Rocha L, B., Iucu, C., Rhee, S., Jiang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nested+collagen+matrices%3A+A+new+model+to+study+migration+of+human+fibroblast+populations+in+three+dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell.+Res%22%5BJournal%5D)">Nested collagen matrices: A new model to study migration of human fibroblast populations in three dimensions.</a> Exp. Cell. Res. 312 (1), 86-94 (2006).</li>
<li>Miron-Mendoza, M., Seemann, J., Grinnell, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+differential+regulation+of+cell+motile+activity+through+matrix+stiffness+and+porosity+in+three+dimensional+collagen+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The differential regulation of cell motile activity through matrix stiffness and porosity in three dimensional collagen matrices.</a> Biomaterials. 31 (25), 6425-6435 (2010).</li>
<li>Wakatsuki, T., Kolodney MS,, Zahalak GI,, Elson EL, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+mechanics+studied+by+a+reconstituted+model+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Cell mechanics studied by a reconstituted model tissue.</a> Biophys. J. 79 (5), 2353-2368 (2000).</li>
<li>De Jesus, A., Aghvami, M., Sander, E. Fibroblast-mediated fiber realignment in fibrin gels. ASME Summer Bioengineering Conference, 2013 Jun 26-29, Sunriver, OR, , (2013).</li>
<li>Aghvami, M., Barocas, V. H., Sander, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiscale+mechanical+simulations+of+cell+compacted+collagen+gels%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomech.+Eng%22%5BJournal%5D)">Multiscale mechanical simulations of cell compacted collagen gels.</a> J. Biomech. Eng. 135, (2013).</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Protokół ten został opracowany w celu obserwacji i ilościowego określenia mechaniki zaangażowanej w przebudowę ECM za pośrednictwem komórki. Takie procesy leżą u podstaw wielu zjawisk biologicznych i mają ważne implikacje dla inżynierii tkanek2,22, redukcji blizny1,23 i zrozumienia patologicznej przebudowy tkanek12,24. Zastosowanie poklatkowej mikroskopii DIC pozwala na określenie i ilościowe określenie przemieszczenia i wyrównania włókien fibryny, które zachodzi w wyniku działania sił tr...

Ważnym narzędziem do badania interakcji komórka-matryca jest wypełniony komórkami żel kolagenowy1,2. Żel zapewnia środowisko 3D, które jest bliższe charakterowi tkanki in vivo i lepiej nadaje się do zrozumienia zachowania komórek niż jest to oferowane przez tradycyjne hodowle 2D3. Wczesne badania, w których fibroblasty były jednorodnie rozmieszczone w żelu kolagenowym, wykazały, że komórki szybko konsolidują włókna kolagenowe i zagęszczają żel4,5. Kurczliwe fibroblasty w swobodnie pływających żelach przechodzą następnie w stan spoczynku wkrótce po tym, jak żel w pełni osiągnie zagęszczenie1,6,7. Fibroblasty w żelach, które są ograniczone na granicach, pozostają w stanie aktywnym, syntetycznym8 i generują wyrównanie włókien w sposób zależny od geometrii żelu i ograniczeń zewnętrznych5,9. Różnice w aktywności komórek wydają się być wynikiem wewnętrznego napięcia (lub jego braku), które rozwija się, gdy komórki wywierają siły trakcyjne poprzez integryny na włókna kolagenowe w żelu.
Wariant tej techniki polega na umieszczeniu eksplantatów fibroblastów (tj. zlepków komórek) w pewnej odległości od siebie w żelu kolagenowym i obserwowaniu interakcji komórka-macierz oraz stopniowego rozwoju wyrównania włókien między eksplantatami (czasami nazywanymi paskami przypominającymi więzadła)10-12. Podstawową zaletą systemu eksplantacji jest to, że pozwala on na układanie komórek w proste wzory geometryczne, co ułatwia wizualizację i badanie mechanizmów leżących u podstaw wyrównania włókien napędzanych komórkami. Te wzorce wyrównania - które są zależne przede wszystkim od wzajemnego oddziaływania między siłami trakcyjnymi komórek, rozkładem przestrzennym komórek, geometrią żelu i ograniczeniami mechanicznymi żelu - są ważne do zrozumienia, ponieważ odgrywają kluczową rolę w globalnej organizacji tkanek, funkcjach mechanicznych i lokalnym środowisku mechanicznym13.
W dziedzinie inżynierii tkankowej, jedna ze strategii wytwarzania mechanicznie funkcjonalnych, inżynieryjnych tkanek polega na kontrolowaniu wzorca wyrównania włókien, który rozwija się w wyniku zagęszczenia komórek, tak aby zmodyfikowana tkanka posiadała wyrównanie włókien naśladujące to w tkance natywnej14,15. Uważa się, że takie wyrównanie jest konieczne, aby zmodyfikowane tkanki mogły odtworzyć złożone mechaniczne zachowanie tkanek rodzimych. Modyfikacja tej strategii polega na zastąpieniu żelu kolagenowego żelem fibrynowym16. Żel fibrynowy rozwija podobny wzór wyrównania jak żel kolagenowy podczas zagęszczania. Z biegiem czasu fibryna ulega degradacji i jest zastępowana przez zsyntetyzowany w komórkach ECM, który podąża za początkowym wzorcem wyrównania włókien fibryny. Uzyskany w ten sposób konstrukt inżynieryjny znacznie poprawił właściwości mechaniczne w porównaniu z konstruktami pochodzącymi z żelu kolagenowego17.
Proces wyrównywania i następujące po nim zdarzenia przebudowy w żelach fibrynowych przebiegają w skomplikowany i słabo zrozumiały sposób. Aby lepiej scharakteryzować te interakcje i ich wpływ na zachowanie komórek i przebudowę ECM, opracowaliśmy procedurę opartą na metodzie eksplantatu. W tej metodzie eksplantaty fibroblastów umieszcza się na żelu fibrynowym w różnych wzorach geometrycznych. Żele są przechowywane w kontrolowanym środowiskowo, zamontowanym pod mikroskopem bioreaktorze18, a proces zagęszczania i ponownego ustawiania włókien jest monitorowany za pomocą mikroskopii poklatkowej z kontrastem różnicowym interferencyjnym (DIC). Pola przemieszczeń są określane ilościowo za pomocą niestandardowych algorytmów. Dane uzyskane z tych eksperymentów mają szerokie implikacje dla wielu procesów, w tym optymalizacji strategii inżynierii tkankowej, poprawy gojenia się ran i leczenia patologicznej przebudowy tkanek.

<table><tbody><tr><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8630</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4648</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gibco</td><td>11965-092</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2942</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0887</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sigma-Aldrich</td><td>223506</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen</td><td>3000</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lonza</td><td>DE14-701F</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sondy molekularne</td><td>F8858</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GIBCO</td><td>A10483-01</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GIBCO</td><td>11430-030</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fisher-Scientific</td><td>SS264-1</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3428-25MG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bioreaktor biotense</td><td>ADMET</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ti-Eclipe Mikroskop</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td># 0 35 mm Szklana płytka Petriego z dnem</td><td>MatTek</td><td>P35G-0-20-C</td><td></td></tr><tr><td># 0 35 mm Szklana szalka Petriego</td><td>MatTek</td><td>P35GTOP-0-20-C</td><td></td></tr><tr><td>Plastikowe złączki Luer, rurki PVC z końcówkami Luer</td><td>Cole-Parmer</td><td>30600-65</td><td></td></tr></tbody></table>

obserwacja i ilościowe określanie zagęszczenia fibryny w żelu za pośrednictwem fibroblastów

Observing and Quantifying Fibroblast-mediated Fibrin Gel Compaction

Komórki osadzone w żelach kolagenowych i fibrynowych przyłączają się i wywierają siły trakcyjne na włókna żelu. Siły te mogą prowadzić do lokalnej i globalnej reorganizacji i ponownego dostosowania mikrostruktury żelu. Proces ten przebiega w złożony sposób, który jest częściowo zależny od wzajemnego oddziaływania między lokalizacją komórek, geometrią żelu i mechanicznymi ograniczeniami żelu. Aby lepiej zrozumieć, w jaki sposób te zmienne wytwarzają globalne wzorce wyrównania włókien, używamy mikroskopii poklatkowej różnicowego kontrastu interferencyjnego (DIC) w połączeniu z bioreaktorem kontrolowanym środowiskowo, aby obserwować proces zagęszczania między geometrycznie rozmieszczonymi eksplantatami (klastrami fibroblastów). Obrazy są następnie analizowane za pomocą niestandardowego algorytmu przetwarzania obrazu w celu uzyskania map odkształcenia. Informacje uzyskane za pomocą tej techniki mogą być wykorzystane do badania mechanobiologii różnych interakcji komórka-macierz, co ma ważne implikacje dla zrozumienia procesów gojenia się ran, rozwoju chorób i zastosowań inżynierii tkankowej.

Przebudowa tkanek to złożony proces napędzany częściowo przez wzajemne oddziaływania fizyczne między komórkami a otaczającą je macierzą. Komórki reorganizują otaczające włókna i generują napięcie w sieci włókien. Z kolei orientacja włókien i środowisko mechaniczne kontrolują zachowanie komórek, dzięki czemu zarówno komórki, jak i macierz reorganizują się globalnie, prowadząc do przebudowy tkanki. W tym eksperymencie komórki eksplantów, początkowo o okrągłej morfologii, zaczęły wnikać w żel i przylegać do włókien fibryny ...

Techniki mikroskopii poklatkowej i przetwarzania obrazów zostały użyte do obserwacji i analizy zagęszczenia żelu za pośrednictwem fibroblastów i wyrównania włókien fibryny w bioreaktorze kontrolowanym przez środowisko przez okres 48 godzin.

Obserwacja i ilościowe określanie zagęszczenia fibryny w żelu za pośrednictwem fibroblastów

Cells embedded in collagen and fibrin gels attach and exert traction forces on the fibers of the gel. These forces can lead to local and global ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest obserwacja i analiza wpływu oddziaływań między komórkami a macierzą na reorganizację włókien oraz aktywność przebudowy macierzy w systemie żelu fibrynowego. Jest to realizowane poprzez polimeryzację trójwymiarowego żelu fibrynowego zawierającego mikrokuleczki na szkiełku podstawowym umieszczonym w bioreaktorze z kontrolowanymi warunkami środowiskowymi. W drugim kroku przygotowywana jest wysoko stężona zawiesina komórkowa, która służy do rozmieszczania skupisk fibroblastów lub eksplantów X w geometrycznych wzorach na powierzchni żelu.Następnie próbkę obrazuje się co 15 minut przy użyciu mikroskopii kontrastowej interferencyjnej (DIC) przez okres 48 godzin. Ostatnim etapem jest pomiar zakresu reorganizacji i przebudowy fibryny w formie odkształcenia w różnych obszarach żelu z wykorzystaniem cyfrowej korelacji obrazów. W rezultacie system eksplantów ten pozwala na rozmieszczenie komórek w prostych wzorach geometrycznych, co ułatwia wizualizację i badanie mechanizmów leżących u podstaw przebudowy macierzy i realignacji włókien indukowanej przez komórki.Metoda ta pozwala odpowiedzieć na kluczowe pytania z dziedziny biologii mechanicznej, takie jak

observing-and-quantifying-fibroblast-mediated-fibrin-gel-compaction

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Obserwowanie i ilościowe określanie kurczenia się żelu fibryny pośredniczonego przez fibroblasty

Niniejszy film prezentuje protokół testu angiogenezy in vitro, który odtwarza kilka etapów angiogenezy. Przedstawiono obrazy time-lapse ukazujące kiełkowanie, formowanie światła naczyń, rozgałęzianie oraz anastomozę – kluczowe cechy angiogenezy.

Zoptymalizowany test kulek z żelu fibrynowego do badania angiogenezy

W tym filmie prezentujemy techniki eksperymentalne wykorzystywane do wytwarzania elastycznych podłoży powleczonych macierzą zewnątrzkomórkową (ECM), które nadają się do hodowli komórkowej oraz pozwalają na zastosowanie mikroskopii sił trakcyjnych i obserwację wpływu sztywności ECM na zachowanie komórek.

Przygotowanie podatnych macierzy do ilościowego pomiaru skurczu komórkowego

Ten film prezentuje ilościową mikroskopię poklatkową do oceny zależnej od sztywności macierzy zewnątrzkomórkowej rozprzestrzeniania się Listeria monocytogenes przez komórki śródbłonka. Bardziej miękki hydrożel ułatwia szybsze rozprzestrzenianie się bakterii przez komórki śródbłonka w porównaniu ze sztywniejszymi odpowiednikami, co podkreśla wpływ sztywności matrycy na rozprzestrzenianie się bakterii.

Ilościowa mikroskopia poklatkowa do oceny rozsiewu bakterii zależnego od sztywności macierzy zewnątrzkomórkowej

Ten system modelowy zaczyna się od wypełnionego miofibroblastami żelu fibrynowego, który może być używany do badania endogennej kolagenu (re)organizacji w czasie rzeczywistym w sposób nieniszczący. System modelowy jest bardzo przestrajalny, ponieważ może być używany z różnymi źródłami komórek, dodatkami do pożywek i może być łatwo dostosowany do konkretnych potrzeb.

Inżynieria konstruktów tkankowych na bazie fibryny z miofibroblastów oraz zastosowanie ograniczeń i szczepów do indukowania reorganizacji komórek i kolagenu

W tym manuskrypcie przedstawiono techniki eksperymentalne, w tym przygotowanie krwi, mikroskopię konfokalną i analizę szybkości lizy, w celu zbadania różnic morfologicznych między normalnymi i nieprawidłowymi strukturami skrzepu spowodowanymi stanami chorobowymi.

Techniki eksperymentalne i obrazowe do badania struktur skrzepów fibryny w stanach prawidłowych i chorobowych

Tutaj prezentujemy protokół do badania patofizjologii proliferacyjnej retinopatii cukrzycowej za pomocą pobranych od pacjenta, chirurgicznie wyciętych tkanek włóknisto-naczyniowych do trójwymiarowej charakterystyki tkanek natywnych i hodowli ex vivo. Ten model hodowli ex vivo jest również podatny na testowanie lub opracowywanie nowych metod leczenia.

Model hodowli tkankowej ex vivo powikłań włóknisto-naczyniowych w proliferacyjnej retinopatii cukrzycowej

Uzyskanie czystej populacji fibroblastów jest kluczowe dla badania ich roli w gojeniu ran i zwłóknieniu. Opisano tutaj szczegółową metodę izolowania fibroblastów i miofibroblastów z nieuszkodzonych i uszkodzonych serc myszy, a następnie scharakteryzowanie ich czystości i funkcjonalności za pomocą immunofluorescencji, RTPCR, sortowania komórek wspomaganego fluorescencją i skurczu żelu kolagenowego.

Izolacja i charakterystyka dorosłych fibroblastów i miofibroblastów serca

Przedstawiona metoda polega na jednoosiowym rozciąganiu miękkich hydrożeli 3D osadzonych w gumie silikonowej, umożliwiając jednocześnie mikroskopię konfokalną na żywo. Przedstawiono charakterystykę zewnętrznych i wewnętrznych szczepów hydrożelu, a także wyrównanie włókien. Opracowane urządzenie i protokół mogą oceniać reakcję komórek na różne reżimy szczepów.

Kontrolowane odkształcanie hydrożeli 3D w obrazowaniu mikroskopowym na żywo

Prezentowany tutaj jest protokół generowania zmodyfikowanych tkanek łącznych do równoległej hodowli 48 tkanek na wielodołkowej płytce z podwójnymi biegunami, odpowiedni do badań mechanistycznych, modelowania chorób i badań przesiewowych. Protokół jest zgodny z fibroblastami z różnych narządów i gatunków, a jego przykładem są tutaj pierwotne fibroblasty serca ludzkiego.

Tkanka łączna pochodząca z fibroblastów pochodząca od człowieka do zastosowań przesiewowych

Ten artykuł opisuje, jak drukować biożele 3D fototostrajalne hydrożele do badania usztywnienia macierzy zewnątrzkomórkowej i aktywacji fibroblastów.

Biodruk 3D fotoprzestrajalnych hydrożeli do badania aktywacji fibroblastów

Mechanicznie izolowana frakcja naczyniowa zrębu (SVF) w połączeniu z hydrożelem fibrynowym oferuje łatwy i skuteczny nośnik dla żywotnych komórek zrębowych pochodzących z tkanki tłuszczowej dla różnych wskazań, w tym inżynierii tkankowej i/lub gojenia się ran. W tym miejscu przedstawiamy przygotowanie mechanicznego konstruktu hydrożelowego SVF (mSVF)-fibryna do badań translacyjnych i zastosowań klinicznych.

Połączenie mechanicznie izolowanej frakcji zrębu naczyniowego i hydrożelu fibrynowego: protokół przetwarzania

Poznaj metodę obserwacji i analizy interakcji komórkowo-macierzowych w żelu fibrynowym przy użyciu mikroskopii czasowej oraz korelacji obrazu cyfrowego. Technika ta umożliwia badanie mechanizmów remodelowania macierzy przez fibroblasty.

Obserwacja i ilościowe określanie zagęszczenia fibryny w żelu za pośrednictwem fibroblastów

Przeglądaj więcej filmów