Analiza wad mięśni szkieletowych u larw danio pręgowanego za pomocą testów dwójłomności i reakcji ucieczki wywołanej dotykiem

Ogólnym celem niniejszej procedury jest ocena stopnia organizacji miofibrylarnej w półprzezroczystych larwach rybek danio oraz ilościowe określenie dystansu ich pływania w odpowiedzi na stymulację dotykową dla obu metod. Zostaje to osiągnięte najpierw poprzez krzyżowanie rybek danio, a następnie poprzez zebranie żywotnych jaj w drugim kroku analizy służącej ocenie struktury mięśni. Powleczony, znieczulony embrion rybki danio jest umieszczany bezpośrednio pomiędzy dwiema soczewkami polaryzacyjnymi na stoliku mikroskopu stereoskopowego w taki sposób, aby ryba była zorientowana wzdłuż osi bocznej ciała i znajdowała się w pozycji jak najbardziej płaskiej.

Następnie wizualizowana jest dwójłomność i kwantyfikowana integralność mięśni. W drugim kroku testu reakcji ucieczki wywołanej dotykiem pojedynczą powleczoną larwę umieszcza się w głębokiej szalce Petriego, a następnie centruje w polu widzenia stereomikroskopu. Larwie podaje się bodziec sensoryczny, dotykając ogona szpilką entomologiczną, a reakcja zwierzęcia jest rejestrowana obrazowo aż do momentu, gdy embrion przestanie pływać lub wypłynie poza pole widzenia.

W ostateczności możliwe jest ilościowe określenie różnic w organizacji mięśni oraz w reakcjach lokomocyjnych. Głównymi zaletami tych nieinwazyjnych technik są możliwość szybkiej analizy dużej liczby ryb oraz możliwość monitorowania in vivo wad mięśni szkieletowych u tych samych osobników przez kilka dni. Wizualne instrukcje dotyczące montażu polaryzatorów oraz odpowiedniego ustawienia larw są kluczowe dla zapewnienia sukcesu procedury.

W ramach tych testów usuń nieżywe jaja ze wszystkich zniesień zebranych od kopulujących dorosłych ryb. Są one zazwyczaj białe i nieprzezroczyste w świetle widzialnym lub wyglądają pod mikroskopem jak skupisko ciemnych, zdezorganizowanych komórek; zwróć embriony do inkubatora w celu dalszego wzrostu od trzech do siedmiu dni po zapłodnieniu. Jeśli interesujący nas embrion nadal znajduje się w chorionie, użyj pary ostrych pęset, aby delikatnie naciąć chorion i następnie odwróć go do góry nogami, tak aby embrion wypadł.

Zanurzyć pokryte embriony w roztworze trica w celu znieczulenia, co ułatwi ich właściwe ustawienie, a następnie wyposażyć mikroskop sekcyjny w soczewkę polaryzacyjną, którą można obracać w celu regulacji kąta światła spolaryzowanego. Po wyprostowaniu się embrionów umieścić drugą soczewkę polaryzacyjną na stoliku mikroskopu bezpośrednio pod górną soczewką i położyć embriony bezpośrednio na tej drugiej soczewce. Każdy wybrany embrion należy następnie ustawić wzdłuż osi bocznej jego ciała.

Obracaj górną soczewkę, mając w polu widzenia wybrany embrion, aż osie polaryzacji obu soczewek zostaną ustawione pod kątem 90 stopni względem siebie, a tło stanie się całkowicie ciemne. Przesuń rybę, aby upewnić się, że leży ona jak najpłaskiej. Jeśli ryba jest wygięta, tylko segmenty o płaskiej orientacji przepuszczą światło spolaryzowane i wykażą błękitną podwójną refrakcję (birefringence).

Następnie należy zaobserwować fenotyp dwójłomności u ryb typu dzikiego. Wysoko zorganizowane mięśnie szkieletowe wykazują silną dwójłomność, ponieważ współczynnik załamania światła równoległego do filamentów miofibrillar jest wyższy niż dla światła spolaryzowanego prostopadle do tych struktur. Ryby z zdezorganizowaną strukturą mięśni szkieletowych, co sugeruje neurodegeneracyjną miopatię lub wadę rozwojową, zazwyczaj wykazują ogólny spadek dwójłomności mięśni szkieletowych.

Charakterystyczne dla dystrofii mięśniowej. Często występuje mozaikowy wzór dwójłomności, w którym ciemne obszary reprezentują degenerację mięśni, a jasne obszary prawidłową architekturę mięśniową. Należy wykonać obrazy ryby w świetle spolaryzowanym w celu ilościowego oznaczenia dwójłomności.

Zapisz obrazy jako pliki tiff. Otwórz obrazy dwójłomności w programie do przetwarzania obrazów. Jeśli, tak jak pokazano tutaj, używasz programu ImageJ, w każdym obrazie najpierw użyj narzędzia do zaznaczania wielokątów, aby obrysować ciało ryby i wyznaczyć obszar mięśnia zebrafish do pomiaru.

Następnie z rozwijanego menu analyze wybierz set measurements, aby dobrać wymagane statystyki dla obrazu. Zaznacz pola area mean gray value oraz min and max gray value, aby skonfigurować test zachowania ucieczki wywołanego dotykiem od drugiego do siódmego dnia po zapłodnieniu. Umieść wybrane pokryte ryby pojedynczo w głębokich szalkach Petriego, pracując z jednym embrionem naraz.

Umieść rybę w centrum pola widzenia stereomikroskopu wyposażonego w system kamery cyfrowej i rozpocznij sekwencyjne obrazowanie z częstotliwością klatek większą lub równą 30 Hz. Następnie, używając szpilki entomologicznej, dotknij ogona zarodka, aby dostarczyć bodziec sensoryczny, przerywając obrazowanie w momencie, gdy zarodek przestanie pływać lub wypłynie poza pole widzenia. Na koniec przekonwertuj sekwencyjne obrazy na plik wideo lub przeanalizuj poszczególne klatki obrazów z lapse-time.

Dwójłomność offline może być wykorzystana jako efektywny nieinwazyjny test pozwalający ocenić stan organizacji włókien miofibrylarnych w żywych embrionach danio pręgowanego; u dzikich typów ryb danio pręgowanego w piątej dobie po zapłodnieniu mięśnie szkieletowe wykazują silną dwójłomność w świetle spolaryzowanym ze względu na uporządkowany układ miofilamentów. W przeciwieństwie do nich, embriony w tym samym wieku, homozygotyczne pod kątem patogennej mutacji w genie dystroglikanu (DAG1), wykazują niejednorodną dwójłomność, co wskazuje na obszary degeneracji mięśni. Taki plamisty wzorzec oraz szybka progresja degeneracji mięśni w trakcie wczesnego rozwoju są zgodne z innymi modelami ryb dystroficznych.

Ilościowe określenie dwójłomności pięciu dni po zapłodnieniu u mutantów dystroficznych DAG one wykazuje znaczną redukcję jasności do 27,9 ± 5,3% maksymalnej dwójłomności obserwowanej u ich rodzeństwa typu dzikiego. Redukcja ta jest bardziej dotkliwa niż spadek do 52,4 ± 5,5% zaobserwowany u morfantów myopatycznych mtm one trzy dni po zapłodnieniu. Myopatyczne modele ryb wykazują raczej ogólną redukcję dwójłomności w porównaniu z typem dzikim, ponieważ często występuje dezorganizacja miofibrylarna w głównych mięśniach szkieletowych osiowych, jednak nie ma dowodów na zmiany degeneracyjne. Zachowania ucieczkowe wyzwalane dotykiem mogą posłużyć do wykazania, że modele choroby mięśni szkieletowych u danio przezebranych wykazują defekty lokomocyjne i trudności w pływaniu.

Ten pierwszy film przedstawia test zachowania ucieczkowego wywołanego dotykiem u dzikich typów ryb danio prążkowanych. Zwróć uwagę, że w piątej dobie po zapłodnieniu prawidłowo rozwinięte pisklęta odpływają bardzo szybko. W odpowiedzi na dotyk, na tym drugim filmie zarejestrowano zachowanie ucieczkowe wywołane dotykiem u piskląt w pierwszej dobie po zapłodnieniu.

Zauważmy, że w piątym dniu po zapłodnieniu embriony mutantów wykazują upośledzoną reakcję na dotyk i nie opuszczają pola widzenia po stymulacji. Następnie przeanalizowano nagrania klatka po klatce, aby potwierdzić, że mutanty DAG one wykazują upośledzony ruch w odpowiedzi na bodźce dotykowe w porównaniu z kontrolną grupą typu dzikiego. Obliczono średnie odległości, jakie oba typy embrionów były w stanie przebyć w ustalonym przedziale czasowym, co wskazuje na obniżoną sprawność motoryczną u mutantów DAG one.

Po opanowaniu tych technik można je wykonywać na dużych grupach ryb w krótkim odstępie czasu, co jest kluczowe podczas prowadzenia wysokoprzepustowych przesiewów chemicznych lub mutagennych. Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić bardziej inwazyjne analizy, takie jak immunohistochemia lub mikroskopia elektronowa, aby zbadać defekty mięśni szkieletowych na poziomie molekularnym i strukturalnym.