Name: Analiza wad mięśni szkieletowych u larw danio pręgowanego za pomocą testów dwójłomności i reakcji ucieczki wywołanej dotykiem (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-13T13:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: Poznaj nieinwazyjne metody oceny organizacji mięśniowej u larw Danio rerio za pomocą testów dwójłomności i reakcji ucieczki. Techniki te umożliwiają szybką analizę wad mięśni szkieletowych w modelu zebrafish.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Behzadowi Moghadaszadehowi za jego wspaniałą pomoc w kwantyfikacji obrazów dwójłomności. Praca ta została sfinansowana przez Muscular Dystrophy Association USA (MDA201302) oraz National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases (R01 AR044345), a także hojne wsparcie od A Foundation Building Strength, Cure CMD i AUism Charitable Foundation. VAG jest wspierany przez K01 AR062601 z National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases, a LLS jest wspierany przez F31 NS081928 z National Institute of Neurological Disorders and Stroke.

1. Analiza in vivo struktury mięśni szkieletowych przez dwójłomność
<ol>
	<li>Późnym popołudniem po karmieniu należy przygotować klatki godowe oddzielające samca (samce) od samicy (samic) pożądanej linii (linii) danio pręgowanego.
	<ol>
		<li>Odróżniaj samice po ich większym podbrzuszu i lekkim niebiesko-białym ubarwieniu, a samce po smukłym kształcie ciała i różowo-żółtych odcieniach.</li>
		<li>Sukces w krzyżowaniu par (jeden samiec i jedna samica) może wynosić tylko około 50%. Aby uzyskać wyższy wskaźnik sukcesu, skryj jednego samca z 2-3 samicami.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Usuń przegrody klatkowe następnego ranka, wkrótce po nadejściu światła i pozwól rybom na tarło bez przeszkód.</li>
	<li>Zbierz jaja za pomocą sitka, gdy na dnie zbiornika złożona zostanie wystarczająca liczba zapłodnionych jaj.</li>
	<li>Przenieś zarodki na głęboką szalkę Petriego, przepłukując sitko wodą dla ryb i włóż ryby rodzicielskie z powrotem do ich zbiorników. Umieścić szalki z zarodkami w inkubatorze o temperaturze 28,5 °C.</li>
	<li>Usuń niezdolne do życia jaja i resztki później tego samego dnia lub następnego ranka i zwróć zarodki do inkubatora w celu dalszego wzrostu.</li>
	<li>Zarodki/larwy osiągają odpowiedni wiek, aby zaobserwować dwójłomność po 3-7 dniach od zapłodnienia (dpf), ponieważ wyniki przed 3 dpf mogą potencjalnie mieć ograniczony kontrast. Zarodki typu dzikiego wykluwają się z kosmówki między 48-60 godzinami po zapłodnieniu (hpf), po których następuje wyprostowanie osi ciała. Późno wykluwające się zarodki typu dzikiego lub zmutowane mogą wymagać ręcznej dechorionacji.
	<ol>
		<li>Delikatnie rozerwij kosmówkę ostrymi kleszczami i odwróć ją do góry nogami, aby zarodek wypadł.</li>
		<li>Pozwól, aby zarodki z odkorionowaną skórką wyprostowały się przed rozpoczęciem testu.</li>
		<li>Znieczulij zarodek (zarodki) trikainą (0,04% w wodzie dla ryb), aby pomóc w ich prawidłowym ułożeniu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zamontuj mikroskop preparacyjny z soczewką spolaryzacyjną, którą można obracać w celu regulacji kąta światła spolaryzowanego (Rysunek 1A).</li>
	<li>Umieść zdekorionowany, znieczulony zarodek (zarodki) bezpośrednio na drugiej soczewce polaryzacyjnej wzdłuż bocznej osi ciała. Druga soczewka powinna być umieszczona poniżej górnej soczewki, na stoliku mikroskopu (rysunek 1B). Nie należy używać plastikowych szalek Petriego w żadnym momencie podczas próby dwójłomności, ponieważ plastik nie jest odpowiednim medium do transmisji załamanego światła.</li>
	<li>Obracaj górną soczewkę tak, aby interesujący Cię zarodek był w zasięgu wzroku, aż osie polaryzacji obu soczewek zostaną zorientowane pod kątem 90° od siebie, a tło będzie całkowicie ciemne.</li>
	<li>Optymalna wydajność testu zależy od orientacji ryb między dwiema soczewkami polaryzacyjnymi. Przesuwaj ryby, aby upewnić się, że leżą tak płasko, jak to możliwe.
	<ol>
		<li>Jeśli ryba jest zakrzywiona, tylko segmenty o tej płaskiej orientacji przejdą przez spolaryzowane światło i będą wykazywać dwójłomność. W takich przypadkach należy zmierzyć dwójłomność na obszarach płaskich i zarejestrować dwójłomność odpowiedniego obszaru u ryb typu dzikiego (np. somity 1–10 zarówno u ryb typu dzikiego, jak i zmutowanych).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obserwuj fenotyp dwójłomności ryby.
	<ol>
		<li>Ryby typu dzikiego z wysoce zorganizowanymi mięśniami szkieletowymi wykazują jasną dwójłomność, ponieważ współczynnik załamania światła dla światła równoległego do miofilamentów jest wyższy niż światło spolaryzowane prostopadłe do tych struktur.</li>
		<li>Ryby ze zdezorganizowanymi mięśniami szkieletowymi sugerującymi miopatię niezwyrodnieniową lub wadę rozwojową zazwyczaj wykazują ogólne zmniejszenie dwójłomności.</li>
		<li>Ryby ze zdezorganizowanymi mięśniami szkieletowymi charakterystycznymi dla dystrofii mięśniowej często wykazują łatkowaty wzór dwójłomności, z ciemnymi obszarami reprezentującymi zwyrodnienie mięśni wśród jasnych obszarów normalnej architektury mięśni.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Określ ilościowo dwójłomność, robiąc zdjęcia dzikich i zmutowanych ryb w świetle spolaryzowanym przy tych samych ustawieniach ekspozycji i powiększeniu. Zapisuj obrazy jako pliki .tiff.
	<ol>
		<li>Otwórz obrazy dwójłomności w oprogramowaniu ImageJ (<a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a>).</li>
		<li>Dla każdego obrazu wybierz obszar mięśnia danio pręgowanego, rysując linię wokół ciała za pomocą opcji "Wielokątne zaznaczenia" na pasku narzędzi.</li>
		<li>Użyj opcji "Ustaw pomiary" w menu rozwijanym "Analizuj", aby wybrać wymagane statystyki dla obrazu.
		<ol>
			<li>Minimalny wybór wymaga, aby pola "Obszar", "Średnia wartość szarości" i "Min i maksymalna wartość szarości" były zaznaczone.</li>
			<li>Maksymalna wartość szarości >255 będzie wskazywać na nasycenie pikseli. Dlatego należy używać obrazów o maksymalnych wartościach szarości mniejszych niż 255.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Znormalizuj średnią intensywność z wybranym obszarem i powtórz tę samą procedurę kwantyfikacji dla każdego obrazu dwójłomności.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Test zachowań ucieczki wywołany dotykiem
<ol>
	<li>Ustaw pary godowe odpowiednich linii (linii) danio pręgowanego i zbierz zarodki zgodnie z powyższym opisem w krokach 1.1–1.5.</li>
	<li>Po 2-7 dniach od zapłodnienia należy umieścić zdechorionowane zarodki/larwy pojedynczo na głębokiej szalce Petriego lub w komorach z płytkami wielodołkowymi.</li>
	<li>Pracując tylko z jednym zarodkiem na raz, wyśrodkuj zarodek w polu view mikroskopu stereoskopowego Nikon SMZ1500 z systemem aparatu cyfrowego SPOT RT3 lub podobnym i rozpocznij obrazowanie sekwencyjne.
	<ol>
		<li>Taką samą częstotliwość obrazowania należy stosować zarówno w przypadku ryb typu dzikiego, jak i zmutowanych. Zalecana jest częstotliwość odświeżania >30 Hz, ponieważ wolniejsze częstotliwości zazwyczaj nie wystarczą, aby uchwycić szybkie pływanie dzikich ryb.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dostarczaj bodźce mechanosensoryczne do zarodka, dotykając ogona szpilką do owadów.</li>
	<li>Przerwij obrazowanie, gdy zarodek przestał pływać lub wypłynął poza pole widzenia.</li>
	<li>Konwertuj sekwencyjne obrazy na plik wideo lub analizuj pojedyncze klatki obrazów poklatkowych w trybie off-line, korzystając z oprogramowania SPOT 5.1 Advanced. Podobne pakiety oprogramowania obejmują Open Lab, NIS Elements lub ogólnodostępny ImageJ (<a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/" title="">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a>).</li>
	<li>Określ ilościowo zachowanie podczas pływania, wykonując reakcję wywołaną dotykiem w wielu zarodkach.
	<ol>
		<li>Można to osiągnąć, uśredniając odległość, jaką zarodki są w stanie przepłynąć w ustalonym przedziale czasu, za pomocą oprogramowania lub linijki metrycznej do oznaczania punktów początkowych i końcowych zawodów pływackich.</li>
		<li>Unikaj przyzwyczajania się zarodków do bodźca dotykowego z upływem czasu, wykonując test z nowym zarodkiem dla każdego powtórzenia eksperymentalnego. Zachowania w modelach dzikich i wiarygodnych mutantów są zwykle wysoce powtarzalne.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Bassett, D. I., Bryson-Richardson, R. J., Daggett, D. F., Gautier, P., Keenan, D. G., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dystrophin+is+required+for+the+formation+of+stable+muscle+attachments+in+the+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Dystrophin is required for the formation of stable muscle attachments in the zebrafish embryo.</a> Development. 130, 5851-5860 (2003).</li>
<li>Gupta, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+dag1+mutant%3A+a+novel+genetic+model+for+dystroglycanopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet%22%5BJournal%5D)">The zebrafish dag1 mutant: a novel genetic model for dystroglycanopathies.</a> Hum. Mol. Genet. 20 (9), 1712-1725 (2011).</li>
<li>Hall, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+candyfloss+mutant+implicates+extracellular+matrix+adhesion+failure+in+laminin+%CE%B12-deficient+congenital+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">The zebrafish candyfloss mutant implicates extracellular matrix adhesion failure in laminin α2-deficient congenital muscular dystrophy.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (17), 7092-7097 (2007).</li>
<li>Dowling, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+myotubularin+function+results+in+T-tubule+disorganization+in+zebrafish+and+human+myotubular+myopathy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Loss of myotubularin function results in T-tubule disorganization in zebrafish and human myotubular myopathy.</a> PLoS Genet. 5 (2), e1000372(2009).</li>
<li>Telfer, W. R., Nelson, D. D., Waugh, T., Brooks, S. V., Dowling, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neb%3A+a+zebrafish+model+of+nemaline+myopathy+due+to+nebulin+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Dis.+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Neb: a zebrafish model of nemaline myopathy due to nebulin mutation.</a> Dis. Model Mech. 5 (3), 389-396 (2012).</li>
<li>Ferrante, M. I., Kiff, R. M., Goulding, D. A., Stemple, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Troponin+T+is+essential+for+sarcomere+assembly+in+zebrafish+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Troponin T is essential for sarcomere assembly in zebrafish skeletal muscle.</a> J. Cell Sci. 124 (4), 565-577 (2011).</li>
<li>Hawkins, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ATPase-dependent+chaperoning+activity+of+Hsp90a+regulates+thick+filament+formation+and+integration+during+skeletal+muscle+myofibrillogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The ATPase-dependent chaperoning activity of Hsp90a regulates thick filament formation and integration during skeletal muscle myofibrillogenesis.</a> Development. 135 (6), 1147-1156 (2008).</li>
<li>Barbazuk, W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+syntenic+relationship+of+the+zebrafish+and+human+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">The syntenic relationship of the zebrafish and human genomes.</a> Genome Res. 10 (9), 1351-1358 (2000).</li>
<li>Schapira, G., Dreyfus, J. C., Joly, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+the+flow+birefringence+of+myosin+as+a+result+of+muscular+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Changes in the flow birefringence of myosin as a result of muscular atrophy.</a> Nature. 170 (4325), 494-495 (1952).</li>
<li>Kimmel, C. B., Patterson, J., Kimmel, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+and+behavioral+characteristics+of+the+startle+response+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Psychobiol%22%5BJournal%5D)">The development and behavioral characteristics of the startle response in zebrafish.</a> Dev. Psychobiol. 7, 47-60 (1974).</li>
<li>Eaton, R. C., Bombardieri, R. A., Meyer, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Mauthner-initiated+startle+response+in+teleost+fish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">The Mauthner-initiated startle response in teleost fish.</a> J. Exp. Biol. 66, 65-81 (1977).</li>
<li>Saint-Amant, L., Drapeau, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+course+of+the+development+of+motor+behaviors+in+the+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Time course of the development of motor behaviors in the zebrafish embryo.</a> J. Neurobiol. 37 (4), 622-632 (1998).</li>
<li>Hirata, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+relatively+relaxed+mutants+have+a+ryanodine+receptor+defect%2C+show+slow+swimming+and+provide+a+model+of+multi-minicore+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Zebrafish relatively relaxed mutants have a ryanodine receptor defect, show slow swimming and provide a model of multi-minicore disease.</a> Development. 134 (15), 2771-2781 (2007).</li>
<li>Wallace, G. Q., McNally, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+muscle+degeneration%2C+regeneration%2C+and+repair+in+the+muscular+dystrophies%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of muscle degeneration, regeneration, and repair in the muscular dystrophies.</a> Annu. Rev. Physiol. 71, 37-57 (2009).</li>
<li>Granato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+controlling+and+mediating+locomotion+behavior+of+the+zebrafish+embryo+and+larva%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Genes controlling and mediating locomotion behavior of the zebrafish embryo and larva.</a> Development. 123, 399-413 (1996).</li>
<li>Berger, J., Sztal, T., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+birefringence+readily+measures+the+level+of+muscle+damage+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Quantification of birefringence readily measures the level of muscle damage in zebrafish.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 423 (4), 785-788 (2012).</li>
<li>Low, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPM7+is+required+within+zebrafish+sensory+neurons+for+the+activation+of+touch-evoked+escape+behaviors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">TRPM7 is required within zebrafish sensory neurons for the activation of touch-evoked escape behaviors.</a> J. Neurosci. 31 (32), 11633-11644 (2011).</li>
<li>Liu, D. W., Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function+of+identified+motoneurones+and+co-ordination+of+primary+and+secondary+motor+systems+during+zebrafish+swimming%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Function of identified motoneurones and co-ordination of primary and secondary motor systems during zebrafish swimming.</a> J. Physiol. 403, 73-89 (1988).</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Pierwotne zaburzenia nerwowo-mięśniowe są tradycyjnie klasyfikowane jako procesy dystroficzne lub niedystroficzne. Dystrofie mięśniowe charakteryzują się zwyrodnieniem włókien mięśniowych, po którym następują powtarzające się rundy regeneracji, co ostatecznie prowadzi do procesu końcowego etapu typowego dla zwłóknienia i zastąpienia przez tkankę tłuszczową14. Natomiast miopatie niedystroficzne nie są związane z martwicą lub zmianami regeneracyjnymi, ale powodują zdezorganizowane włókna mięśniowe i ogólne osłab...

<table><tbody><tr><td>Tricaine </td><td>Sigma</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>Szalki Petriego</td><td>Fischer Scientific</td><td>0875711Z</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td>Fischer Scientific</td><td>100189-588</td><td></td></tr><tr><td>Szpilka do owadów</td><td>Fischer Scientific</td><td>S67375</td><td></td></tr><tr><td>Soczewki polaryzacyjne Kamera</td><td>Ritz Quantaray Tristar Optics C-PL 72mm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inkubator</td><td>Fischer Naukowy</td><td>inkubator izotemperaturowy model mikroskopu 630D</td><td></td></tr><tr><td></td><td>firmy Nikon Instruments Inc.</td><td>Przyrządy diagnostyczne do kamer SMZ 1500</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Inc.</td><td>Oprogramowanie do obrazowania SPOT RT3</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Diagnostic Instruments Inc.</td><td>SPOT 5.1 Zaawansowany</td><td></td></tr></tbody></table>

analiza wad mięśni szkieletowych u larw danio pręgowanego za pomocą testów dwójłomności i reakcji ucieczki wywołanej dotykiem

Analysis of Skeletal Muscle Defects in Larval Zebrafish by Birefringence and Touch-evoke Escape Response Assays

Danio rerio) danio pręgowany (Danio rerio) stały się szczególnie skutecznym narzędziem do modelowania ludzkich chorób wpływających na mięśnie szkieletowe, w tym dystrofii mięśniowych1-3, wrodzonych miopatii4,5 i zakłóceń w składaniu sarkomerycznym6,7, ze względu na wysoką ochronę genomiczną i strukturalną u ssaków8. Dezorganizację mięśni i upośledzenie lokomocji można szybko ocenić u danio pręgowanego w ciągu pierwszych kilku dni po zapłodnieniu. Dwa testy, które pomagają scharakteryzować defekty mięśni szkieletowych u danio pręgowanego, to dwójłomność (strukturalna) i reakcja ucieczki wywołana dotykiem (behawioralna).
Dwójłomność to fizyczna właściwość, w której światło jest obracane, gdy przechodzi przez uporządkowaną materię, taką jak pseudokrystaliczna tablica mięśniowych sarkomerów9. Jest to proste, nieinwazyjne podejście do oceny integralności mięśni u przezroczystych larw danio pręgowanego na wczesnym etapie rozwoju. Danio pręgowany typu dzikiego z wysoce zorganizowanymi mięśniami szkieletowymi wydaje się bardzo jasny na ciemnym tle, gdy jest wizualizowany między dwoma spolaryzowanymi filtrami światła, podczas gdy mutanty mięśni mają wzorce dwójłomności specyficzne dla pierwotnego zaburzenia mięśniowego, które modelują. Danio pręgowany modelujący dystrofie mięśniowe, choroby charakteryzujące się zwyrodnieniem włókien mięśniowych, po którym następują powtarzające się rundy regeneracji, wykazują zwyrodnieniowe ciemne plamy w mięśniach szkieletowych w spolaryzowanym świetle. Miopatie niedystroficzne nie są związane z martwicą ani zmianami regeneracyjnymi, ale powodują dezorganizację włókien mięśniowych i osłabienie mięśni szkieletowych. Miopatyczne danio pręgowane zazwyczaj wykazują ogólne zmniejszenie dwójłomności, co odzwierciedla dezorganizację sarkomerów.
Test ucieczki wywołany dotykiem polega na obserwacji zachowania embrionu podczas pływania w odpowiedzi na stymulację dotykową10-12. W porównaniu z larwami typu dzikiego, zmutowane larwy często wykazują słaby skurcz ucieczki, po którym następuje powolne pływanie lub inny rodzaj upośledzonego ruchu, który nie jest w stanie wypchnąć larw na większą odległość niż na niewielką odległość12. Zaletą tych testów jest to, że postęp choroby u tego samego typu ryb może być monitorowany in vivo przez kilka dni oraz że duża liczba ryb może być analizowana w krótkim czasie w porównaniu z wyższymi kręgowcami.

Dwójłomność może służyć jako wydajny, nieinwazyjny test pozwalający ocenić stan organizacji miofibrylarnej w żywych embrionach danio pręgowanego. Przedstawiono przykłady ryb danio pręgowanego typu dzikiego, a także osobników z obniżoną ekspresją genów kluczowych dla rozwoju i funkcji mięśni szkieletowych. Ryby danio pręgowanego typu dzikiego w 5 dpf wykazują silną dwójłomność mięśni szkieletowych w świetle spolaryzowanym, co wynika z uporządkowanego układu miofilamentów (Figures 2A-B). W przeciwieństwie ...

Danio pręgowany jest teraz sprawdzonym i potężnym narzędziem do modelowania dystrofii mięśniowych, wrodzonych miopatii i pokrewnych chorób nerwowo-mięśniowych. Dwójłomność i zachowanie ucieczki wywołane dotykiem to dwa powszechne nieinwazyjne testy stosowane do określenia stopnia dezorganizacji mięśni i upośledzenia lokomocji zarodków danio pręgowanego we wczesnym okresie rozwoju.

Analiza wad mięśni szkieletowych u larw danio pręgowanego za pomocą testów dwójłomności i reakcji ucieczki wywołanej dotykiem

Zebrafish (Danio rerio) have become a particularly effective tool for modeling human diseases affecting skeletal muscle, including muscular ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest ocena stopnia organizacji miofibrylarnej w półprzezroczystych larwach rybek danio oraz ilościowe określenie dystansu ich pływania w odpowiedzi na stymulację dotykową dla obu metod. Zostaje to osiągnięte najpierw poprzez krzyżowanie rybek danio, a następnie poprzez zebranie żywotnych jaj w drugim kroku analizy służącej ocenie struktury mięśni. Powleczony, znieczulony embrion rybki danio jest umieszczany bezpośrednio pomiędzy dwiema soczewkami polaryzacyjnymi na stoliku mikroskopu stereoskopowego w taki sposób, aby ryba była zorientowana wzdłuż osi bocznej ciała i znajdowała się w pozycji jak najbardziej płaskiej.Następnie wizualizowana jest dwójłomność i kwantyfikowana integralność mięśni. W drugim kroku testu reakcji ucieczki wywołanej dotykiem pojedynczą powleczoną larwę umieszcza się w głębokiej szalce Petriego, a następnie centruje w polu widzenia stereomikroskopu. Larwie podaje się bodziec sensoryczny, dotykając ogona szpilką entomologiczną, a reakcja zwierzęcia jest rejestrowana obrazowo aż do momentu, gdy embrion przestanie pływać lub wypłynie poza pole widzenia.W ostateczności możliwe jest ilościowe określenie różnic w organizacji mięśni oraz w reakcjach lokomocyjnych. Głównymi zaletami tych nieinwazyjnych technik są możliwość szybkiej analizy dużej liczby ryb oraz możliwość monitorowania in vivo wad mięśni szkieletowych u tych samych osobników przez kilka dni. Wizualne instrukcje dotyczące montażu polaryzatorów oraz odpowiedniego ustawienia larw są kluczowe dla zapewnienia sukcesu procedury.W ramach tych testów usuń nieżywe jaja ze wszystkich zniesień zebranych od kopulujących dorosłych ryb. Są one zazwyczaj białe i nieprzezroczyste w świetle widzialnym lub wyglądają pod mikroskopem jak skupisko ciemnych, zdezorganizowanych komórek; zwróć embriony do inkubatora w celu dalszego wzrostu od trzech do siedmiu dni po zapłodnieniu. Jeśli interesujący nas embrion nadal znajduje się w chorionie, użyj pary ostrych pęset, aby delikatnie naciąć chorion i następnie odwróć go do góry nogami, tak aby embrion wypadł.Zanurzyć pokryte embriony w roztworze trica w celu znieczulenia, co ułatwi ich właściwe ustawienie, a następnie wyposażyć mikroskop sekcyjny w soczewkę polaryzacyjną, którą można obracać w celu regulacji kąta światła spolaryzowanego. Po wyprostowaniu się embrionów umieścić drugą soczewkę polaryzacyjną na stoliku mikroskopu bezpośrednio pod górną soczewką i położyć embriony bezpośrednio na tej drugiej soczewce. Każdy wybrany embrion należy następnie ustawić wzdłuż osi bocznej jego ciała.Obracaj górną soczewkę, mając w polu widzenia wybrany embrion, aż osie polaryzacji obu soczewek zostaną ustawione pod kątem 90 stopni względem siebie, a tło stanie się całkowicie ciemne. Przesuń rybę, aby upewnić się, że leży ona jak najpłaskiej. Jeśli ryba jest wygięta, tylko segmenty o płaskiej orientacji przepuszczą światło spolaryzowane i wykażą błękitną podwójną refrakcję (birefringence).Następnie należy zaobserwować fenotyp dwójłomności u ryb typu dzikiego. Wysoko zorganizowane mięśnie szkieletowe wykazują silną dwójłomność, ponieważ współczynnik załamania światła równoległego do filamentów miofibrillar jest wyższy niż dla światła spolaryzowanego prostopadle do tych struktur. Ryby z zdezorganizowaną strukturą mięśni szkieletowych, co sugeruje neurodegeneracyjną miopatię lub wadę rozwojową, zazwyczaj wykazują ogólny spadek dwójłomności mięśni szkieletowych.Charakterystyczne dla dystrofii mięśniowej. Często występuje mozaikowy wzór dwójłomności, w którym ciemne obszary reprezentują degenerację mięśni, a jasne obszary prawidłową architekturę mięśniową. Należy wykonać obrazy ryby w świetle spolaryzowanym w celu ilościowego oznaczenia dwójłomności.Zapisz obrazy jako pliki tiff. Otwórz obrazy dwójłomności w programie do przetwarzania obrazów. Jeśli, tak jak pokazano tutaj, używasz programu ImageJ, w każdym obrazie najpierw użyj narzędzia do zaznaczania wielokątów, aby obrysować ciało ryby i wyznaczyć obszar mięśnia zebrafish do pomiaru.Następnie z rozwijanego menu analyze wybierz set measurements, aby dobrać wymagane statystyki dla obrazu. Zaznacz pola area mean gray value oraz min and max gray value, aby skonfigurować test zachowania ucieczki wywołanego dotykiem od drugiego do siódmego dnia po zapłodnieniu. Umieść wybrane pokryte ryby pojedynczo w głębokich szalkach Petriego, pracując z jednym embrionem naraz.Umieść rybę w centrum pola widzenia stereomikroskopu wyposażonego w system kamery cyfrowej i rozpocznij sekwencyjne obrazowanie z częstotliwością klatek większą lub równą 30 Hz. Następnie, używając szpilki entomologicznej, dotknij ogona zarodka, aby dostarczyć bodziec sensoryczny, przerywając obrazowanie w momencie, gdy zarodek przestanie pływać lub wypłynie poza pole widzenia. Na koniec przekonwertuj sekwencyjne obrazy na plik wideo lub przeanalizuj poszczególne klatki obrazów z lapse-time.Dwójłomność offline może być wykorzystana jako efektywny nieinwazyjny test pozwalający ocenić stan organizacji włókien miofibrylarnych w żywych embrionach danio pręgowanego; u dzikich typów ryb danio pręgowanego w piątej dobie po zapłodnieniu mięśnie szkieletowe wykazują silną dwójłomność w świetle spolaryzowanym ze względu na uporządkowany układ miofilamentów. W przeciwieństwie do nich, embriony w tym samym wieku, homozygotyczne pod kątem patogennej mutacji w genie dystroglikanu (DAG1), wykazują niejednorodną dwójłomność, co wskazuje na obszary degeneracji mięśni. Taki plamisty wzorzec oraz szybka progresja degeneracji mięśni w trakcie wczesnego rozwoju są zgodne z innymi modelami ryb dystroficznych.Ilościowe określenie dwójłomności pięciu dni po zapłodnieniu u mutantów dystroficznych DAG one wykazuje znaczną redukcję jasności do 27,9 ± 5,3% maksymalnej dwójłomności obserwowanej u ich rodzeństwa typu dzikiego. Redukcja ta jest bardziej dotkliwa niż spadek do 52,4 ± 5,5% zaobserwowany u morfantów myopatycznych mtm one trzy dni po zapłodnieniu. Myopatyczne modele ryb wykazują raczej ogólną redukcję dwójłomności w porównaniu z typem dzikim, ponieważ często występuje dezorganizacja miofibrylarna w głównych mięśniach szkieletowych osiowych, jednak nie ma dowodów na zmiany degeneracyjne. Zachowania ucieczkowe wyzwalane dotykiem mogą posłużyć do wykazania, że modele choroby mięśni szkieletowych u danio przezebranych wykazują defekty lokomocyjne i trudności w pływaniu.Ten pierwszy film przedstawia test zachowania ucieczkowego wywołanego dotykiem u dzikich typów ryb danio prążkowanych. Zwróć uwagę, że w piątej dobie po zapłodnieniu prawidłowo rozwinięte pisklęta odpływają bardzo szybko. W odpowiedzi na dotyk, na tym drugim filmie zarejestrowano zachowanie ucieczkowe wywołane dotykiem u piskląt w pierwszej dobie po zapłodnieniu.Zauważmy, że w piątym dniu po zapłodnieniu embriony mutantów wykazują upośledzoną reakcję na dotyk i nie opuszczają pola widzenia po stymulacji. Następnie przeanalizowano nagrania klatka po klatce, aby potwierdzić, że mutanty DAG one wykazują upośledzony ruch w odpowiedzi na bodźce dotykowe w porównaniu z kontrolną grupą typu dzikiego. Obliczono średnie odległości, jakie oba typy embrionów były w stanie przebyć w ustalonym przedziale czasowym, co wskazuje na obniżoną sprawność motoryczną u mutantów DAG one.Po opanowaniu tych technik można je wykonywać na dużych grupach ryb w krótkim odstępie czasu, co jest kluczowe podczas prowadzenia wysokoprzepustowych przesiewów chemicznych lub mutagennych. Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić bardziej inwazyjne analizy, takie jak immunohistochemia lub mikroskopia elektronowa, aby zbadać defekty mięśni szkieletowych na poziomie molekularnym i strukturalnym.

analysis-skeletal-muscle-defects-larval-zebrafish-birefringence-touch

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Analiza wad mięśni szkieletowych u larw Danio pręgowanego z wykorzystaniem dwójłomności i testów reakcji ucieczki wywołanej dotykiem

Ten film opisuje test reakcji na dotyk, który mierzy reakcję larwy danio pręgowanego na bodźce dotykowe.

Test reakcji ucieczki: metoda badania reakcji larw danio pręgowanego na bodźce dotykowe

Film opisuje unikanie i testowanie metodą thigmotaxis larw danio pręgowanego. Film bada zachowanie larw danio pręgowanego w odpowiedzi na wizualny bodziec awersyjny.

Test unikania danio pręgowanego i thigmotaxsji: wysokoprzepustowa metoda badania zachowania larw w odpowiedzi na awersyjny bodziec wzrokowy

Danio pręgowany to nowy system do modelowania zaburzeń mięśni szkieletowych u ludzi.  Opisujemy szybką i skuteczną metodę izolowania włókien mięśniowych mięśni szkieletowych od embrionalnego i larwalnego danio pręgowanego.  Metoda ta pozwala uzyskać preparat z włókien mięśniowych o dużej gęstości, odpowiedni do badania morfologii pojedynczych włókien mięśni szkieletowych, lokalizacji subkomórkowej białek i fizjologii mięśni.

Analiza embrionalnych i larwalnych włókien mięśniowych szkieletu danio pręgowanego z preparatów zdysocjowanych

Pomiary siły mogą być użyte do pokazania zmian w funkcjonowaniu mięśni spowodowanych rozwojem, kontuzją, chorobą, leczeniem lub toksycznością chemiczną. W tym filmie pokazujemy metodę pomiaru siły podczas maksymalnego skurczu mięśnia tułowia larw danio pręgowanego.

Pomiar siły podczas skurczu w celu oceny funkcji mięśni u larw danio pręgowanego

Prezentujemy metodę analizy elektroretinograficznej (ERG) larw danio pręgowanego z wykorzystaniem technik mikromanipulacji i elektroretinografii. Jest to prosta i nieskomplikowana metoda oznaczania funkcji wzrokowych larw danio pręgowanego in vivo.

Elektroretinogram Analiza odpowiedzi wzrokowej u larw danio pręgowanego

W tym badaniu opisujemy prostą metodę przeprowadzania analizy Evans Blue Dye (EBD) na larwach danio pręgowanego.  Technika ta jest potężnym narzędziem do charakteryzowania integralności mięśni szkieletowych i wyznaczania modeli dystrofii mięśniowej danio pręgowanego, a także jest cenną metodą opracowywania nowych metod terapeutycznych.

Analiza integralności mięśni szkieletowych larw danio pręgowanego za pomocą niebieskiego barwnika Evansa

Danio pręgowany to doskonały model do badania funkcji mięśni i chorób. Podczas wczesnej embriogenezy danio pręgowany rozpoczyna regularne skurcze mięśni, powodując rytmiczne zachowanie podczas pływania, które zmienia się, gdy mięsień jest zakłócony. W tym miejscu opisujemy reakcję wywołaną dotykiem i test lokomocji, aby zbadać wydajność pływania jako miarę funkcji mięśni.

Wykorzystanie reakcji wywołanej dotykiem i testów lokomocji do oceny wydajności i funkcji mięśni u danio pręgowanego

Tutaj prezentujemy protokół rozwoju i charakterystyki epilepsji u danio pręgowanego, wynikającej z przejściowego zahamowania genu DEPDC5.

Analiza behawioralna i fizjologiczna w modelu padaczki danio pręgowanego

Regeneracja mięśni szkieletowych jest napędzana przez komórki macierzyste mięśni rezydujące w tkankach, które są upośledzone w wielu chorobach mięśni, takich jak dystrofia mięśniowa, co skutkuje niezdolnością mięśni do regeneracji. W tym miejscu opisujemy protokół, który pozwala na badanie regeneracji mięśni w modelach choroby mięśni danio pręgowanego.

Badanie regeneracji mięśni w modelach chorób mięśni danio pręgowanego

Przedstawiono nową, wszechstronną metodę obserwacji mikrokrążenia. Jest ona uważana za odpowiednią do długotrwałej obserwacji oraz do łączenia z interwencjami farmakofizjologicznymi lub biologii molekularnej.

Pomiar mikrokrążenia in vivo w mięśniach szkieletowych za pomocą mikroskopii intravitalnej

Poznaj nieinwazyjne metody oceny organizacji mięśniowej u larw Danio rerio za pomocą testów dwójłomności i reakcji ucieczki. Techniki te umożliwiają szybką analizę wad mięśni szkieletowych w modelu zebrafish.

Analiza wad mięśni szkieletowych u larw danio pręgowanego za pomocą testów dwójłomności i reakcji ucieczki wywołanej dotykiem

Przeglądaj więcej filmów