Rozciąganie w komórkach śródbłonka mikronaczyniowego mózgu (cEND) jako model in vitro urazowego uszkodzenia mózgu bariery krew-mózg

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zademonstrowanie wykorzystania urazu rozciągającego jako modelu urazowego uszkodzenia mózgu. Jest to realizowane poprzez uprzednie hodowanie mikro naczyniowych komórek śródbłonka w studzienkach z elastycznym dnem. Drugim krokiem jest różnicowanie komórek poprzez redukcję zawartości płodowego surowicy cielęcej w pożywce hodowlanej.

Następnie komórki poddaje się uszkodzeniu przy użyciu urządzenia do rozciągania komórek. Ostatnim krokiem jest ocena stopnia uszkodzenia komórek. W rezultacie indukowane rozciąganiem uszkodzenie komórek śródbłonka mózgu służy do wykazania uszkodzenia bariery krew-mózg in vitro.

Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię urazowych obrażeń mózgu, ponieważ modeluje ona rzeczywisty wpływ, jaki podczas TBI wywiera się na barierę krew-mózg, wykorzystując uraz rozciągający morskich komórek śródbłonka mózgu. Procedurę zaprezentuje dr Elaine Salvador, postdoc z mojego laboratorium. Rozpocznij tę procedurę od hodowli morskich komórek śródbłonka mikronaczyniowego mózgu w kolbie hodowlanej T 75.

Wymieniaj pożywkę dwa razy w tygodniu aż do osiągnięcia konfluencji. Następnie przemyj komórki PBS. Po tym odessij PBS i trypsynę.

Zneutralizuj komórki za pomocą dwóch mililitrów ciepłego roztworu trypsyny EDTA. Inkubuj komórki w temperaturze 37 °C przez pięć minut lub do momentu rozproszenia warstwy komórkowej. Następnie dodaj do komórek osiem mililitrów pożywki hodowlanej i kilkakrotnie opukaj kolbę, aby odłączyć komórki.

Obejrzyj komórki pod mikroskopem, aby upewnić się, że całkowicie oddzieliły się od kolby. Następnie pipetuj medium z oddzielonymi komórkami w górę i w dół. Po tym zabiegu zakręć kolbą, aby wymieszać zawiesinę komórkową.

Nanieś 20 µL zawiesiny komórkowej do hemocytometru i odlicz liczbę komórek. Wyznacz gęstość komórek, aby uzyskać 20 000 komórek na centymetr kwadratowy w studzience. Następnie przenieś zawiesinę komórkową do kolagenu.

Przygotowano sześć sześciodołkowych płytek hodowlanych z elastycznym dnem, z całkowitą objętością 3 mL na dołek. Pożywkę hodowlaną wymieniano dwa razy w tygodniu, a komórki hodowano w temperaturze 37 °C przez jeden tydzień, aż do uzyskania pełnej konfluencji.

W celu dyferencjacji komórek należy wymienić pożywkę hodowlaną na pożywkę do dyferencjacji i inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 24 godziny. W tej procedurze włącz urządzenie do kontroli uszkodzeń komórek i ustaw opóźnienie na 50 ms. Następnie ustaw ciśnienie regulatora na 15 PSI i naciśnij spust kilka razy, aż zarejestrowane ciśnienie szczytowe stanie się stabilne.

Następnie ustaw ciśnienie regulatora na żądaną wartość. Po tym czasie umieść płytkę hodowlaną z sześcioma studniami i elastycznym dnem w uchwycie tacy. Upewnij się, że selektor studni jest ustawiony na odpowiednią wielkość studni.

Następnie mocno nasuń wtyczkę adaptera na, dobrze, przytrzymaj wtyczkę pewnie jedną ręką, a drugą naciśnij spust, a następnie zapisz wygenerowane ciśnienie szczytowe. Niezwłocznie umieść płytkę z powrotem w inkubatorze w temperaturze 37 °C na wymagany czas lub użyj jej natychmiast w kolejnych eksperymentach bądź analizie w celu oceny urazu rozciągnięcia za pomocą testu poboru DI. Bezpośrednio po rozciągnięciu komórek dodaj do pożywki hodowlanej komórek 30 µL barwnika żywotności w stężeniu 1 mg/mL, który służy jako marker cytotoksyczności.

W celu oceny urazu rozciągającego poprzez uwalnianie dehydrogenazy mleczanowej. Po rozciągnięciu należy natychmiast usunąć 200 µL pożywki hodowlanej z dołka; tę samą procedurę należy powtórzyć dla każdego punktu czasowego po urazie, który ma zostać uwzględniony w badaniu uwalniania LDH. Następnie pożywkę hodowlaną należy wirować przez pięć minut przy najwyższych obrotach mikrocentryfugi.

Aby usunąć resztki komórkowe, należy odlać supernatant i wykorzystać go w kolejnych etapach. Po pobraniu niezbędnych próbek z różnych punktów czasowych należy zlizować komórki, używając roztworu lizującego dołączonego do zestawu testowego LDH. Następnie do każdego dołka płytki 96-dołkowej z zestawu należy dodać 100 µL medium testowego dołączonego do zestawu.

Następnie należy dodać 100 µL bezkomórkowego pożywki do hodowli komórkowej do dwóch równoległych dołków płytki 96-dołkowej, inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 30 minut, a następnie odczytać absorbancję przy 492 nm. Przedstawione tutaj badanie za pomocą mikroskopii świetlnej pokazuje komórki prawidłowe w porównaniu z komórkami uszkodzonymi.

Normalna, nierozciągnięta konfluenta warstwa pojedyncza komórek jest gęsto upakowana; gdy komórki są rozciągane poprzez przyłożenie szczytowego impulsu ciśnienia od 1,8 do 2,0 PSI, wydają się mniej zwarte. Przy umiarkowanym uszkodzeniu komórek impulsem ciśnienia szczytowego od 2,5 do 3,0, niektóre z nich wydają się obrzęknięte i zdeformowane. Przy silnym rozciągnięciu wynoszącym od 3,5 do 4,5 PSI komórki ulegają skurczeniu.

Poniżej przedstawiono badanie mikroskopowe z użyciem fluorescencji w porównaniu komórek prawidłowych i uszkodzonych. Komórki poddano barwieniu na żywotność dwie godziny po uszkodzeniu. Są to komórki kontrolne nierozciągnięte, komórki umiarkowanie rozciągnięte oraz komórki silnie rozciągnięte.

Rycina ta przedstawia uwalnianie enzymu LDH do medium po urazie wywołanym rozciąganiem. Poziom LDH uwolnionego do medium hodowlanego mierzono w różnych odstępach czasu po urazie indukowanym rozciąganiem, a wyniki wyrażono jako procent całkowitego uwalnianego LDH z komórek poddanych niskiemu i umiarkowanemu rozciąganiu. Nie stwierdzono istotnych różnic w porównaniu z kontrolą nierozciąganą oraz pomiędzy grupami.

Komórki poddane silnemu rozciąganiu uwolniły znacznie większą ilość LDH w porównaniu do wszystkich pozostałych próbek, z wyjątkiem próbki poddanej umiarkowanemu rozciąganiu po upływie jednej godziny od jego zastosowania. Technika ta utorowała drogę badaczom z dziedziny neurobiologii do analizy urazowych obrażeń mózgu w komórkach śródbłonka mózgu organizmów morskich in vitro.