Name: Rozciąganie w komórkach śródbłonka mikronaczyniowego mózgu (cEND) jako model in vitro urazowego uszkodzenia mózgu bariery krew-mózg (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-26T23:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 19 s
Description: Poznaj model in vitro urazowego uszkodzenia mózgu wykorzystujący rozciąganie komórek śródbłonka mikronaczyniowego mózgu. Ta metoda pozwala badać mechanizmy uszkodzenia bariery krew-mózg.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badania były wspierane przez Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Niemiecką Fundację Badawczą) w ramach grantu nr FO 315/4- oraz Siódmy Program Ramowy Unii Europejskiej (FP7/2007-2013) na podstawie umowy o grant nr. ZDROWIE-F2-2009- 241778 do mukowiscydozy.

1. Umieszczanie komórek śródbłonka w płytkach studzienkowych
<ol>
	<li>Hoduj mysie komórki mikronaczyniowe śródbłonka mózgu (cEND) w kolbie hodowlanej T75, zmieniając pożywkę (DMEM zawierającą 10% FCS, 50 U/ml penicyliny/streptomycyny, 1% L-glutaminy) dwa razy w tygodniu, aż do osiągnięcia konfluencji. (Aby uzyskać informacje na temat generowania i unieśmiertelniania komórek śródbłonka mikronaczyniowego mózgu, patrz Burek et al., 2012; Förster i wsp., 200521,19).</li>
	<li>Umyj komórki solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS). Usunąć PBS i trypsynizować komórki 2 ml ciepłego roztworu trypsyny-EDTA.</li>
	<li>Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 5 minut lub do momentu rozproszenia warstwy komórkowej.</li>
	<li>Dodać 8 ml pożywki hodowlanej do komórek. Stuknij w kolbę kilka razy, aby odłączyć komórki.</li>
	<li>Zobacz komórki pod mikroskopem, aby zapewnić całkowite oderwanie od kolby.</li>
	<li>Pipetować podłoże z odłączonymi komórkami w górę iw dół. Zakręcić kolbą, aby wymieszać zawiesinę komórek.</li>
	<li>Weź 20 μl zawiesiny komórek, umieść w hemocytometrze i policz liczbę komórek.</li>
	<li>Określ gęstość komórek i zasiej 20 000 komórek/cm2 do studzienki.</li>
	<li>Przenieś zawiesinę komórkową do wstępnie pokrytych 6-dołkowych płytek hodowlanych z elastycznym dnem kolagenu1 (57,75 cm2) w całkowitej objętości 3 ml / basenik. Każda studzienka ma powierzchnię 9,62 cm2.</li>
	<li>Hodować komórki w temperaturze 37 °C przez jeden tydzień, aż do zlewania się. Zmieniaj pożywkę hodowlaną dwa razy w tygodniu.</li>
</ol>
2. Różnicowanie komórek przed urazem wywołanym rozciąganiem
<ol>
	<li>Zmienić pożywkę hodowlaną komórek za pomocą pożywki różnicującej (DMEM zawierający 1% surowicy płodu cielęcego pozbawionej surowicy (ssFCS), 50 j./ml penicyliny/streptomycyny).</li>
	<li>Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 24 godziny.</li>
</ol>
3. Uszkodzenie komórek śródbłonka wywołane rozciąganiem
<ol>
	<li>Włącz urządzenie kontrolujące obrażenia komórek.</li>
	<li>Ustaw opóźnienie na 50 ms.</li>
	<li>Ustaw ciśnienie regulatora na 15 psi i naciśnij spust kilka razy, aż zarejestrowane ciśnienie szczytowe ustabilizuje się.</li>
	<li>Ustaw ciśnienie regulatora na żądaną wartość. Użyj tabeli 1 jako przewodnika do generowania różnych stopni urazu rozciągającego.</li>
	<li>Umieść 6-dołkową płytkę hodowlaną z elastycznym dnem (57.75 cm2) w uchwycie tacy. Upewnij się, że selektor studni jest ustawiony na prawidłowy rozmiar studzienki (tj. dużą studzienkę).</li>
	<li>Umieść wtyczkę adaptera mocno nad studnią. Jedną ręką mocno przytrzymaj wtyczkę, podczas gdy druga ręka naciska spust.</li>
	<li>Zapisz wygenerowane ciśnienie szczytowe.</li>
	<li>Natychmiast umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze w temperaturze 37 °C na żądany okres czasu lub natychmiast użyć do przeprowadzenia kolejnych doświadczeń lub oceny.</li>
</ol>
4. Ocena uszkodzenia rozciągającego za pomocą testu absorpcji barwnika
<ol>
	<li>Natychmiast po rozciągnięciu komórek (etap 3.7) dodać 30 μl roztworu 1 mg/ml barwienia żywotności, który działa jako marker cytotoksyczności (patrz dodatkowa tabela materiałów i wyposażenia) do pożywki do hodowli komórkowej (Uwaga: należy użyć 10 μl roztworu barwnika na każdy ml pożywki do hodowli komórkowych).</li>
	<li>Po dodaniu barwnika do komórek, natychmiast obejrzyj pod mikroskopem fluorescencyjnym.</li>
</ol>
5. Ocena uszkodzenia rozciągającego przez uwalnianie dehydrogenazy mleczanowej (LDH)
<ol>
	<li>Natychmiast po rozciągnięciu komórek (krok 3.7) należy usunąć 200 μl pożywki do hodowli komórkowych z dołka. Zrób to samo dla każdego punktu czasowego po urazie, który chciałbyś uwzględnić w swoim dochodzeniu w sprawie uwolnienia LDH (np. 30 minut, 1 godzina, 2 godziny itp.)</li>
	<li>Odwirować pożywkę do hodowli komórkowych na najwyższym ustawieniu mikrowirówki przez 5 minut, aby usunąć wszelkie resztki komórek. Usuń supernatant i użyj go w kolejnych krokach.</li>
	<li>Po wykonaniu kroku 5.1 i pobraniu niezbędnych próbek, które chciałbyś mieć, z różnych punktów czasowych, które chcesz zbadać, poddaj komórki lizie za pomocą roztworu do lizy zawartego w zestawie do oznaczania LDH (patrz dodatkowa tabela materiałów i sprzętu).</li>
	<li>Umieścić 100 μl pożywki do oznaczania zawartej w zestawie do oznaczania do każdej studzienki na 96-dołkowej płytce dostarczonej w zestawie.</li>
	<li>Umieścić 100 μl bezkomórkowej pożywki do hodowli komórkowych w dwóch równoległych dołkach 96-dołkowej płytki dołączonej do zestawu do oznaczania.</li>
	<li>Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 30 minut.</li>
	<li>Odczytać absorbancję przy 492 nm.</li>
</ol>

<ol><li>Hyder, A. A., Wunderlich, C. A., Puvanachandra, P., Gururaj, G., Kobusingye, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+traumatic+brain+injuries%3A+a+global+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22NeuroRehabilitation%22%5BJournal%5D)">The impact of traumatic brain injuries: a global perspective.</a> NeuroRehabilitation. 22 (5), 341-353 (2007).</li>
<li>Morrison, B. III, Saatman, K. E., Meaney, D. F., McIntosh, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+centralnervoussystemmodels+of+mechanicallyinducedtrauma%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">In vitro centralnervoussystemmodels of mechanicallyinducedtrauma: a review.</a> J. Neurotrauma. 15 (11), 911-928 (1998).</li>
<li>Albert-Weissenberger, C., Sirén, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Transl.+Stroke+Med%22%5BJournal%5D)">Experimental traumatic brain injury.</a> Exp. Transl. Stroke Med. 2 (16), 1-8 (2010).</li>
<li>Morrison, B., Elkin, B., Dollé, J. P., Yarmush, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+models+of+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">In vitro models of traumatic brain injury.</a> Annu. Rev. Biomed. Eng. 13, 91-126 (2011).</li>
<li>Cargill, R. S., Thibault, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+alterations+in+%5BCa2%2B%5Di+in+NG108-15+cells+subjected+to+high+strain+rate+deformation+and+chemical+hypoxia%3A+an+in+vitro+model+for+neural+trauma%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Acute alterations in [Ca2+]i in NG108-15 cells subjected to high strain rate deformation and chemical hypoxia: an in vitro model for neural trauma.</a> J. Neurotrauma. 13 (7), 395-407 (1996).</li>
<li>Geddes-Klein, D., Schiffman, K., Meaney, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+and+Consequences+of+neuronal+stretch+injury+in+vitro+differ+with+the+model+of+trauma%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Mechanisms and Consequences of neuronal stretch injury in vitro differ with the model of trauma.</a> J. Neurotrauma. 23 (2), 93-204 (2006).</li>
<li>Ellis, E. F., McKinney, J. S., Willoughby, K. A., Liang, S., Povlischock, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+model+for+rapid+stretch-induced+injury+of+cells+in+culture%3A+characterization+of+the+model+using+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">A new model for rapid stretch-induced injury of cells in culture: characterization of the model using astrocytes.</a> J. Neurotrauma. 12 (3), 325-339 (1995).</li>
<li>McKinney, J. S., Willoughby, K. A., Liang, S., Ellis, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stretch-induced+injury+of+cultured+neuronal%2C+glial+and+endothelia+cells+%28Effect+of+polyethylene+glycol-conjugated+superoxide+dismutase%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Stretch-induced injury of cultured neuronal, glial and endothelia cells (Effect of polyethylene glycol-conjugated superoxide dismutase.</a> Stroke. 27 (5), 934-940 (1996).</li>
<li>Wanner, I. B., Deik, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+in+vitro+model+of+the+glialscarinhibitsaxongrowth%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">A new in vitro model of the glialscarinhibitsaxongrowth.</a> Glia. 56 (15), 1691-16709 (2008).</li>
<li>Wanner, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+In+Vitro+Trauma+Model+to+Study+Rodent+and+Human+Astrocyte+Reactivity%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">An In Vitro Trauma Model to Study Rodent and Human Astrocyte Reactivity.</a> Methods Mol. Biol. 814, 189-219 (2012).</li>
<li>Berrout, J., Jin, M., O'Neil, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+role+of+TRPP2+and+TRPC1+channels+in+stretch-induced+injury+of+blood-brain+barrier+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Critical role of TRPP2 and TRPC1 channels in stretch-induced injury of blood-brain barrier endothelial cells.</a> Brain Res. 1436, 1-12 (2011).</li>
<li>Weber, J. T., Rzigalinski, B. A., Willoughby, K. A., Moore, S. F., Ellis, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+in+calcium-mediated+signal+transduction+after+traumatic+brain+injury+of+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Alterations in calcium-mediated signal transduction after traumatic brain injury of cortical neurons.</a> Cell Calcium. 26, 289-299 (1999).</li>
<li>Zhang, L., Rzigalinski, B. A., Ellis, E. F., Satin, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduction+of+voltage-dependent+Mg2%2B+blockade+of+NMDA+current+in+mechanically+injured+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reduction of voltage-dependent Mg2+ blockade of NMDA current in mechanically injured neurons.</a> Science. 274, 1921-1923 (1996).</li>
<li>Gidday, J. M., Beetsch, J. W., Park, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+glutathione+protects+cerebral+endothelial+cells+from+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Endogenous glutathione protects cerebral endothelial cells from traumatic brain injury.</a> J. Neurotrauma. 16 (1), 27-36 (1999).</li>
<li>Gumbleton, M., Audus, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+and+limitations+in+the+use+of+in+vitro+cell+cultures+to+serve+as+permeability+screen+for+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharm.+Sci%22%5BJournal%5D)">Progress and limitations in the use of in vitro cell cultures to serve as permeability screen for the blood-brain barrier.</a> J. Pharm. Sci. 90, 1681-1698 (2001).</li>
<li>Omidi, Y., Campbell, L., Barar, J., Connell, D., Akhtar, S., Gumbleton, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+immortalised+mouse+brain+capillary+endothelial+cell+line%2C+b.End3%2C+as+an+in+vitro+blood-brain+barrier+model+for+drug+uptake+and+transport+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the immortalised mouse brain capillary endothelial cell line, b.End3, as an in vitro blood-brain barrier model for drug uptake and transport studies.</a> Brain Res. 990 (1-2), 95-112 (2003).</li>
<li>Montesano, R., Pepper, M. S., Mohle-Steinlein, U., Risau, W., Wangner, E. F., Orci, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Icreased+proteolytic+activity+is+responsible+for+the+aberrant+morphogenetic+behaviour+of+endothelial+cells+expressing+the+middle+T+oncogene%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Icreased proteolytic activity is responsible for the aberrant morphogenetic behaviour of endothelial cells expressing the middle T oncogene.</a> Cell. 62, 435-445 (1990).</li>
<li>RayChaudhury, A., Frazier, W., D'Amore, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+normal+and+tumorigenic+endothelial+cells%3A+differences+in+thrombospondin+production+and+responses+to+transforming+growth+factor-beta%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Comparison of normal and tumorigenic endothelial cells: differences in thrombospondin production and responses to transforming growth factor-beta.</a> J. Cell Sci. 107, 39-46 (1994).</li>
<li>Förster, C., Silwedel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Occludin+as+direct+target+for+glucocorticoid-induced+improvement+of+blood-brain+barrier+properties+in+a+murine+in+vitro+system%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Occludin as direct target for glucocorticoid-induced improvement of blood-brain barrier properties in a murine in vitro system.</a> J. Physiol. 565 (Pt 2), 475-486 (2005).</li>
<li>Rubin, L. L., Hall, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cell+culturemodel+of+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A cell culturemodel of the blood-brain barrier.</a> J. Cell Biol. 115 (6), 1725-1735 (1991).</li>
<li>Burek, N. M., Salvador, E., Förster, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+an+immortalized+murine+brain+microvascular+endothelial+cell+line+as+an+in+vitro+blood+brain+barrier+model%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Generation of an immortalized murine brain microvascular endothelial cell line as an in vitro blood brain barrier model.</a> J. Vis. Exp. (66), (2011).</li>
<li>Weber, J. T., Rzigalinski, B. A., Gabler, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+in+calcium-mediated+signal+transduction+after+traumatic+injury+of+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Alterations in calcium-mediated signal transduction after traumatic injury of cortical neurons.</a> Cell Calcium. 26, 289-299 (1999).</li>
<li>Shlosberg, D., Benifla, M., Kaufer, D., Friedman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+brain+barrier+breakdown+as+a+therapeutic+target+in+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Blood brain barrier breakdown as a therapeutic target in traumatic brain injury.</a> Nat. Rev. Neurol. 6, 393-403 (2010).</li>
<li>Thal, S. C., Schaible, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+proteasomal+glucocorticoid+receptor+degradation+restores+dexamethasone-mediated+stabilization+of+the+blood-brain+barrier+after+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Crit.+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Inhibition of proteasomal glucocorticoid receptor degradation restores dexamethasone-mediated stabilization of the blood-brain barrier after traumatic brain injury.</a> Crit. Care Med. , (2013).</li>
<li>Werner, C., Engelhard, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiology+of+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Anaesth%22%5BJournal%5D)">Pathophysiology of traumatic brain injury.</a> Br. J. Anaesth. 99 (1), 4-9 (2007).</li>
<li>Tanno, H., Nockels, R. P., Pitts, L. H., Noble, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breakdown+of+the+blood-brain+barrier+after+fluid+percussion+brain+injury+in+the+rat%3A+Part+2%3A+Effect+of+hypoxia+on+permeability+to+plasma+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Breakdown of the blood-brain barrier after fluid percussion brain injury in the rat: Part 2: Effect of hypoxia on permeability to plasma proteins.</a> J. Neurotrauma. 9 (4), 335-347 (1992).</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Skutki urazów mechanicznych in vitro badano i opracowano metody dla astrocytów, neuronów, komórek glejowych i komórek śródbłonka aorty8, 9, 22. Jednak do tej pory nie jest znany model in vitro uszkodzenia rozciągającego w hodowanych komórkach śródbłonka mózgu. Komórkowe modele traumy zapewniają cenne korzyści w porównaniu z modelami zwierzęcymi, ponieważ środowisko mechaniczne komórek może być precyzyjnie kontrolowane6. W związku z tym model in vitro dla traumy spowodowanej urazem rozciągającym przy użyciu hodowanych komórek śródbłonka mózgu, które działają jako model bariery krew-mózg (BBB), taki jak to, co przedstawia nasz protokół, może okazać się przydatny.
Protokół ten wykorzystuje komórki cEND, uznany model BBB w naszym laboratorium. Ponieważ rozpad BBB jest często udokumentowany u pacjentów z TBI, a TBI jest często związany z zaburzeniem BBB, co może prowadzić do powstania obrzęku23, 24, przedstawiona tutaj metoda może być specjalnie stosowana w prowadzeniu badań BBB w odniesieniu do TBI.
W tym modelu ważne jest, aby zwrócić uwagę na stopień uszkodzenia rozciągającego komórki. O ile komórki są uszkodzone w każdym przypadku i przy jakiejkolwiek wielkości nacisku, stopień uszkodzenia, który może wpływać na komórki śródbłonka, różni się znacznie od innych typów komórek. Komórki śródbłonka aorty są bardziej odporne na uszkodzenia rozciągające niż astrocyty lub mieszane komórki glejowe9. Ponadto naprawiają się szybciej po urazie w porównaniu z innymi typami komórek. Dlatego w przypadku komórek śródbłonka mózgu, szczególnie komórek cEND, potrzebna jest większa ilość uszkodzeń rozciągających, aby wywołać wysoki stopień uszkodzenia. Pożądany stopień urazu można osiągnąć poprzez zastosowanie odpowiedniego ciśnienia wskazanego w tabeli 1. Jednak w przypadku komórek cEND preferowane są poważne uszkodzenia ze względu na ich odporność na obciążenie. Przeprowadzone testy LDH wykazały, że wraz ze wzrostem stopnia rozciągliwości więcej LDH jest wydzielane do supernatantu. W przeciwieństwie do tego, komórki, które otrzymały niewielką ilość uszkodzeń rozciągających, wytwarzały LDH w ilości podobnej do komórek kontrolnych. Jak wspomniano w protokole, należy zadbać o to, aby używana była odpowiednia ilość medium, ponieważ zwiększenie lub zmniejszenie ilości medium może skutkować różnicami w szczytowym ciśnieniu przyłożonym do odwiertów. Na przykład studzienka zawierająca 5 ml płynu rejestruje szczytowe ciśnienie średnio 4,0 psi, podczas gdy pusta studzienka rejestruje średnio 3,8 psi po zastosowaniu ciśnienia 45 psi. Dlatego najlepiej jest kilkakrotnie nacisnąć spust nad studzienką kontrolną, aby upewnić się, że ciśnienie szczytowe, które zostanie wygenerowane, odpowiada pożądanej wartości.
W naszych eksperymentach użyliśmy barwienia żywotności, aby określić wpływ rozciągliwości na przepuszczalność błony komórkowej. Optyka zastosowanych przez nas płytek hodowlanych z elastycznym dnem umożliwia nam oglądanie barwionych komórek bezpośrednio pod mikroskopem. Jednak w przypadku chęci przeprowadzenia badań immunoznakowania bezpośrednio po urazie rozciągającym mogą pojawić się trudności. Po pierwsze, rozmiar i grubość płytki może stanowić problem w przypadku niektórych platform do oglądania mikroskopów. Po drugie, optyka elastycznej membrany studni może być przeszkodą w wyraźnym widzeniu.
Pomimo powyższych ograniczeń, opisana procedura może być jednak wykorzystana jako model mechanicznego uszkodzenia układu krew-mózg in vitro . Urazowe uszkodzenie mózgu (TBI) obejmuje dwa elementy, a mianowicie niedokrwienie i uraz. Niedokrwienie może wystąpić jako wtórny uraz po TBI w przypadkach, gdy dochodzi do poważnej utraty krwi skutkującej niskim ciśnieniem krwi lub w wyniku obrzęku mózgu ograniczającego dopływ tlenu do mózgu. Za uszkodzenie uważa się opóźnione, niemechaniczne stanowiące następujące po sobie procesy patologiczne zainicjowane w momencie urazu25. Występowanie niedotlenienia po ciężkim urazowym uszkodzeniu mózgu jest powszechne26. Deprywacja glukozy w tlenie (OGD) jest metodą stosowaną obecnie do modelowania niedokrwienia in vitro. Tak więc poddawanie komórek działaniu OGD jako wtórnego uszkodzenia komórek po rozciągnięciu może naśladować występowanie TBI, po którym następuje niedokrwienie. W związku z tym, aby ulepszyć nasz obecny model TBI in vitro i jak najbardziej zbliżyć go do rzeczywistego TBI, tak jak występuje in vivo, w przyszłości będziemy również stosować OGD w połączeniu z uszkodzeniem rozciągającym.

Urazowe uszkodzenie mózgu (TBI) jest jedną z głównych przyczyn zgonów na całym świecie. Około 10 milionów ludzi rocznie cierpi na TBI, co sprawia, że jest to poważny problem zdrowotny i medyczny1. Z tego powodu stworzono i opracowano różne modele TBI in vivo i in vitro w celu zbadania jego mechanizmów2,3,4. Lepsze zrozumienie TBI może pomóc w poprawie leczenia pacjentów i zmniejszeniu związanej z tym śmiertelności, zachorowalności i kosztów.
Istnieje wiele modeli uszkodzeń mózgu, które wykorzystują zarówno metody in vivo, jak i in vitro. Modele in vivo mogą naśladować rzeczywiste zdarzenie urazu głowy. Jednak ze względu na złożoność sytuacji in vivo dostęp do tkanki będącej przedmiotem zainteresowania staje się ograniczony2. Aby zrozumieć fizjologiczną reakcję poszczególnych komórek w wyniku zadanego urazu, ważne jest, aby komórki były odizolowane od skutków ogólnoustrojowych, które mogą hamować lub zmieniać ich indywidualną odpowiedź5. Z tego powodu komórkowe modele traumy zapewniają cenne korzyści w porównaniu z modelami zwierzęcymi, ponieważ środowisko mechaniczne komórek może być precyzyjnie kontrolowane6.
Opracowano systemy in vitro, które wykorzystują mechaniczne obciążenie komórek lub tkanek do określenia zmian wywołanych przez taką metodę uszkodzenia. Na przykład ustalono metodę badania wpływu mechanicznego uszkodzenia komórek na astrocyty, neurony, komórki glejowe i komórki śródbłonka aorty7,8,9. Model urazowy in vitro stworzony do badania reaktywności astrocytów u gryzoni i ludzi10 wykorzystywał urządzenie do kontroli ciśnienia identyczne z tym, którego używamy w naszym modelu. Tę samą metodę zastosowano do wywołania urazu poprzez rozciągnięcie komórek śródbłonka mikronaczyń mózgowych myszy (bEnd3)11 i neuronów korowych12,13, a także komórek śródbłonka mózgu nowonarodzonych prosiąt14. Urządzenie dobrze deformuje dno hodowli, powodując w ten sposób mechaniczne uszkodzenie rozciągnięcia10. Powoduje uszkodzenie hodowanych komórek poprzez zastosowanie ciśnienia powietrza nad komórkami. Ciśnienie to może odchylić błonę, na której rosną komórki, rozciągając w ten sposób komórki. Różne stopnie rozciągnięcia (tj. "niskie", "umiarkowane" lub "ciężkie") można osiągnąć, odpowiednio ustawiając czas trwania i intensywność impulsu ciśnienia powietrza. Ta metoda urazu wywołanego rozciąganiem została skorelowana z urazem urazowym in vivo7. Co więcej, ta metoda uszkodzenia pozwala na precyzyjną kontrolę środowiska zewnątrzkomórkowego i może być łatwo rozmnażana.
Chociaż podobne podejście zostało użyte dla wielu innych typów komórek mózgowych, w tym bEnd3, nasz model ma tę zaletę, że wykorzystuje mysie komórki mikronaczyniowe śródbłonka mózgu (cEND) wygenerowane w naszym laboratorium. Ta linia komórkowa jest dobrze dopasowanym modelem bariery krew-mózg (BBB). Hodowle komórkowe in vitro stosowane jako modele BBB powinny posiadać cechy, które umożliwią im wykorzystanie ich jako badania przesiewowego przepuszczalności. Jednym z ważnych kryteriów, aby model komórkowy in vitro był predyktorem przepuszczalności BBB, jest to, że powinien on posiadać fizjologicznie realistyczną architekturę komórkową15. Mimo że komórki bEnd3 wykazują charakterystyczną wrzecionowatą morfologię płaskonabłonkową w hodowli16, wykazują nieregularne zachowanie morfogenetyczne in vitro, w wyniku którego tworzą jamy przypominające torbiele, a nie regularne struktury rurkowe w żelach fibrynowych17. Co więcej, kiedy komórki zostały wstrzyknięte embrionalnym i nowonarodzonym myszom, wywołały szybko rosnące guzy, śmiertelne dla myszy embrionalnych, ale nie u nowonarodzonych i młodych myszy. Sugeruje się zatem, że jeden lub więcej procesów regulujących normalny wzrost, migrację i różnicowanie śródbłonka zostało zmienionych lub wyeliminowanych w tej linii komórkowej18. Z drugiej strony, morfologiczna, immunocytochemiczna ocena ekspresji śródbłonka i markerów BBB, pomiary strumienia bioelektrycznego i parakomórkowego pokazują, że nasz model BBB cEND jest rzeczywiście odpowiednim modelem BBB19.
Śródbłonek mózgu in vivo charakteryzuje się niezwykle szczelną przepuszczalnością z trans-śródbłonkowym oporem elektrycznym (TEER) w zakresie od 2,000-5,000 Ωcm2. W badaniach właściwości bariery mikrokrążeniowej mózgu wobec farmaceutyków należy wziąć pod uwagę restrykcyjność i szczelność komórek parakomórkowych. W większości komórek śródbłonka naczyń włosowatych mózgu (BCEC) nie jest to zachowane, ponieważ komórki wykazują TEER w zakresie od 50-100 Ωcm2 20. Unieśmiertelniona linia komórkowa śródbłonka mózgu bEnd3 generuje wartości TEER nie większe niż 60 Ωcm2 15. Natomiast różnicowanie komórek cEND z pożywką zawierającą obniżoną surowicę wykazuje wartości TEER w zakresie 300-500 Ωcm2 19,21.
Do tej pory, modele in vitro uszkodzeń spowodowanych rozciąganiem w hodowanych komórkach śródbłonka mózgu są rzadkie. W związku z tym przydatny może okazać się model in vitro dla urazu spowodowanego rozciągnięciem przy użyciu hodowanych komórek śródbłonka mózgu, które działają jako model bariery krew-mózg. W tym protokole przedstawiamy model in vitro, który może naśladować rzeczywisty wpływ, jaki komórki mózgowe, w szczególności komórki śródbłonka mikronaczyniowego mózgu BBB, otrzymują podczas TBI. Główną zaletą tego modelu jest to, że ilość uszkodzeń zastosowanych w komórkach, jak również w środowisku zewnątrzkomórkowym, może być łatwo kontrolowana w precyzyjny sposób, co umożliwia łatwą odtwarzalność zestawu eksperymentalnego.

<table><tbody><tr><td>Kontroler uszkodzeń komórek II</td><td>Niestandardowy projekt i produkcja, Wirginia, USA&</td><td></td><td>nbsp;</td></tr><tr><td>Płytka hodowlana Bioflex - Kolagen typu I</td><td>Flexcell, Dunn Labortechnik</td><td>BF - 3001C</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Dulbecco' s zmodyfikowany Orzeł" s średni (DMEM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5796</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Surowica cielęca płodu (FCS)</td><td>PAA Laboratories</td><td>A15110-1333</td><td>stężenie końcowe 10%, inaktywowana termicznie (30 min w 56 & stopni; C)</td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Biochrom AG</td><td>K0282</td><td>Przechowywanie: &le; -15 &deg; C</td></tr><tr><td>MEM Vitamin</td><td>Biochrom AG</td><td>K0373</td><td>Przechowywanie: &le; -15 &deg; C</td></tr><tr><td>Na-pirogronian</td><td>Biochrom AG</td><td>L0473</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Aminokwasy endogenne (NEA)</td><td>Biochrom AG</td><td>K0293</td><td>Przechowywanie w temperaturze 4 & st.; C</td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>Biochrom AG</td><td>A2212</td><td>Przechowywanie: &le; -15 &deg; C</td></tr><tr><td>Surowica cielęca płodu, pozbawiona węgla (ssFCS)</td><td>Life Technologies</td><td>12676-011</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Roztwór trypsyny-EDTA</td><td>PAA Laboratories</td><td>L11-004</td><td>Przechowywanie: &le; -15 &deg; C</td></tr><tr><td>Image-iT DEAD Green</td><td>Life Technologies</td><td>I10291</td><td>Przechowywanie: &le; -15 &deg; C, chroniony przed światłem</td></tr><tr><td>Zestaw do wykrywania cytotoksyczności PLUS (LDH)&nbsp;</td><td>Roche</td><td>4744926001</td><td>Przechowywanie: &le; -15 &deg; Z</td></tr></tbody></table>

rozciąganie w komórkach śródbłonka mikronaczyniowego mózgu (cend) jako model in vitro urazowego uszkodzenia mózgu bariery krew-mózg

Stretch in Brain Microvascular Endothelial Cells (cEND) as an In Vitro Traumatic Brain Injury Model of the Blood Brain Barrier

Ze względu na wysoką śmiertelność spowodowaną urazowym uszkodzeniem mózgu (TBI), metody, które pozwoliłyby lepiej zrozumieć mechanizmy leżące u jego podstaw, są przydatne w leczeniu. W tym celu dostępne są zarówno metody in vivo, jak i in vitro. Modele in vivo mogą naśladować rzeczywisty uraz głowy, który występuje podczas TBI. Techniki in vivo mogą jednak nie być wykorzystywane do badań na poziomie fizjologii komórki. W związku z tym metody in vitro są korzystniejsze w tym celu, ponieważ zapewniają łatwiejszy dostęp do komórek i środowiska zewnątrzkomórkowego w celu manipulacji.
Nasz protokół przedstawia model TBI in vitro wykorzystujący uszkodzenie rozciągające w komórkach śródbłonka mikronaczyniowego mózgu. Wykorzystuje ciśnienie wywierane na komórki hodowane w studzienkach z elastycznym dnem. Wywierany nacisk może być łatwo kontrolowany i może powodować obrażenia, które wahają się od niskich do poważnych. Mysie komórki mikronaczyniowe śródbłonka mózgu (cEND) wygenerowane w naszym laboratorium są dobrze dopasowanym modelem bariery krew-mózg (BBB), zapewniając tym samym przewagę innym systemom, które wykorzystują podobną technikę. Ponadto, ze względu na prostotę metody, konfiguracje eksperymentalne można łatwo powielić. W związku z tym model ten może być wykorzystany do badania mechanizmów komórkowych i molekularnych zaangażowanych w TBI na początku krwi.

Komórki hodowane na 6-dołkowych płytkach hodowlanych o elastycznym dnie (57,75 cm2), uprzednio powleczonych kolagenem I, poddano różnym stopniom urazu rozciągającego przy użyciu urządzenia do rozciągania komórek. Po poddaniu komórek urazowi zbadano pod mikroskopem wpływ urazu indukowanego rozciąganiem na morfologię komórek. Zaobserwowano, że wraz ze stosowaniem większego stopnia rozciągania komórek można było zauważyć większy stopień ich deformacji (Rysunek 1). Jak pokazano na Rysunku 1A, komórki kontrolne, które nie zostały poddane urazowi, wyglądają jak regularnie ukształtowane komórki śródbłonka naczyniowego mózgu (cEND) bez żadnych oznak obrzęku lub deformacji. Po zastosowaniu urazu rozciągającego (Rysunki 1B-D) pod mikroskopem świetlnym można było zaobserwować deformację. Po silnym rozciągnięciu komórek przy ciśnieniu szczytowym między 3,5-4,5 psi, komórki cEND wydawały się wyraźnie skurczone, obrzęknięte i zdeformowane z widocznymi przestrzeniami międzykomórkowymi. Ponadto pobieranie barwnika żywotności (stężenie końcowe 100 nM) również wzrosło wraz ze zwiększaniem stopnia urazu rozciągającego (Rysunek 2). Zastosowany barwnik żywotności jest barwnikiem nieprzenikalnym dla zdrowych komórek, który staje się przenikalny, gdy naruszona zostanie integralność błony plazmatycznej komórek. Barwnik nie wniknął do większości komórek kontrolnych, w związku z czym zabarwiono tylko kilka komórek (Rysunek 2A) w porównaniu do komórek rozciągniętych (Rysunki 2B-D). Przy zwiększonym stopniu urazu rozciągającego więcej komórek fluorescowało na zielono.
Jako biochemiczny marker uszkodzenia zbadano również uwalnianie enzymu dehydrogenazy mleczanowej (LDH) zgodnie z instrukcjami producenta. Rycina 3 pokazuje, że narastające uszkodzenie wynikające z rozciągania komórek powodowało zwiększone uwalnianie LDH.
<img alt="Fazy wzrostu hodowli komórkowej; obraz mikroskopowy, konfluencja komórek fibroblastów, analiza proliferacji komórek." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50928/50928fig1.jpg" width="500px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Badanie komórek prawidłowych i uszkodzonych za pomocą mikroskopii świetlnej. (A) Prawidłowa, nienapięta, konfluencyjna monowarstwa komórek jest gęsto upakowana i wydłużona. Po poddaniu komórek rozciąganiu za pomocą szczytowego impulsu ciśnienia o wartości 1,8-2,0 psi (t.j. niskie rozciąganie) wydają się one mniej zwarte, a wolne przestrzenie są wskazane strzałkami (B). W przypadku umiarkowanego uszkodzenia komórek szczytowym impulsem ciśnienia 2,5-3,0 psi, niektóre z nich pojawiły się obrzęknięte i zdeformowane (C). Przy silnym rozciąganiu o wartości 3,5-4,5 psi komórki ulegają obkurczeniu, co wskazano strzałką (D). Powiększenie 100X. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50928/50928fig1highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz</a>.
<img alt="Obraz z mikroskopu fluorescencyjnego, fazy wzrostu hodowli komórkowych, analiza ekspresji białek." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50928/50928fig2.jpg" width="500px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Badanie mikroskopowe z użyciem fluorescencji komórek prawidłowych i uszkodzonych. Komórki poddane barwieniu żywotności 2h po uszkodzeniu. A: kontrolne komórki nierozciągnięte. B-D: komórki rozciągnięte (B - nisko, C - umiarkowanie, D - silnie). Powiększenie 100X. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50928/50928fig2highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz</a>.
<img alt="Wykres uwalniania LDH; poziomy nasilenia inkubacji po rozciąganiu, wykres liniowy, ocena uszkodzenia komórek." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50928/50928fig3.jpg" width="500px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Uwalnianie enzymuydehydrogenazy mleczanowej (LDH) do supernatantu po urazie spowodowanym rozciąganiem. Ilość LDH uwolnioną do pożywki hodowlanej mierzono w różnych odstępach czasu po urazie indukowanym rozciąganiem. LDH wyrażono jako procent całkowitej ilości LDH zdolnej do uwolnienia (LDH w pożywce oraz w komórkach). Wartości podano jako ± SEM. Liczba n dla każdego punktu czasowego wynosi 5, z wyjątkiem wartości dla 0 h przy silnym rozciąganiu, gdzie n = 3. Uwalnianie LDH z komórek poddanych słabemu i umiarkowanemu rozciąganiu nie różniło się istotnie od kontroli nierozciągniętej ani od siebie nawzajem. Komórki poddane silnemu rozciąganiu uwalniały istotnie większą ilość LDH w porównaniu do wszystkich pozostałych próbek, z wyjątkiem próbki umiarkowanie rozciągniętej w 1 hr. (p &lt; 0.05, jednoczynnikowa ANOVA, metoda Holma-Sidaka). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50928/50928fig3highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz</a>.
Tabela 1. Przewodnik po generowaniu różnych stopni urazów rozciąganiających.
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<th>Ciśnienie regulatora</th>
			<th>Ciśnienie szczytowe</th>
			<th>Stopień obrażeń</th>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 psi</td>
			<td>1,2-1,5 psi</td>
			<td>&lt; Niski</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20–25 psi</td>
			<td>1,8-2,0 psi</td>
			<td>Niski</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30-35 psi</td>
			<td>2,5-3,0 psi</td>
			<td>Umiarkowany</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40–50 psi</td>
			<td>3,5-4,5 psi</td>
			<td>Ciężki</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 psi</td>
			<td>4,8–6,0 psi</td>
			<td>&gt; Ciężki</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

Modele urazowego uszkodzenia mózgu in vitro są opracowywane do odtwarzania deformacji mózgu in vivo. Uraz wywołany rozciąganiem został zastosowany w przypadku astrocytów, neuronów, komórek glejowych, komórek aorty i śródbłonka mózgu. Jednak nasz system wykorzystuje model bariery krew-mózg (BBB), który posiada właściwości stanowiące legalny model bariery krew-mózg, aby ustanowić model TBI in vitro.

Rozciąganie w komórkach śródbłonka mikronaczyniowego mózgu (cEND) jako model in vitro urazowego uszkodzenia mózgu bariery krew-mózg

Due to the high mortality incident brought about by traumatic brain injury (TBI), methods that would enable one to better understand the underlying ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zademonstrowanie wykorzystania urazu rozciągającego jako modelu urazowego uszkodzenia mózgu. Jest to realizowane poprzez uprzednie hodowanie mikro naczyniowych komórek śródbłonka w studzienkach z elastycznym dnem. Drugim krokiem jest różnicowanie komórek poprzez redukcję zawartości płodowego surowicy cielęcej w pożywce hodowlanej.Następnie komórki poddaje się uszkodzeniu przy użyciu urządzenia do rozciągania komórek. Ostatnim krokiem jest ocena stopnia uszkodzenia komórek. W rezultacie indukowane rozciąganiem uszkodzenie komórek śródbłonka mózgu służy do wykazania uszkodzenia bariery krew-mózg in vitro.Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię urazowych obrażeń mózgu, ponieważ modeluje ona rzeczywisty wpływ, jaki podczas TBI wywiera się na barierę krew-mózg, wykorzystując uraz rozciągający morskich komórek śródbłonka mózgu. Procedurę zaprezentuje dr Elaine Salvador, postdoc z mojego laboratorium. Rozpocznij tę procedurę od hodowli morskich komórek śródbłonka mikronaczyniowego mózgu w kolbie hodowlanej T 75.Wymieniaj pożywkę dwa razy w tygodniu aż do osiągnięcia konfluencji. Następnie przemyj komórki PBS. Po tym odessij PBS i trypsynę.Zneutralizuj komórki za pomocą dwóch mililitrów ciepłego roztworu trypsyny EDTA. Inkubuj komórki w temperaturze 37 °C przez pięć minut lub do momentu rozproszenia warstwy komórkowej. Następnie dodaj do komórek osiem mililitrów pożywki hodowlanej i kilkakrotnie opukaj kolbę, aby odłączyć komórki.Obejrzyj komórki pod mikroskopem, aby upewnić się, że całkowicie oddzieliły się od kolby. Następnie pipetuj medium z oddzielonymi komórkami w górę i w dół. Po tym zabiegu zakręć kolbą, aby wymieszać zawiesinę komórkową.Nanieś 20 µL zawiesiny komórkowej do hemocytometru i odlicz liczbę komórek. Wyznacz gęstość komórek, aby uzyskać 20 000 komórek na centymetr kwadratowy w studzience. Następnie przenieś zawiesinę komórkową do kolagenu.Przygotowano sześć sześciodołkowych płytek hodowlanych z elastycznym dnem, z całkowitą objętością 3 mL na dołek. Pożywkę hodowlaną wymieniano dwa razy w tygodniu, a komórki hodowano w temperaturze 37 °C przez jeden tydzień, aż do uzyskania pełnej konfluencji.W celu dyferencjacji komórek należy wymienić pożywkę hodowlaną na pożywkę do dyferencjacji i inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 24 godziny. W tej procedurze włącz urządzenie do kontroli uszkodzeń komórek i ustaw opóźnienie na 50 ms. Następnie ustaw ciśnienie regulatora na 15 PSI i naciśnij spust kilka razy, aż zarejestrowane ciśnienie szczytowe stanie się stabilne.Następnie ustaw ciśnienie regulatora na żądaną wartość. Po tym czasie umieść płytkę hodowlaną z sześcioma studniami i elastycznym dnem w uchwycie tacy. Upewnij się, że selektor studni jest ustawiony na odpowiednią wielkość studni.Następnie mocno nasuń wtyczkę adaptera na, dobrze, przytrzymaj wtyczkę pewnie jedną ręką, a drugą naciśnij spust, a następnie zapisz wygenerowane ciśnienie szczytowe. Niezwłocznie umieść płytkę z powrotem w inkubatorze w temperaturze 37 °C na wymagany czas lub użyj jej natychmiast w kolejnych eksperymentach bądź analizie w celu oceny urazu rozciągnięcia za pomocą testu poboru DI. Bezpośrednio po rozciągnięciu komórek dodaj do pożywki hodowlanej komórek 30 µL barwnika żywotności w stężeniu 1 mg/mL, który służy jako marker cytotoksyczności.W celu oceny urazu rozciągającego poprzez uwalnianie dehydrogenazy mleczanowej. Po rozciągnięciu należy natychmiast usunąć 200 µL pożywki hodowlanej z dołka; tę samą procedurę należy powtórzyć dla każdego punktu czasowego po urazie, który ma zostać uwzględniony w badaniu uwalniania LDH. Następnie pożywkę hodowlaną należy wirować przez pięć minut przy najwyższych obrotach mikrocentryfugi.Aby usunąć resztki komórkowe, należy odlać supernatant i wykorzystać go w kolejnych etapach. Po pobraniu niezbędnych próbek z różnych punktów czasowych należy zlizować komórki, używając roztworu lizującego dołączonego do zestawu testowego LDH. Następnie do każdego dołka płytki 96-dołkowej z zestawu należy dodać 100 µL medium testowego dołączonego do zestawu.Następnie należy dodać 100 µL bezkomórkowego pożywki do hodowli komórkowej do dwóch równoległych dołków płytki 96-dołkowej, inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 30 minut, a następnie odczytać absorbancję przy 492 nm. Przedstawione tutaj badanie za pomocą mikroskopii świetlnej pokazuje komórki prawidłowe w porównaniu z komórkami uszkodzonymi.Normalna, nierozciągnięta konfluenta warstwa pojedyncza komórek jest gęsto upakowana; gdy komórki są rozciągane poprzez przyłożenie szczytowego impulsu ciśnienia od 1,8 do 2,0 PSI, wydają się mniej zwarte. Przy umiarkowanym uszkodzeniu komórek impulsem ciśnienia szczytowego od 2,5 do 3,0, niektóre z nich wydają się obrzęknięte i zdeformowane. Przy silnym rozciągnięciu wynoszącym od 3,5 do 4,5 PSI komórki ulegają skurczeniu.Poniżej przedstawiono badanie mikroskopowe z użyciem fluorescencji w porównaniu komórek prawidłowych i uszkodzonych. Komórki poddano barwieniu na żywotność dwie godziny po uszkodzeniu. Są to komórki kontrolne nierozciągnięte, komórki umiarkowanie rozciągnięte oraz komórki silnie rozciągnięte.Rycina ta przedstawia uwalnianie enzymu LDH do medium po urazie wywołanym rozciąganiem. Poziom LDH uwolnionego do medium hodowlanego mierzono w różnych odstępach czasu po urazie indukowanym rozciąganiem, a wyniki wyrażono jako procent całkowitego uwalnianego LDH z komórek poddanych niskiemu i umiarkowanemu rozciąganiu. Nie stwierdzono istotnych różnic w porównaniu z kontrolą nierozciąganą oraz pomiędzy grupami.Komórki poddane silnemu rozciąganiu uwolniły znacznie większą ilość LDH w porównaniu do wszystkich pozostałych próbek, z wyjątkiem próbki poddanej umiarkowanemu rozciąganiu po upływie jednej godziny od jego zastosowania. Technika ta utorowała drogę badaczom z dziedziny neurobiologii do analizy urazowych obrażeń mózgu w komórkach śródbłonka mózgu organizmów morskich in vitro.

stretch-brain-microvascular-endothelial-cells-cend-as-an-vitro

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Rozciąganie komórek śródbłonka mikrokrążenia mózgowego (cEND) jako in vitro model urazowego uszkodzenia mózgu bariery krew-mózg

Niniejsza metoda opisuje sposób izolacji i unieśmiertelniania mikro naczyniowych komórek śródbłonka z mózgu myszy. Przedstawiamy szczegółowy protokół, obejmujący kolejno homogenizację tkanki mózgowej, etapy trawienia, wysiew oraz unieśmiertelnianie komórek. Uzyskanie homogennej, unieśmiertelnionej linii mikro naczyniowych komórek śródbłonka zajmuje zazwyczaj około pięciu tygodni.

Generowanie unieśmiertelnionej linii komórek śródbłonka mikrokrążenia mózgu myszy jako modelu bariery krew-mózg in vitro

Stworzenie ludzkich modeli bariery krew-mózg (BBB) może przynieść korzyści badaniom nad chorobami mózgu związanymi z niewydolnością bariery krew-mózg. Opisujemy tutaj ulepszoną technikę przygotowania kontaktowego modelu BBB, która umożliwia kokulturację ludzkich astrocytów i komórek śródbłonka mózgu po przeciwnych stronach porowatej błony.

Ulepszona metoda przygotowania opartego na komórkach ludzkich, kontaktowego modelu bariery krew-mózg

Komórki śródbłonka mikronaczyniowego mózgu (BMEC) są połączone specyficznymi białkami połączeniowymi, tworząc wysoce regulowaną barierę oddzielającą krew od ośrodkowego układu nerwowego (OUN), tak zwaną barierę krew-mózg (BBB). Izolacja pierwotnych mysich komórek śródbłonka mikronaczyniowego mózgu, jak omówiono w tym protokole, umożliwia szczegółowe badania in vitro bariery krew-mózg.

Izolacja pierwotnych mysich komórek śródbłonka mikronaczyniowego mózgu

Tutaj opisujemy mysi model bariery krew-mózg in vitro, który wykorzystuje impedancję spektroskopii komórek, koncentrując się na konsekwencjach dla integralności i przepuszczalności komórek śródbłonka po interakcji z aktywowanymi limfocytami T.

Model in vitro bariery krew-mózg przy użyciu spektroskopii impedancyjnej: skupienie się na interakcji limfocytów T z komórkami śródbłonka

Celem protokołu jest przedstawienie zoptymalizowanej procedury tworzenia modelu bariery krew-mózg (BBB) in vitro opartego na pierwotnych komórkach śródbłonka mózgu świni (pBECs). Model wykazuje wysoką odtwarzalność, wysoką szczelność i nadaje się do badań nad transportem i transportem wewnątrzkomórkowym w odkrywaniu leków.

Ulepszona metoda tworzenia modelu bariery krew-mózg in vitro na podstawie komórek śródbłonka mózgu świni

Ogólnym celem tej procedury jest dostarczenie wysoce powtarzalnej techniki oceny in vivo naruszenia bariery krew-mózg w szczurzych modelach udaru niedokrwiennego.

Ocena in vivo przerwania bariery krew-mózg w szczurzym modelu udaru niedokrwiennego

Ukierunkowanie leków na nowotwory ośrodkowego układu nerwowego jest dużym wyzwaniem. W tym miejscu opisujemy protokół wytwarzania in vitro naśladującego barierę nowotworową krew-mózg przy użyciu komórek mysich i / lub ludzkich oraz omawiamy ich znaczenie dla przewidywalności celowania w nowotwór ośrodkowego układu nerwowego in vivo.

Przewidywanie dostarczania ładunków in vivo przy użyciu bariery krew-mózg w naczyniu

Ludzka bariera krew-mózg selektywnie zapobiega przenikaniu hydrofilowych cząsteczek i patogenów do mózgu. Kilka patologii, w tym zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych i majaczenie pooperacyjne, wiąże się ze zwiększoną przepuszczalnością bariery krew-mózg. W tym miejscu opisujemy model hodowli komórek śródbłonka w celu zbadania przepuszczalności bariery przez przenikanie drobnoustrojów.

Analiza przepuszczalności bariery krew-mózg przez przenikanie drobnoustrojów przez komórki śródbłonka mikronaczyniowego

Ten protokół szczegółowo opisuje dostosowaną metodę pozyskiwania, rozszerzania i kriokonserwacji mikronaczyniowych komórek śródbłonka mózgu uzyskanych przez różnicowanie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych, oraz badania właściwości bariery krew-mózg w modelu ex vivo.

Wyprowadzanie, ekspansja, kriokonserwacja i charakterystyka mikronaczyniowych komórek śródbłonka mózgu z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

Bariera krew-mózg (BBB) odgrywa kluczową rolę w utrzymaniu stabilnego i zdrowego środowiska mózgu. Dysfunkcja bariery krew-mózg jest związana z wieloma chorobami neurologicznymi. Opracowaliśmy trójwymiarowy model bariery krew-mózg pochodzący z komórek macierzystych, aby zbadać patologię naczyń mózgowych, integralność bariery krew-mózg oraz sposób, w jaki bariera krew-mózg jest zmieniona przez genetykę i chorobę.

Rekonstrukcja bariery krew-mózg in vitro w celu modelowania i terapeutycznego ukierunkowania choroby neurologicznej

Opracowano metodę wizualizacji wynaczynienia barwnika z powodu uszkodzenia bariery krew-mózg (BBB) poprzez podanie myszom dwóch barwników fluorescencyjnych w różnych punktach czasowych. Zastosowanie glicerolu jako krioprotektantu ułatwiło immunohistochemię na tej samej próbce.

Ocena przełamania bariery krew-mózg w mysim modelu łagodnego urazowego uszkodzenia mózgu

Poznaj model in vitro urazowego uszkodzenia mózgu wykorzystujący rozciąganie komórek śródbłonka mikronaczyniowego mózgu. Ta metoda pozwala badać mechanizmy uszkodzenia bariery krew-mózg.

Rozciąganie w komórkach śródbłonka mikronaczyniowego mózgu (cEND) jako model in vitro urazowego uszkodzenia mózgu bariery krew-mózg (Wideo) | JoVE Journal

Rozciąganie w komórkach śródbłonka mikronaczyniowego mózgu (cEND) jako model in vitro urazowego uszkodzenia mózgu bariery krew-mózg

Przeglądaj więcej filmów