Rozwój i rozmnażanie Drosophila

Drosophila melanogaster są powszechnie wykorzystywane jako organizm modelowy w badaniach nad rozwojem i rozrodem. Drosophila przechodzi przez kilka etapów rozwojowych w procesie znanym jako cykl życiowy, a każdy z tych etapów stanowi unikalną platformę dla badań rozwojowych. W tym filmie przedstawimy podstawy rozwoju i rozrodu Drosophila, w tym sposób przeprowadzania krzyżówek genetycznych, oraz omówimy, w jaki sposób te badania mogą być stosowane do zrozumienia procesów obejmujących zakres od gojenia ran po behawior.

Najpierw omówmy cykl życiowy Drosophila. Drosophila przechodzi przez 4 główne stadia rozwoju: embrion, larwa, pociwar i osobnik dorosły.

Embrion to zapłodnione jajo o owalnym kształcie i długości około 0.5 mm. Bezpośrednio po zapłodnieniu embrion przechodzi szybkie podziały mitotyczne bez wzrostu. Jądro zygCyczne przechodzi dziewięć rund podziałów jądrowych, ale nie następuje cytokineza, co prowadzi do powstania wielojądrowej komórki zwanej blastodermą syncytialną. Ponieważ wszystkie jądra w blastodermie syncytialnej dzielą wspólną cytoplazmę, białka mogą swobodnie dyfundować, tworząc gradienty morfogenów, które są istotne dla ustalenia planu budowy ciała oraz wzorca poszczególnych organów i tkanek muchy. Po 10. podziale jądrowym jądra migrują na obrzeża blastodermy syncytialnej. Po 13. rundzie podziałów jądrowych, która następuje około 3 godzin po zapłodnieniu, 6000 jąder w blastodermie syncytialnej ulega indywidualizacji, tworząc blastodermę komórkową. Blastoderma komórkowa składa się z jednowarstwowej warstwy komórek, która w procesie zwanym gastrulacją przekształca się w złożoną strukturę wielowarstwową. Podczas gastrulacji zmiany kształtu komórek napędzają inwagincjację warstwy jednowarstwowej, co ostatecznie prowadzi do powstania warstw zarodkowych: endodermy, mezodermy i ektodermy. Z endodermy powstaje układ pokarmowy, z mezodermy mięśnie i serce, a z ektodermy naskórek i ośrodkowy układ nerwowy. Po 24 godzinach embriony wykluwają się jako larwy.

Larwy są białe, z segmentowanymi ciałami przypominającymi robaki. Poruszają się w wilgotnej pożywce, stale jedząc, co prowadzi do szybkiego wzrostu. Larwy przechodzą przez trzy stadia: pierwsze stadium larwalne przez 24 godziny, drugie przez kolejne 24 godziny i trzecie przez 48 godzin. Między każdym stadium następuje linienie. Gdy są gotowe do przepocwarzenia, larwy w trzecim stadium opuszczają źródło pokarmu i przyczepiają się do twardej powierzchni, np. do ścianki fiolki.

Pociwary są nieruchome; początkowo są miękkie i białe, lecz z czasem twardnieją i brązowieją. W ciągu czterech dni tkanki larwalne ulegają degeneracji, a tworzą się tkanki osobników dorosłych. Eklozja oznacza koniec stadium poczwarki i wyjście much w formie osobników dorosłych.

8 godzin po eklozji osobniki dorosłe stają się reaktywne płciowo i zaczynają się kojarzyć, rozpoczynając cykl życiowy od nowa.

Pełny cykl życiowy trwa około 10 dni w temperaturze 25 °C, jednak może on zależeć od temperatury. Na przykład w 18 °C cykl życiowy trwa około 19 dni, a w 29 °C tylko 7 dni.

W trakcie rozwoju precyzyjna regulacja genetyczna formowania wzorca ustala plan budowy ciała i specyfikuje poszczególne tkanki oraz organy. Co istotne, ustanowienie osi przednio-tylnej definiuje orientację organizmu od głowy do ogona i jest regulowane przez kilka grup genów.

Po pierwsze, geny efektu macierzyńskiego są dostarczane w oocycie i dziedziczone po samicy. Są one istotne w syncytialnym blastodermie dla wstępnego ustanowienia przodu i tyłu zarodka. W szczególności gen bicoid definiuje przód zarodka, w tym głowę i klatkę piersiową, podczas gdy gen nanos definiuje tył, w tym odwłok.

Po drugie, geny segmentacji, które są regulowane przez geny efektu macierzyńskiego, obejmują geny luki (gap genes) oraz geny reguły parzystej (pair rule genes). Geny luki ustanawiają segmentowy plan budowy ciała wzdłuż osi przednio-tylnej poprzez szerokie podzielenie zarodka. Geny reguły parzystej są wyrażane w wzorze prążkowanym prostopadłym do osi przednio-tylnej, co dalej dzieli zarodek na mniejsze segmenty. Następnie geny polarności segmentu, takie jak engrailed, zaczynają ustanawiać losy komórek w obrębie każdego segmentu.

Na koniec, geny homeotyczne odpowiadają za definiowanie konkretnych struktur anatomicznych, takich jak skrzydła i odnóża. Co ciekawe, kolejność genów na chromosomie odzwierciedla sposób, w jaki są one wyrażane wzdłuż osi przednio-tylnej.

Drosophila to niezwykle płodne organizmy, które w ciągu życia mogą wyprodukować tysiące potomstwa. Samice składają setki jaj dziennie i kontynuują zapładnianie jaj na długo po dokonaniu kopulacji.

Drosophila są również organizmami dymorficznymi płciowo, co oznacza, że samice różnią się fenotypowo od samców. W szczególności samce są mniejsze od samic i mają ciemno zabarwione narządy płciowe zewnętrzne, a także więcej czarnego pigmentu na dolnej części odwłoka. Samce posiadają również kępkę szczecinek na przednich odnóżach, zwane grzebykami płciowymi, służące do chwytania samicy podczas kopulacji. Te wyraźne różnice fenotypowe sprawiają, że bardzo łatwo jest odróżnić samce od samic, co jest szczególnie przydatne podczas planowania krzyżówek genetycznych.

Ustawianie krzyżówek z Drosophila jest użyteczną techniką w badaniach genetyki. Zacznijmy zatem!

Pierwszym krokiem w przygotowaniu krzyżówki jest zebranie dziewiczych samic o pożądanym genotypie, aby można było dokładnie kontrolować, z którym samcem dana samica wejdzie w parę. Drosophila nie są w stanie kopulować przez pierwsze 8 godzin po wylohaniu, więc zbieranie bardzo młodych osobników dorosłych gwarantuje dziewictwo. Aby zebrać nowo wylochane samice, należy przenieść zawartość fiolki do pojemnika z utylizacją, aby pozbyć się wszystkich osobników dorosłych. Co 3-4 godziny należy sprawdzać fiolkę pod kątem nowo wylohanych dorosłych i zbierać samice do nowej fiolki bez samców, aż będą gotowe do użycia. Dziewicze samice rozpoznaje się po bardzo jasnym kolorze ciała oraz ciemnej plamce na odwłoku, znanej jako mekonium.

Po przygotowaniu do rozpoczęcia krzyżówki, należy umieścić 4-6 samców i 4-6 dziewiczych samic o pożądanych genotypach w datowanej fiolce z pożywką i przechowywać w temperaturze 25° C i wilgotności 60%. Po 3-4 dniach pojawią się larwy i należy przenieść rodziców do nowej fiolki, aby zapobiec kopulacji rodziców z potomstwem. Po około 10 dniach wylohają się nowe potomstwo, a ich fenotypy będą można zbadać.

Jednym z narzędzi wykorzystywanych przez badaczy Drosophila są chromosomy balansujące, które zapobiegają rekombinacji genetycznej i zawierają markery genetyczne, takie jak zakręcone skrzydła (curly wings), które są przydatne w określaniu prawidłowego genotypu muchy. Jeśli chcemy uzyskać muchy heterozygotyczne dla dwóch różnych mutacji, można skrzyżować linię z mutacją nr 1 na chromosomie balansującym CyO z drugą linią z mutacją nr 2, również zbalansowaną na CyO. Każde potomstwo, które wylocha się bez zakręconych skrzydeł, jest heterozygotyczne dla obu mutacji.

Kolejnym powszechnie stosowanym narzędziem w badaniach nad Drosophila jest system UAS-GAL4, który pozwala badaczom na ekspresję lub wyciszenie genu w konkretnej tkance. GAL4 to drożdżowy czynnik transkrypcyjny sterowany przez promotor specyficzny dla danej tkanki, a UAS to Upstream Activating sequence, która kontroluje ekspresję interesującego nas genu. Gdy skrzyżuje się muchę z tkankowo-specyficznym transgenem GAL4 z muchą posiadającą transgen UAS z genem zainteresowania bezpośrednio poniżej, białko GAL4 wiąże się z UAS i indukuje ekspresję pożądanego genu. Na przykład skrzyżowanie UAS-GFP z apterous-GAL4, który jest specyficzny dla pryzmatów skrzydeł w stadium poczwarki, powoduje ekspresję GFP specyficznie w tych komórkach.

Istnieje wiele zastosowań, które mogą być wykorzystane do badania rozwoju i reprodukcji Drosophila. Jednym z nich są analizy behawioralne – a konkretnie zachowania godowe. Podczas zalotów samiec orientuje się w stronę samicy i podąża za nią, uderzając ją przednimi odnóżami. Jeśli samica jest podatna, pozwala samcowi na kopulację. Samiec wygina odwłok i przekazuje płyn nasienny do samicy, co określa się mianem kopulacji. Analiza tych zachowań godowych u różnych mutantów pozwala zrozumieć genetyczną kontrolę zachowania

Rozwój Drosophila jest niezwykle dynamicznym procesem obejmującym liczne ruchy i zmiany kształtu komórek, które można badać za pomocą obrazowania na żywo. Przykładem jest domykanie grzbietowe podczas embriogenezy, polegające na zamykaniu się szczeliny w nabłonku w sposób przypominający zapinanie zamka, co wymaga koordynacji wielu typów komórek. Domykanie grzbietowe w trakcie rozwoju często służy jako model do badania gojenia ran, co może mieć znaczenie kliniczne.

Trzecią metodą stosowaną do zrozumienia procesów zachodzących podczas rozwoju Drosophila jest interferencja RNA, która wycisza aktywność poszczególnych genów i może być wykorzystywana w szeroko zakrojonych badaniach genetyki odwrotnej. Na przykład do embrionów można wstrzyknąć dsRNA, a następnie ocenić wpływ wyciszenia genu na rozwój organów. W ten sposób interferencja RNA pozwoliła zidentyfikować gen istotny dla procesu fuzji podczas rozwoju cew rozmownego.

Właśnie obejrzeli Państwo wprowadzenie JoVE do reprodukcji i rozwoju Drosophila melanogaster. W tym filmie omówiliśmy cykl życiowy Drosophila, w tym szczegóły dotyczące każdego etapu rozwoju. Dowiedzieliśmy się również, jak wykorzystać możliwości rozrodcze Drosophila do badań genetycznych i jak zaplanować krzyżówkę. Na koniec dowiedzieliśmy się, w jaki sposób rozwój i reprodukcja Drosophila są przydatne w zrozumieniu złożonych procesów, takich jak zachowanie, gojenie ran i rozwój narządów.