Name: In situ TEM zespołów biologicznych w cieczy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-30T20:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 28 s
Description: Poznaj metodę in situ TEM do obrazowania zespołów biologicznych w cieczy z nanometrową rozdzielczością. Technika umożliwia obserwację dynamicznych zachowań cząstek rotawirusa w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują dr. Michaelowi J. Friedlanderowi, dyrektorowi Virginia Tech Carilion Research Institute za zachęcanie do naszych wysiłków badawczych. Projekt ten był wspierany przez fundusze rozwojowe dla S.M.M i D.F.K. oraz częściowo przez inicjatywę Nano-Bio Instytutu Technologii Krytycznej i Nauk Stosowanych w Virginia Tech.

1. Przygotuj urządzenia do przechwytywania biegłości16
<ol>
	<li>Oczyść chipy elektroniczne z azotku krzemu, inkubując je w 15 ml acetonu przez 2 minuty, a następnie w 15 ml metanolu przez 2 minuty (rysunek 1A). Pozostaw wióry do wyschnięcia pod laminarnym przepływem powietrza.</li>
	<li>Inkubować suszone frytki na rozgrzanej płytce mieszającej (bez mieszania) przez 1,5 godziny w temperaturze 150 °C, a następnie pozostawić je do ostygnięcia do temperatury pokojowej przed użyciem.</li>
	<li>Za pomocą strzykawek Hamilton skomponować mieszaniny lipidów w małych szklanych probówkach zawierających 25% chloroformu, 55% DLPC (1,2-dilauroilofosfocholiny) w chloroformie (1 mg/ml) i 20% lipidów Ni-NTA (sól kwasu 1,2-dioleoilo-iminodiacetycznego-sukcynylo-niklowego) w chloroformie (1 mg/ml) o całkowitej objętości 40 μl.</li>
	<li>Nałożyć 1 μl podwielokrotności mieszaniny na każde 15 μl kropli wody Milli-Q na kawałek Parafilmu na wilgotnej szalce Petriego (Rysunek 1B). Próbki należy inkubować na lodzie przez co najmniej 60 minut.</li>
</ol>
2. Wychwytywanie makrocząsteczek17
<ol>
	<li>Umieść E-chip ze zintegrowanym przekładką 150 nm na wierzchu próbki jednowarstwowej i inkubuj przez 1 minutę (rysunek 1C).</li>
	<li>Delikatnie zdjąć wiór z próbki i dodać 3 μl porcji białka A znakowanego przez Hisa. Inkubować przez 1 minutę w temperaturze pokojowej (ryc. 1D).</li>
	<li>Zetrzyj nadmiar kropli za pomocą bibuły filtracyjnej Whatman #1 i natychmiast dodaj 3 μl porcji roztworu przeciwciała. Inkubować przez 1 minutę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Usunąć nadmiar roztworu za pomocą strzykawki Hamiltona i natychmiast dodać 1 μl porcji rotavirus DLPs (0,1 mg/ml) w roztworze buforowym zawierającym 50 mM HEPES (pH 7,5), 150 mM NaCl, 10 mM MgCl2 i 10 mM CaCl2. Inkubować przez co najmniej 2 minuty w temperaturze pokojowej. Przygotowanie DLP zostało opisane wcześniej18.</li>
</ol>
3. Złóż komorę mikroprzepływową i załaduj uchwyt na próbki in situ
<ol>
	<li>Załaduj mokry E-chip zawierający próbkę wirusa do końcówki uchwytu próbki mikroprzepływowej. Rozładować jarzeniowo drugi płaski chip E przez 1 minutę, a następnie załadować go na wierzch chipa dystansowego (rysunek 2, panele 1-5).</li>
	<li>Alternatywnie, aby zwiększyć kontrast makrocząsteczek biologicznych, barwnik z metali ciężkich (np. 0,2% mrówczanu uranylu) można dodać do mokrych próbek przed umieszczeniem drugiego E-chipa na mokrej próbce. Jednak E-chip zawierający próbkę będzie musiał zostać umyty wodą Milli-Q przed dodaniem odczynnika kontrastowego.</li>
	<li>Ułóż cały zespół razem, aby utworzyć szczelną obudowę, przytrzymywaną mechanicznie w uchwycie za pomocą 3 mosiężnych (Rysunek 2, panele 6-8).</li>
	<li>Po zamontowaniu końcówka uchwytu jest pompowana do 10-6 Torr za pomocą turbopompowanej suchej przepompowni przed umieszczeniem uchwytu w TEM.</li>
</ol>
4. Obrazowanie w cieczy za pomocą transmisyjnego mikroskopu elektronowego
<ol>
	<li>Załaduj uchwyt próbki in situ do transmisyjnego mikroskopu elektronowego (firma FEI) wyposażonego w żarnik LaB6 i działającego pod napięciem 120 kV.</li>
	<li>Włącz filament TEM i wyreguluj eucentryczną wysokość stolika mikroskopu w stosunku do próbki, korzystając z funkcji woblera, aby przechylić próbkę od -15° do +15° do przodu iz powrotem w kolumnie. Ta procedura dostosowuje stolik w kierunku z, aby pomóc w uwzględnieniu odpowiedniej grubości komory cieczy. Ten krok zapewnia również użycie dokładnego powiększenia podczas rejestrowania obrazów.</li>
	<li>Najpierw rejestruj obrazy wzdłuż krawędzi i w rogach komory mikroprzepływowej. Obszary te zazwyczaj zawierają najcieńszy roztwór. Rejestruj obrazy próbek w warunkach niskiej dawki (1-3 elektrony/A2) za pomocą kamery CCD. Używaj powiększeń nominalnych od 6 000X do 30 000X.</li>
	<li>Określ prawidłową wartość rozmycia, ustawiając ostrość na krawędzi komory fluidalnej. Użyj wartości -1,5 μm, aby rejestrować obrazy w powiększeniu 30 000x. W przypadku napotkania gęstego roztworu lub jeśli w przygotowaniu próbki nie zastosowano środka kontrastowego, należy zastosować wyższe wartości rozmycia w zakresie od -2 do -4 μm.</li>
	<li>Aby upewnić się, że roztwór znajduje się w komorze mikroprzepływowej przez cały czas trwania eksperymentów, należy skupić wiązkę elektronów, aż pęcherzyki utworzą się w cieczy wewnątrz urządzenia.</li>
</ol>

<ol><li>Zhou, Z. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+atomic+resolution+structural+determination+by+single-particle+cryo-electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Towards atomic resolution structural determination by single-particle cryo-electron microscopy.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 18, 218-228 (2008).</li>
<li>Wolf, M., Garcea, R. L., Grigorieff, N., Harrison, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subunit+interactions+in+bovine+papillomavirus%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Subunit interactions in bovine papillomavirus.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 6298-6303 (2010).</li>
<li>Dubochet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-electron+microscopy+of+vitrified+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Q.+Rev.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Cryo-electron microscopy of vitrified specimens.</a> Q. Rev. Biophys. 21, 129-228 (1988).</li>
<li>Unwin, P. N., Henderson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+structure+determination+by+electron+microscopy+of+unstained+crystalline+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular structure determination by electron microscopy of unstained crystalline specimens.</a> J. Mol. Biol. 94, 425-440 (1975).</li>
<li>Ohi, M., Li, Y., Cheng, Y., Walz, T. Negative Staining and Image Classification - Powerful Tools in Modern Electron Microscopy. Biol. Proced. Online. 6, 23-34 (2004).</li>
<li>Adrian, M., Dubochet, J., Fuller, S. D., Harris, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-negative+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Micron%22%5BJournal%5D)">Cryo-negative staining.</a> Micron. 29, 145-160 (1998).</li>
<li>Parsons, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+wet+specimens+in+electron+microscopy.+Improved+environmental+chambers+make+it+possible+to+examine+wet+specimens+easily%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structure of wet specimens in electron microscopy. Improved environmental chambers make it possible to examine wet specimens easily.</a> Science. 186, 407-414 (1974).</li>
<li>Parsons, D. F., Matricardi, V. R., Moretz, R. C., Turner, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopy+and+diffraction+of+wet+unstained+and+unfixed+biological+objects%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Biol.+Med.+Phys%22%5BJournal%5D)">Electron microscopy and diffraction of wet unstained and unfixed biological objects.</a> Adv. Biol. Med. Phys. 15, 161-270 (1974).</li>
<li>Hui, S. W., Parsons, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+diffraction+of+wet+biological+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Electron diffraction of wet biological membranes.</a> Science. 184, 77-78 (1974).</li>
<li>Hui, S. W., Parsons, D. F., Cowden, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+diffraction+of+wet+phospholipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Electron diffraction of wet phospholipid bilayers.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 71, 5068-5072 (1974).</li>
<li>Ring, E. A., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+system+for+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc.+Microanal%22%5BJournal%5D)">Microfluidic system for transmission electron microscopy.</a> Microsc. Microanal. 16, 622-629 (2010).</li>
<li>Dukes, M. J., Ramachandra, R., Baudoin, J. P., Gray Jerome, W., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+locations+of+gold-labeled+proteins+in+a+whole+mount+eukaryotic+cell+obtained+with+3nm+precision+using+aberration-corrected+scanning+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional locations of gold-labeled proteins in a whole mount eukaryotic cell obtained with 3nm precision using aberration-corrected scanning transmission electron microscopy.</a> J. Struct. Biol. 174, 552-562 (2011).</li>
<li>Yuk, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+EM+of+colloidal+nanocrystal+growth+using+graphene+liquid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">High-resolution EM of colloidal nanocrystal growth using graphene liquid cells.</a> Science. 336, 61-64 (2012).</li>
<li>Peckys, D. B., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+gold+nanoparticle+uptake+in+live+cells+with+liquid+scanning+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Visualizing gold nanoparticle uptake in live cells with liquid scanning transmission electron microscopy.</a> Nano Lett. 11, 1733-1738 (2011).</li>
<li>Klein, K. L., Anderson, I. M., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmission+electron+microscopy+with+a+liquid+flow+cell%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Transmission electron microscopy with a liquid flow cell.</a> J. Microsc. 242, 117-123 (2011).</li>
<li>Degen, K., Dukes, M., Tanner, J. R., Kelly, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+affinity+capture+devices-a+nanoscale+purification+platform+for+biological+in+situ+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Rsc.+Adv%22%5BJournal%5D)">The development of affinity capture devices-a nanoscale purification platform for biological in situ transmission electron microscopy.</a> Rsc. Adv. 2, 2408-2412 (2012).</li>
<li>Gilmore, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+viral+assemblies+in+a+nanoscale+biosphere%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Visualizing viral assemblies in a nanoscale biosphere.</a> Lab Chip. 13, 216-219 (2013).</li>
<li>Bican, P., Cohen, J., Charpilienne, A., Scherrer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+characterization+of+bovine+rotavirus+cores%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Purification and characterization of bovine rotavirus cores.</a> J. Virol. 43, 1113-1117 (1982).</li>
<li>Frank, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SPIDER+and+WEB%3A+processing+and+visualization+of+images+in+3D+electron+microscopy+and+related+fields%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">SPIDER and WEB: processing and visualization of images in 3D electron microscopy and related fields.</a> J. Struct. Biol. 116, 190-199 (1996).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near-atomic+resolution+using+electron+cryomicroscopy+and+single-particle+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Near-atomic resolution using electron cryomicroscopy and single-particle reconstruction.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 1867-1872 (2008).</li>
<li>Scheres, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Bayesian+view+on+cryo-EM+structure+determination%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">A Bayesian view on cryo-EM structure determination.</a> J. Mol. Biol. 415, 406-418 (2012).</li>
<li>Kelly, D. F., Abeyrathne, P. D., Dukovski, D., Walz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Affinity+Grid%3A+a+pre-fabricated+EM+grid+for+monolayer+purification%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The Affinity Grid: a pre-fabricated EM grid for monolayer purification.</a> J. Mol. Biol. 382, 423-433 (2008).</li>
</ol>

Autorka, Madeline J. Dukes, jest pracownikiem firmy Protochips, Inc.

W prezentowanej pracy zastosowaliśmy podejście oparte na wychwytywaniu powinowactwa do wiązania DLP rotawirusów z platformą mikroprzepływową. Pozwoliło to na obrazowanie in situ kompleksów wielkocząsteczkowych w ciekłym mikrośrodowisku. Podejście do przechwytywania jest istotne w odniesieniu do innych technik obrazowania mikroprzepływowego , ponieważ lokalizuje próbki biologiczne w oknie obrazowania, aby zniwelować duże problemy dyfuzyjne, które pojawiają się podczas rejestrowania obrazów w ciecz...

<a href="https://app.jove.com/t/6605">This corrects</a> the article <a href="https://dx.doi.org/10.3791/50936">10.3791/50936</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/50936">In situ TEM of Biological Assemblies in Liquid</a>. The Representative Results and References sections were&#160;updated.

Erratum: In situ TEM of Biological Assemblies in Liquid

Wspólnym celem biologów i inżynierów jest zrozumienie wewnętrznego działania maszyn molekularnych. Transmisyjne mikroskopy elektronowe (TEM) są idealnymi instrumentami do wizualizacji tych skomplikowanych szczegółów w rozdzielczości bliskiej atomowi1-2. W celu podtrzymania systemu wysokiej próżni TEM, próbki biologiczne są zwykle zatopione w cienkich warstwach szklistego lodu3, cukrów4, soli metali ciężkich5 lub pewnej ich kombinacji6. W rezultacie, obrazy osadzonych próbek mogą ujawnić tylko ograniczone migawki dynamicznych procesów.
Wczesne próby utrzymania próbek biologicznych w stanie nawodnienia w środowiskowych komorach płynnych zostały podjęte przez Parsonsa i współpracowników przy użyciu różnicowych etapów pompowania. Wzorce dyfrakcji elektronów niebarwionych kryształów katalazy udało się zarejestrować z rozdzielczością 3 A w stanie uwodnionym7-8. Ponadto oddzielone fazowo domeny lipidowe można badać w uwodnionych błonach ludzkich erytrocytów9-10. Jednak ruch spowodowany dyfuzją cieczy i jej interferencją z wiązką elektronów, spowodował poważną utratę rozdzielczości i do niedawna nie podejmowano dalszych eksperymentów z wykorzystaniem próbek biologicznych.
Wprowadzono nowo opracowane mikroprzepływowe uchwyty na próbki, które wykorzystują mikroprocesory półprzewodnikowe do tworzenia mikroskalowej komory środowiskowej. Urządzenia te mogą utrzymywać próbki w cieczy, gdy są one umieszczone w kolumnie TEM11-12. Ten przełom techniczny w obrazowaniu TEM pozwolił naukowcom po raz pierwszy zaobserwować postępujące zdarzenia na poziomie molekularnym13. Tę nową modalność nazywamy "mikroskopią molekularną in situ", ponieważ eksperymenty można teraz przeprowadzać "wewnątrz" kolumnyEM 14-15. Ogólnym celem tej metody jest zobrazowanie zespołów biologicznych w cieczy w celu obserwacji ich dynamicznych zachowań w rozdzielczości nanometrowej. Przesłanką stojącą za opracowaną techniką jest rejestrowanie obserwacji w czasie rzeczywistym i badanie nowych właściwości maszynerii biologicznej w roztworze. Metodologia ta rozszerza zastosowanie TEM do szerszych celów w biologii komórkowej i molekularnej12-16.
W obecnym artykule wideo prezentujemy obszerny protokół do montażu i użycia dostępnego na rynku uchwytu na próbki mikroprzepływowe. Te wyspecjalizowane uchwyty wykorzystują mikroczipy z azotku krzemu wykonane ze zintegrowanymi przekładkami, tworząc komorę cieczy, która zawiera niewielkie objętości roztworu. Cienkie, przezroczyste okienka są wytrawiane w mikroczipach do celów obrazowania12. Demonstrujemy prawidłowe użycie uchwytu mikroprzepływowego do badania dwuwarstwowych cząstek (DLP) małpiego rotawirusa w cieczy za pomocą TEM. Aby zapewnić, że zespoły biologiczne, takie jak DLP, nie ulegną gwałtownej dyfuzji na duże odległości podczas obrazowania, stosujemy metodę Affinity Capture, aby przywiązać je do powierzchni komory mikroprzepływowej16. Ten etap wychwytywania molekularnego ma dużą przewagę nad alternatywnymi technikami obrazowania próbek biologicznych w cieczy, ponieważ pozwala na pozyskiwanie obrazów, które zostaną wykorzystane do dalszych procedur przetwarzania. Ten etap wychwytywania stosowany w połączeniu z obrazowaniem mikroprzepływowym jest unikalny dla naszych procedur17. Czytelnicy korzystający z aplikacji biologii strukturalnej wykorzystujących TEM lub komory obrazowania mikroprzepływowego mogą rozważyć zastosowanie technik wychwytywania powinowactwa, gdy celem końcowym są dynamiczne obserwacje na poziomie molekularnym.

<table><tbody><tr><td>E-chipy, chip dystansowy</td><td>Protochips, Inc.</td><td>EPB-52TBD</td><td>400 &mu; m x 50 &mu; m</td></tr><tr><td>okno E-chip, górny chip</td><td>Protochips, Inc.</td><td>EPT-45W</td><td>400 &mu; m x 50 &mu; m okno</td></tr><tr><td>Lipid Ni-NTA</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>790404P</td><td>Forma proszku</td></tr><tr><td>DLPC (12:0) lipid</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850335P</td><td>Forma proszku</td></tr><tr><td>Kolby miarowe&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>20-812A; 20-812C</td><td>1 ml; 5 ml&nbsp;</td></tr><tr><td>Strzykawki Hamilton</td><td>Co.</td><td>80300, 80400</td><td>1-10 &mu; l; 1-25 &mu; l</td></tr><tr><td>Bibuła filtracyjna Whatman #1</td><td>Whatman</td><td>1001 090</td><td>100 sztuk, 90 mm</td></tr><tr><td>Szklane szalki Petriego</td><td>Corning</td><td>70165-101</td><td>100 mm x 15 mm</td></tr><tr><td>Szklane pipety Pasteura</td><td>VWR</td><td>14673-010</td><td>14673-010</td></tr><tr><td>Szklane rurki hodowlane</td><td>VWR</td><td>47729-566</td><td>6 mm x 50 mm</td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Fisher Scientific</td><td>A11-1</td><td>1 L</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A412-1</td><td>1 L</td></tr><tr><td>Chloroform&nbsp;</td><td>Mikroskopia elektronowa</td><td>12550</td><td>100 ml&nbsp;</td></tr><tr><td>Białko oznaczone przez niego A</td><td>Abcam, Inc.</td><td>ab52953</td><td>System wodny 10 mg</td></tr><tr><td>Milli-Q</td><td>EMD Millipore Corp.</td><td>Z00QSV001</td><td>Woda ultraczysta</td></tr><tr><td>HEPES Fisher</td><td>Scientific</td><td>BP310-500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Sprzęt&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt na próbki Poseidon In situ</td><td>Protochips, Inc.</td><td></td><td>&nbsp; Kompatybilny z</td></tr><tr><td>FEI: FEI Spirit BioTwin TEM</td><td>FEI Co.</td><td></td><td>Kamera CCD 120 kV</td></tr><tr><td>Eagle 2k HS</td><td>FEI Co.</td><td></td><td>10&nbsp; &Aring;/piksel próbkowanie przy 30 000X</td></tr><tr><td>Stacja pomp suchych Gatan 655</td><td>Gatan, Inc.</td><td></td><td>Końcówka uchwytu pompy do 10-6&nbsp; range</td></tr><tr><td>PELCO easiGlow, jednostka wyładowcza jarzeniowa</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td></td><td>&nbsp; Tryb ujemnej polaryzacji</td></tr><tr><td>Podgrzewana płyta mieszająca Isotemp</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>Heat do 150 &ordm; C przez 1,5 godziny</td></tr></tbody></table>

in situ tem zespołów biologicznych w cieczy

In situ TEM of Biological Assemblies in Liquid

Badacze regularnie używają transmisyjnych mikroskopów elektronowych (TEM) do badania jednostek biologicznych i oceny nowych materiałów. W tym miejscu opisujemy dodatkowe zastosowanie tych instrumentów - oglądanie zespołów wirusowych w płynnym środowisku. Ta ekscytująca i nowatorska metoda wizualizacji struktur biologicznych wykorzystuje niedawno opracowany uchwyt na próbki na bazie mikroprzepływów. Nasz artykuł wideo pokazuje, jak zmontować i użyć uchwytu mikroprzepływowego do obrazowania próbek cieczy w TEM. W szczególności używamy dwuwarstwowych cząstek rotawirusa małpiego (DLP) jako naszego systemu modelowego. Opisujemy również kroki mające na celu pokrycie powierzchni komory cieczowej biofilmami powinowactwa, które wiążą DLP z okienkiem podglądu. Dzięki temu możemy obrazować zespoły w sposób odpowiedni do określania struktury 3D. W ten sposób przedstawiamy pierwsze spojrzenie na cząstki subwirusowe w natywnym środowisku ciekłym.

Reprezentatywne obrazy DLP w cieczy z wykorzystaniem E-chipów poddanych wyładowaniom żarowym (Rysunek 3A) pokazują mniejszą liczbę DLP w danym obszarze widzenia, prawdopodobnie ze względu na dyfuzję, w porównaniu do DLP wzbogaconych na urządzeniach Affinity Capture (Rysunek 3B). Dodanie formatanu uranylu do komory obrazowania zwiększa kontrast preparatu, a tym samym widoczność poszczególnych DLP w roztworze (Rysunek 3C, górny panel). Lepszy kontrast umożliwia późniejsze ...

Tutaj opisujemy procedurę obrazowania kompleksów wirusowych w cieczy w rozdzielczości nanometrowej za pomocą transmisyjnego mikroskopu elektronowego.

In situ TEM zespołów biologicznych w cieczy

Researchers regularly use Transmission Electron Microscopes (TEMs) to examine biological entities and to assess new materials. Here, we describe an ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest obrazowanie struktur biologicznych oraz cieczy w celu obserwacji ich dynamicznych zachowań z rozdzielczością nanometrową. Osiąga się to poprzez wstępne przygotowanie mikrochipów z azotku krzemu z powierzchnią do wychwytu powinowactwa, co umożliwia przytwierdzenie makrocząsteczek do powierzchni mikrochipu, zapobiegając ich dyfuzji w cieczy. Drugim krokiem jest naniesienie próbek biologicznych na mikrochip w celu rekrutacji cząsteczek rotawirusa.Następnie mikrochip zawierający cząstki wirusa jest płukany środkiem kontrastowym, a następnie umieszczany w mikrofluidycznym uchwycie na próbkę. Ostatnim krokiem jest zamontowanie górnego chipa i płytki czołowej w celu utworzenia zamkniętego naczynia zamykającego płynną próbkę. Ostatecznie w TEM rejestrowane są obrazy, aby ujawnić cechy próbki wirusa wewnątrz płynnej mikrokomory.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z innymi istniejącymi metodami badania obiektów w cieczy jest fakt, że nasze próbki nie dyfundują szybko na duże odległości podczas obrazowania dzięki zastosowanej na mikrochipach powłoce do wychwytu powinowactwa. Zastosowania tej techniki obejmują oceny w czasie rzeczywistym systemów dostarczania leków opartych na nanocząsteczkach lub opracowywanie szczepionek przeciwko patogenom wirusowym, ponieważ po raz pierwszy możemy zaobserwować, jak dynamiczne nanomaszyny zmieniają się w roztworze. Choć metoda ta pozwala na wizualizację biologicznych makrocząsteczek, może być ona również stosowana w innych systemach, takich jak aplikacje elektrochemiczne.Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ przygotowanie urządzeń do wychwytu powinowactwa oraz ładowanie mikrofluidycznego uchwytu na próbki mogą stanowić problem dla początkującego użytkownika. Aby rozpocząć, należy oczyścić chipy z azotku krzemu, inkubując je w 15 milliliters acetonu przez dwie minuty, a następnie w 15 milliliters metanolu przez dwie minuty.Aby usunąć pozostałości fotorezystu użytego w procesie produkcji, należy pozwolić chipom na szybkie wyschnięcie w laminarnym strumieniu powietrza. Po wyschnięciu chipy inkubuje się na płycie nagrzanej do 150 °C przez 1,5 godziny. Następnie należy pozwolić im ostygnąć do temperatury pokojowej.Następnie, używając strzykawek Hamiltona, należy przygotować mieszaninę lipidową w małej szklanej probówce. Najpierw należy dodać 25% chloroformu, a następnie 55% DLPC w chloroformie w stężeniu 1 mg/mL. Na koniec, używając osobnej strzykawki, należy dodać 20% lipidu niklowego NTA w chloroformie w stężeniu 1 mg/mL, aby uzyskać całkowitą objętość 40 µL.Następnie wyciąć kawałek param tak, aby pasował do szklanej szalki Petriego o wymiarach 100 by 15 mm, i nanieść na powierzchnię param dziewięć kropel wody Milli Q o objętości 15 µL każda. Na każdą kroplę 15 µL wody Milli Q nanieść alikwot 1 µL mieszaniny lipidowej, a następnie umieścić płytkę na lodzie w wilgotnym środowisku na co najmniej 60 min, aby na powierzchni kropel utworzyła się monowarstwa lipidowa. Na kropelkę z monowarstwą nałożyć EIP z zintegrowanym dystansem 150 nm i inkubować je razem przez jedną minutę.Następnie ostrożnie podnieś chip z kropelki i nanieś trzy µL białka A z tagiem His o stężeniu 0,01 mg/mL bezpośrednio na powierzchnię chipa. Inkubuj chip i białko A przez jedną minutę w temperaturze pokojowej. Następnie usuń nadmiar cieczy za pomocą papieru filtrującego Watman nr 1 i bezzwłocznie dodaj trzy µL roztworu przeciwciał IgG o stężeniu 0,01 mg/mL.Inkubować próbkę przez jedną minutę w temperaturze pokojowej. Następnie usunąć nadmiar roztworu za pomocą strzykawki Hamiltona i niezwłocznie dodać jedną mikrolitrową alikwotę cząsteczek rotawirusa o podwójnej warstwie w stężeniu 0,1 mg/ml w buforze HEPS, a następnie inkubować chip przez co najmniej dwie minuty w temperaturze pokojowej. Drugą płaską płytkę IP przygotowuje się poprzez wyładowanie żarowe przez jedną minutę, a komorę mikroprzepływową montuje się za pomocą stereoskopu ST, najpierw osadzając pierścienie O-ring w końcówce komory na próbkę.Następnie załaduj mokrą płytkę E IP zawierającą próbkę wirusową do końcówki mikrofluidycznego uchwytu na próbki. Następnie nałóż płaską płytkę EIP poddaną wyładowaniu żarowym na wierzch próbki, ściskając cały zespół razem, aby utworzyć szczelną obudowę utrzymywaną mechanicznie w uchwycie za pomocą trzech mosiężnych śrub. Po montażu odpompuj powietrze z końcówki uchwytu do poziomu 10⁻⁶ tor.Po zastosowaniu stacji pompowania na sucho z pompą turbomolekularną przed umieszczeniem uchwytu w TEM, wprowadź uchwyt dwóch próbek do transmisyjnego mikroskopu elektronowego wyposażonego w włókno LaB₆ pracujące przy napięciu 120 kV. Następnie włącz włókno TEM i dostosuj wysokość centryczną stolika mikroskopu względem próbki, korzystając z funkcji wobblera w celu przechylania próbki od -15 stopni do +15 stopni w przód i w tył. W kolumnie zarejestruj obrazy przy powiększeniu od 6 000 do 30 000 razy wzdłuż krawędzi oraz w obszarach narożnych komory mikrofluidycznej.Wykonaj pierwszy obraz za pomocą kamery CCD w warunkach niskiej dawki od 1 do 3 elektronów na angstrem kwadratowy. Wyznacz odpowiednią wartość defokusu, ustawiając ostrość na krawędzi komory fluidycznej. Generalnie stosuj wartość defokusu wynoszącą -1,5 µm podczas rejestrowania obrazów przy powiększeniu 30 000x, aby upewnić się, że roztwór znajduje się w komorze mikrofluidycznej.W trakcie przeprowadzania eksperymentów należy ogniskować wiązkę elektronów do momentu powstania pęcherzyków w cieczy wewnątrz urządzenia. Przedstawiony tutaj obraz został wykonany po dwóch minutach przy gęstości pięciu elektronów na angstrem kwadratowy. Po pięciu minutach powstało jeszcze więcej pęcherzyków w wyniku wyładowania żarowego, wiązania mikroczipów.W roztworze znajduje się bardzo mało cząstek dwuwarstwowych, co prawdopodobnie wynika z dyfuzji. W porównaniu z nimi, cząstki dwuwarstwowe są wzbogacone na mikrochipach z naniesionymi ligandami powinowactwa; przedstawione tutaj obrazy oraz rekonstrukcja 3D obrazują cząstki dwuwarstwowe w cieczy zawierającej odczynnik kontrastowy. Średnica rekonstrukcji wynosi 80 nanometrów.Średnie klas cząstek dwuwarstwowych i cieczy ujawniły wyraźnie zdefiniowane cechy wzdłuż ich zewnętrznej powierzchni. Poszczególne panele mają rozmiar 110 nanometrów. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pamiętać o wycentrowaniu E IPS w końcówce uchwytu próbki oraz o przeprowadzeniu procedury PrepU uchwytu przed wprowadzeniem go do mikroskopu elektronowego.Po przeprowadzeniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak ocena aktywności transkrypcyjnej, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, na przykład: w jakim stopniu wiązka elektronów wpłynęła na wydajność funkcjonalną kompleksów wirusowych? Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak wytwarzać urządzenia do wychwytu powinowactwa, modyfikować je za pomocą adapterów molekularnych, wprowadzać preparaty wirusowe do mikrofluidycznego uchwytu TEM oraz obrazować preparaty przy użyciu standardowych procedur mikroskopowych. Należy pamiętać, że praca z patogenami wirusowymi może być niezwykle niebezpieczna, dlatego podczas przeprowadzania procedur z patogenami klasy BSL 2 należy zawsze przestrzegać środków ostrożności, takich jak noszenie rękawiczek i okularów ochronnych.

in-situ-tem-of-biological-assemblies-in-liquid

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

In situ TEM struktur biologicznych w cieczy

Opracowaliśmy niezależną komórkę cieczową, która umożliwia obrazowanie przez ciecze za pomocą transmisyjnego mikroskopu elektronowego. Dynamiczne procesy zachodzące w nanocząstkach w cieczach mogą być ujawniane w czasie rzeczywistym z rozdzielczością subnanometrową.

Odkrywanie dynamicznych procesów materiałów w cieczach za pomocą mikroskopii elektronowej transmisji komórek ciekłych

Ten artykuł przedstawia metodę hodowli biofilmu do spektrometrii mas jonów wtórnych in situ w czasie przelotu do mapowania chemicznego w stanie uwodnionym, możliwa dzięki reaktorowi mikroprzepływowemu, System do analizy na granicy faz ciekłej próżni. Jako model wykorzystano Shewanella oneidensis MR-1 z białkiem zielonej fluorescencji.

In Situ Charakterystyka biofilmów Shewanella oneidensis MR1 za pomocą SALVI i ToF-SIMS

Przedstawiamy procedurę obrazowania w czasie rzeczywistym i analizy składu pierwiastkowego cząstek bemitu w wodzie dejonizowanej za pomocą płynnej skaningowej mikroskopii elektronowej in situ.

In Situ Charakterystyka cząstek bemitu w wodzie przy użyciu ciekłego SEM

Tutaj wprowadzamy eksperymentalne protokoły obserwacji procesu samoorganizacji w czasie rzeczywistym za pomocą mikroskopii elektronowej transmisyjnej komórki cieczowej.

Mikroskopia elektronowa transmisyjna z ciekłymi komórkami do śledzenia samoorganizacji nanocząstek

Urządzenie do mikroskopii fotooptycznej in situ zostało opracowane do monitorowania wielkości pojedynczych komórek bezpośrednio w zawiesinie komórki. Pomiar w czasie rzeczywistym odbywa się poprzez sprzężenie sondy fotooptycznej z możliwością sterylizacji z automatyczną analizą obrazu. Zmiany morfologiczne pojawiają się w zależności od stanu wzrostu i warunków uprawy.

In Situ Mikroskopia do określania w czasie rzeczywistym morfologii pojedynczych komórek w bioprocesach

Przedstawiono protokół przygotowania mikrodobitkowych komórek płynnych z grafenem do mikroskopii elektronowej in situ nanokryształów złota z roztworu prekursorowego HAuCl4. Ponadto przedstawiono procedurę analizy w celu ilościowego określenia obserwowanego trawienia i dynamiki wzrostu.

Przygotowanie ciekłych komórek mikrostudzienkowych na bazie grafenu do transmisyjnej mikroskopii elektronowej in situ

Tutaj prezentujemy protokół przeprowadzania eksperymentów z reakcjami na gaz zamkniętymi in situ TEM, jednocześnie szczegółowo opisując kilka powszechnie stosowanych metod przygotowania próbek.

Przeprowadzanie reakcji gazowych in situ w komórkach zamkniętych w transmisyjnym mikroskopie elektronowym

Obecny protokół opisuje modyfikacje transmisyjnego mikroskopu elektronowego (TEM) z systemem oświetlenia świetlnego, wytwarzanie komórek płynnych oraz obserwacje in situ TEM indukowanych światłem interakcji między komórkami bakteryjnymi a fotosensybilizatorem. Omówiono również metody przygotowania próbek, uszkodzenia wiązki elektronów i obrazowanie.

Indukowana światłem transmisyjna mikroskopia elektronowa in situ do obserwacji oddziaływania ciecz-miękka materia

Tutaj opisane są protokoły przygotowania zestawów wirusów odpowiednich do analizy ciekłego EM i krio-EM w nanoskali przy użyciu transmisyjnej mikroskopii elektronowej.

Postęp w obrazowaniu w wysokiej rozdzielczości zespołów wirusów w cieczach i lodzie

Tomografia krio-STEM umożliwia wizualizację organelli nienaruszonych komórek bez osadzania, cięcia lub innych inwazyjnych przygotowań. Uzyskana rozdzielczość 3D mieści się obecnie w zakresie kilku nanometrów, przy polu widzenia kilku mikrometrów i dostępnej grubości rzędu 1 μm.

Wizualizacja organelli in situ za pomocą tomografii krio-STEM

Poznaj metodę in situ TEM do obrazowania zespołów biologicznych w cieczy z nanometrową rozdzielczością. Technika umożliwia obserwację dynamicznych zachowań cząstek rotawirusa w czasie rzeczywistym.

In situ TEM zespołów biologicznych w cieczy

Przeglądaj więcej filmów