Obrazowanie centrosomów w jądrach much

Ogólnym celem tej procedury jest wykorzystanie genetycznie znakowanych markerów Centro Somal do badań przesiewowych w kierunku nowych mutacji genetycznych i odkrycia funkcji nowo zidentyfikowanych genów Centro somal. Można to osiągnąć za pomocą trzech różnych strategii obrazowania. Śledź obrazowanie żywych jąder, ścieżkę B, chemiczne utrwalanie jąder lub ścieżkę barwienia immunologicznego C.

Pierwszym etapem zabiegu jest wyizolowanie jąder muszek wykazujących ekspresję genetycznie znakowanych białek somalnych centris, po czym można natychmiast wykonać obrazowanie. Drugim krokiem jest chemiczne utrwalenie jąder, po czym można również wykonać obrazowanie. Po trzecie, jądra mogą być wybarwione immunologicznie, a następnie zobrazowane.

Ostatecznie lokalizacje białek centri określa się za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie strefy centralnej, takie jak molekularne podstawy tworzenia się centralnego, elongacja centralna i separacja centralna. Zacznij od wyizolowania jąder drosophila, jak opisano w publikacji JoVE 2 6 4 1.

Po wyizolowaniu jąder zanurz próbkę w sześciu mikrolitrach świeżo przygotowanego buforu barwiącego o temperaturze pokojowej na dodatnio naładowanym szkiełku mikroskopowym. Odczekaj 10 minut, a następnie delikatnie zmyj nadmiar DPI, dwukrotnie wymieniając bufor barwiący. Z sześcioma mikrolitrami PBS.

Uważaj, aby nie zmyć jąder. Usuń roztwory ze szkiełka, używając kawałka bibuły filtracyjnej, aby je odjąć. Sześć mikrolitrów dobrze sprawdza się w przypadku szkiełek nakrywkowych o powierzchni 18 milimetrów kwadratowych.

Teraz pomaga użycie ostrego skalpela do przekłucia jąder w pobliżu interesującego typu komórki, a to minimalizuje nacisk na te komórki podczas etapu zgniatania. Następnie ostrożnie umieść szkiełko nakrywkowe na próbce i uszczelnij ją lakierem do paznokci. Następnie zaznacz długopisem pozycję jąder na szkiełku i przystąp do obrazowania.

Po wyizolowaniu jąder zanurz je w sześciomikrolitrowej kropli PBS na dodatnio naładowanym szklanym szkiełku mikroskopowym. Ręcznie ustaw jądra w sposób liniowy lub w inny preferowany sposób. Następnie użyj kawałka bibuły filtracyjnej, aby usunąć PBS i zastąp go sześcioma mikrolitrami świeżo przygotowanego stałego buforu.

Po pięciu minutach w stałym buforze odetnij go kawałkiem bibuły filtracyjnej. Teraz zanurz próbkę w sześciu mikrolitrach świeżo przygotowanego buforu barwiącego DPI na 10 minut. Zmyj DPI, zastępując je dwoma sześciolitrowymi objętościami PBS.

Następnie ostrożnie umieść szkiełko nakrywkowe o średnicy 18 milimetrów kwadratowych na próbce i uszczelnij je lakierem do paznokci. Następnie zaznacz położenie jąder na szkiełku i przystąp do obrazowania. Do tej procedury najpierw przygotuj silikonowane szkiełka nakrywkowe.

Najpierw zanurz szkiełka nakrywkowe w małej tacy z roztworem silikonu na minutę w temperaturze pokojowej pod wyciągiem, upewnij się, że szkiełka nakrywkowe są całkowicie odsłonięte i nie są ułożone jeden na drugim. Następnie umyj szkiełka nawierzchniowe trzy razy w wodzie przez jedną minutę na pranie. Następnie wykonaj trzy jednominutowe pranie w 70% etanolu i ostatnie jednominutowe pranie w wodzie.

Następnie pozostaw silikonowane szkiełka nakrywkowe do wyschnięcia na powietrzu pod wyciągiem. Po wypreparowaniu kilku jąder i przecięciu szkiełka z typem próbki, dodaj pięć mikrolitrów PBS do silikonowanego szkiełka nakrywkowego i przenieś jądra do kropli PBS. Aby zapewnić sukces, potrzebnych jest kilka szkiełek nakrywkowych, z których każdy ma jedno jądro.

Następnie pod mikroskopem preparacyjnym ostrożnie przekłuj każde z jąder, jak pokazano wcześniej. Teraz delikatnie umieść dodatnio naładowany szklany mikroskop. Nasuń na szkiełko nakrywkowe, pozwalając PBS równomiernie rozprowadzić się między szkiełkiem nakrywkowym a szkiełkiem.

Następnie odchodić nadmiar buforu spomiędzy szkiełka nakrywkowego i szkiełka, co zwiększy nacisk na jądra i je zgnieci. Teraz wrzuć przygotowane szkiełko do ciekłego azotu. Można teraz przygotować i dodać do zbiornika więcej zjeżdżalni.

Przed przystąpieniem do użycia dużych kleszczy wyjmij jedno z szkiełek z ciekłego azotu i szybko użyj skalpela, aby usunąć szkiełko nakrywkowe. Próbka powinna pozostać na szkiełku podstawowym podczas zdejmowania szkiełka nakrywkowego z próbki. Uważaj, aby nie rozmazać go po powierzchni suwaka S.

Można to osiągnąć, używając skalpela, aby jednym szybkim ruchem zdjąć szkiełko nakrywkowe. Teraz inkubuj szkiełka w szklanym słoiku do barwienia Coplan wypełnionym metanolem. Schładzane w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez 15 minut.

Po inkubacji przenieść szkiełka do słoika zawierającego aceton. Schłodzone w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza po 30 sekundach w acetonie. Myj szkiełka przez minutę w PBS w temperaturze pokojowej.

Następnie inkubuj szkiełka przez 10 minut w świeżo przygotowanym PBST, aby zablokować niespecyficzne miejsca Podczas inkubacji PBS TB napełnij studzienki komory wilgotnościowej wodą Po 10 minutach wyjmij szkiełka z PBST i wysusz każde szkiełko wokół próbki. Uważaj, aby nie wysuszyć samej próbki. Ponieważ każde szkiełko jest suszone.

Umieść go w komorze wilgotnościowej. Ważne jest, aby osuszyć obszar szkiełka otaczającego próbkę przed dodaniem roztworu przeciwciała. Gwarantuje to, że przeciwciało pozostaje zlokalizowane na próbce, zapobiegając w ten sposób wysuszeniu na etapie inkubacji.

Następnie delikatnie upuść 100 mikrolitrów przeciwciała pierwszorzędowego rozcieńczonego w świeżo przygotowanym P-B-S-T-B-R na próbki. Użyj rozcieńczenia od jednego do 200 w przypadku niescharakteryzowanych przeciwciał. Następnie umieść jednocentymetrowy kwadratowy kawałek paraform na wierzchu próbki, aby rozprowadzić roztwór przeciwciała i chronić roztwór przeciwciała przed odparowaniem.

Pozostaw próbki do inkubacji przez godzinę w temperaturze pokojowej. Po godzinie za pomocą kleszczy delikatnie usuń paraformę ze szkiełek. Następnie umyj szkiełka trzy razy w PBST w temperaturze pokojowej przez pięć minut na pranie.

Następnie przenieś szkiełka do komory wilgotnościowej z próbką skierowaną do góry, delikatnie dodaj 100 mikrolitrów przeciwciała wtórnego rozcieńczonego w PBST, BR na próbki. Tak jak poprzednio, nałóż paraform i odczekaj godzinę, zmyj wtórną za pomocą trzech pięciominutowych płukań w PBST, a następnie trzech pięciominutowych płukań w PBS. Następnie ostrożnie osusz szkiełka do sucha, nie dotykając próbek.

Dodać sześć mikrolitrów podłoża montażowego i nałożyć standardowe szkiełko nakrywkowe. Po uszczelnieniu szkiełka nakrywkowego lakierem do paznokci i zaznaczeniu pozycji jąder przystąp do obrazowania. Centrosomy w trakcie spermatogenezy ulegają wielu przemianom morfologicznym i funkcjonalnym.

Jednym z łatwo obserwowanych procesów jest wydłużenie centrosomów w spermatogoniach, marker LAR ANA jeden GFP oznacza długość 0,6 mikrona, która wydłuża się podczas spermatogenezy i osiąga długość 2,5 mikrona w prawie dojrzałych spermatydach. Ponieważ olejki centri plemników drosophila są wyjątkowo długie, obrazowanie może być wykorzystane do ilościowych stwierdzeń dotyczących wydłużenia centrosomów. W porównaniu z morfologią typu dzikiego zidentyfikowano różne mutacje, które zmieniają wzrost centralny.

Dwa przykłady to zawsze mutacje wczesne i kula armatnia, które zatrzymują spermatogenezę przed wystąpieniem mejozy, ale nie blokują wydłużenia centów w tych zmutowanych olejkach cent dojrzałych spermatocytów rosną do około 2,4 mikrona w porównaniu do centów olejków komórek kontrolnych, które osiągają maksymalną długość 1,8 mikrona. Po opanowaniu ścieżki A można ją wykonać w 20 minut, ścieżki B w 30 minut, a ścieżki C w ciągu trzech do pięciu godzin, w zależności od wielkości próby. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak obrazować centrosom w locie.