Name: Obrazowanie centrosomów w jądrach much (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-20T19:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 41 s
Description: Poznaj techniki obrazowania białek centrosomalnych w jądrach Drosophila podczas spermatogenezy. Ta metoda umożliwia identyfikację nowych genów i funkcji centrosomów w biologii komórkowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była wspierana przez grant (R01GM098394) od NIH i National Institute of General Medical Sciences, a także 1121176 grantu od National Science Foundation.

1. Ścieżka A. Przygotowanie testów na żywo
<ol>
 <li>Przygotować PBS, rozpuszczając 8,0 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na2HPO4, 0,24 g KH2PO4 w 800 ml wody destylowanej i dostosować pH do 7,4. Doprowadzić objętość do 1 l i sterylizować w autoklawie.</li>
 <li>Wyizoluj jądra, jak opisano wcześniej 27.</li>
 <li>Przygotować bufor barwiący DAPI, rozcieńczając 1 mg/ml bulionu do 1 μg/ml w PBS. Użyj folii aluminiowej, aby chronić probówkę przed światłem i przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
 <li>Po wyizolowaniu jąder zanurz próbkę w 6 μl buforu barwiącego DAPI na dodatnio naładowanym szkiełku mikroskopowym na 10 minut. Jądra dobrze przylegają do dostępnych na rynku dodatnio naładowanych szkiełek, co pozwala na łatwą manipulację próbką. Szkiełka naładowane dodatnio są kowalencyjnie modyfikowane w celu nadania powierzchni szkła statycznego ładunku dodatniego. Podobnie jak powłoka polilizynowa, sprzyja to interakcji jąder z powierzchnią szkiełka.</li>
 <li> Nadmiar DAPI zmyć, zastępując dwukrotnie bufor barwiący 6 μl PBS. Użyj kawałka bibuły filtracyjnej, aby usunąć bufor po każdym etapie mycia. Należy zachować ostrożność, aby przypadkowo nie wyjąć jąder wraz z buforem podczas każdego prania.</li>
 <li>Dodać 6 μl PBS do próbki. Ilość stosowanego bufora powinna być dostosowana do rozmiaru szkiełka nakrywkowego. Objętości przewidziane w niniejszym protokole dotyczą szkiełka nakrywkowego o wymiarach 18 x 18 mm. Opcjonalnie: Wskazane jest przekłucie jąder w pobliżu względnej lokalizacji interesującego typu komórki. Zapewni to minimalny nacisk na te komórki podczas etapu zgniatania, zachowując w ten sposób ich integralność strukturalną. Przekłuwanie jąder można wykonać za pomocą ostrego, czystego skalpela.</li>
 <li>Ostrożnie umieść szkiełko nakrywkowe na wierzchu próbki.</li>
 <li>Uszczelnij krawędzie szkiełka nakrywkowego za pomocą przezroczystego lakieru do paznokci, aby upewnić się, że bufor nie odparuje z żywej próbki podczas obrazowania.</li>
 <li>Użyj markera, aby wyznaczyć pozycję jąder, aby ułatwić zlokalizowanie próbki na szkiełku i przystąp do obrazowania.</li>
	<li>Nadmiar buforu barwiącego DAPI zmyć, zastępując bufor dwukrotnie 6 μl PBS. Użyj kawałka bibuły filtracyjnej, aby usunąć bufor po każdym etapie mycia. Uważaj, aby przypadkowo nie usunąć próbki wraz z buforem podczas każdego prania.</li>
</ol>
2. Ścieżka B. Przygotowanie stałych jąder
<ol>
 <li>Przygotować bufor Fix, rozcieńczając 37% roztwór podstawowy formaldehydu w PBS do końcowego stężenia 3,7% formaldehydu w 1x PBS</li>
 <li>Przygotować bufor do barwienia DAPI, rozcieńczając 1 mg/ml bulionu DAPI do 1 μg/ml w PBS.</li>
 <li>Zanurz jądra w kropli PBS o objętości 6 μl na dodatnio naładowanym szklanym szkiełku mikroskopowym.</li>
 <li>Ręcznie ustaw jądra w sposób liniowy lub w inny preferowany sposób.</li>
 <li>Za pomocą kawałka bibuły filtracyjnej usuń PBS i zastąp go 6 μl buforu Fix na 5 minut.</li>
 <li>Za pomocą kawałka bibuły filtracyjnej usuń bufor Fix i zanurz próbkę w 6 μl buforu barwiącego DAPI na 10 minut.</li>
 
<li>Ostrożnie umieść szkiełko nakrywkowe o wymiarach 18 x 18 mm na wierzchu próbki.</li>
 <li>Uszczelnij krawędzie szkiełka nakrywkowego za pomocą przezroczystego lakieru do paznokci, aby upewnić się, że bufor nie odparuje z próbki podczas obrazowania.</li>
 <li>Użyj markera, aby wyznaczyć pozycję jąder, aby ułatwić zlokalizowanie próbki na szkiełku i przystąp do obrazowania.</li>
</ol>
3. Ścieżka C. Przygotowanie jąder wybarwionych immunologicznie
Silikonowanie szkiełek nakrywkowych: Zanurz wiele szkiełek nakrywkowych 18 x 18 mm w małej tacce zawierającej roztwór silikonowy i inkubuj przez 1 minutę w temperaturze pokojowej pod wyciągiem. Upewnij się, że szkiełka nakrywkowe są całkowicie odsłonięte i nie są ułożone jeden na drugim.
<ol>
 <li>Umieścić próbkę w kropli PBS o objętości 5 μl na silikonowanym szkiełku nakrywkowym. Ustaw jądra zgodnie z potrzebami i przebij jądra ostrym skalpelem. Delikatnie umieść dodatnio naładowane szkiełko mikroskopowe na szkiełku nakrywkowym, pozwalając PBS równomiernie rozproszyć się między szkiełkiem nakrywkowym a szkiełkiem. Użyj małego kawałka bibuły filtracyjnej, aby usunąć nadmiar bufora między szkiełkiem nakrywkowym a szkiełkiem. Gdy bufor jest usuwany przez bibułę filtracyjną, wzrost ciśnienia spowoduje zgniecenie jąder. Wiele próbek powinno być przygotowywanych jednocześnie, ponieważ niektóre mogą zostać utracone lub uszkodzone w trakcie trwania protokołu. Grawer do szkła może być używany do oznaczania szkiełek, jeśli jednocześnie będą przygotowywane różne rodzaje próbek.
	 <ol>
		 <li>Umyj szkiełka nakrywkowe 3 razy po 1 minutę w wodzie, następnie 3 razy po 1 minutę w 70% etanolu i końcowe umyj przez 1 minutę w wodzie. Pozostaw silikonowane szkiełka nakrywkowe do wyschnięcia na powietrzu pod wyciągiem.</li>
		</ol>
	</li>
	<li>Wrzuć szkiełka do ciekłego azotu i pozostaw próbkę do zamrożenia na 5-10 minut.</li>
 <li>Usuń szkiełka z ciekłego azotu za pomocą dużych kleszczy. Użyj skalpela, aby szybko usunąć szkiełko nakrywkowe. Próbka powinna pozostać na szkiełku. Należy uważać, aby nie rozmazać próbki podczas tego procesu, przesuwając szkiełko nakrywkowe wzdłuż szkiełka.</li>
 <li>Inkubować szkiełka w schłodzonym metanolu w szklanym słoiku do barwienia Coplin w temperaturze -20 °C przez 15 minut. </li>
 <li>Przenieść szkiełka do szklanego słoika do barwienia z kopliny, zawierającego wstępnie schłodzony aceton w temperaturze -20 °C przez 30 sekund.</li>
 <li>Myj szkiełka przez 1 minutę w PBS w temperaturze pokojowej za pomocą szklanego słoika do barwienia Coplin.</li>
 <li>Przygotować PBST-B, uzupełniając PBS 0,1% Triton-X100 i 1% białkiem surowicy bydlęcej (BSA). Zamiast BSA można użyć 5% normalnej surowicy od tego samego gatunku gospodarza, co przeciwciało drugorzędowe (od kroku 3.14) w celu zmniejszenia szumu tła wytwarzanego przez wiązanie nieswoistych przeciwciał drugorzędowych.</li>
 <li>Inkubować szkiełka przez 10 minut w PBST-B w szklanym słoiku do barwienia Coplin w celu zablokowania nieokreślonych miejsc.</li>
 <li>Napełnij studzienki komory wilgotnościowej wodą. Wilgotność wewnątrz komory zminimalizuje parowanie roztworów przeciwciał z próbki podczas etapów inkubacji.</li>
 <li>Przygotować PBST-BR, uzupełniając PBST-B 100 μg/ml RNazy A. RNaza A rozkłada RNA w próbce, a także służy jako dodatkowy środek blokujący poprzez silną absorpcję do powierzchni szkła.
	 <ol>
		 <li>Umieść kawałek Parafilmu o wymiarach około 1x1 cm na wierzchu próbki, aby równomiernie rozprowadzić roztwór przeciwciała i chronić roztwór przeciwciała przed odparowaniem. Zamknąć komorę wilgotnościową i inkubować próbkę w przeciwciałie pierwszorzędowym przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
		</ol>
	</li>
 <li>Wyjmij szkiełka z PBST-B. Użyj kawałka bibuły filtracyjnej, aby wysuszyć obszar szkiełka wokół próbki, uważając, aby nie wysuszyć samej próbki. Na koniec umieść szkiełko w komorze wilgotnościowej próbką skierowaną do góry</li>
 <li>Delikatnie dodać 100 μl przeciwciała pierwszorzędowego rozcieńczonego w PBST-BR na wierzch próbki (1:200 jest na ogół dobrym stężeniem początkowym dla niescharakteryzowanych przeciwciał).
	 <ol>
		 <li>Przykryj próbkę kawałkiem Parafilmu o wymiarach około 1 x 1 cm i zamknij komorę wilgotnościową. Inkubować próbkę w przeciwciałie drugorzędowym przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
		 </ol>
	</li>
 <li>Otwórz komorę wilgotności i za pomocą kleszczy delikatnie usuń Parafilm ze szkiełka. Inkubować szkiełka przez 5 minut w PBST w szklanym słoiku do barwienia z kopliny w temperaturze pokojowej w celu umycia. Powtórz ten proces, w sumie trzy prania.</li>
 <li>Wyjmij szkiełka z PBST-B i umieść je w komorze wilgotnościowej próbką skierowaną do góry. Delikatnie dodać 100 μl przeciwciała drugorzędowego rozcieńczonego w PBST-BR na wierzch próbki.</li>
 <li>Otwórz komorę wilgotności i za pomocą kleszczy delikatnie usuń Parafilm ze szkiełka. Ponownie umyj próbkę 3x przez 5 minut każdy w PBST w szklanym słoiku do barwienia Coplin, a następnie 3x po 5 minut w PBS.</li>
 <li>Użyj Kimwipe i bibuły filtracyjnej, aby ostrożnie osuszyć powierzchnię szkiełka, uważając, aby nie dotknąć ani nie wysuszyć próbki.</li>
 <li>Dodać 6 μl podłoża montażowego do próbki, przykryć czystym szkiełkiem nakrywkowym (nie pokrytym silikonem), a krawędzie uszczelnić lakierem do paznokci.</li>
 <li>Użyj markera, aby wyznaczyć pozycję jąder, aby ułatwić zlokalizowanie próbki na szkiełku i przystąp do obrazowania.</li>
</ol>
4. Uwagi dotyczące obrazowania
Obrazowanie można osiągnąć za pomocą pionowego lub odwróconego mikroskopu światła regularnego lub mikroskopu konfokalnego. Ważne jest, aby mikroskop był wyposażony w kontrast fazowy, szczególnie do obrazowania żywych próbek jąder (ścieżka A). Ta funkcja stała się niedawno dostępna w mikroskopach konfokalnych.
Gdy jądra pękają spontanicznie (ścieżka A), końcówka (obszar komórki macierzystej) jest zwykle nienaruszona i łatwo ją zidentyfikować, co stanowi dobry znacznik do początkowego zlokalizowania i użycia do orientacji.
Centriole są dość małymi strukturami i dlatego obrazy powinny być wykonywane przy użyciu obiektywów 63X lub 100X, o współczynniku powiększenia 4-6X i rozdzielczości co najmniej 512 x 512 pikseli, jeśli to możliwe.

<ol><li>Blachon, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+proximal+centriole-like+structure+is+present+in+Drosophila+spermatids+and+can+serve+as+a+model+to+study+centriole+duplication%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A proximal centriole-like structure is present in Drosophila spermatids and can serve as a model to study centriole duplication.</a> Genetics. 182, 133-144 (2009).</li>
<li>Hennig, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spermatogenesis+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+journal+of+developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Spermatogenesis in Drosophila.</a> The International journal of developmental biology. 40, 167-176 (1996).</li>
<li>Fabian, L., Brill, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+spermiogenesis%3A+Big+things+come+from+little+packages%5BTitle%5D)+AND+%22Spermatogenesis%22%5BJournal%5D)">Drosophila spermiogenesis: Big things come from little packages.</a> Spermatogenesis. 2, 197-212 (2012).</li>
<li>White-Cooper, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+gene+regulation+during+Drosophila+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of gene regulation during Drosophila spermatogenesis.</a> Reproduction. 139, 11-21 (2010).</li>
<li>Davies, E. L., Fuller, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+self-renewal+and+differentiation+in+adult+stem+cell+lineages%3A+lessons+from+the+Drosophila+male+germ+line%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Symp+Quant+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation of self-renewal and differentiation in adult stem cell lineages: lessons from the Drosophila male germ line.</a> Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 73, 137-145 (2008).</li>
<li>Belote, J. M., Zhong, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Duplicated+proteasome+subunit+genes+in+Drosophila+and+their+roles+in+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Heredity%22%5BJournal%5D)">Duplicated proteasome subunit genes in Drosophila and their roles in spermatogenesis.</a> Heredity. 103, 23-31 (2009).</li>
<li>Xiao, X., Yang, W. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin-based+dynamics+during+spermatogenesis+and+its+significance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Zhejiang+University.+Science.+B%22%5BJournal%5D)">Actin-based dynamics during spermatogenesis and its significance.</a> Journal of Zhejiang University. Science. B. 8, 498-506 (2007).</li>
<li>Hennig, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+proteins+in+the+spermatogenesis+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">Chromosomal proteins in the spermatogenesis of Drosophila.</a> Chromosoma. 111, 489-494 (2003).</li>
<li>Wakimoto, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Doubling+the+rewards%3A+testis+ESTs+for+Drosophila+gene+discovery+and+spermatogenesis+expression+profile+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+research%22%5BJournal%5D)">Doubling the rewards: testis ESTs for Drosophila gene discovery and spermatogenesis expression profile analysis.</a> Genome research. 10, 1841-1842 (2000).</li>
<li>Avidor-Reiss, T., Gopalakrishnan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+a+centriole%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Building a centriole.</a> Curr Opin Cell Biol. , (2012).</li>
<li>Blachon, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+asterless+and+vertebrate+Cep152+Are+orthologs+essential+for+centriole+duplication%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Drosophila asterless and vertebrate Cep152 Are orthologs essential for centriole duplication.</a> Genetics. 180, 2081-2094 (2008).</li>
<li>Basto, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flies+without+Centrioles%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Flies without Centrioles.</a> Cell. 125, 1375-1386 (2006).</li>
<li>Mottier-Pavie, V., Megraw, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+bld10+is+a+centriolar+protein+that+regulates+centriole%2C+basal+body%2C+and+motile+cilium+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Drosophila bld10 is a centriolar protein that regulates centriole, basal body, and motile cilium assembly.</a> Mol Biol Cell. 20, 2605-2614 (2009).</li>
<li>Rodrigues-Martins, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DSAS-6+Organizes+a+Tube-like+Centriole+Precursor%2C+and+Its+Absence+Suggests+Modularity+in+Centriole+Assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">DSAS-6 Organizes a Tube-like Centriole Precursor, and Its Absence Suggests Modularity in Centriole Assembly.</a> Curr Biol. 17, 1465-1472 (2007).</li>
<li>Stevens, N. R., Dobbelaere, J., Brunk, K., Franz, A., Raff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+Ana2+is+a+conserved+centriole+duplication+factor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Drosophila Ana2 is a conserved centriole duplication factor.</a> J Cell Biol. 188, 313-323 (2010).</li>
<li>Gopalakrishnan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sas-4+provides+a+scaffold+for+cytoplasmic+complexes+and+tethers+them+in+a+centrosome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Sas-4 provides a scaffold for cytoplasmic complexes and tethers them in a centrosome.</a> Nat Commun. 2, 359(2011).</li>
<li>Gopalakrishnan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tubulin+nucleotide+status+controls+Sas-4-dependent+pericentriolar+material+recruitment%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Tubulin nucleotide status controls Sas-4-dependent pericentriolar material recruitment.</a> Nat Cell Biol. 14, 865-873 (2012).</li>
<li>Riparbelli, M. G., Callaini, G., Megraw, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+and+persistence+of+primary+cilia+in+dividing+Drosophila+spermatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Assembly and persistence of primary cilia in dividing Drosophila spermatocytes.</a> Dev Cell. 23, 425-432 (2012).</li>
<li>Maines, J. Z., Wasserman, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-transcriptional+regulation+of+the+meiotic+Cdc25+protein+Twine+by+the+Dazl+orthologue+Boule%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Post-transcriptional regulation of the meiotic Cdc25 protein Twine by the Dazl orthologue Boule.</a> Nat Cell Biol. 1, 171-174 (1999).</li>
<li>Herrmann, S., Amorim, I., Sunkel, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+POLO+kinase+is+required+at+multiple+stages+during+spermatogenesis+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">The POLO kinase is required at multiple stages during spermatogenesis in Drosophila melanogaster.</a> Chromosoma. 107, 440-451 (1998).</li>
<li>Yamashita, Y. M., Jones, D. L., Fuller, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orientation+of+asymmetric+stem+cell+division+by+the+APC+tumor+suppressor+and+centrosome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Orientation of asymmetric stem cell division by the APC tumor suppressor and centrosome.</a> Science. 301, 1547-1550 (2003).</li>
<li>Dix, C. I., Raff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+Spd-2+Recruits+PCM+to+the+Sperm+Centriole%2C+but+Is+Dispensable+for+Centriole+Duplication%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Drosophila Spd-2 Recruits PCM to the Sperm Centriole, but Is Dispensable for Centriole Duplication.</a> Curr Biol. , (2007).</li>
<li>Stevens, N. R., Dobbelaere, J., Wainman, A., Gergely, F., Raff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ana3+is+a+conserved+protein+required+for+the+structural+integrity+of+centrioles+and+basal+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Ana3 is a conserved protein required for the structural integrity of centrioles and basal bodies.</a> J Cell Biol. 187, 355-363 (2009).</li>
<li>Giansanti, M. G., Bucciarelli, E., Bonaccorsi, S., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+SPD-2+Is+an+Essential+Centriole+Component+Required+for+PCM+Recruitment+and+Astral-Microtubule+Nucleation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Drosophila SPD-2 Is an Essential Centriole Component Required for PCM Recruitment and Astral-Microtubule Nucleation.</a> Curr Biol. , (2008).</li>
<li>Januschke, J., Llamazares, S., Reina, J., Gonzalez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+neuroblasts+retain+the+daughter+centrosome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Drosophila neuroblasts retain the daughter centrosome.</a> Nat Commun. 2, 243(2011).</li>
<li>Cheng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrosome+misorientation+reduces+stem+cell+division+during+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Centrosome misorientation reduces stem cell division during ageing.</a> Nature. 456, 599-604 (2008).</li>
<li>Zamore, P. D., Ma, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Drosophila+melanogaster+testes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of Drosophila melanogaster testes.</a> J. Vis. Exp. , e2641(2011).</li>
<li>Fuller, M. T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFuller%2C+MT+%22The+Development+of+Drosophila+melanogaster%22">The Development of Drosophila melanogaster</a>. Bate, M., Martinez-Arias, A. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 71-174 (1993).</li>
<li>Cenci, G., Bonaccorsi, S., Pisano, C., Verni, F., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+and+microtubule+organization+during+premeiotic%2C+meiotic+and+early+postmeiotic+stages+of+Drosophila+melanogaster+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci.+%22%5BJournal%5D)">Chromatin and microtubule organization during premeiotic, meiotic and early postmeiotic stages of Drosophila melanogaster spermatogenesis.</a> J Cell Sci. . 107 (Pt. 12), 3521-3534 (1994).</li>
<li>White-Cooper, H., Schafer, M. A., Alphey, L. S., Fuller, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+and+post-transcriptional+control+mechanisms+coordinate+the+onset+of+spermatid+differentiation+with+meiosis+I+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Transcriptional and post-transcriptional control mechanisms coordinate the onset of spermatid differentiation with meiosis I in Drosophila.</a> Development. 125, 125-134 (1998).</li>
<li>Yamashita, Y. M., Mahowald, A. P., Perlin, J. R., Fuller, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetric+inheritance+of+mother+versus+daughter+centrosome+in+stem+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Asymmetric inheritance of mother versus daughter centrosome in stem cell division.</a> Science. 315, 518-521 (2007).</li>
<li>Tates, A. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTates%2C+AD+%22Cytodifferentiation+during+Spermatogenesis+in+Drosophila+melanogaster%3A+An+Electron+Microscope+Study%22">Cytodifferentiation during Spermatogenesis in Drosophila melanogaster: An Electron Microscope Study</a>. , Rijksuniversiteit de Leiden. Leiden, Netherlands. (1971).</li>
<li>Baker, J. D., Adhikarakunnathu, S., Kernan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanosensory-defective%2C+male-sterile+unc+mutants+identify+a+novel+basal+body+protein+required+for+ciliogenesis+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Mechanosensory-defective, male-sterile unc mutants identify a novel basal body protein required for ciliogenesis in Drosophila.</a> Development. 131, 3411-3422 (2004).</li>
<li>Avidor-Reiss, T., Gopalakrishnan, J., Blachon, S., Polyanovsky, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAvidor-Reiss%2C+T+%22The+Centrosome%3A+Cell+and+Molecular+Mechanisms+of+Functions+and+Dysfunctions+in+Disease%22">The Centrosome: Cell and Molecular Mechanisms of Functions and Dysfunctions in Disease</a>. Schatten, H. , Humana Press. (2012).</li>
<li>Gopalakrishnan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembling+SAS-6+multimer+is+a+core+centriole+building+block%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Self-assembling SAS-6 multimer is a core centriole building block.</a> J Biol Chem. 285, 8759-8770 (2010).</li>
<li>Hassell, J., Hand, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+fixation+with+diimidoesters+as+an+alternative+to+aldehydes.+I.+Comparison+of+cross-linking+and+ultrastructure+obtained+with+dimethylsuberimidate+and+glutaraldehyde%5BTitle%5D)+AND+%22The+journal+of+histochemistry+and+cytochemistry+%3A+official+journal+of+the+Histochemistry+Society%22%5BJournal%5D)">Tissue fixation with diimidoesters as an alternative to aldehydes. I. Comparison of cross-linking and ultrastructure obtained with dimethylsuberimidate and glutaraldehyde.</a> The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 22, 223-229 (1974).</li>
<li>Pisano, C., Bonaccorsi, S., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+kl-3+loop+of+the+Y+chromosome+of+Drosophila+melanogaster+binds+a+tektin-like+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The kl-3 loop of the Y chromosome of Drosophila melanogaster binds a tektin-like protein.</a> Genetics. 133, 569-579 (1993).</li>
</ol>

Bezpłatny dostęp do tej publikacji był wspierany przez Leica Microsystems.

Badanie biologii centrosomów w jądrach muszek przy użyciu genetycznie znakowanych markerów centrosomalnych jest przydatną metodą oceny funkcji i aktywności centrosomów zarówno w kontekście dzikim, jak i zmutowanym. W szczególności ścieżka A nadaje się do szybkich badań przesiewowych nieprawidłowości centrosomalnych, takich jak wady rozwojowe, misegregacja, niestabilność lub nieprawidłowa długość w celu identyfikacji nowych mutantów. Co więcej, rzęski spermatydów w żywych preparatach pozostają ruchliwe przez około 15 minut po sekcji, a zastosowanie żywych jąder na ścieżce A pozwala również na łatwe zajęcie się ruchliwością plemników. Ponieważ aktywność ruchliwych rzęsek plemników jest bezpośrednio związana z funkcją centrosomów, można przeprowadzić testy w celu określenia wpływu różnych mutacji centrosomalnych na funkcję rzęsek. Ścieżka B może być używana do bardziej szczegółowych obserwacji, zwłaszcza gdy wymagane są dane statystyczne, takie jak liczenie centrioli na komórkę i/lub liczby komórek na torbiel. Ścieżka C jest najbardziej przydatna do szczegółowych obserwacji, które wymagają barwienia przeciwciałami. Przykłady obejmują znakowanie określonego typu komórek, takich jak komórki macierzyste, barwienie białka, które nie ma dostępnego znacznika, takiego jak acetylowana tubulina, lub w celu sprawdzenia braku lub błędnej lokalizacji białka w mutancie.
Podczas obrazowania centrosomów i struktur związanych z centrosomami stosowanie genetycznie znakowanych markerów zamiast przeciwciał jest nie tylko łatwiejsze eksperymentalnie, ale także zapewnia bardziej wiarygodne i powtarzalne wyniki. Dlatego zastosowanie genetycznie znakowanych białek centrosomalnych jest niezawodnym podejściem do analiz mechanistycznych i ilościowych, które wymagają dużego zestawu danych. Na przykład zastosowanie genetycznie znakowanych markerów centrosomalnych było szczególnie cenne dla ilościowego określenia długości centrioli. Taka analiza wykazała, że różne mutacje można podzielić na dwie kategorie w zależności od zmienności długości centrioli. Jedna kategoria obejmuje mutacje, które zmieniają długość centrioli, ale nie wpływają na odchylenie standardowe 1 , a druga kategoria obejmuje mutacje, które wpływają zarówno na długość centrioli, jak i odchylenie standardowe długości 11. Takie dane ilościowe mogą dostarczyć użytecznych informacji na temat funkcji poszczególnych genów centrosomalnych. Mutanty centrosomalne, które wykazują wadliwą długość centrioli ze wzrostem odchylenia standardowego, mogą być spowodowane destabilizacją struktury środkowej. Jednak wadliwa długość centrioli z normalnym błędem standardowym może wskazywać, że mutacja nie destabilizuje strukturalnie centrioli i jest bardziej prawdopodobne, że jest spowodowana zmianą mechanizmu regulacyjnego kontrolującego długość centrioli. Ze względu na niespójności w barwieniu immunologicznym, analizy ilościowe są trudne przy użyciu samych markerów przeciwciał.
Centrosom jest dużą, złożoną strukturą białkową, a wiele jego białek znajduje się tylko w jego wnętrzu. Użycie genetycznie znakowanych markerów centrosomalnych zamiast przeciwciał pozwala na konsekwentne znakowanie wewnętrznych składników centrosomu, których epitopy mogą być w inny sposób niedostępne dla markerów przeciwciał. Na przykład badania lokalizacji Bld10 przy użyciu przeciwciał wykazały, że białko jest wzbogacone na dystalnych i proksymalnych końcach centrioli 13, podczas gdy Bld10-GFP wykazuje bardziej równomierną dystrybucję 1. Jednak ważne jest również, aby wziąć pod uwagę poziom ekspresji określonego genetycznie znakowanego białka, ponieważ może to wpływać na dystrybucję białka. Lokalizacja Sas-4-GFP i SAS-6-GFP wyrażonych pod ich endogennym jest ograniczona do bliższych końców centrioli 1,16,35 Z drugiej strony Sas-4-GFP i SAS-6-GFP wyrażane pod silnym promotorem ubikwityny są zlokalizowane na całej długości centrioli 12,14 . Inną ważną kwestią jest wpływ znacznika genetycznego na funkcję białka. Analizowanie, czy genetycznie znakowane białka są funkcjonalne, można przetestować, wprowadzając białko transgeniczne do zmutowanego tła i badając, czy białko transgeniczne ratuje zmutowany fenotyp.
Utrwalanie jąder Drosophila można przeprowadzić przy użyciu różnych chemicznych utrwalaczy. Tutaj opisujemy utrwalanie zarówno formaldehydem (ścieżka B), jak i metanolem-acetonem (ścieżka C). Jednak każdy utrwalacz może być stosowany zamiennie, a ponieważ różne utrwalacze mogą chemicznie zakłócać natywne epitopy przeciwciał, wybór odpowiedniego utrwalacza do barwienia immunologicznego musi być określony doświadczalnie. Powszechnie stosuje się następujące utrwalacze i warunki inkubacji: 3,7% formaldehydu, 5 min w temperaturze pokojowej; metanol, 15 min w temperaturze -20 °C; aceton, 10 min w temperaturze -20 °C; metanol, 15 min w temperaturze -20 °C, a następnie aceton, 30 sekund w temperaturze -20 °C; etanol, 20 min w temperaturze -20 °C. Chociaż wiązanie acetonem, metanolem i etanolem nie wymaga przedłużonego etapu permeabilizacji w celu barwienia immunologicznego, po utrwaleniu formaldehydem należy przeprowadzić 1-godzinną inkubację w PBST-B w temperaturze pokojowej, aby przeniknąć błony komórkowe i umożliwić dostęp przeciwciał do wewnątrzkomórkowych epitopów. Ponadto niektóre utrwalacze są bardziej odpowiednie dla określonych antygenów. Na przykład formaldehyd dobrze sprawdza się w wiązaniu małych białek, podczas gdy metanol i aceton dobrze nadają się do utrwalania dużych kompleksów molekularnych 36.
Barwienie immunologiczne jąder Drosophila zostało wcześniej opisane w celu obserwacji struktur chromatyny i cytoszkieletu mikrotubul 29,37. W tym przypadku (ścieżka C) procedura została zoptymalizowana pod kątem analizy struktur centrosomalnych zawierających genetycznie znakowane białka. Przedstawiamy szczegółowy opis tej procedury, aby pomóc osobom, które nie mają doświadczenia w pracy z jądrami Drosophila . Procedura ta obejmuje również modyfikacje mające na celu poprawę zachowania i morfologii jąder, na przykład poprzez użycie silikonowanych szkiełek nakrywkowych i dodatnio naładowanych szklanych szkiełek mikroskopowych.

Jądra Drosophila są odpowiednim układem narządów do badania różnych procesów komórkowych i rozwojowych i były szeroko sprawdzane w latach 1-9. Manuskrypt ten koncentruje się na wykorzystaniu jąder Drosophila do badania centrosomu, konserwatywnego organcelli komórkowej. Podobnie jak w innych systemach, centrosom jąder Drosophila funkcjonuje w mitozie, mejozie i ciliogenezie 10. Centrosomy składają się z pary struktur opartych na mikrotubulach, znanych jako centriole, otoczonych złożoną siecią białkową zwaną materiałem pericentriolarnym (PCM). Para centrioli składa się ze starszej środkowej matki i młodszej centrioli córki. W miarę jak komórka postępuje w kierunku mitozy, obie centriole oddzielają się, duplikują i uzyskują dużą ilość PCM, aby ostatecznie utworzyć dwa odrębne centrosomy. Centrosom zawierający oryginalną centriorolę macierzystą jest określany jako centrosom macierzysty, a centrosom zawierający oryginalną centriorolę potomną jest określany jako centrosom potomny.
Jądra Drosophila są idealne do badania molekularnych podstaw biologii centrosomów za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z różnych powodów.
<ol>
 <li>Większość białek Drosophila, które są wymagane do biologii centrosomów w jądrach, jest zachowana wśród eukariontów, co sugeruje, że wgląd w biologię centrosomów u ludzi i innych gatunków można uzyskać, badając centrosom w jądrach Drosophila 1,11-14 .</li>
 <li>Przeprowadzenie analizy mutantów u Drosophila zapewnia znaczną przewagę, ponieważ, w przeciwieństwie do wielu innych modeli, mutacje centrosomalne u Drosophila nie są śmiertelne w zarodku, co pozwala na klasyczną analizę genetyczną funkcji centrosomów. Ta wyjątkowa cecha Drosophila wynika z obecności wkładu matki, który utrzymuje się w krytycznych stadiach rozwoju embrionalnego. 1,11-14 . W ten sposób można a) badać mutacje, które całkowicie eliminują powstawanie centrosomów i b) badać los normalnego centrosomu, który powstał we wczesnym zarodku przez wkład matki w kontekście zmutowanym po wyczerpaniu wkładu matki (zasada metody jest opisana w 11).</li>
 <li>Dostępne są funkcjonalne transgeny z genetycznie kodowanymi znacznikami fluorescencyjnymi, które oznaczają centrosom. Wiele z tych linii wykorzystuje własny promotor białka do napędzania transkrypcji transgenu, aby zapobiec silnej nadekspresji. Jest to szczególnie ważne, ponieważ nadekspresja białek często prowadzi do powstawania artefaktów, które zakłócają analizę funkcji centrosomów 1,11 .</li>
 <li>Centriole i centrosom są wyjątkowo długie w spermatogenezie Drosophila, co pozwala na szybką i łatwą analizę centrosomu za pomocą obrazowania.</li>
 <li>Kolejne etapy spermatogenezy i biologii centrosomów są zorganizowane chronologicznie wzdłuż jąder, zaczynając od czubka jądra z centrosomami plemników macierzystych, a kończąc na dnie jąder ze zmniejszonym rozmiarem centrosomu i aktywnością w dojrzałych plemnikach (ryc. 1 i 2). Pozwala to na łatwą identyfikację i analizę funkcji centrosomów na różnych etapach rozwoju plemników.</li>
 <li>Jądra można łatwo wypreparować z męskich larw, poczwarek i dorosłych 27.</li>
 <li>Podczas spermatogenezy centrosom i jego centriole przechodzą przez wiele stanów składowych, strukturalnych i funkcjonalnych, aby funkcjonować w mitozie, mejozie i tworzeniu rzęsek. Podczas tych procesów centrosom gromadzi się, duplikuje, migruje, zakotwicza się w określonych częściach komórki, dojrzewa, dzieli się i tworzy rzęskę. Ponadto w centrioli dojrzałego spermatydu powstaje prekursor dośrodkowy o nazwie PCL 1. Również w dojrzałym plemniku centrosom przechodzi proces zwany redukcją centrosomów, w którym traci wiele składników PCM i centrioli (ryc. 1 i 2). Tak więc badania w jądrach pozwalają zająć się wieloma aspektami życia centrosomów, takimi jak między innymi retencja centrosomów w komórkach macierzystych, duplikacja centrioli, stabilność centrioli, wydłużanie centrioli, separacja i segregacja centrioli, rekrutacja PCM, ciliogeneza, tworzenie PCL, redukcja centrosomów i zarodkowanie mikrotubul astralnych.</li>
 <li>Wreszcie, badania nad biologią centrosomów są wspomagane przez inne dobrze znane cechy Drosophila, które sprawiły, że jest to preferowany organizm modelowy do badań biologicznych. Należą do nich krótki czas generacji, łatwość genetyki, a także mutageneza losowa i ukierunkowana na miejsce.</li>
</ol>
Razem, wyżej wymienione cechy jąder Drosophila tworzą model, w którym centrosom może być badany za pomocą łatwego, szybkiego i szczegółowego obrazowania. Techniki opisane w tym artykule zostały zastosowane do zbadania wielu aspektów biologii centrosomów, w tym tworzenia centrioli 11, duplikacji centrioli 15, rekrutacji PCM 16, regulacji centrosomów 17 i ciliogenezy 18. Techniki te zostały również zastosowane do badania centrosomów w innych obszarach biologii, takich jak regulacja mejotyczna 19, montaż wrzeciona 20 i aktywność centrosomów w asymetrycznym podziale komórek macierzystych 21 wśród wielu innych.
Obrazowanie jąder w centrosomie zaczyna się od uzyskania muszek, które wyrażają genetycznie oznaczone białka centrosomalne i wyizolowania jąder od męskich larw, poczwarek lub dorosłych muszek. Muchy te są dostępne w kilku grupach badawczych 1,11,15,22-25 . Jądra larw zawierają wszystkie etapy spermatogenezy przed mejozą i są przydatne podczas analizy mutacji, które są śmiertelne u poczwarki lub osoby dorosłej. Jednak jądra późnych poczwarek lub młodych dorosłych osobników są najbardziej wytrzymałe i zawierają wszystkie etapy spermatogenezy przed i po mejozie, co czyni je preferowanymi do analizy. Ponieważ liczba plemników zmniejsza się wraz z wiekiem muchy, użycie dorosłych jąder jest również odpowiednie do badania centrosomu w kontekście starzenia się. 26. Metoda izolacji jąder od dorosłych much została już wcześniej opisana 27.
Obrazowanie centrosomów i ich funkcji w jądrach Drosophila można osiągnąć za pomocą trzech powiązanych ścieżek, które są tutaj przedstawione (Rysunek 3). Wybór najbardziej odpowiedniej ścieżki zależy od charakteru pytania, na które zwraca się badacz.
Ścieżka A obejmuje obrazowanie testów na żywo. Jest to najszybsza z trzech ścieżek, ale może być stosowana tylko wtedy, gdy próbki nie muszą być konserwowane i gdy barwienie immunologiczne nie jest wymagane. Na ścieżce A jądra są montowane (nienaruszone, przekłuwane lub cięte) na szkiełkach i ostrożnie zgniatane pod szkiełkiem nakrywkowym, tworząc pojedynczą warstwę łatwych do zidentyfikowania komórek. Komórki są następnie wizualizowane zarówno za pomocą mikroskopii z kontrastem fazowym, jak i mikroskopii fluorescencyjnej. Zastosowanie kontrastu fazowego jest szczególnie ważne w analizie jąder Drosophila, ponieważ ujawnia informacje komórkowe, które nie są widoczne przy innych formach przechodzącego oświetlenia, a tym samym pozwala na szybką identyfikację różnych etapów rozwoju plemników 28,29 . Ścieżka A ma jednak dwie główne wady. Po pierwsze, integralność morfologiczna komórek jest często zagrożona po pęknięciu jąder. Po drugie, nieutrwalone komórki czasami poruszają się w próbce, co utrudnia obrazowanie wielu warstw konfokalnych w określonym regionie. Aby ułatwić analizę określonych typów komórek, jądra mogą być przekłuwane lub cięte w celu ukierunkowania sposobu, w jaki jądro pęka w taki sposób, aby zgniatanie pod szkiełkiem nakrywkowym w minimalnym stopniu wpływało na morfologię interesującego typu komórki.
Ścieżka B obejmuje chemiczne utrwalanie jąder. Ta ścieżka wymaga pośredniej ilości czasu na przygotowanie próbki i ma tę zaletę, że utrwalone próbki można zapisać do późniejszej analizy. Ponadto utrwalenie służy usztywnieniu struktur komórkowych, minimalizując ruch próbki podczas obrazowania. Jednak mikroskopia z kontrastem fazowym staje się znacznie mniej pouczająca po utrwaleniu chemicznym, co utrudnia identyfikację niektórych etapów rozwoju plemników.
Ścieżka C jest najbardziej czasochłonna, ale ma dodatkową zaletę, że struktury komórkowe są stałe i wybarwione immunologicznie, co pozwala na wizualizację białek, które nie są dostępne z odpowiednimi znacznikami genetycznymi. Istnieje wiele przeciwciał dostępnych zarówno komercyjnie, jak i z różnych grup badawczych do barwienia immunologicznego centrosomów i struktur związanych z centrosomami w jądrach Drosophila.

<table><tbody><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Dodatnio naładowane szkiełka</td><td>AZER Scientific</td><td>EMS200A +</td><td></td></tr> <tr><td>Mikroskopia elektronowa</td> z <td>mikroskalpelem z piór</td> Sciences <td>72045-30</td><td></td></tr><tr><td>37% formaldehyd lub paraformaldehyd</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP531-500</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Boston Bioproducts</td><td>BM-220</td><td></td></tr><tr><td>18x18 mm szkiełka nakrywkowe numer 1.5</td><td>VWR</td><td>48366 205</td><td></td></tr><tr><td>Lakier do paznokci</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>72180</td><td></td></tr><tr><td>Sigmacote</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SL2-100 ml</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A412-4</td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Fisher Scientific</td><td>A949-1</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284-100ML</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>001-000-162</td><td></td></tr><tr><td>RNAzyca A</td><td>5 prime</td><td>2900142</td><td></td></tr><tr><td>Bibuła filtracyjna</td><td>Whatman</td><td>1001-055</td><td></td></tr><tr><td>Grawer do szkła</td><td>Dremel</td><td>290-01</td><td></td></tr><tr><td>TCS SP5 Mikroskop konfokalny</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nośnik montażowy</td><td>Electron Nauki mikroskopowe</td><td>17985-10</td><td></td></tr><tr><td>Komora wilgotnościowa barwienia immunologicznego, Nauki o mikroskopii czarnych</td><td>elektronów</td><td>62010-37</td><td></td></tr><tr><td>Szklany słoik do barwienia z kopliny, zakrętka</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>70315</td><td></td></tr></tbody></table>

obrazowanie centrosomów w jądrach much

Imaging Centrosomes in Fly Testes

Centrosomy to konserwatywne organelle oparte na mikrotubulach, których struktura i funkcja zmieniają się dramatycznie w trakcie cyklu komórkowego i różnicowania komórek. Centrosomy są niezbędne do określenia osi podziału komórki podczas mitozy i do zarodkowania rzęsek podczas interfazy. Tożsamość białek, które pośredniczą w tych dynamicznych zmianach, pozostaje tylko częściowo znana, a funkcja wielu białek, które są zaangażowane w te procesy, jest nadal szczątkowa. Niedawne prace wykazały, że spermatogeneza Drosophila zapewnia potężny system do identyfikacji nowych białek krytycznych dla funkcji i tworzenia centrosomów, a także do uzyskania wglądu w szczególną funkcję znanych graczy w procesach związanych z centrosomami. Drosophila jest uznanym organizmem modelu genetycznego, w którym mutanty w genach centrosomalnych można łatwo uzyskać i łatwo analizować. Co więcej, niedawne postępy w zakresie czułości i rozdzielczości mikroskopii świetlnej oraz opracowanie solidnych, znakowanych genetycznie markerów centrosomalnych zmieniły możliwość wykorzystania jąder Drosophila jako prostego i dostępnego systemu modelowego do badania centrosomów. W artykule opisano zastosowanie genetycznie znakowanych markerów centrosomalnych do wykonywania genetycznych badań przesiewowych dla nowych mutantów centrosomalnych oraz w celu uzyskania wglądu w specyficzną funkcję nowo zidentyfikowanych genów.

Centrosomy przechodzą wiele morfologicznych i funkcjonalnych przemian w trakcie spermatogenezy. Ta cecha spermatogenezy sprawia, że jądra są użytecznym systemem do badania różnych aspektów biologii centrosomów. Jednym z takich łatwo obserwowanych procesów jest wydłużanie centrosomów. W spermatogonii marker dośrodkowy Ana1-GFP oznacza centriolę o długości 0,6 μm (ryc. 4a). Ta centriole wydłuża się podczas spermatogenezy i osiąga długość 2,5 μm u prawie dojrzałych spermatydów. Ponieważ centriole w plemnikach Drosophila są wyjątkowo długie, obrazowanie można wykorzystać do ilościowego stwierdzenia wydłużenia centrosomów (Figura 4b). Analizę długości centrioli można również przeprowadzić na tle mutantów i zidentyfikowano różne mutanty, które zmieniają wzrost centrioli (ryc. 5). Przykładami są zawsze wczesne (aly) i kula armatnia (can), mutacje, które zatrzymują spermatogenezę przed wystąpieniem mejozy 30, ale nie blokują wydłużenia centrioli. W tych mutantach centriole dojrzałych spermatocytów rosną do około ~2,4 μm w porównaniu z centriolami komórek kontrolnych, które osiągają maksymalnie 1,8 μm.
<img src="/files/ftp_upload/50938/50938fig1.jpg" alt="Rysunek 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50938/50938fig1highres.jpg"> 
Rysunek 1. Spermatogeneza i biologia centrosomów. a) Rozwój komórek macierzystych i spermatogonii. Wszystkie plemniki pochodzą z komórek macierzystych znajdujących się na wierzchołkowym końcu jąder. Każda komórka macierzysta dzieli się asymetrycznie, tworząc komórkę macierzystą, która dziedziczy centrosom macierzysty i spermatogonium progenitorowe, które dziedziczy centrosom potomny 31. Gdy tworzą się spermatogonie, są one otoczone przez 2 komórki torbieli, które nadal otaczają spermatocyty i spermatydy przez cały okres spermatogenezy. Spermatogonia dzieli się 4 razy, aby wytworzyć 16 Spermatogonii, z których każda zawiera dwie centriole. b) Rozwój spermatocytów i mejoza. Podczas rozwoju spermatocytów centriole powielają się ponownie, tworząc cztery centriole zorganizowane w dwie pary na komórkę i 64 centriole na torbiel. Na wczesnym etapie rozwoju spermatocytów każda centriola przemieszcza się do błony plazmatycznej, dokuje do niej i wydłuża się, tworząc strukturę przypominającą pierwotną rzęskę18,32-34 . W dojrzałych spermatocytach długość centrioli osiąga ~1,8 μm. Centrosomy odgrywają istotną rolę w mejozie. Podczas mejozy I pary centrioli, które są nadal przyczepione do błony plazmatycznej, przesuwają się w kierunku środka komórki i tworzą wgłębienia błony komórkowej na ich dystalnym końcu. PCM wokół centrioli rośnie, zarodkuje mikrotubule astralne i kolokalizuje się z biegunem wrzeciona. Podczas przejścia do mejozy II para centrioli rozdziela się tak, że na każdym biegunie wrzeciona znajduje się tylko jedna centriol. C) Spermiogeneza. Pod koniec mejozy II, wczesny okrągły spermatyd ma pojedynczą centriolę przymocowaną do wgłębnej błony plazmatycznej. Duża okrągła pochodna mitochondrialna znajduje się w pobliżu jądra, a później zaczyna się wydłużać wzdłuż rosnącego aksonemu w późniejszych okrągłych spermatydach. Podczas spermatogenezy aksonem tworzy się i wydłuża wewnątrz cytoplazmy. Ponadto nowa struktura dośrodkowa znana jako PCL (Proksymal Centriole Like) pojawia się w pobliżu istniejącej wcześniej centrioli1. Pod koniec spermatogenezy komórki mające wspólną torbiel oddzielają się od siebie, aby stać się w pełni dojrzałymi ruchliwymi plemnikami. Diagramy rozwoju spermatocytów (B) i spermiogenezy (C) przedstawiają tylko jedną komórkę z 16 spermatocytów i 64 spermatydów, odpowiednio na torbiel i nie przedstawiają komórek torbieli. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50938/50938fig1large.jpg" target="_blank"> Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą postać</a>.
<img src="/files/ftp_upload/50938/50938fig2.jpg" alt="Rysunek 2" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50938/50938fig2highres.jpg"> 
Rysunek 2. Jądra Drosophila. Nakładka mikrofotografii kontrastu fazowego i fluorescencji GFP jądra z pełnym wierzchołkiem wyraża marker pan-centriolarny Ana-1-GFP. Wyraźny obszar odpowiadający panelom 1-3 na rysunku 1 jest oddzielony przerywaną czerwoną linią A) Komórki macierzyste i spermatogonia, B) Spermatocyty i mjoza, C) Spermiogeneza.
<img src="/files/ftp_upload/50938/50938fig3.jpg" alt="Rysunek 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50938/50938fig3highres.jpg"> 
Rysunek 3. Ścieżki w kierunku obrazowania centrosomów w jądrach Drosophila.
<img src="/files/ftp_upload/50938/50938fig4.jpg" alt="Rysunek 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50938/50938fig4highres.jpg"> 
Rysunek 4. Wydłużenie centrosomów podczas spermatogenezy. A) Każdy etap pokazuje obraz z kontrastem fazowym (po lewej), obraz fluorescencyjny (w środku) i powiększony obraz centrosomu (po prawej). Obraz z kontrastem fazowym pokazuje konkretny etap komórki na podstawie położenia i morfologii komórki, jądra, jąderka i mitochondriów. Obraz fluorescencyjny przedstawia DNA wybarwione DAPI (na niebiesko). Obraz centrosomu pokazuje centrosomy oznaczone przez Asterless-GFP (Asl, górne obrazy) i Ana1-GFP (Ana1, dolny obraz). Białe kółko podkreśla błonę komórkową zarówno na obrazach z kontrastem fazowym, jak i fluorescencyjnym. Przerywane białe kółka i szare kółko na obrazie fluorescencyjnym podkreślają odpowiednio położenie jądra i jąderka. Żółta strzałka wskazuje pętle chromosomu Y. Czerwone przerywane kółka oznaczają mitochondria. Etapy 1-6 odnoszą się do 29, a etapy 13-17 odnoszą się do opisu etapów komórkowych w 32. Etap 1: Pierwotny spermatocyt. Zidentyfikowany jako mała komórka, wierzchołek jądra. Etap 2a: Spermatocyt polarny. Identyfikowany przez obecność czapy mitochondrialnej po jednej stronie jądra. Etap 3: Spermatocyt apolarny. Identyfikowany przez stosunkowo większy rozmiar niż pierwotny spermatocyt i brak czapeczki mitochondrialnej. Etap 4: Pierwotny spermatocyt. Identyfikowane po wyglądzie wszystkich: Wszystkie 3 pętle chromosomu Y. Etap 5: Dojrzały pierwotny spermatocyt. Największy spermatocyt wytwarzany w spermatogenezie, identyfikowany przez dalszy wzrost wielkości jądra. Etap 6: Premejotyczny pierwotny spermatocyt. Pętle chromosomu Y rozpadają się, a jądro znika. Etap 13: Spermatyda w stadium cebuli. Okrągła komórka zawierająca jednakowej wielkości jądro i mitochondria. Etap 17: Późna spermatyda. Zidentyfikowany jako wydłużony spermatyd, który pozostaje częścią wiązki 64 spermatyd z jądrami znajdującymi się w pobliżu podstawy jąder., Jądra są nieco szersze niż dojrzałe spermatydy znajdujące się w pęcherzyku nasiennym. Podziałki liniowe, 10 μm i 1 μm. B) Wykres przedstawia średnią i odchylenie standardowe dla każdego etapu, mierzone za pomocą Asterless-GFP (niebieski) i Ana1-GFP (zielony). Na etapie 6 średnie i odchylenia standardowe Asterless-GFP (niebieski) i Ana1-GFP (zielony) nakładają się na siebie i widoczne jest tylko Asterless-GFP (niebieskie). Począwszy od etapu 13, Asterless-GFP nie zdobi całej centrioli i pomiary nie zostały określone (ND).
<img src="/files/ftp_upload/50938/50938fig5.jpg" alt="Rysunek 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50938/50938fig5highres.jpg"> 
Rysunek 5. Nienormalnie długie centriole w stadium 6 Spermatocyty aly i mogą mutanty. AC) Mikrografia świetlna całych jąder i panel fluorescencyjny reprezentatywnego centrosomu znakowanego przez Ana1-GFP. Zwróć uwagę na nieprawidłowy kształt jąder u mutantów aly i can, co wynika z braku plemników w wyniku zatrzymania mejozy. D) Wykres przedstawia średnią, odchylenie standardowe i rozkład danych długości centrioli w typie dzikim, aly i can. Numer próbki dla każdego punktu danych znajduje się w nawiasach. Podziałka, 1 μm.

Obrazowanie białek centrosomalnych podczas spermatogenezy Drosophila jest skuteczną metodą identyfikacji nowych białek krytycznych dla biologii centrosomów, a także wyjaśnienia szczególnej funkcji znanych graczy w tym procesie.

Obrazowanie centrosomów w jądrach much

Centrosomes are conserved microtubule-based organelles whose structure and function change dramatically throughout the cell cycle and cell ...

Ogólnym celem tej procedury jest wykorzystanie genetycznie znakowanych markerów Centro Somal do badań przesiewowych w kierunku nowych mutacji genetycznych i odkrycia funkcji nowo zidentyfikowanych genów Centro somal. Można to osiągnąć za pomocą trzech różnych strategii obrazowania. Śledź obrazowanie żywych jąder, ścieżkę B, chemiczne utrwalanie jąder lub ścieżkę barwienia immunologicznego C.Pierwszym etapem zabiegu jest wyizolowanie jąder muszek wykazujących ekspresję genetycznie znakowanych białek somalnych centris, po czym można natychmiast wykonać obrazowanie. Drugim krokiem jest chemiczne utrwalenie jąder, po czym można również wykonać obrazowanie. Po trzecie, jądra mogą być wybarwione immunologicznie, a następnie zobrazowane.Ostatecznie lokalizacje białek centri określa się za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie strefy centralnej, takie jak molekularne podstawy tworzenia się centralnego, elongacja centralna i separacja centralna. Zacznij od wyizolowania jąder drosophila, jak opisano w publikacji JoVE 2 6 4 1.Po wyizolowaniu jąder zanurz próbkę w sześciu mikrolitrach świeżo przygotowanego buforu barwiącego o temperaturze pokojowej na dodatnio naładowanym szkiełku mikroskopowym. Odczekaj 10 minut, a następnie delikatnie zmyj nadmiar DPI, dwukrotnie wymieniając bufor barwiący. Z sześcioma mikrolitrami PBS.Uważaj, aby nie zmyć jąder. Usuń roztwory ze szkiełka, używając kawałka bibuły filtracyjnej, aby je odjąć. Sześć mikrolitrów dobrze sprawdza się w przypadku szkiełek nakrywkowych o powierzchni 18 milimetrów kwadratowych.Teraz pomaga użycie ostrego skalpela do przekłucia jąder w pobliżu interesującego typu komórki, a to minimalizuje nacisk na te komórki podczas etapu zgniatania. Następnie ostrożnie umieść szkiełko nakrywkowe na próbce i uszczelnij ją lakierem do paznokci. Następnie zaznacz długopisem pozycję jąder na szkiełku i przystąp do obrazowania.Po wyizolowaniu jąder zanurz je w sześciomikrolitrowej kropli PBS na dodatnio naładowanym szklanym szkiełku mikroskopowym. Ręcznie ustaw jądra w sposób liniowy lub w inny preferowany sposób. Następnie użyj kawałka bibuły filtracyjnej, aby usunąć PBS i zastąp go sześcioma mikrolitrami świeżo przygotowanego stałego buforu.Po pięciu minutach w stałym buforze odetnij go kawałkiem bibuły filtracyjnej. Teraz zanurz próbkę w sześciu mikrolitrach świeżo przygotowanego buforu barwiącego DPI na 10 minut. Zmyj DPI, zastępując je dwoma sześciolitrowymi objętościami PBS.Następnie ostrożnie umieść szkiełko nakrywkowe o średnicy 18 milimetrów kwadratowych na próbce i uszczelnij je lakierem do paznokci. Następnie zaznacz położenie jąder na szkiełku i przystąp do obrazowania. Do tej procedury najpierw przygotuj silikonowane szkiełka nakrywkowe.Najpierw zanurz szkiełka nakrywkowe w małej tacy z roztworem silikonu na minutę w temperaturze pokojowej pod wyciągiem, upewnij się, że szkiełka nakrywkowe są całkowicie odsłonięte i nie są ułożone jeden na drugim. Następnie umyj szkiełka nawierzchniowe trzy razy w wodzie przez jedną minutę na pranie. Następnie wykonaj trzy jednominutowe pranie w 70% etanolu i ostatnie jednominutowe pranie w wodzie.Następnie pozostaw silikonowane szkiełka nakrywkowe do wyschnięcia na powietrzu pod wyciągiem. Po wypreparowaniu kilku jąder i przecięciu szkiełka z typem próbki, dodaj pięć mikrolitrów PBS do silikonowanego szkiełka nakrywkowego i przenieś jądra do kropli PBS. Aby zapewnić sukces, potrzebnych jest kilka szkiełek nakrywkowych, z których każdy ma jedno jądro.Następnie pod mikroskopem preparacyjnym ostrożnie przekłuj każde z jąder, jak pokazano wcześniej. Teraz delikatnie umieść dodatnio naładowany szklany mikroskop. Nasuń na szkiełko nakrywkowe, pozwalając PBS równomiernie rozprowadzić się między szkiełkiem nakrywkowym a szkiełkiem.Następnie odchodić nadmiar buforu spomiędzy szkiełka nakrywkowego i szkiełka, co zwiększy nacisk na jądra i je zgnieci. Teraz wrzuć przygotowane szkiełko do ciekłego azotu. Można teraz przygotować i dodać do zbiornika więcej zjeżdżalni.Przed przystąpieniem do użycia dużych kleszczy wyjmij jedno z szkiełek z ciekłego azotu i szybko użyj skalpela, aby usunąć szkiełko nakrywkowe. Próbka powinna pozostać na szkiełku podstawowym podczas zdejmowania szkiełka nakrywkowego z próbki. Uważaj, aby nie rozmazać go po powierzchni suwaka S.Można to osiągnąć, używając skalpela, aby jednym szybkim ruchem zdjąć szkiełko nakrywkowe. Teraz inkubuj szkiełka w szklanym słoiku do barwienia Coplan wypełnionym metanolem. Schładzane w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez 15 minut.Po inkubacji przenieść szkiełka do słoika zawierającego aceton. Schłodzone w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza po 30 sekundach w acetonie. Myj szkiełka przez minutę w PBS w temperaturze pokojowej.Następnie inkubuj szkiełka przez 10 minut w świeżo przygotowanym PBST, aby zablokować niespecyficzne miejsca Podczas inkubacji PBS TB napełnij studzienki komory wilgotnościowej wodą Po 10 minutach wyjmij szkiełka z PBST i wysusz każde szkiełko wokół próbki. Uważaj, aby nie wysuszyć samej próbki. Ponieważ każde szkiełko jest suszone.Umieść go w komorze wilgotnościowej. Ważne jest, aby osuszyć obszar szkiełka otaczającego próbkę przed dodaniem roztworu przeciwciała. Gwarantuje to, że przeciwciało pozostaje zlokalizowane na próbce, zapobiegając w ten sposób wysuszeniu na etapie inkubacji.Następnie delikatnie upuść 100 mikrolitrów przeciwciała pierwszorzędowego rozcieńczonego w świeżo przygotowanym P-B-S-T-B-R na próbki. Użyj rozcieńczenia od jednego do 200 w przypadku niescharakteryzowanych przeciwciał. Następnie umieść jednocentymetrowy kwadratowy kawałek paraform na wierzchu próbki, aby rozprowadzić roztwór przeciwciała i chronić roztwór przeciwciała przed odparowaniem.Pozostaw próbki do inkubacji przez godzinę w temperaturze pokojowej. Po godzinie za pomocą kleszczy delikatnie usuń paraformę ze szkiełek. Następnie umyj szkiełka trzy razy w PBST w temperaturze pokojowej przez pięć minut na pranie.Następnie przenieś szkiełka do komory wilgotnościowej z próbką skierowaną do góry, delikatnie dodaj 100 mikrolitrów przeciwciała wtórnego rozcieńczonego w PBST, BR na próbki. Tak jak poprzednio, nałóż paraform i odczekaj godzinę, zmyj wtórną za pomocą trzech pięciominutowych płukań w PBST, a następnie trzech pięciominutowych płukań w PBS. Następnie ostrożnie osusz szkiełka do sucha, nie dotykając próbek.Dodać sześć mikrolitrów podłoża montażowego i nałożyć standardowe szkiełko nakrywkowe. Po uszczelnieniu szkiełka nakrywkowego lakierem do paznokci i zaznaczeniu pozycji jąder przystąp do obrazowania. Centrosomy w trakcie spermatogenezy ulegają wielu przemianom morfologicznym i funkcjonalnym.Jednym z łatwo obserwowanych procesów jest wydłużenie centrosomów w spermatogoniach, marker LAR ANA jeden GFP oznacza długość 0,6 mikrona, która wydłuża się podczas spermatogenezy i osiąga długość 2,5 mikrona w prawie dojrzałych spermatydach. Ponieważ olejki centri plemników drosophila są wyjątkowo długie, obrazowanie może być wykorzystane do ilościowych stwierdzeń dotyczących wydłużenia centrosomów. W porównaniu z morfologią typu dzikiego zidentyfikowano różne mutacje, które zmieniają wzrost centralny.Dwa przykłady to zawsze mutacje wczesne i kula armatnia, które zatrzymują spermatogenezę przed wystąpieniem mejozy, ale nie blokują wydłużenia centów w tych zmutowanych olejkach cent dojrzałych spermatocytów rosną do około 2,4 mikrona w porównaniu do centów olejków komórek kontrolnych, które osiągają maksymalną długość 1,8 mikrona. Po opanowaniu ścieżki A można ją wykonać w 20 minut, ścieżki B w 30 minut, a ścieżki C w ciągu trzech do pięciu godzin, w zależności od wielkości próby. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak obrazować centrosom w locie.

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Metody izolowania i przygotowywania próbek jąder Drosophila (żywych i stałych) do obrazowania za pomocą mikroskopii kontrastu fazowego i fluorescencji są opisane tutaj.

Cytologiczna analiza spermatogenezy: żywe i utrwalone preparaty jąder Drosophila

Barwienie immunologiczne jest skuteczną techniką wizualizacji określonych typów komórek i białek w tkankach. Wykorzystując sonikację, opisany tutaj protokół łagodzi potrzebę preparowania tkanek Drosophila melanogaster z zarodków i larw w późnym stadium przed barwieniem immunologicznym. Zapewniamy skuteczną metodologię barwienia immunologicznego całych larw utrwalonych formaldehydem.

Wspomagane sonikacją barwienie immunofluorescencyjne tkanek drobnoustrojowych i larwalnych drobnoustrojowych i larwalnych Drosophila in situ

Tutaj opracowano nowatorski ilościowy test fluorescencyjny do pomiaru zmian poziomu białka szczególnie w centrosomach poprzez normalizację intensywności fluorescencji tego białka do odpowiedniego wzorca wewnętrznego.

Ilościowy test immunofluorescencyjny do pomiaru zmienności poziomów białek w centrosomach

Tutaj opisujemy protokoły wykrywania endogennych i egzogennych białek centromer-kinetochoru w komórkach ludzkich i ilościowego określania tych poziomów białek w centromerach-kinetochorach poprzez pośrednie barwienie immunofluorescencyjne za pomocą utrwalania (utrwalanie paraformaldehydu, acetonu lub metanolu).

Analiza immunofluorescencyjna endogennych i egzogennych białek centromerowo-kinetochorowych

Przedstawiamy protokoły pobierania, przygotowania i obrazowania dojrzałych oocytów Drosophila. Metody te pozwalają na wizualizację zachowania chromosomów oraz składania i funkcji wrzeciona podczas mejozy.

Techniki obrazowania prometafazy i metafazy mejozy I w utrwalonych oocytach Drosophila

Celem tej techniki zgniatania kanalików jest szybka ocena cech cytologicznych rozwijających się mysich spermatocytów przy jednoczesnym zachowaniu integralności komórkowej. Metoda ta pozwala na badanie wszystkich etapów spermatogenezy i może być łatwo stosowana wraz z innymi biochemicznymi i molekularnymi podejściami biologicznymi do badania mejozy myszy.

Technika squasha kanalików nasiennych do cytologicznej analizy spermatogenezy z wykorzystaniem modelu mysiego

Celem tego protokołu jest analiza podziału komórek w nienaruszonej tkance za pomocą żywej i utrwalonej mikroskopii komórkowej przy użyciu mejocytów Drosophila. Protokół pokazuje, jak wyizolować całe, nienaruszone jądra od larw Drosophila i wczesnych poczwarek oraz jak je przetworzyć i zamontować pod mikroskopem.

Przygotowanie jąder larw i poczwarek Drosophila do analizy podziału komórkowego w żywych, nienaruszonych tkankach

Prezentujemy tutaj ulepszony protokół przygotowania całego mocowania i barwienia immunologicznego jąder Drosophila, odpowiedni do mikroskopii konfokalnej, a także umożliwiający powtarzalne i wiarygodne znakowanie. Ilustrujemy ten protokół poprzez reprezentację 3D i kwantyfikację eksperymentów kolokalizacyjnych na dużych spermatocytach S4-S5.

Barwienie immunologiczne jąder Drosophila w celu analizy konfokalnej 3D dużych spermatocytów

Prezentowany tutaj jest protokół do obrazowania żywych komórek w nienaruszonej tkance w superrozdzielczości. Ustandaryzowaliśmy warunki obrazowania bardzo wrażliwej populacji dorosłych komórek macierzystych w ich natywnym środowisku tkankowym. Technika ta polega na zrównoważeniu rozdzielczości czasowej i przestrzennej, aby umożliwić bezpośrednią obserwację zjawisk biologicznych w żywej tkance.

Obrazowanie żywych komórek w superrozdzielczości struktur subkomórkowych

Ten artykuł opisuje in-vivo hamowanie CENP-E poprzez operację jamy brzusznej i wstrzyknięcie do jąder GSK923295, cenny model męskiego podziału mejotycznego. Korzystając z testów immunofluorescencji, cytometrii przepływowej i transmisyjnej mikroskopii elektronowej, pokazujemy, że hamowanie CENP-E powoduje niewspółosiowość chromosomów i niestabilność genomu w spermatocytach myszy.

Ocena funkcjonalna kinezyny-7 CENP-E w spermatocytach za pomocą inhibicji in vivo, immunofluorescencji i cytometrii przepływowej

Ruch chromosomów podczas profazy mejotycznej to słabo poznane zjawisko, które jest fundamentalne dla powstawania zarodników. Protokół ten opisuje metodę pozyskiwania, analizy i ilościowego określania ruchów centromerów podczas profazy mejotycznej w męskich meiocytach Arabidopsis thaliana .

Charakterystyka obrazowania na żywo ruchów centromerów podczas męskiej profazy mejotycznej u Arabidopsis thaliana

Poznaj techniki obrazowania białek centrosomalnych w jądrach Drosophila podczas spermatogenezy. Ta metoda umożliwia identyfikację nowych genów i funkcji centrosomów w biologii komórkowej.

Obrazowanie centrosomów w jądrach much

Przeglądaj więcej filmów