Name: Badanie układów receptor-ligand celulosomu za pomocą spektroskopii sił pojedynczych cząsteczek opartej na AFM (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-20T13:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 34 s
Description: Poznaj spektroskopię sił pojedynczych cząsteczek opartą na AFM do badania właściwości mechanicznych i stanów zwijania białek celulosomu. Ta metoda pozwala analizować interakcje receptor-ligand w złożonych układach białkowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy potwierdzają finansowanie z grantu Europejskiej Rady ds. Badań Naukowych dla Hermanna Gauba. Michael A. Nash z wdzięcznością dziękuje za dofinansowanie z programu Society in Science - The Branco Weiss Fellowship. Autorzy dziękują Edwardowi A. Bayerowi, Yoavowi Barakowi i Danielowi B. Friedowi z Weizmann Institute of Science za hojne dostarczenie białek użytych w tym badaniu. Autorzy dziękują Hermannowi E. Gaubowi, Eliasowi M. Puchnerowi i Stefanowi W. Stahlowi za pomocne dyskusje.

<ol><li>Bayer, E. A., Belaich, J. P., Shoham, Y., Lamed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cellulosomes%3A+Multienzyme+machines+for+degradation+of+plant+cell+wall+polysaccharides%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The cellulosomes: Multienzyme machines for degradation of plant cell wall polysaccharides.</a> Annu. Rev. Microbiol. 58, 521-554 (2004).</li>
<li>Bayer, E. A., Lamed, R., White, B. A., Flint, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+Cellulosomes+to+Cellulosomics%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Rec%22%5BJournal%5D)">From Cellulosomes to Cellulosomics.</a> Chem. Rec. 8 (6), 364-377 (2008).</li>
<li>Binnig, G., Quate, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+Force+Microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+Lett%22%5BJournal%5D)">Atomic Force Microscope.</a> Phys. Rev. Lett. 56 (9), 930-933 (1986).</li>
<li>Garcı́a, R., Perez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+atomic+force+microscopy+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Surf.+Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Dynamic atomic force microscopy methods.</a> Surf. Sci. Rep. 47 (6), 197-301 (2002).</li>
<li>Engel, A., Müller, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observing+single+biomolecules+at+work+with+the+atomic+force+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Observing single biomolecules at work with the atomic force microscope.</a> Nat. Struct. Biol. 7 (9), 715-718 (2000).</li>
<li>Li, H., Cao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+Mechanics%3A+From+Single+Molecules+to+Functional+Biomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22Acc.+Chem.+Res%22%5BJournal%5D)">Protein Mechanics: From Single Molecules to Functional Biomaterials.</a> Acc. Chem. Res. 43 (10), 1331-1341 (2010).</li>
<li>Florin, E. -L., Moy, V. T., Gaub, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesion+forces+between+individual+ligand-receptor+pairs%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Adhesion forces between individual ligand-receptor pairs.</a> Science. 264 (5157), 415-417 (1994).</li>
<li>Oberhauser, A., Hansma, P., Carrion-Vazquez, M., Fernandez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stepwise+unfolding+of+titin+under+force-clamp+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Stepwise unfolding of titin under force-clamp atomic force microscopy.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98 (2), 468-472 (2001).</li>
<li>Puchner, E. M., Gaub, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+and+function%3A+probing+proteins+with+AFM-based+force+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Force and function: probing proteins with AFM-based force spectroscopy.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 19 (5), 605-614 (2009).</li>
<li>Rief, M., Gautel, M., Oesterhelt, F., Fernandez, J., Gaub, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+unfolding+of+individual+titin+immunoglobulin+domains+by+AFM%5BTitle%5D)+AND+%22Sci%22%5BJournal%5D)">Reversible unfolding of individual titin immunoglobulin domains by AFM.</a> Sci. 276 (5315), 1109-1112 (1997).</li>
<li>Stahl, S. W., Nash, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+dissection+of+the+high-affinity+cohesin%E2%80%93dockerin+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Single-molecule dissection of the high-affinity cohesin–dockerin complex.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (50), 20431-20436 (2012).</li>
<li>Boland, T., Ratner, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+measurement+of+hydrogen+bonding+in+DNA+nucleotide+bases+by+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Direct measurement of hydrogen bonding in DNA nucleotide bases by atomic force microscopy.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92 (12), 5297-5301 (1995).</li>
<li>Morfill, J., Kühner, F., Blank, K., Lugmaier, R. A., Sedlmair, J., Gaub, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B-S+Transition+in+Short+Oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">B-S Transition in Short Oligonucleotides.</a> Biophys. J. 93 (7), 2400-2409 (2007).</li>
<li>Rief, M., Clausen-Schaumann, H., Gaub, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence-dependent+mechanics+of+single+DNA+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Sequence-dependent mechanics of single DNA molecules.</a> Nat. Struct. Biol. 6 (4), 346-350 (1999).</li>
<li>Severin, P. M. D., Zou, X., Gaub, H. E., Schulten, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytosine+methylation+alters+DNA+mechanical+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Cytosine methylation alters DNA mechanical properties.</a> Nucleic Acids Res. 39 (20), 8740-8751 (2011).</li>
<li>Geisler, M., Balzer, B. N., Hugel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymer+Adhesion+at+the+Solid-Liquid+Interface+Probed+by+a+Single-Molecule+Force+Sensor%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Polymer Adhesion at the Solid-Liquid Interface Probed by a Single-Molecule Force Sensor.</a> Small. 5 (24), 2864-2869 (2009).</li>
<li>Giannotti, M. I., Vancso, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interrogation+of+Single+Synthetic+Polymer+Chains+and+Polysaccharides+by+AFM-Based+Force+Spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Phys.+Chem%22%5BJournal%5D)">Interrogation of Single Synthetic Polymer Chains and Polysaccharides by AFM-Based Force Spectroscopy.</a> Chem. Phys. Chem. 8 (16), 2290-2307 (2007).</li>
<li>Hugel, T., Rief, M., Seitz, M., Gaub, H., Netz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+Stretched+Single+Polymers%3A+Atomic-Force-Microscope+Experiments+Versus+Ab-Initio+Theory%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+Lett%22%5BJournal%5D)">Highly Stretched Single Polymers: Atomic-Force-Microscope Experiments Versus Ab-Initio Theory.</a> Phys. Rev. Lett. 94 (4), 10-1103 (2005).</li>
<li>Nash, M. A., Gaub, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Molecule+Adhesion+of+a+Stimuli-Responsive+Oligo%28ethylene+glycol%29+Copolymer+to+Gold%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Single-Molecule Adhesion of a Stimuli-Responsive Oligo(ethylene glycol) Copolymer to Gold.</a> ACS Nano. 6 (12), 10735-10742 (2012).</li>
<li>Merkel, R., Nassoy, P., Leung, A., Ritchie, K., Evans, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energy+landscapes+of+receptor-ligand+bonds+explored+with+dynamic+force+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Energy landscapes of receptor-ligand bonds explored with dynamic force spectroscopy.</a> Nature. 397 (6714), 50-53 (1999).</li>
<li>Morfill, J., Neumann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force-based+Analysis+of+Multidimensional+Energy+Landscapes%3A+Application+of+Dynamic+Force+Spectroscopy+and+Steered+Molecular+Dynamics+Simulations+to+an+Antibody+Fragment%E2%80%93Peptide%5BTitle%5D)+AND+%22Complex.+J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Force-based Analysis of Multidimensional Energy Landscapes: Application of Dynamic Force Spectroscopy and Steered Molecular Dynamics Simulations to an Antibody Fragment–Peptide.</a> Complex. J. Mol. Biol. 381 (5), 1253-1266 (2008).</li>
<li>Ortiz, C., Hadziioannou, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entropic+Elasticity+of+Single+Polymer+Chains+of+Poly%28methacrylic+acid%29+Measured+by+Atomic+Force+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Entropic Elasticity of Single Polymer Chains of Poly(methacrylic acid) Measured by Atomic Force Microscopy.</a> Macromolecules. 32 (3), 780-787 (1999).</li>
<li>Bustamante, C., Marko, J. F., Siggia, E. D., Smith, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entropic+Elasticity+of+l-phage+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Entropic Elasticity of l-phage DNA.</a> Science. 265 (5178), 1599-1600 (1994).</li>
<li>Marko, J. F., Siggia, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stretching+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Stretching DNA.</a> Macromolecules. 28 (26), 8759-8770 (1995).</li>
<li>Puchner, E. M., Franzen, G., Gautel, M., Gaub, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparing+Proteins+by+Their+Unfolding+Pattern%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Comparing Proteins by Their Unfolding Pattern.</a> Biophys. J. 95 (1), 426-434 (2008).</li>
<li>Livadaru, L., Netz, R. R., Kreuzer, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stretching+Response+of+Discrete+Semiflexible+Polymers%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Stretching Response of Discrete Semiflexible Polymers.</a> Macromolecules. 36 (10), 3732-3744 (2003).</li>
<li>Zimmermann, J. L., Nicolaus, T., Neuert, G., Blank, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thiol-based%2C+site-specific+and+covalent+immobilization+of+biomolecules+for+single-molecule+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Thiol-based, site-specific and covalent immobilization of biomolecules for single-molecule experiments.</a> Nat. Protoc. 5 (6), 975-985 (2010).</li>
<li>Gumpp, H., Stahl, S. W., Strackharn, M., Puchner, E. M., Gaub, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastable+combined+atomic+force+and+total+internal+fluorescence+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Rev.+Sci.+Instrum%22%5BJournal%5D)">Ultrastable combined atomic force and total internal fluorescence microscope.</a> Rev. Sci. Instrum. 80 (6), 063704 (2009).</li>
<li>Gustafsson, M. G. L., Clarke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scanning+force+microscope+springs+optimized+for+optical-beam+deflection+and+with+tips+made+by+controlled+fracture%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Phys%22%5BJournal%5D)">Scanning force microscope springs optimized for optical-beam deflection and with tips made by controlled fracture.</a> J. Appl. Phys. 76 (1), 172 (1994).</li>
<li>Cook, S. M., Lang, K. M., Chynoweth, K. M., Wigton, M., Simmonds, R. W., Schäffer, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+implementation+of+dynamic+methods+for+measuring+atomic+force+microscope+cantilever+spring+constants%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Practical implementation of dynamic methods for measuring atomic force microscope cantilever spring constants.</a> Nanotechnology. 17 (9), 2135-2145 (2006).</li>
<li>Proksch, R., Schäffer, T. E., Cleveland, J. P., Callahan, R. C., Viani, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Finite+optical+spot+size+and+position+corrections+in+thermal+spring+constant+calibration%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Finite optical spot size and position corrections in thermal spring constant calibration.</a> Nanotechnology. 15 (9), 1344-1350 (2004).</li>
<li>Ainavarapu, S. R. K., Brujic, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contour+Length+and+Refolding+Rate+of+a+Small+Protein+Controlled+by+Engineered+Disulfide+Bonds%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Contour Length and Refolding Rate of a Small Protein Controlled by Engineered Disulfide Bonds.</a> Biophys. J. 92 (1), 225-233 (2007).</li>
<li>Dietz, H., Rief, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+Molecular+Fingerprints+in+Single+Molecule+Force+Spectroscopy+Using+Pattern+Recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Jap.+J.+Appl.+Phys%22%5BJournal%5D)">Detecting Molecular Fingerprints in Single Molecule Force Spectroscopy Using Pattern Recognition.</a> Jap. J. Appl. Phys. 46, 5540-5542 (2007).</li>
<li>Evans, E., Ritchie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+strength+of+molecular+adhesion+bonds%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Dynamic strength of molecular adhesion bonds.</a> Biophys. J. 72 (4), 1541-1555 (1997).</li>
<li>Dietz, H., Rief, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+structure+by+mechanical+triangulation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Protein structure by mechanical triangulation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103 (5), 1244-1247 (2006).</li>
<li>Dudko, O. K., Hummer, G., Szabo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+Rates+and+Activation+Free+Energies+from+Single-Molecule+Pulling+Experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+Lett%22%5BJournal%5D)">Intrinsic Rates and Activation Free Energies from Single-Molecule Pulling Experiments.</a> Phys. Rev. Lett. 96 (10), 108101 (2006).</li>
<li>Friddle, R. W., Noy, A., De Yoreo, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interpreting+the+widespread+nonlinear+force+spectra+of+intermolecular+bonds%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Interpreting the widespread nonlinear force spectra of intermolecular bonds.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (34), 13573-13578 (2012).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Aby uzyskać znaczące dane z eksperymentów spektroskopii sił pojedynczych cząsteczek, kluczowe jest uzyskanie dobrze zdefiniowanych i powtarzalnych geometrii ciągnięcia. Zastosowany tutaj protokół skutkuje specyficzną dla miejsca immobilizacją kompleksów białkowych w zdefiniowanej geometrii ciągnięcia.
Wsporniki użyte w tym badaniu zostały wybrane ze względu na ich czułość na siłę i wysoką częstotliwość rezonansu w wodzie. Co więcej, mała krzywizna końcówki wynosząca około 10 nm jest korzystna ...

Celulosomy to duże kompleksy multienzymatyczne wyświetlane na powierzchni beztlenowych bakterii celulolitycznych (np. C. thermocellum), które wyewoluowały, aby skutecznie depolimeryzować lignocelulozę ściany komórkowej roślin do rozpuszczalnych oligosacharydów1. Główną cechą celulozoomów jest oddziaływanie kohezyna-dokeryna o wysokim powinowactwie. W najbardziej znaczącym paradygmacie wysoce konserwatywny moduł dokeryny 60-75 aminokwasów typu I jest wyświetlany na C-końcowym końcu różnych enzymów bakteryjnych. Moduł dokeryny kieruje składanie synergicznych kombinacji enzymów na niekatalityczne białko rusztowania ("rusztowanie"), które składa się z poliproteiny domen kohezyny specyficznych dla modułu dockerin typu I. Na wyższych poziomach architektura celulosomu może stać się bardzo złożona, obejmując alternatywne pary kohezyny i dokeryny (np. typ II, typ III), które zakotwiczają struktury na powierzchni komórki i umożliwiają montaż rozgałęzionych struktur zawierających wiele rusztowań2. Różne typy kohezyny-dockeriny, pomimo powiązanych struktur, wykazują zróżnicowaną specyficzność wiązania, hamując reaktywność krzyżową z niezamierzonymi rusztowaniami lub składnikami innych gatunków bakterii wytwarzających celulozomy. Podczas gdy podejścia bioinformatyczne z powodzeniem zidentyfikowały tysiące unikalnych składników celulozomalnych na poziomie genetycznym, znanych jest stosunkowo niewiele struktur białkowych, a mechanizmy działania w określaniu specyficzności kohezyny i dockeriny pozostają aktywnym obszarem badań w dziedzinie biologii strukturalnej.
Od czasu wynalezienia mikroskopu sił atomowych (AFM) przez Binniga i wsp.3, różne tryby operacyjne AFM zostały opracowane i stale ulepszane, w tym obrazowanie bezkontaktowe, obrazowanie w trybie oscylacji4 i spektroskopia sił pojedynczych cząsteczek (SMFS)5,6. SMFS przekształcił się w szeroko stosowaną technikę bezpośredniego badania pojedynczych białek7-11, kwasów nukleinowych12-15 i syntetycznych polimerów16-19. W typowym eksperymencie SMFS mającym na celu zbadanie wiązania receptor-ligand20,21, końcówka wspornika AFM jest modyfikowana za pomocą jednego z partnerów wiążących, podczas gdy płaska powierzchnia szkła jest modyfikowana za pomocą komplementarnego partnera wiążącego. Zmodyfikowany wspornik styka się z powierzchnią, co pozwala partnerom na związanie. Podstawa wspornika jest następnie wycofywana ze stałą prędkością, a siła jest mierzona za pomocą metody optycznego odchylenia dźwigni. Wynikowe ślady danych siła-odległość wykazują piki przypominające piłokształtne, jeśli ustanowiono wiązanie. W przypadkach, gdy partnerzy wiążący są połączeni z wieloma domenami białkowymi, każdy pik w śladzie siły-odległości może być skorelowany z rozwijaniem się pojedynczej domeny białkowej lub pofałdowanej poddomeny, podczas gdy ostatni pik odpowiada zerwaniu interfejsu wiązania białka. Określone pozycje elementów odpornych na siłę mogą być wykorzystane jako odcisk palca do identyfikacji różnych domen białkowych będących przedmiotem zainteresowania. Metoda ta może być stosowana do badania ważnych aminokwasów biorących udział w fałdowaniu i stabilizacji białek. W literaturze opisano wiele modeli dotyczących charakterystycznego zachowania wydłużenia siły obserwowanego w eksperymentach SMFS. Do najczęściej stosowanych modeli należą łańcuch swobodnie przegubowy (FJC) model22, łańcuch ślimakowy (WLC) model18,23-25 oraz łańcuch swobodnie obracający się (FRC) model25,26.
W naszej poprzedniej pracy11 użyliśmy spektroskopii sił pojedynczej cząsteczki do zbadania interakcji modułów kohezyny i dockeriny. W tym miejscu przedstawiono eksperymentalny protokół funkcjonalizacji powierzchni szkła i kantylu za pomocą konstruktów białkowych enzym-dokeryna i CBM-kohezyna. Prezentujemy również protokół SMFS oparty na AFM, w tym procedury akwizycji i analizy danych. Opisany protokół można łatwo uogólnić na inne układy molekularne i powinien okazać się szczególnie przydatny dla badaczy zainteresowanych parami ligandów receptorów o wysokim powinowactwie.

<table><tbody><tr><td>3-aminopropylodimetyloetoksysilan</td><td>ABCR GmbH</td><td>AB110423</td><td></td></tr><tr><td>5 kDa NHS-PEG-maleimide</td><td>Rapp Polymer</td><td>13 5000-65-35</td><td></td></tr><tr><td>TCEP Żel redukujący dwusiarczek</td><td>Thermo Scientific, Pierce</td><td>77712</td><td><a href="http://www.thermoscientific.com/pierce">www.thermoscientific.com/pierce</a></td></tr><tr><td>Tris(hydroksymetylo)aminometan</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioLever mini wsporniki z azotku krzemu</td><td>Olympus</td><td>BL-AC40TS-C2</td><td>Miękkie dozowniki</td></tr><tr><td>XYZ Siłowniki piezoelektryczne</td><td>Physik Instrumente GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Podczerwień " szerokie spektrum" Laser na podczerwień</td><td>Superlum</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MFP-3D AFM Kontroler</td><td>Asylum Research</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Igor Pro 6.31</td><td>Wavemetrics</td><td></td><td>Akwizycja i analiza danych</td></tr><tr><td>Chlorek</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>sodu Chlorek</td><td></td><td></td><td></td>wapnia</tr><tr><td>Miernik</td><td></td><td></td><td></td>pH</tr><tr><td>Boran</td><td></td><td></td><td></td> sodu</tr><tr><td>Pęseta</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Okulary nakrywkowe</td><td>Thermo Scientific, Menzel-Gl&auml; ser</td><td></td><td>Średnica 24 mm, grubość 0,5 mm</td></tr><tr>Uchwyt <td></td><td></td><td>na próbkę PTFE</td><td>wykonany na zamówienie</td></tr><tr><td>Kąpiel</td><td></td><td></td><td></td>sonicyjna</tr><tr><td>Czystość analityczna etanolu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kwas siarkowy (stężony)</td><td></td><td></td><td>czystość analityczna</td></tr><tr><td>Nadtlenek wodoru (30%)czystość</td><td></td><td></td> <td>analityczna</td></tr><tr><td>Wytrząsarka orbitalna</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Czystość analityczna</td> <td>toluenu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bibuła</td><td></td><td></td><td></td>filtracyjna</tr><tr><td>Szkiełka</td><td></td><td></td><td></td>podstawowe</tr><tr><td>Mikroprobówki Mikropipety</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wirówka przystosowana</td><td></td><td></td><td>do mikroprobówek</td></tr><tr><td>Rotator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>szalki</td><td></td><td></td><td></td>Petriego</tr><tr><td>Zlewki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td></td><td></td><td></td> optyczny</tr></tbody></table>

badanie układów receptor-ligand celulosomu za pomocą spektroskopii sił pojedynczych cząsteczek opartej na afm

Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy

Celulozomy to dyskretne kompleksy multienzymatyczne używane przez podzbiór beztlenowych bakterii i grzybów do trawienia substratów lignocelulozowych. Składanie enzymów na niekatalitycznym białku rusztowania jest kierowane przez interakcje między rodziną powiązanych par receptor-ligand składających się z oddziałujących modułów kohezyny i dokeryny. Niezwykle silne wiązanie między modułami kohezyny i dokeryny powoduje stałe dysocjacji w niskim zakresie od pikomolarnego do nanomolowego, co może utrudniać dokładne pomiary poza szybkością przy użyciu konwencjonalnych metod masowych. Spektroskopia sił pojedynczych cząsteczek (SMFS) z mikroskopem sił atomowych mierzy reakcję poszczególnych biomolekuł na siłę i w przeciwieństwie do innych metod manipulacji pojedynczymi cząsteczkami (tj. pęsety optycznej) jest optymalna do badania oddziaływań receptor-ligand o wysokim powinowactwie ze względu na jej zdolność do badania reżimu dużej siły (>120 pN). Tutaj przedstawiamy nasz kompletny protokół badania zespołów białek celulozomalnych na poziomie pojedynczej cząsteczki. Korzystając z topologii białek pochodzących z natywnego celulosomu, pracowaliśmy z białkami fuzyjnymi enzym-dockerin i moduł-kohezyna wiążąca węglowodany (CBM-kohezyna), z których każde zawierało dostępną wolną grupę tiolową na zmodyfikowanej reszcie cysteiny. Przedstawiamy nasz protokół immobilizacji powierzchni specyficzny dla danego miejsca, wraz z naszą procedurą pomiaru i analizy danych w celu uzyskania szczegółowych parametrów wiązania dla kompleksu o wysokim powinowactwie. Pokazujemy, jak określić ilościowo siły rozwijające pojedynczą subdomenę, złożone siły zrywające, odchylenia kinetyczne i potencjalne szerokości studni wiążącej. Dalej opisano skuteczne zastosowanie tych metod w charakterystyce oddziaływania kohezyna-dokeryna odpowiedzialnego za tworzenie wielodomenowych kompleksów celulolitycznych.

Opisaną procedurę wykorzystaliśmy do zbadania pary kohezyna-dokeryna typu I z C. thermocellum. Po pomyślnym związaniu pary kohezyna-dokeryna, zarejestrowane profile siła-odległość wykazały charakterystyczne wzorce pików. Typowy profil przedstawiono na Rysunku 4a. Każdy pik na profilu reprezentuje rozfałdowanie jednej subdomeny białka, a ostatni pik odpowiada dysocjacji kompleksu receptor-ligand.
W przypadku kompleksu CBM-kohezyna-dokeryna-ksylanaza badanego w niniejsz...

Celulosomy to kompleksy wieloenzymatyczne przeznaczone do trawienia celulozy. SMFS oparty na AFM wykorzystano do zbadania właściwości mechanicznych i konfiguracji fałdowania zespołów białkowych związanych z celulozonami. Przedstawiamy kompletny przepływ pracy do immobilizacji białek, pozyskiwania i analizy danych w celu zbadania interakcji poszczególnych kompleksów receptor-ligand zaangażowanych w składanie celulasomów.

Badanie układów receptor-ligand celulosomu za pomocą spektroskopii sił pojedynczych cząsteczek opartej na AFM

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the ...

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest zbadanie właściwości mechanicznych i stanów zwijania partnerów wiążących białka fuzyjne przy użyciu spektroskopii sił pojedynczej cząsteczki opartej na AFM. Osiąga się to poprzez kowalencyjną immobilizację partnerów wiążących białka na szkiełku przedmiotowym oraz na dźwigni AFM w drugim kroku, aby uzyskać ściśle określoną geometrię rozciągania. Powierzchnia szkła jest dociskana przez dźwignię, co umożliwia nawiązanie wiązania receptor-ligand.Następnie wspornik jest wycofywany ze stałą prędkością w celu rozfałdowania poszczególnych domen białkowych i rozdzielenia kompleksu receptor-ligand; uzyskane wyniki ujawniają elementy struktury trzeciorzędowej, które pełnią rolę barier energetycznych na ścieżce rozfałdowania, co znajduje odzwierciedlenie w modelach elastyczności polimerów. Dalsze informacje kinetyczne i energetyczne dotyczące partnerów wiążących można uzyskać poprzez dopasowanie modeli kinetycznych do dynamicznego widma sił. Ogólnym celem tej procedury jest badanie ścieżek rozfałdowania białek pod wpływem siły.Metoda ta pozwala na uzyskanie wglądu w stabilność mechaniczną białek. Można ją zastosować do każdego układu receptor-ligand, w którym możliwe jest zaprojektowanie dostępnej grupy plików. Badacze stosujący tę metodę po raz pierwszy mogą napotkać trudności, ponieważ kluczowe jest zachowanie odpowiedniego czasu, a manipulowanie belkami wspornikami może być wymagające.Ta metoda może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z dziedziny biofizyki, takie jak sposób rozwijania się białka wielodomenowego. Na początek umieść dwa szkiełka nakrywki o średnicy 24 mm i grubości 0,5 mm w uchwycie z PTFE, a następnie poddaj je sonikacji. Szkiełka nakrywki powinny znajdować się w mieszaninie etanolu i wody ultrapurej w stosunku 50:50 przez 15 minut.Po zakończeniu sonikacji opłucz szkiełka podstawowe wodą ultrapure i poddaj je trawieniu w roztworze piranha przez 30 minut. Po 30 minutach wyjmij szkiełka podstawowe, opłucz je wodą ultrapure i wysusz łagodnym strumieniem azotu. Następnie zanurz szkiełka podstawowe w mieszaninie etanolu, wody ultrapure i 3-aminopropylodimetyloetanosilanu w proporcjach 45:5:1.Umieść zanurzone próbki na wytrząsarce w temperaturze pokojowej na 60 minut przy prędkości około 50 obrotów na minutę. Następnie kolejno zanurz szkiełko nakrywkowe w 100% etanolu, a potem w wodzie ultrapurej, powtarzając każdą czynność dwukrotnie. Ponownie osusz szkiełka nakrywkowe pod delikatnym strumieniem azotu.Po wyschnięciu wypraź szkiełka nakrywkowe w piekarniku w temperaturze 80°C przez 30 minut. Niewykorzystane szkiełka nakrywkowe można przechowywać w atmosferze argonu do sześciu tygodni w celu przeprowadzenia aminizacji końcówek wsporników krzemowych. Najpierw umieść cztery wsporniki krzemowe na czystym szkiełku przedmiotowym i poddaj je działaniu ozonu UV przez 15 minut.Następnie zanurzcie wsporniki na trzy minuty w roztworze etanolu i 3-aminopropylodimetyloetylosilanu w stosunku 50:50, z dodatkiem 0,25% wody ultrapure. Następnie płuczcie wsporniki sekwencyjnie przez 60 sekund w becherach z toluenem, etanolem i wodą ultrapure. Po ostatnim płukaniu ostrożnie osuszcie wsporniki na papierze filtracyjnym pomiędzy płukaniami.Umieść wsporniki na czystym szkiełku przedmiotowym i wypalaj je w temperaturze 80 °C przez 30 minut. Przygotuj dwie porcje kulek redukujących siarczki TEP, odcinając najpierw końcówkę końcówki pipety 200 µL w celu zwiększenia jej średnicy, a następnie pipetując 100 µL roztworu kulek ze stanu zapasu do każdej probówki mikrocentryfużowej o pojemności 1,5 ml. Następnie dodaj 1 ml TBS do zawiesiny kulek TEP i wypłucz kulki, krótko wstrząsając probówką w wortexie.Następnie osadź kulki, wirując próbki przy 850 Gs przez trzy minuty. Ostrożnie usuń i odrzuć nadsącz za pomocą mikropipety i przepłucz kulki jeszcze dwa razy jednym mililitrem TBS. Po wirowaniu pomiędzy płukaniami i po ostatnim płukaniu, dodaj do kulek TEP stężony roztwór białka o stężeniu trzech miligramów na mililitr w stosunku jeden do dwóch i delikatnie wymieszaj zawiesinę, mieszając końcówką mikropipety, aby uniknąć wprowadzenia pęcherzyków powietrza.Następnie umieść mieszaninę zawiesiny kulek TEP z białkiem na rotatorze na 2,5 godziny. Moczyć wsporniki amino-eyes oraz szkiełka nakrywki w buforze z nadwęglanem sodu o pH 8,5 przez 45 minut, aby zdeprotonować grupy aminowe pierwotne na powierzchni. Następnie doprowadzić proszek N-H-S-P-E-G malam do temperatury pokojowej i przygotować 210 µL roztworu o stężeniu 25 µM, mieszając go w buforze z nadwęglanem sodu za pomocą wortexa.Roztwór należy wykorzystać jak najszybciej ze względu na niezwykle krótki okres półtrwania NHS. Przy pH 8.5 szybko nanieś krople roztworu N-H-S-P-E-G o objętości 30 µL na szalkę Petriego oraz 90 µL na co drugie szkiełko podstawowe. Ostrożnie umieść belki wspornikowe w kroplach o objętości 30 µL.Następnie odwróć szkiełko nakrywkowe bez kropli na szkiełko z roztworem N-H-S-P-E-G malam, aby utworzyć strukturę kanapkową z roztworem N-H-S-P-E-G MALAM. Następnie inkubuj wsporniki i szkiełka nakrywkowe z roztworem N-H-S-P-E-G MALAM w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę. Odwiruj koraliki TEP i roztwór zredukowanego białka przy 100 GS przez jedną minutę, a następnie zbierz supernatant.Następnie rozcieńcz roztwór białka w buforze TBS. Dąż do uzyskania stężenia białka podczas konjugacji powierzchniowej w zakresie od 0,5 do 2 mg/mL. Następnie odstaw zredukowane i rozcieńczone roztwory białek na kilka minut, w tym czasie płucząc wsporniki i szkiełka nakrywkowe.Opłucz szkiełka nakrywki w trzech kolejnych zlewkach z wodą ultraczystą. Usuń pozostałą ciecz ze szkiełek nakrywek, ostrożnie dotykając ich krawędzi papierem filtracyjnym. Następnie zamocuj szkiełka nakrywki w odpowiednim uchwycie do próbek, który jest kompatybilny z urządzeniem AFM, i osusz pozostałą ciecz łagodnym strumieniem azotu.Nanieś 20 µL rozcieńczonego roztworu białka w postaci kropli na środek szkiełek nakrywkowych. Następnie przepłucz wsporniki w trzech kolejnych zlewkach z wodą ultrapure, a następnie nanieś krople 30 µL drugiego rozcieńczonego roztworu białka. Inkubuj pegylowane szkiełka nakrywkowe i wsporniki z odpowiednimi rozcieńczonymi roztworami białek w temperaturze pokojowej przez jedną do dwóch godzin w komorze wilgotnościowej.Następnie za pomocą pipety należy przepłukać szkiełka nakrywki co najmniej 10 razy jednym mililitrem TBS, a następnie przechowywać je w TBS do czasu pomiaru. Należy również przepłukać wsporniki, korzystając z trzech kolejnych zlewków zawierających TBS, aby usunąć niezwiązane białka, a następnie również przechowywać je w TBS. Funkcjonalizowane wsporniki oraz szkiełka szklane należy zamontować w modelu A FM, który nadaje się do pomiarów w cieczach i obsługuje dostępny zakres prędkości w osi Z od około 200 do 5 000 nanometrów na sekundę.Podczas montowania należy zminimalizować ekspozycję na powietrze i upewnić się, że powierzchnie pozostają pokryte buforem przez cały proces, aż do prawidłowego ustawienia wiązki lasera. Pozostawić układ do wyrównania na co najmniej 30 minut, aby zredukować efekty dryftu, a w razie potrzeby przeprowadzić ponowną kalibrację. Następnie rozpocząć pomiary po pomyślnym związaniu kohezji.Zapisy siła-odległość zarejestrowane w eksperymencie Docker in pair, przedstawione tutaj, wykazują charakterystyczny wzorzec pików. Każdy pik na zapisie reprezentuje rozfałdowanie jednej poddomeny białka, przy czym ostatni pik odpowiada dysocjacji kompleksu receptor-ligand.Nagrane profile siła-odległość zostały następnie przekształcone w przestrzeń siła-długość konturowa i zestawione w histogramie pozycji bariery. Dane wykazują przyrost długości konturowej o około 89 nanometrów, który można jednoznacznie przypisać odwijaniu domeny xin w celu zbadania krajobrazu energetycznego kohezyjnego dockera i oddziaływania. Łącznie uzyskano 186 profili danych przy czterech różnych prędkościach rozciągania.Wynikowe dynamiczne widmo sił, przedstawione jako duże niebieskie koła, obrazuje najbardziej prawdopodobne siły zerwania przy danej prędkości obciążania. Wartości te dopasowano następnie do modelu Bella-Evansa; dopasowanie pozwoliło wyznaczyć wartości Koff oraz delta X, które okazały się zgodne z wcześniej opublikowanymi wynikami. Po opanowaniu metody, część eksperymentalna tej techniki może zostać wykonana w ciągu ośmiu do dziewięciu godzin.Po wykonaniu tej procedury, w ramach kolejnego eksperymentu, można przeprowadzić mutagenezę celowaną, aby określić aminokwasy kluczowe dla wiązania po jego wytworzeniu. Technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie biofizyki pojedynczych cząsteczek do badania krajobrazów fałdowania białek. Wykorzystujemy ją do badania właściwości mechanicznych SOE celulozy, które należą do najbardziej stabilnych mechanicznie znanych układów białkowych.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak przeprowadzać spektroskopię sił pojedynczych cząsteczek dla par receptor-ligand białek.

investigating-receptor-ligand-systems-cellulosome-with-afm-based

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Badanie układów receptor-liganda celulosomów z wykorzystaniem AFM-opartej spektroskopii sił dla pojedynczych cząsteczek

Przedstawiono protokół kowalencyjnego łączenia dużej różnorodności pojedynczych cząsteczek na końcówce AFM. Podano procedury i przykłady określające siłę adhezji i energię swobodną tych cząsteczek na stałych nośnikach i biointerfejsach.

Badanie adhezji pojedynczych cząsteczek za pomocą spektroskopii sił atomowych

Opisujemy protokół przygotowania dwuwarstw lipidowych i jego charakterystyki za pomocą mikroskopii sił atomowych i spektroskopii sił.

Obrazowanie mikroskopii sił atomowych i spektroskopia sił podpartych dwuwarstw lipidowych

Opisujemy technikę jednoczesnego pomiaru kinetyki wiązania pojedynczego receptora-liganda o regulowanej sile oraz obrazowania w czasie rzeczywistym sygnalizacji wapniowej w pojedynczym limfocycie T.

Sonda siły biomembrany fluorescencyjnej: jednoczesna kwantyfikacja kinetyki receptor-ligand i sygnalizacji wewnątrzkomórkowej indukowanej wiązaniem na pojedynczej komórce

Tutaj prezentujemy protokół do pomiaru siły oddziaływań między dobrze zdefiniowaną powierzchnią nieorganiczną a peptydami lub aminokwasami za pomocą pomiarów spektroskopii sił pojedynczej cząsteczki za pomocą mikroskopu sił atomowych (AFM). Informacje uzyskane z pomiaru są ważne dla lepszego zrozumienia interakcji peptyd-materiał nieorganiczny.

Wgląd w interakcje aminokwasów i peptydów z materiałami nieorganicznymi za pomocą spektroskopii sił pojedynczych cząsteczek

Opisujemy szczegółowe procedury i strategie pomiaru właściwości mechanicznych i szlaków mechanicznego rozwijania pojedynczych cząsteczek białka za pomocą mikroskopu sił atomowych. Pokazujemy również reprezentatywne wyniki jako odniesienie do selekcji i uzasadnienia dobrych zapisów pojedynczych cząsteczek białka.

Spektroskopia sił pojedynczych cząsteczek białka przy użyciu mikroskopu sił atomowych

Ten protokół opisuje kowalencyjną immobilizację białek za pomocą heterobifunkcyjnego czynnika sprzęgającego silan z powierzchniami tlenku krzemu, przeznaczoną do spektroskopii sił pojedynczych cząsteczek opartej na mikroskopii sił atomowych, której przykładem jest oddziaływanie RrgA (adhezyna końcówki pilus-1 S. pneumoniae) z fibronektyną.

Kowalencyjna immobilizacja białek do spektroskopii sił pojedynczej cząsteczki

Przedstawiamy protokół funkcjonalizacji wsporników mikroskopu sił atomowych (AFM) z pojedynczym limfocytem T i cząstką kulki do badań immunologicznych. Przedstawiono procedury badania wiązania jednoparowych komórek T z komórkami dendrytycznymi przez AFM oraz monitorowania odpowiedzi komórkowej makrofagów w czasie rzeczywistym na pojedynczą cząstkę stałą za pomocą AFM z obrazowaniem fluorescencyjnym.

Funkcjonalizacja wsporników mikroskopu sił atomowych z pojedynczymi limfocytami T lub pojedynczą cząstką do immunologicznej spektroskopii sił pojedynczych komórek

Tutaj prezentujemy protokół koniugacji monomeru białkowego za pomocą enzymów tworzących polimer białkowy o kontrolowanej sekwencji i unieruchamiania go na powierzchni w celu badań spektroskopii sił pojedynczych cząsteczek.

Synteza enzymatyczna i immobilizacja spolimeryzowanego białka za pośrednictwem OaAEP1 do spektroskopii sił pojedynczych cząsteczek

Kowalencyjne dołączanie cząsteczek sondy do końcówek wsporników mikroskopii sił atomowych (AFM) jest niezbędną techniką do badania ich właściwości fizycznych. Dzięki temu możemy określić siłę rozciągania, siłę desorpcji i długość polimerów za pomocą spektroskopii sił pojedynczych cząsteczek opartej na AFM o wysokiej odtwarzalności.

Kowalencyjne przyłączanie pojedynczych cząsteczek do spektroskopii sił opartej na AFM

Ten protokół ma na celu automatyzację pomiarów AFM na setkach komórek mikrobiologicznych. Najpierw drobnoustroje są unieruchamiane w mikrostrukturach stemplowych PDMS, a następnie pomiary spektroskopii sił są wykonywane automatycznie na setkach unieruchomionych komórek.

Automatyzacja pomiarów mikroskopem sił bioatomowych na setkach komórek C. albicans

Mikroskopia sił atomowych - spektroskopia w podczerwieni (AFM-IR) stanowi potężną platformę do badań nad bakteriami, umożliwiając osiągnięcie rozdzielczości w nanoskali. Zarówno mapowanie zmian subkomórkowych (np. po podziale komórki), jak i badania porównawcze składu chemicznego (np. wynikającego z oporności na leki) mogą być prowadzone na poziomie pojedynczej komórki u bakterii.

Mikroskopia sił atomowych w połączeniu ze spektroskopią w podczerwieni jako narzędzie do badania chemii pojedynczych bakterii

Poznaj spektroskopię sił pojedynczych cząsteczek opartą na AFM do badania właściwości mechanicznych i stanów zwijania białek celulosomu. Ta metoda pozwala analizować interakcje receptor-ligand w złożonych układach białkowych.

Badanie układów receptor-ligand celulosomu za pomocą spektroskopii sił pojedynczych cząsteczek opartej na AFM

Przeglądaj więcej filmów