Badanie układów receptor-ligand celulosomu za pomocą spektroskopii sił pojedynczych cząsteczek opartej na AFM

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest zbadanie właściwości mechanicznych i stanów fałdowania partnerów wiążących białka fuzyjne za pomocą spektroskopii sił pojedynczej cząsteczki opartej na FM. Osiąga się to poprzez kowalencyjne unieruchomienie partnerów wiążących białka na szkiełku podstawowym i na wsporniku A FM w celu uzyskania dobrze zdefiniowanej geometrii ciągnięcia w drugim kroku. Powierzchnia szkła jest wcięta wspornikiem, co umożliwia ustanowienie wiązania liganda receptora.

Następnie wspornik jest chowany ze stałą prędkością, aby rozwinąć poszczególne domeny białkowe i skojarzyć kompleks ligandów receptora, uzyskuje się wyniki, które ujawniają trzeciorzędowe elementy strukturalne, które działają jak bariery energetyczne wzdłuż szlaku rozwijania, które ujawniają się w modelach elastyczności polimeru. Dalsze informacje kinetyczne i energetyczne o partnerach wiążących można uzyskać, dopasowując modele kinetyczne do dynamicznego spektrum sił. Ogólnym celem tej procedury jest zbadanie ścieżek rozwoju białek pod wpływem siły.

Metoda ta może dostarczyć informacji na temat stabilności mechanicznej białek. Można go zastosować do dowolnego systemu ligandów receptora białkowego, który można zaprojektować za pomocą dostępnej grupy plików. Badacze stosujący tę metodę po raz pierwszy mają problem, ponieważ czas jest kluczowy, a obsługa wsporników może być trudna.

Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biofizyki, takie jak to, w jaki sposób białko wielodomenowe rozwija się na początku. Dwie szklane okładki o średnicy 24 na 24 milimetry i grubości 0,5 milimetra wsuwają się do uchwytu A-P-T-F-E, a następnie sygnalizują dźwięk. Okładkę wsuwa się w mieszaninę etanolu i wody ultraczystej o stężeniu od 50 do 50 na 15 minut.

Po zakończeniu sonikacji spłucz szkiełka nakrywkowe ultraczystą wodą i wytraw je w roztworze piranii przez 30 minut. Po 30 minutach usuń szkiełka nakrywkowe, spłucz je ultraczystą wodą i wysusz pod delikatnym strumieniem azotu. Następnie zanurz pokrywę w mieszaninie 45 do pięciu do jednego etanolu, ultraczystej wody i trzech aminopropylodimetylo-ahoy.

Zanurzone próbki należy umieścić na wytrząsarce w temperaturze pokojowej na 60 minut z prędkością około 50 obrotów na minutę. Następnie zanurz kolejno szkiełko nakrywkowe w 100% etanolu, a następnie w ultraczystej wodzie dwa razy każdy. Ponownie wysusz pokrywę pod delikatnym strumieniem azotu.

Po wyschnięciu przykrywkę pieczemy w piekarniku nagrzanym do 80 stopni Celsjusza przez 30 minut. Niewykorzystane szkiełka nakrywkowe należy przechowywać pod preparatem Argonne przez okres do sześciu tygodni w celu przeprowadzenia aminoizacji silikonowych końcówek wspornikowych. Najpierw umieść cztery silikonowe wsporniki na czystym szkiełku podstawowym i poddaj je działaniu ozonu UV przez 15 minut.

Następnie zanurz wsporniki na trzy minuty i 50 do 50 roztworu etanolu i trzech aminopropylodimetylooksy Ilene, wraz z punktem 25% ultraczystej wody. Następnie przepłucz wsporniki sekwencyjnie przez 60 sekund w piekarzach toluenu, etanolu i wody ultraczystej. Ostrożnie osusz wsporniki na bibule filtracyjnej między RIN po ostatnim płukaniu.

Umieść wsporniki na czystym szkiełku podstawowym i piecz je w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez 30 minut. Przygotuj dwie T kulek redukujących siarczki TEP diss, najpierw odcinając końcówkę końcówki pipety o pojemności 200 mikrolitrów, aby poszerzyć jej średnicę, a następnie pipetując 100 mikrolitrów roztworu kulek podstawowych do każdej mikroprobówki o pojemności 1,5 mililitra. Następnie dodaj jeden mililitr TBS do zawiesiny kulek TEP OTT i spłucz kulki, krótko obracając mikrorurkę.

Następnie granulki osadzać przez odwirowywanie próbek w temperaturze 850 g przez trzy minuty. Ostrożnie usunąć i wyrzucić supernatant za pomocą mikropipety i przepłukać kulki jeszcze dwukrotnie jednym mililitrem TBS. Wirowanie między płukaniami odbywa się po ostatnim płukaniu, dodać stężony roztwór białka w ilości trzech miligramów na mililitr do kulek TEP w stosunku jeden do dwóch i delikatnie wymieszać zawiesinę, mieszając końcówką z mikropipetą, aby uniknąć wprowadzenia pęcherzyków powietrza.

Następnie umieść mieszaninę zawiesiny z kulkami białkowymi TEP na rotatorze na 2,5 godziny. Namocz aminowe oczy, wsporniki i szkiełka nakrywkowe w buforze batu sodu o pH 8,5 przez 45 minut w celu deprotonacji pierwszorzędowych grup aminowych na powierzchni. Następnie podgrzej proszek malam N-H-S-P-E-G do temperatury pokojowej i przygotuj 210 mikrolitrów w temperaturze 25 mikromolów, wirując go w buforze sodowym chłopca ósemki.

Roztwór powinien być stosowany tak szybko, jak to możliwe ze względu na wyjątkowo krótki okres półtrwania NHS. Przy pH 8,5 szybko nanieś 30 mikrolitrów roztworu malamu N-H-S-P-E-G na szalkę Petriego i 90 mikrolitrów na co drugie szklane szkiełko nakrywkowe. Ostrożnie umieść wsporniki wewnątrz kropel o pojemności 30 mikrolitrów.

Następnie przełóż szkiełko nakrywkowe bez kropelki na szkiełko z roztworem malam N-H-S-P-E-G, aby utworzyć kanapkę z roztworem N-H-S-P-E-G MALAM. W środku inkubować wsporniki i szkiełka nakrywkowe z roztworem N-H-S-P-E-G MALAM w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę. Odwirować kulkę TEP i zredukowany roztwór białka o stężeniu 100 g przez jedną minutę i zebrać snat.

Następnie rozcieńczyć roztwór białka TBS. Dążyć do stężenia białka podczas koniugacji powierzchniowej w zakresie od 0,5 do dwóch miligramów na mililitr. Następnie odstaw zredukowane i rozcieńczone roztwory białka na kilka minut, jednocześnie spłukując wsporniki i szkiełka nakrywkowe.

Opłucz szkiełka nakrywkowe w trzech kolejnych zlewkach z ultraczystą wodą. Usuń resztki płynu z szkiełek nakrywkowych, ostrożnie dotykając krawędzi bibuły filtracyjnej. Następnie zamontuj szkiełka nakrywkowe w odpowiednim uchwycie na próbkę, który jest kompatybilny z przyrządem A FM i wysusz resztki cieczy pod delikatnym strumieniem azotu.

Nałóż 20 mikrolitrów rozcieńczonego roztworu białka w postaci kropelki na środek szkiełek nakrywkowych. Następnie opłucz wsporniki w trzech sekwencyjnych zlewkach z ultraczystą wodą, a następnie 30 mikrolitrów kropelek drugiego rozcieńczonego roztworu białka. Inkubować pegylowane szkiełka nakrywkowe i wsporniki z odpowiednimi rozcieńczonymi roztworami białkowymi w temperaturze pokojowej przez jedną do dwóch godzin w komorze wilgotnościowej.

Następnie za pomocą pipety przepłucz szkiełka nakrywkowe co najmniej 10 razy jednym mililitrem TBS, a następnie przechowuj je w TBS do czasu pomiaru. Przepłucz również wsporniki za pomocą trzech sekwencyjnych zlewek zawierających TBS, aby usunąć niezwiązane białka i przechowywać je również w TBS. Zamontuj funkcjonalizowane, wspornikowe i szklane szkiełka w modelu A FM, który nadaje się do pomiaru w cieczach i obsługuje dostępny zakres prędkości na pieto Z pieto od około 200 do 5 000 nanometrów na sekundę.

Podczas montażu puszki minimalizuj narażenie na działanie powietrza, upewnij się, że powierzchnie pozostają pokryte buforem podczas całego procesu przy prawidłowym wyregulowaniu wiązki laserowej. Pozwól systemowi zrównoważyć się przez co najmniej 30 minut, aby zmniejszyć wszelkie efekty dryftu i w razie potrzeby ponownie wyreguluj. Następnie rozpocznij wykonywanie pomiarów po pomyślnym związaniu kohezji.

Dokuj w parze zarejestrowane ślady odległości siły pokazane tutaj. Wykazują charakterystyczny wzór szczytu. Każdy pik w śladzie reprezentuje rozwijanie się jednej poddomeny białka, przy czym ostatni pik odpowiada dysocjacji kompleksu ligandów receptora.

Zarejestrowane ślady odległości siły zostały następnie przekształcone w przestrzeń długości konturu siły i zebrane w histogram położenia bariery. Dane pokazują przyrost długości konturu wynoszący około 89 nanometrów, który można jednoznacznie przypisać do rozwijania domeny xin w celu zbadania krajobrazu energetycznego spójnego doku i interakcji. Łącznie uzyskano 186 śladów danych przy czterech różnych prędkościach łączenia.

Wynikowe widmo sił dynamicznych pokazane jako duże niebieskie okręgi reprezentuje najbardziej prawdopodobne siły zrywające przy danej szybkości obciążenia. Wartości te zostały następnie dopasowane do modelu Bella Evansa, dopasowanie dało wartości dla Koffa i delta X, które okazały się dobrze zgodne z wcześniej opublikowanymi wynikami. Po opanowaniu eksperymentalną część tej techniki można wykonać w ciągu ośmiu do dziewięciu godzin.

Zgodnie z tą procedurą można przeprowadzić mutagenezę specyficzną dla miejsca w eksperymencie uzupełniającym w celu określenia aminokwasów kluczowych do wiązania po jego rozwoju. Technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się biofizyką pojedynczych cząsteczek do zbadania krajobrazów fałdowania białek. Używamy go do badania właściwości mechanicznych celulozowych SOE, które są jednymi z najbardziej stabilnych mechanicznie systemów białkowych.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykonywać spektroskopię sił pojedynczej cząsteczki na parach ligandów receptora białkowego.