Badanie układów receptor-ligand celulosomu za pomocą spektroskopii sił pojedynczych cząsteczek opartej na AFM

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest zbadanie właściwości mechanicznych i stanów zwijania partnerów wiążących białka fuzyjne przy użyciu spektroskopii sił pojedynczej cząsteczki opartej na AFM. Osiąga się to poprzez kowalencyjną immobilizację partnerów wiążących białka na szkiełku przedmiotowym oraz na dźwigni AFM w drugim kroku, aby uzyskać ściśle określoną geometrię rozciągania. Powierzchnia szkła jest dociskana przez dźwignię, co umożliwia nawiązanie wiązania receptor-ligand.

Następnie wspornik jest wycofywany ze stałą prędkością w celu rozfałdowania poszczególnych domen białkowych i rozdzielenia kompleksu receptor-ligand; uzyskane wyniki ujawniają elementy struktury trzeciorzędowej, które pełnią rolę barier energetycznych na ścieżce rozfałdowania, co znajduje odzwierciedlenie w modelach elastyczności polimerów. Dalsze informacje kinetyczne i energetyczne dotyczące partnerów wiążących można uzyskać poprzez dopasowanie modeli kinetycznych do dynamicznego widma sił. Ogólnym celem tej procedury jest badanie ścieżek rozfałdowania białek pod wpływem siły.

Metoda ta pozwala na uzyskanie wglądu w stabilność mechaniczną białek. Można ją zastosować do każdego układu receptor-ligand, w którym możliwe jest zaprojektowanie dostępnej grupy plików. Badacze stosujący tę metodę po raz pierwszy mogą napotkać trudności, ponieważ kluczowe jest zachowanie odpowiedniego czasu, a manipulowanie belkami wspornikami może być wymagające.

Ta metoda może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z dziedziny biofizyki, takie jak sposób rozwijania się białka wielodomenowego. Na początek umieść dwa szkiełka nakrywki o średnicy 24 mm i grubości 0,5 mm w uchwycie z PTFE, a następnie poddaj je sonikacji. Szkiełka nakrywki powinny znajdować się w mieszaninie etanolu i wody ultrapurej w stosunku 50:50 przez 15 minut.

Po zakończeniu sonikacji opłucz szkiełka podstawowe wodą ultrapure i poddaj je trawieniu w roztworze piranha przez 30 minut. Po 30 minutach wyjmij szkiełka podstawowe, opłucz je wodą ultrapure i wysusz łagodnym strumieniem azotu. Następnie zanurz szkiełka podstawowe w mieszaninie etanolu, wody ultrapure i 3-aminopropylodimetyloetanosilanu w proporcjach 45:5:1.

Umieść zanurzone próbki na wytrząsarce w temperaturze pokojowej na 60 minut przy prędkości około 50 obrotów na minutę. Następnie kolejno zanurz szkiełko nakrywkowe w 100% etanolu, a potem w wodzie ultrapurej, powtarzając każdą czynność dwukrotnie. Ponownie osusz szkiełka nakrywkowe pod delikatnym strumieniem azotu.

Po wyschnięciu wypraź szkiełka nakrywkowe w piekarniku w temperaturze 80°C przez 30 minut. Niewykorzystane szkiełka nakrywkowe można przechowywać w atmosferze argonu do sześciu tygodni w celu przeprowadzenia aminizacji końcówek wsporników krzemowych. Najpierw umieść cztery wsporniki krzemowe na czystym szkiełku przedmiotowym i poddaj je działaniu ozonu UV przez 15 minut.

Następnie zanurzcie wsporniki na trzy minuty w roztworze etanolu i 3-aminopropylodimetyloetylosilanu w stosunku 50:50, z dodatkiem 0,25% wody ultrapure. Następnie płuczcie wsporniki sekwencyjnie przez 60 sekund w becherach z toluenem, etanolem i wodą ultrapure. Po ostatnim płukaniu ostrożnie osuszcie wsporniki na papierze filtracyjnym pomiędzy płukaniami.

Umieść wsporniki na czystym szkiełku przedmiotowym i wypalaj je w temperaturze 80 °C przez 30 minut. Przygotuj dwie porcje kulek redukujących siarczki TEP, odcinając najpierw końcówkę końcówki pipety 200 µL w celu zwiększenia jej średnicy, a następnie pipetując 100 µL roztworu kulek ze stanu zapasu do każdej probówki mikrocentryfużowej o pojemności 1,5 ml. Następnie dodaj 1 ml TBS do zawiesiny kulek TEP i wypłucz kulki, krótko wstrząsając probówką w wortexie.

Następnie osadź kulki, wirując próbki przy 850 Gs przez trzy minuty. Ostrożnie usuń i odrzuć nadsącz za pomocą mikropipety i przepłucz kulki jeszcze dwa razy jednym mililitrem TBS. Po wirowaniu pomiędzy płukaniami i po ostatnim płukaniu, dodaj do kulek TEP stężony roztwór białka o stężeniu trzech miligramów na mililitr w stosunku jeden do dwóch i delikatnie wymieszaj zawiesinę, mieszając końcówką mikropipety, aby uniknąć wprowadzenia pęcherzyków powietrza.

Następnie umieść mieszaninę zawiesiny kulek TEP z białkiem na rotatorze na 2,5 godziny. Moczyć wsporniki amino-eyes oraz szkiełka nakrywki w buforze z nadwęglanem sodu o pH 8,5 przez 45 minut, aby zdeprotonować grupy aminowe pierwotne na powierzchni. Następnie doprowadzić proszek N-H-S-P-E-G malam do temperatury pokojowej i przygotować 210 µL roztworu o stężeniu 25 µM, mieszając go w buforze z nadwęglanem sodu za pomocą wortexa.

Roztwór należy wykorzystać jak najszybciej ze względu na niezwykle krótki okres półtrwania NHS. Przy pH 8.5 szybko nanieś krople roztworu N-H-S-P-E-G o objętości 30 µL na szalkę Petriego oraz 90 µL na co drugie szkiełko podstawowe. Ostrożnie umieść belki wspornikowe w kroplach o objętości 30 µL.

Następnie odwróć szkiełko nakrywkowe bez kropli na szkiełko z roztworem N-H-S-P-E-G malam, aby utworzyć strukturę kanapkową z roztworem N-H-S-P-E-G MALAM. Następnie inkubuj wsporniki i szkiełka nakrywkowe z roztworem N-H-S-P-E-G MALAM w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę. Odwiruj koraliki TEP i roztwór zredukowanego białka przy 100 GS przez jedną minutę, a następnie zbierz supernatant.

Następnie rozcieńcz roztwór białka w buforze TBS. Dąż do uzyskania stężenia białka podczas konjugacji powierzchniowej w zakresie od 0,5 do 2 mg/mL. Następnie odstaw zredukowane i rozcieńczone roztwory białek na kilka minut, w tym czasie płucząc wsporniki i szkiełka nakrywkowe.

Opłucz szkiełka nakrywki w trzech kolejnych zlewkach z wodą ultraczystą. Usuń pozostałą ciecz ze szkiełek nakrywek, ostrożnie dotykając ich krawędzi papierem filtracyjnym. Następnie zamocuj szkiełka nakrywki w odpowiednim uchwycie do próbek, który jest kompatybilny z urządzeniem AFM, i osusz pozostałą ciecz łagodnym strumieniem azotu.

Nanieś 20 µL rozcieńczonego roztworu białka w postaci kropli na środek szkiełek nakrywkowych. Następnie przepłucz wsporniki w trzech kolejnych zlewkach z wodą ultrapure, a następnie nanieś krople 30 µL drugiego rozcieńczonego roztworu białka. Inkubuj pegylowane szkiełka nakrywkowe i wsporniki z odpowiednimi rozcieńczonymi roztworami białek w temperaturze pokojowej przez jedną do dwóch godzin w komorze wilgotnościowej.

Następnie za pomocą pipety należy przepłukać szkiełka nakrywki co najmniej 10 razy jednym mililitrem TBS, a następnie przechowywać je w TBS do czasu pomiaru. Należy również przepłukać wsporniki, korzystając z trzech kolejnych zlewków zawierających TBS, aby usunąć niezwiązane białka, a następnie również przechowywać je w TBS. Funkcjonalizowane wsporniki oraz szkiełka szklane należy zamontować w modelu A FM, który nadaje się do pomiarów w cieczach i obsługuje dostępny zakres prędkości w osi Z od około 200 do 5 000 nanometrów na sekundę.

Podczas montowania należy zminimalizować ekspozycję na powietrze i upewnić się, że powierzchnie pozostają pokryte buforem przez cały proces, aż do prawidłowego ustawienia wiązki lasera. Pozostawić układ do wyrównania na co najmniej 30 minut, aby zredukować efekty dryftu, a w razie potrzeby przeprowadzić ponowną kalibrację. Następnie rozpocząć pomiary po pomyślnym związaniu kohezji.

Zapisy siła-odległość zarejestrowane w eksperymencie Docker in pair, przedstawione tutaj, wykazują charakterystyczny wzorzec pików. Każdy pik na zapisie reprezentuje rozfałdowanie jednej poddomeny białka, przy czym ostatni pik odpowiada dysocjacji kompleksu receptor-ligand.

Nagrane profile siła-odległość zostały następnie przekształcone w przestrzeń siła-długość konturowa i zestawione w histogramie pozycji bariery. Dane wykazują przyrost długości konturowej o około 89 nanometrów, który można jednoznacznie przypisać odwijaniu domeny xin w celu zbadania krajobrazu energetycznego kohezyjnego dockera i oddziaływania. Łącznie uzyskano 186 profili danych przy czterech różnych prędkościach rozciągania.

Wynikowe dynamiczne widmo sił, przedstawione jako duże niebieskie koła, obrazuje najbardziej prawdopodobne siły zerwania przy danej prędkości obciążania. Wartości te dopasowano następnie do modelu Bella-Evansa; dopasowanie pozwoliło wyznaczyć wartości Koff oraz delta X, które okazały się zgodne z wcześniej opublikowanymi wynikami. Po opanowaniu metody, część eksperymentalna tej techniki może zostać wykonana w ciągu ośmiu do dziewięciu godzin.

Po wykonaniu tej procedury, w ramach kolejnego eksperymentu, można przeprowadzić mutagenezę celowaną, aby określić aminokwasy kluczowe dla wiązania po jego wytworzeniu. Technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie biofizyki pojedynczych cząsteczek do badania krajobrazów fałdowania białek. Wykorzystujemy ją do badania właściwości mechanicznych SOE celulozy, które należą do najbardziej stabilnych mechanicznie znanych układów białkowych.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak przeprowadzać spektroskopię sił pojedynczych cząsteczek dla par receptor-ligand białek.