Name: Izolacja mieloidalnych komórek dendrytycznych i komórek nabłonkowych z ludzkiej grasicy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-19T21:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 7 s
Description: Poznaj metodę izolacji mieloidalnych komórek dendrytycznych i komórek nabłonkowych z ludzkiej grasicy. Protokół obejmuje rozdrabnianie mechanicznne, trawienie enzymatyczne oraz separację gradientową, zapewniając wysoką czystość uzyskanych populacji komórkowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy wdzięczni chirurgom z Oddziału Chirurgii Klatki Piersiowej i Układu Krążenia, Kliniki Uniwersyteckiej w Tybindze za dostarczenie nam próbek grasicy oraz Bruno Kyewskiemu (DKFZ, Heidelberg, Niemcy) za dostarczenie przeciwciała CDR2. Chcielibyśmy również podziękować Hansowi-Jörgowi Bühringowi i Sabrinie Grimm z sortowni (Uniwersytet w Tybindze). Prace te były wspierane przez SFB 685 i Fundację Hertie.

<ol><li>Miller, J. F. A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+discovery+of+thymus+function+and+of+thymus-derived+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunological+Reviews%22%5BJournal%5D)">The discovery of thymus function and of thymus-derived lymphocytes.</a> Immunological Reviews. 185, 7-14 (2002).</li>
<li>Klein, L., Hinterberger, M., Wirnsberger, G., Kyewski, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+presentation+in+the+thymus+for+positive+selection+and+central+tolerance+induction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Antigen presentation in the thymus for positive selection and central tolerance induction.</a> Nat Rev Immunol. 9, 833-844 (2009).</li>
<li>Vandenabeele, S., Hochrein, H., Mavaddat, N., Winkel, K., Shortman, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+thymus+contains+2+distinct+dendritic+cell+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Human thymus contains 2 distinct dendritic cell populations.</a> Blood. 97, 1733-1741 (2001).</li>
<li>Gotter, J., Brors, B., Hergenhahn, M., Kyewski, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medullary+Epithelial+Cells+of+the+Human+Thymus+Express+a+Highly+Diverse+Selection+of+Tissue-specific+Genes+Colocalized+in+Chromosomal+Clusters%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Medullary Epithelial Cells of the Human Thymus Express a Highly Diverse Selection of Tissue-specific Genes Colocalized in Chromosomal Clusters.</a> The Journal of Experimental Medicine. 199, 155-166 (2004).</li>
<li>Rouse, R. V., Bolin, L. M., Bender, J. R., Kyewski, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibodies+reactive+with+subsets+of+mouse+and+human+thymic+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+%26+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibodies reactive with subsets of mouse and human thymic epithelial cells.</a> Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 36, 1511-1517 (1988).</li>
<li>Stoeckle, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cathepsin+S+dominates+autoantigen+processing+in+human+thymic+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Autoimmunity%22%5BJournal%5D)">Cathepsin S dominates autoantigen processing in human thymic dendritic cells.</a> Journal of Autoimmunity. 38, 332-343 (2012).</li>
<li>Woods Ignatoski, K. M., Bingham, E. L., Frome, L. K., Doherty, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+trans-differentiation+of+thymus+cells+into+parathyroid-like+cells+without+genetic+manipulation%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+C+Methods%22%5BJournal%5D)">Directed trans-differentiation of thymus cells into parathyroid-like cells without genetic manipulation.</a> Tissue Eng Part C Methods. 17, 1051-1059 (2011).</li>
<li>Williams, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Cell+Analysis+of+Complex+Thymus+Stromal+Cell+Populations%3A+Rapid+Thymic+Epithelia+Preparation+Characterizes+Radiation+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Translational+Science%22%5BJournal%5D)">Single Cell Analysis of Complex Thymus Stromal Cell Populations: Rapid Thymic Epithelia Preparation Characterizes Radiation Injury.</a> Clinical and Translational Science. 2, 279-285 (2009).</li>
<li>Bendriss-Vermare, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+thymus+contains+IFN-%CE%B1-producing+CD11c-%2C+myeloid+CD11c%2B%2C+and+mature+interdigitating+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Human thymus contains IFN-α-producing CD11c-, myeloid CD11c+, and mature interdigitating dendritic cells.</a> The Journal of Clinical Investigation. 107, 835-844 (2001).</li>
<li>Schmitt, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+characterization+of+human+thymic+dendritic+cell+subsets%5BTitle%5D)+AND+%22Immunobiology%22%5BJournal%5D)">Ex vivo characterization of human thymic dendritic cell subsets.</a> Immunobiology. 212, 167-177 (2007).</li>
<li>Dzionek, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BDCA-4%3A+Three+Markers+for+Distinct+Subsets+of+Dendritic+Cells+in+Human+Peripheral+Blood%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">BDCA-4: Three Markers for Distinct Subsets of Dendritic Cells in Human Peripheral Blood.</a> The Journal of Immunology. 165, 6037-6046 (2000).</li>
<li>Wu, L., Shortman, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+thymic+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of thymic dendritic cells.</a> Seminars in Immunology. 17, 304-312 (2005).</li>
<li>Seach, N., Wong, K., Hammett, M., Boyd, R. L., Chidgey, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purified+enzymes+improve+isolation+and+characterization+of+the+adult+thymic+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Purified enzymes improve isolation and characterization of the adult thymic epithelium.</a> Journal of Immunological Methods. 385, 23-34 (2012).</li>
<li>Adamopoulou, E., Tenzer, S., Hillen, N., Klug, P., Rota, I. A., Tietz, S., Gebhardt, M., Stevanovic, S., Schild, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+MHC-peptide+matrix+of+central+tolerance+in+the+human+thymus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Exploring the MHC-peptide matrix of central tolerance in the human thymus.</a> Nature Communications. , (2013).</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Opisany tutaj protokół jest modyfikacją protokołu opublikowanego przez Göttera i wsp.4. Krytycznymi etapami w protokole są stan i wstępne przygotowanie tkanki, a także separacja gęstości Percoll. Zdecydowanie zalecamy przetworzenie tkanki tak szybko, jak to możliwe po pobraniu. Ważne jest, aby pracować szybko, ale dokładnie podczas czyszczenia i cięcia tkanki. Podczas płukania tymocytami opisanego w kroku 2.3 ważne jest, aby znaleźć właściwą równowagę podczas wywierania nacisku tylną częścią tłoka str...

Grasica jest organem, w którym zachodzi rozwój limfocytów T. Jego względny i bezwzględny rozmiar zmniejsza się wraz z wiekiem, gdy jest sukcesywnie zastępowany przez tłuszcz, chociaż aktywność grasicy można jeszcze wykryć w starszym wieku. Jego znaczenie dla odpowiedzi immunologicznej wykazano na początku lat 60. XXwieku1.
Repertuar limfocytów T jest kształtowany poprzez interakcję receptorów limfocytów T z kompleksami peptyd-MHC na różnych rodzajach grasicy, które dostarczają wskazówek o przeżyciu lub śmierci rozwijającym się limfocytom T, co skutkuje funkcjonalnym i w dużej mierze samotolerancyjnym repertuarem limfocytów T2.
Około 98% komórek w ludzkiej grasicy rozwija limfocyty T zwane tymocytami. Pozostałe 2% składa się z wielu różnych typów komórek, w tym różnych TEC (korowych, rdzeniowych, podtorebkowych), szpikowych i plazmocytoidalnych DC (mDC, pDC), makrofagów, limfocytów B, dojrzałych recyrkulujących limfocytów T, granulocytów, fibroblastów, komórek śródbłonka i bardzo rzadkich komórek nabłonkowych o fenotypie ekspresji przypominającym fenotyp komórek z innych tkanek, takich jak mięśnie, neurony i nabłonek oddechowy (ryc. 1). Spośród nich TEC i DC są głównymi typami APC występującymi w normalnej grasicy. W ostatnich latach coraz większe zainteresowanie cieszy się oczyszczaniem tych typów APC do hodowli i profilowania molekularnego. Ze względu na ich niską częstotliwość, izolacja któregokolwiek z tych typów komórek w celu szczegółowej analizy wymaga wydajnej, powtarzalnej i opłacalnej procedury. Przedstawiona metoda jest modyfikacją wcześniej opublikowanych badań3,4.
Podobnie jak w przypadku każdej innej tkanki, ekstrakcja komórek z grasicy może być osiągnięta poprzez enzymatyczną dezagregację sieci interakcji komórka-komórka i komórka-matryca, w celu uzyskania zawieszenia pojedynczych komórek. Istnieją pewne parametry, takie jak dobra wydajność dysocjacji, wydajność komórek, żywotność komórek i zatrzymywanie markerów powierzchniowych komórek, które są kluczowe i muszą być zoptymalizowane w celu pomyślnej izolacji tych rzadkich populacji komórek.
W tym protokole, izolacja podzbiorów DC i TEC odbywa się poprzez wykonanie jednokomórkowego zawieszenia tkanki poprzez mechaniczne zakłócenie i trawienie enzymatyczne. Używamy kolagenazy A z Clostridium histolyticum, która ma zrównoważony stosunek różnych aktywności enzymów, aby rozbić natywny kolagen, który utrzymuje tkankę razem. DNaza I jest zawarta w roztworze enzymu w celu zmniejszenia agregacji komórek z powodu wolnego DNA z martwych komórek (tymocyty są bardzo wrażliwe). Oferujemy również alternatywne podejście do typowego enzymatycznego trawienia tkanek polegające na mechanicznym i enzymatycznym traktowaniu tkanek wspomaganym dysocjatorem tkankowym. Zawiesina pojedynczej komórki jest następnie poddawana pojedynczemu wirowaniu o gęstości Percoll w celu wzbogacenia frakcji o niskiej gęstości (LDF) komórek. Z tej frakcji komórek DC można wyizolować poprzez barwienie markerów powierzchniowych DC (tj. CD11c+) i zastosowanie separacji magnetycznej lub sortowania komórek aktywowanego fluorescencją (FACS). W przeciwieństwie do komórek limfoidalnych stanowiących zdecydowaną większość komórek grasicy, TEC nie wyrażają CD45 na wysokich poziomach, ale są dodatnie dla cząsteczki adhezji komórek nabłonka EpCAM. cTEC można odróżnić od rdzeniastego TEC po ekspresji jeszcze niezdefiniowanego antygenu rozpoznawanego przez przeciwciało CDR-2 (korowe retikulocyty-2)4,5 i nieco niższą ekspresję EpCAM. Różnicowa koekspresja EpCAM i CDR2 pozwala na efektywną izolację tych podzbiorów TEC poprzez szybkie sortowanie komórek6.
Przedstawiony tutaj protokół jest zoptymalizowany dla ludzkiej tkanki grasicy. Czas trwania procedury zależy od ilości tkanki i zdolności eksperymentatora, a także szybkości sortera komórek, jeśli stosuje się sortowanie FACS. Zwykle protokół izolacji DC można ukończyć w ciągu 5-6 godzin, a izolacji TEC w ciągu 8-10 godzin. Izolacja podzbiorów DC i TEC z tkanki grasicy jest wrażliwa na czas. Im szybsza procedura izolacji, tym lepsza kondycja komórek. Wreszcie, wyizolowane komórki mogą być wykorzystane do dalszych badań, takich jak badania porównawcze ekspresji mRNA i białka, eksperymenty PCR, izolacja białek, profilowanie molekularne (tj. transkryptomika, analiza mikroRNA), a także hodowla komórkowa6.
Oświadczenie etyczne
Aby móc pracować z ludzką tkanką grasicy, badacz musi uzyskać zgodę lokalnej komisji etycznej lub odpowiedzialnych władz, a także świadomą pisemną zgodę dawcy (lub zazwyczaj jego rodziców, ponieważ tkanka jest zwykle pozyskiwana od nieletnich dzieci). Ponadto wszystkie tkanki ludzkie powinny być traktowane jako potencjalnie zakaźne i należy podjąć odpowiednie środki, takie jak praca w rękawiczkach itp.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Odczynniki i materiały</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>PAA</td><td>E15-842</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>PBS PAA firmy Dulbecco</td><td></td><td>H15-002</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca-Gold</td><td>PAA</td><td>A15-151</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca Albumina</td><td>PAA</td><td>K41-001</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Kolagenaza A</td><td>Roche</td><td>10 103 586 001</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>DNaza I, II stopień bydlęca trzustka</td><td>Roche</td><td>10 104 159 001</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA 10x w PBS</td><td>PAA</td><td>L11-001</td><td>stężenie 20 mg/ml</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Zestaw do znakowania białek</td><td>Sondy molekularne</td><td>A-10235</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>anty-ludzki CDR2 (oczyszczony)</td><td>Bruno Kyewski, DKFZ- Heidelberg, Niemcy</td><td></td><td>oznaczony Alexa Fluor 488</td></tr><tr><td>anty-ludzki CD45 (Pacific Blue)</td><td>Biolegend</td><td>304022</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>anty-ludzki EpCAM (APC)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-254</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>anty-ludzki CD11c (PE)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-411</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Mikrogranulki anty-PE</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-048-801</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Mikrogranulki anty-CD45, ludzkie</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-045-801</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Kolumny LS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>gentleMACS C Probówki</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-237</td><td>do dysocjatora tkanek</td></tr><tr><td>Percoll (gęstość 1.130 g/ml)</td><td>GE Healthcare, Nauki przyrodnicze</td><td>17-0891-01</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Sterylna woda destylowana (bez DNAzy/ RNAzy)</td><td>GIBCO</td><td>10977-035</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Gamunex 10%</td><td>Tajecris-Biotherapeutics</td><td>G120052</td><td>wstępne rozcieńczenie 1:10, stosować 20 &mu; L/1 x 106komórki</td></tr><tr><td>0,22 &mu; m filtr</td><td>Millex GS</td><td>SLGS033SS</td><td>Napędzany strzykawką</td></tr><tr><td>Jednostka filtrująca Stericup</td><td>Millipore</td><td>SCGPU05RE</td><td>Napędzana pompą</td></tr><tr><td>50 ml probówki wirówkowe dębowe kalenicowe PC</td><td>Nalgene</td><td>3118-0050</td><td>50 ml</td></tr><tr><td>50 ml PP rurki stożkowe</td><td>Becton Dickinson</td><td>352070</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>12 mm x 75 mm 5 ml probówki</td><td>Becton Dickinson</td><td>352058</td><td>barwienia FACS</td></tr><tr><td>Sitko do komórek 70 &mu; m</td><td>Becton Dickinson</td><td>352350</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">INSTRUMENTS</td></tr><tr><td>Cytometr-sorter przepływowy (BD FACSAriaTMIIu)</td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Sorvall Evolution R6 (wirnik)</td><td>Kendro</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Rotator REAX 2</td><td>Heidolph</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>dysocjator tkankowy gentleMACS Dysocjator</td><td>tkankowy Miltenyi Biotec</td><td>130-093 235</td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja mieloidalnych komórek dendrytycznych i komórek nabłonkowych z ludzkiej grasicy

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

W tym protokole udostępniamy metodę izolacji komórek dendrytycznych (DC) i komórek nabłonkowych (TEC) z ludzkiej grasicy. DC i TEC są głównymi typami komórek prezentujących antygen (APC) występującymi w normalnej grasicy i dobrze wiadomo, że odgrywają one różne role podczas selekcji grasicy. Komórki te są zlokalizowane w różnych mikrośrodowiskach w grasicy, a każdy typ APC stanowi tylko niewielką populację komórek. Aby lepiej zrozumieć biologię tych typów komórek, charakterystyka tych populacji komórek jest wysoce pożądana, ale ze względu na ich niską częstotliwość, izolacja któregokolwiek z tych typów komórek wymaga wydajnej i powtarzalnej procedury. Protokół ten szczegółowo opisuje metodę uzyskiwania komórek odpowiednich do charakterystyki różnych właściwości komórkowych. Tkanka grasicy ulega mechanicznemu rozerwaniu, a po różnych etapach trawienia enzymatycznego powstała zawiesina komórkowa jest wzbogacana za pomocą etapu wirowania o gęstości Percoll. W celu wyizolowania szpiku DC (CD11c+) komórki z frakcji o niskiej gęstości (LDF) są poddawane immunoselekcji przez magnetyczne sortowanie komórek. Wzbogacenie populacji TEC (mTEC, cTEC) osiąga się poprzez zubożenie komórek krwiotwórczych (CD45hi) z frakcji komórek Percollu o niskiej gęstości, umożliwiając ich późniejszą izolację poprzez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS) przy użyciu określonych markerów komórkowych. Izolowane ogniwa mogą być wykorzystywane do różnych dalszych zastosowań.

Jako materiał wyjściowy w niniejszym protokole wykorzystujemy tkankę grasicy pobraną od dzieci poddawanych korekcyjnej operacji serca i naczyń krwionośnych (Katedra Chirurgii Klatki Piersiowej i Naczyń Krwionośnych, Klinika Uniwersytecka w Tübingen), uzyskaną po wyrażeniu świadomej zgody i zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi. Ten odrzucony materiał może znacznie różnić się rozmiarem, od 2-30 g lub więcej. Liczba uzyskanych podzbiorów mDC oraz TEC (cTEC i mTEC) zależy od wielkości, a także od wieku próbki tkanki grasic...

Ten protokół szczegółowo opisuje metodę izolowania komórek prezentujących antygen z ludzkiej grasicy poprzez różne etapy enzymatycznego trawienia tkanki, następnie gęstości odwirowania zawiesiny pojedynczej komórki i na końcu magnetycznego i/lub FACS sortowania interesujących populacji komórek.

Izolacja mieloidalnych komórek dendrytycznych i komórek nabłonkowych z ludzkiej grasicy

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wyizolowanie komórek dendrytycznych i komórek nabłonkowych z ludzkiego grasicy. Osiąga się to najpierw poprzez fragmentację wypreparowanej tkanki za pomocą rozdrabniania mechanicznego. Następnie fragmenty tkanki są poddawane dalszemu trawieniu enzymatycznemu w celu uzyskania zawiesiny pojedynczych komórek.Na koniec zawiesina komórkowa jest wzbogacana o frakcję komórek o niskiej gęstości za pomocą separacji w gradiencie Percoll. Ostatecznie komórki dendrytyczne i nabłonkowe mogą zostać wyizolowane z tej frakcji poprzez sortowanie magnetyczne lub FACS, bądź kombinację obu tych metod. Przedstawiona tutaj metoda zapewnia wydajną, powtarzalną i kosztowo efektywną procedurę skutecznej izolacji oraz późniejszej analizy rzadkich populacji komórek, takich jak komórki dendrytyczne i komórki nabłonkowe grasicy występujące w ludzkim grasicy.I rotta, doktorantka z naszego laboratorium, zaprezentuje Państwu tę procedurę. W pierwszej kolejności należy umieścić tkankę grasicy w szalce Petriego zawierającej sterylni PBS o temperaturze pokojowej i wypłukać resztki krwi. Następnie do szalki należy dodać świeży PBS i za pomocą pęsety oraz nożyczek usunąć skrzepy krwi, tkankę łączną i tłuszczową, a także wszelkie części tkanki, które nie wydają się zdrowe.Po oczyszczeniu tkanki grasicy należy ją zważyć w celu uzyskania wartości referencyjnej, a następnie pociąć na jednolitych kawałków o wielkości jednego centymetra sześciennego. Teraz należy pokryć kawałki roztworem PBS i umieścić je w lodzie. Następnie, używając tłoka sterylnej strzykawki o pojemności od 10 do 20 ml, należy szybko i z umiarkowaną siłą nacisnąć tkankę, aby usunąć większość tymocytów i zmniejszyć całkowitą objętość tkanki przeznaczonej do trawienia.Roztwór stanie się widocznie mętny. W miarę uwalniania się tymocytów, delikatnie zamieszaj zawartość naczynia, a następnie za pomocą szklanego aspiratora usuń nadsącz zawierający grasicę, uważając, aby przypadkowo nie odessać fragmentów tkanki. Pomocne może być użycie sterylnego skrobaka do hodowli komórkowych w celu zgromadzenia wszystkich fragmentów tkanki po jednej stronie naczynia, a następnie nachylenie naczynia pod kątem 45 stopni i odessanie pozostałego nadsączu.Przepłucz naczynie świeżym PBS i kontynuuj zbieranie supernatantu, aż PBS stanie się względnie przezroczysty. Przeprowadź końcowe płukanie za pomocą RPMI, a następnie użyj ostrych nożyczek, aby posiekać fragmenty tkanki tak drobno, jak to możliwe — co najmniej na tyle małe, aby mogły przejść przez pipetę o objętości 5 ml w celu izolacji komórek dendrytycznych lub dc. Najpierw umieść do 10 g posiekanej tkanki w probówkach o pojemności 50 ml, dodając 10 ml roztworu kolagenazy DNA oraz 10 ml RPMI na każde 5 g tkanki.Następnie inkubować zawiesinę tkankową przez 40 minut przy powolnym obracaniu w inkubatorze termicznym w temperaturze 37 °C. Roztwór enzymu stanie się mętny w miarę uwalniania do niego komórek. Po zakończeniu trawienia wirować zawiesinę komórkową przez dwie minuty przy 110 G i w temperaturze pokojowej, abyt osadzić fragmenty tkanki, zebrać nadsącz, a następnie odwirować zawiesinę komórkową do postaci pelletu.Tym razem odlej supernatant i resuspender komórki w 10 do 50 mililitrów kompletnego medium RPMI. W zależności od wielkości osadu określ liczbę żywych komórek metodą wykluczania błękitu trypanu, a następnie umieść zawiesinę komórkową w temperaturze 37 stopni Celsjusza z lekko poluzowaną zakrętką w celu wyizolowania komórek nabłonkowych grasicy (TEC). Następnie resuspender pozostałości tkanki w 10 mililitrach świeżego roztworu kolagenazy i DNazy, dodając 10 mililitrów RPMI oraz trypsyny z EDTA.Kontynuuj trawienie fragmentów tkanek przez 40 minut w temperaturze 37°C przy łagodnym obrotach. W ciągu ostatnich 10 do 15 minut inkubacji dodaj płodową surowicę cielęcą w stosunku jeden do pięciu, aby zneutralizować trypsynę. Po odwirowaniu fragmentów tkanek zbierz nadsącz i ponownie odwiruj zawiesinę komórkową.Tym razem ostrożnie odessaj i usuń nadsącz, dbając o to, aby nie usunąć luźnego osadu. Po zliczeniu liczby żywych komórek, umieść tę zawiesinę komórkową również w temperaturze 37 °C. Aby wzbogacić frakcję o niskiej gęstości lub komórki LDF, rozpocznij od wirowania zawiesin komórkowych wcześniej odstawionych do wzbogacenia DC i tech, podczas gdy pozostałe komórki będą opadać podczas wirowania.Przygotuj gradient gęstości Percoll o stężeniu 1,07 g/ml. Zgodnie z tą tabelą, resuspenduj oba osady do stężenia 1 × 10⁹ komórek w 6 ml przygotowanego roztworu Percoll. Wymieszaj zawiesinę komórkową w sposób zapewniający uzyskanie homogenicznego roztworu, a następnie przelej roztwory do 50 ml poliwęglanowych probówek wiriówek Corning z nakrętką.Następnie, za pomocą pipety, powoli nałóż 30 mililitrów kompletnego medium RPMI na każdą probówkę, tworząc warstwę nad zawiesiną komórek perca. Uważając, aby nie zmieszać warstw, ostrożnie przenieś probówki do schłodzonej wcześniej wirówki z rotorem kątowym i wirować komórki przez 35 minut. Następnie, używając sterylnych pipet Pasteura, ostrożnie przenieś wzbogacone frakcje komórek o niskiej gęstości z granicy faz między komórkami perca a medium do probówek o pojemności 50 mililitrów zawierających zimne kompletne RPMI.Następnie napełniam probówki dodatkowym kompletnym RPMI, aby rozcieńczyć pozostałość na każdą komórkę. Na koniec dwukrotnie płuczę wzbogacone komórki niekompletnym RPMI, a następnie resuspenduję osad w świeżej pożywce i wyznaczam liczbę żywych komórek. Na tej pierwszej rycinie pokazany jest, zgodnie z opisem, dość duży, dziewięciocentymetrowy fragment tkanki pobrany od 6-letniego dziecka.Ważnym pierwszym krokiem jest oczyszczenie tkanki z niepożądanych elementów. Zgodnie z oznaczeniem białymi strzałkami, następnie uzyskano zawiesinę pojedynczych komórek tkanki grasicy i wzbogacono ją o frakcję komórek o niskiej gęstości. Podczas gdy typowa zawiesina pojedynczych komórek zawiera około 3% komórek H-L-A-D-R pozytywnych po separacji w gradiencie gęstości, odsetek ten wzrasta do 15–40% w frakcji komórek o dużym rozmiarze.Frakcja o niskiej gęstości w frakcji o wysokiej gęstości, która składa się głównie z jednorodnych, małych tymocytów. Takie komórki grasicze praktycznie nie występują.Mieloidalne komórki dendrytyczne można zidentyfikować na podstawie ekspresji szeregu markerów powierzchniowych, w tym CD 11 C. Niniejsza rycina przedstawia wydajną izolację komórek CD 11 C pozytywnych przy użyciu zmodyfikowanego protokołu magnetycznej separacji komórek po izolacji. Czystość CD 11 C pozytywnych komórek DC wynosiła 93%, co ustalono na podstawie immunobarwienia wyizolowanych komórek. Średnio odzysk wyizolowanych komórek CD 11 C pozytywnych wynosi od 5×10⁵ do 5×10⁶ mieloidalnych komórek dendrytycznych na 10⁹ wszystkich komórek grasicy.W niniejszej tabeli przedstawiono reprezentatywne dane uzyskane z kilku indywidualnych próbek grasicy o różnym wieku i masie tkanki, przy zastosowaniu różnych objętości wejściowych zawiesin pojedynczych komórek, a także całkowitą liczbę komórek w frakcji o niskiej gęstości oraz późniejszą wydajność i czystość uzyskania komórek CD11c-dodatnich wyłącznie we frakcji wzbogaconej w komórki prezentujące antygen. Około 0,5% komórek to komórki nabłonka korowego (CD45-low EPCA-dodatnie lub CD45-ujemne EPAM-dodatnie) oraz komórki nabłonka rdzeniowego, które można wyizolować z trawionych trypsyną stromalnych komórek wzbogaconych CD45-low/negative odpowiednio jako EPAM-low CD2-dodatnie i EPAM-high CD2-ujemne. Izolacja komórek dendrytycznych i podzbiorów komórek nabłonka grasicy z ludzkiej grasicy.Procedura jest ograniczona czasowo. Im szybciej przeprowadzona zostanie ululacja, tym lepsza będzie kondycja komórek. Po opanowaniu tego protokołu komórki dendrytyczne można wyizolować w ciągu pięciu do sześciu godzin, a nabłonkowe komórki grasicy w ciągu ośmiu do 10 godzin.Po obejrzeniu dzisiejszego filmu powinni Państwo posiadać bardzo dobrą wiedzę na temat tego, jak przygotować tkankę grasicy człowieka w celu skutecznej izolacji komórek dendrytycznych oraz komórek nabłonkowych grasicy. Izolowane komórki mogą być następnie wykorzystane w wielu różnych zastosowaniach analitycznych w celu ich dalszej charakterystyki oraz lepszego zrozumienia ich biologii.

isolation-myeloid-dendritic-cells-epithelial-cells-from-human

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Izolacja komórek dendrytycznych mieloidowych i komórek nabłonkowych z tymusu człowieka

Opisano metodę otrzymywania wysoce oczyszczonej preparacji komórek dendrytycznych z płuc myszy. Szczególny nacisk położono na izolację podgrupy konwencjonalnych komórek dendrytycznych.

Izolacja komórek dendrytycznych z płuc myszy

Tutaj opisujemy skuteczną metodę izolacji, identyfikacji i oczyszczania mysich komórek nabłonka grasicy (TEC). Protokół może być wykorzystany do badań funkcji grasicy pod kątem prawidłowego rozwoju komórek T, dysfunkcji grasicy i rekonstytucji limfocytów T.

Izolacja, identyfikacja i oczyszczanie mysich komórek nabłonkowych grasicy

Odrębne podzbiory komórek dendrytycznych istnieją jako rzadkie populacje w narządach limfoidalnych, dlatego są trudne do wyizolowania w wystarczającej liczbie i czystości do eksperymentów immunologicznych. W tym miejscu opisujemy metodę o wysokiej skuteczności i wysokiej wydajności do izolacji wszystkich obecnie znanych głównych podzbiorów komórek dendrytycznych śledziony myszy.

Wydajna i wysokowydajna metoda izolacji podzbiorów komórek dendrytycznych myszy

To badanie porównuje dwie różne metody izolacji ludzkich monocytów w celu uzyskania in vitro komórek dendrytycznych (DC). Monocyty są selekcjonowane przez przyleganie lub ujemnie wzbogacane przez separację magnetyczną. Wydajność i żywotność monocytów wraz z żywotnością, proliferacją MDDC i ekspresją markera powierzchniowego CD11c/CD14 zostaną porównane między obiema metodami.

Charakterystyka ludzkich komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów za pomocą obrazowania cytometrii przepływowej: porównanie dwóch protokołów izolacji monocytów

Tutaj pokazujemy, jak monocyty są izolowane przez magnetyczne oddzielanie kulek od komórek jednojądrzastych krwi obwodowej po odwirowaniu w gradionym gradifikacji gęstości ludzkiej krwi antykoagulowanej. Po inkubacji przez 5 dni ludzkie monocyty różnicują się w niedojrzałe komórki dendrytyczne i są gotowe do procedur eksperymentalnych w warunkach nieklinicznych.

Wytwarzanie ludzkich komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów z krwi pełnej

Opisujemy tutaj metodę izolowania i oczyszczania komórek dendrytycznych z różnych anatomicznych przedziałów w ludzkim żeńskim układzie rozrodczym w celu oceny ich cech fenotypowych i funkcjonalnych. Metodę tę można dostosować do izolowania innych komórek odpornościowych lub komórek dendrytycznych z innych tkanek błony śluzowej.

Izolacja komórek dendrytycznych z ludzkiego żeńskiego układu rozrodczego do badań fenotypowych i funkcjonalnych

DC (MoDC) pochodzące z monocytów może wykrywać niewielkie ilości cząsteczek związanych z niebezpieczeństwem i dlatego jest łatwo zapoczątkowane. Przedstawiamy szczegółowy protokół izolacji MoDC z krwi i nowotworów oraz ich aktywacji za pomocą kompleksów immunologicznych, podkreślając jednocześnie kluczowe środki ostrożności, które należy wziąć pod uwagę, aby uniknąć ich przedwczesnej aktywacji.

Protokół izolacji komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów myszy i ich późniejsza aktywacja in vitro za pomocą nowotworowych kompleksów immunologicznych

Tutaj prezentujemy protokół rozwoju i charakterystyki tolerogennych komórek dendrytycznych (TolDCs) oraz oceny ich immunoterapeutycznej użyteczności.

Rozwój i charakterystyka funkcjonalna mysich tolerogennych komórek dendrytycznych

Tutaj prezentujemy protokoły, które umożliwiają izolację komórek zrębu z mysich kości, szpiku kostnego, grasicy i ludzkiej tkanki grasicy, kompatybilne z monokomórkową multiomiką.

Izolacja komórek zrębu z narządów krwiotwórczych

Opisujemy protokoły przygotowania zawiesiny pojedynczej komórki nabłonka grasicy myszy oraz barwienia cząsteczek wewnątrzkomórkowych do analizy cytometrycznej przepływowej.

Przygotowanie jednokomórkowej zawiesiny mysich komórek nabłonka grasicy i barwienie cząsteczek wewnątrzkomórkowych do analizy cytometrii przepływowej

Opisujemy procedurę oceny zdolności środków farmakologicznych do generowania tolerogennych komórek dendrytycznych z naiwnych komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów in vitro i walidacji ich siły poprzez autologiczne generowanie regulatorowych limfocytów T.

Prosta i skuteczna metoda testowania środków immunomodulujących do wytwarzania tolerogennych komórek dendrytycznych z ludzkich monocytów CD14+

Poznaj metodę izolacji mieloidalnych komórek dendrytycznych i komórek nabłonkowych z ludzkiej grasicy. Protokół obejmuje rozdrabnianie mechanicznne, trawienie enzymatyczne oraz separację gradientową, zapewniając wysoką czystość uzyskanych populacji komórkowych.

Izolacja mieloidalnych komórek dendrytycznych i komórek nabłonkowych z ludzkiej grasicy

Przeglądaj więcej filmów