Izolacja mieloidalnych komórek dendrytycznych i komórek nabłonkowych z ludzkiej grasicy

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wyizolowanie komórek dendrytycznych i komórek nabłonkowych z ludzkiego grasicy. Osiąga się to najpierw poprzez fragmentację wypreparowanej tkanki za pomocą rozdrabniania mechanicznego. Następnie fragmenty tkanki są poddawane dalszemu trawieniu enzymatycznemu w celu uzyskania zawiesiny pojedynczych komórek.

Na koniec zawiesina komórkowa jest wzbogacana o frakcję komórek o niskiej gęstości za pomocą separacji w gradiencie Percoll. Ostatecznie komórki dendrytyczne i nabłonkowe mogą zostać wyizolowane z tej frakcji poprzez sortowanie magnetyczne lub FACS, bądź kombinację obu tych metod. Przedstawiona tutaj metoda zapewnia wydajną, powtarzalną i kosztowo efektywną procedurę skutecznej izolacji oraz późniejszej analizy rzadkich populacji komórek, takich jak komórki dendrytyczne i komórki nabłonkowe grasicy występujące w ludzkim grasicy.

I rotta, doktorantka z naszego laboratorium, zaprezentuje Państwu tę procedurę. W pierwszej kolejności należy umieścić tkankę grasicy w szalce Petriego zawierającej sterylni PBS o temperaturze pokojowej i wypłukać resztki krwi. Następnie do szalki należy dodać świeży PBS i za pomocą pęsety oraz nożyczek usunąć skrzepy krwi, tkankę łączną i tłuszczową, a także wszelkie części tkanki, które nie wydają się zdrowe.

Po oczyszczeniu tkanki grasicy należy ją zważyć w celu uzyskania wartości referencyjnej, a następnie pociąć na jednolitych kawałków o wielkości jednego centymetra sześciennego. Teraz należy pokryć kawałki roztworem PBS i umieścić je w lodzie. Następnie, używając tłoka sterylnej strzykawki o pojemności od 10 do 20 ml, należy szybko i z umiarkowaną siłą nacisnąć tkankę, aby usunąć większość tymocytów i zmniejszyć całkowitą objętość tkanki przeznaczonej do trawienia.

Roztwór stanie się widocznie mętny. W miarę uwalniania się tymocytów, delikatnie zamieszaj zawartość naczynia, a następnie za pomocą szklanego aspiratora usuń nadsącz zawierający grasicę, uważając, aby przypadkowo nie odessać fragmentów tkanki. Pomocne może być użycie sterylnego skrobaka do hodowli komórkowych w celu zgromadzenia wszystkich fragmentów tkanki po jednej stronie naczynia, a następnie nachylenie naczynia pod kątem 45 stopni i odessanie pozostałego nadsączu.

Przepłucz naczynie świeżym PBS i kontynuuj zbieranie supernatantu, aż PBS stanie się względnie przezroczysty. Przeprowadź końcowe płukanie za pomocą RPMI, a następnie użyj ostrych nożyczek, aby posiekać fragmenty tkanki tak drobno, jak to możliwe — co najmniej na tyle małe, aby mogły przejść przez pipetę o objętości 5 ml w celu izolacji komórek dendrytycznych lub dc. Najpierw umieść do 10 g posiekanej tkanki w probówkach o pojemności 50 ml, dodając 10 ml roztworu kolagenazy DNA oraz 10 ml RPMI na każde 5 g tkanki.

Następnie inkubować zawiesinę tkankową przez 40 minut przy powolnym obracaniu w inkubatorze termicznym w temperaturze 37 °C. Roztwór enzymu stanie się mętny w miarę uwalniania do niego komórek. Po zakończeniu trawienia wirować zawiesinę komórkową przez dwie minuty przy 110 G i w temperaturze pokojowej, abyt osadzić fragmenty tkanki, zebrać nadsącz, a następnie odwirować zawiesinę komórkową do postaci pelletu.

Tym razem odlej supernatant i resuspender komórki w 10 do 50 mililitrów kompletnego medium RPMI. W zależności od wielkości osadu określ liczbę żywych komórek metodą wykluczania błękitu trypanu, a następnie umieść zawiesinę komórkową w temperaturze 37 stopni Celsjusza z lekko poluzowaną zakrętką w celu wyizolowania komórek nabłonkowych grasicy (TEC). Następnie resuspender pozostałości tkanki w 10 mililitrach świeżego roztworu kolagenazy i DNazy, dodając 10 mililitrów RPMI oraz trypsyny z EDTA.

Kontynuuj trawienie fragmentów tkanek przez 40 minut w temperaturze 37°C przy łagodnym obrotach. W ciągu ostatnich 10 do 15 minut inkubacji dodaj płodową surowicę cielęcą w stosunku jeden do pięciu, aby zneutralizować trypsynę. Po odwirowaniu fragmentów tkanek zbierz nadsącz i ponownie odwiruj zawiesinę komórkową.

Tym razem ostrożnie odessaj i usuń nadsącz, dbając o to, aby nie usunąć luźnego osadu. Po zliczeniu liczby żywych komórek, umieść tę zawiesinę komórkową również w temperaturze 37 °C. Aby wzbogacić frakcję o niskiej gęstości lub komórki LDF, rozpocznij od wirowania zawiesin komórkowych wcześniej odstawionych do wzbogacenia DC i tech, podczas gdy pozostałe komórki będą opadać podczas wirowania.

Przygotuj gradient gęstości Percoll o stężeniu 1,07 g/ml. Zgodnie z tą tabelą, resuspenduj oba osady do stężenia 1 × 10⁹ komórek w 6 ml przygotowanego roztworu Percoll. Wymieszaj zawiesinę komórkową w sposób zapewniający uzyskanie homogenicznego roztworu, a następnie przelej roztwory do 50 ml poliwęglanowych probówek wiriówek Corning z nakrętką.

Następnie, za pomocą pipety, powoli nałóż 30 mililitrów kompletnego medium RPMI na każdą probówkę, tworząc warstwę nad zawiesiną komórek perca. Uważając, aby nie zmieszać warstw, ostrożnie przenieś probówki do schłodzonej wcześniej wirówki z rotorem kątowym i wirować komórki przez 35 minut. Następnie, używając sterylnych pipet Pasteura, ostrożnie przenieś wzbogacone frakcje komórek o niskiej gęstości z granicy faz między komórkami perca a medium do probówek o pojemności 50 mililitrów zawierających zimne kompletne RPMI.

Następnie napełniam probówki dodatkowym kompletnym RPMI, aby rozcieńczyć pozostałość na każdą komórkę. Na koniec dwukrotnie płuczę wzbogacone komórki niekompletnym RPMI, a następnie resuspenduję osad w świeżej pożywce i wyznaczam liczbę żywych komórek. Na tej pierwszej rycinie pokazany jest, zgodnie z opisem, dość duży, dziewięciocentymetrowy fragment tkanki pobrany od 6-letniego dziecka.

Ważnym pierwszym krokiem jest oczyszczenie tkanki z niepożądanych elementów. Zgodnie z oznaczeniem białymi strzałkami, następnie uzyskano zawiesinę pojedynczych komórek tkanki grasicy i wzbogacono ją o frakcję komórek o niskiej gęstości. Podczas gdy typowa zawiesina pojedynczych komórek zawiera około 3% komórek H-L-A-D-R pozytywnych po separacji w gradiencie gęstości, odsetek ten wzrasta do 15–40% w frakcji komórek o dużym rozmiarze.

Frakcja o niskiej gęstości w frakcji o wysokiej gęstości, która składa się głównie z jednorodnych, małych tymocytów. Takie komórki grasicze praktycznie nie występują.

Mieloidalne komórki dendrytyczne można zidentyfikować na podstawie ekspresji szeregu markerów powierzchniowych, w tym CD 11 C. Niniejsza rycina przedstawia wydajną izolację komórek CD 11 C pozytywnych przy użyciu zmodyfikowanego protokołu magnetycznej separacji komórek po izolacji. Czystość CD 11 C pozytywnych komórek DC wynosiła 93%, co ustalono na podstawie immunobarwienia wyizolowanych komórek. Średnio odzysk wyizolowanych komórek CD 11 C pozytywnych wynosi od 5×10⁵ do 5×10⁶ mieloidalnych komórek dendrytycznych na 10⁹ wszystkich komórek grasicy.

W niniejszej tabeli przedstawiono reprezentatywne dane uzyskane z kilku indywidualnych próbek grasicy o różnym wieku i masie tkanki, przy zastosowaniu różnych objętości wejściowych zawiesin pojedynczych komórek, a także całkowitą liczbę komórek w frakcji o niskiej gęstości oraz późniejszą wydajność i czystość uzyskania komórek CD11c-dodatnich wyłącznie we frakcji wzbogaconej w komórki prezentujące antygen. Około 0,5% komórek to komórki nabłonka korowego (CD45-low EPCA-dodatnie lub CD45-ujemne EPAM-dodatnie) oraz komórki nabłonka rdzeniowego, które można wyizolować z trawionych trypsyną stromalnych komórek wzbogaconych CD45-low/negative odpowiednio jako EPAM-low CD2-dodatnie i EPAM-high CD2-ujemne. Izolacja komórek dendrytycznych i podzbiorów komórek nabłonka grasicy z ludzkiej grasicy.

Procedura jest ograniczona czasowo. Im szybciej przeprowadzona zostanie ululacja, tym lepsza będzie kondycja komórek. Po opanowaniu tego protokołu komórki dendrytyczne można wyizolować w ciągu pięciu do sześciu godzin, a nabłonkowe komórki grasicy w ciągu ośmiu do 10 godzin.

Po obejrzeniu dzisiejszego filmu powinni Państwo posiadać bardzo dobrą wiedzę na temat tego, jak przygotować tkankę grasicy człowieka w celu skutecznej izolacji komórek dendrytycznych oraz komórek nabłonkowych grasicy. Izolowane komórki mogą być następnie wykorzystane w wielu różnych zastosowaniach analitycznych w celu ich dalszej charakterystyki oraz lepszego zrozumienia ich biologii.