Izolacja mieloidalnych komórek dendrytycznych i komórek nabłonkowych z ludzkiej grasicy

Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie komórek dendrytycznych i komórek nabłonkowych z ludzkiej grasicy. Osiąga się to poprzez uprzednie rozdrobnienie wypreparowanej tkanki przez mechaniczne rozerwanie. Następnie fragmenty tkanek są dalej trawione enzymatycznie w celu wytworzenia zawiesiny pojedynczej komórki.

Wreszcie, zawiesina komórkowa jest wzbogacana o frakcję komórek o niskiej gęstości poprzez separację perca. Ostatecznie komórki dendrytyczne i nabłonkowe można wyizolować z tej frakcji przez sortowanie magnetyczne lub faktograficzne, lub kombinację obu. Metoda, którą tutaj prezentujemy, zapewnia wydajną, powtarzalną i opłacalną procedurę udanej izolacji, a następnie badania populacji rzadkich komórek, takich jak komórki dendrytyczne i komórki nabłonka grasicy znajdujące się w ludzkiej grasicy.

I rotta, doktorant z naszego laboratorium zademonstruje ci procedurę. Zacznij od umieszczenia tkanki grasicy na szalce Petriego zawierającej sterylny PBS o temperaturze pokojowej i spłucz resztki krwi. Następnie dodaj świeży PBS do szalki Petriego i użyj kleszczy i nożyczek, aby usunąć wszelkie skrzepy krwi, tkankę łączną i tłuszczową oraz wszelkie części tkanki, które nie wydają się być zdrowe.

Gdy tkanka grasicy jest czysta, zważ ją w celach informacyjnych, a następnie pokrój tkankę na jednocentymetrowe kawałki sześcienne o jednolitej wielkości. Teraz przykryj kawałki PBS i umieść je na lodzie. Następnie użyj tylnej części sterylnego tłoka strzykawki o pojemności od 10 do 20 mililitrów, aby szybko wywrzeć łagodny nacisk na tkankę, aby usunąć większość tymocytów i zmniejszyć ogólną objętość tkanki do strawienia.

Roztwór stanie się widocznie mętny. Gdy tymocyty zostaną uwolnione, delikatnie wymieszaj naczynie, a następnie użyj szklanego aspiratora, aby usunąć tykanie zawierające sklarowany sklarowany sklarant, uważając, aby przypadkowo nie zassać kawałków tkanki. Pomocne może być użycie sterylnego skrobaka do hodowli komórkowych w celu skoncentrowania wszystkich kawałków tkanki po jednej stronie naczynia, a następnie przechylenie szalki pod kątem 45 stopni i odessanie pozostałego supernatantu.

Wypłukać naczynie świeżym PBS i kontynuować zbieranie supernatantu, aż PBS stanie się względnie przezroczysty. Wykonaj końcowe płukanie za pomocą RPMI, a następnie użyj ostrych nożyczek, aby zmielić kawałki tkanki tak drobno, jak to możliwe, co najmniej na tyle małe, aby wprowadzić do pięciomililitrowej pipety w celu wyizolowania komórek dendrytycznych lub prądu stałego. Najpierw umieść do 10 gramów kawałków tkanki siatkowej w 50-mililitrowych probówkach z 10 mililitrami roztworu DNA kolagenazy i 10 mililitrami RPMI na pięć gramów tkanki.

Następnie inkubować zawiesinę tkankową przez 40 minut przy powolnej rotacji w inkubatorze termicznym o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Roztwór enzymatyczny stanie się mętny, gdy komórki zostaną do niego uwolnione. Pod koniec trawienia odwirować zawiesinę komórkową przez dwie minuty w temperaturze 110 G i temperaturze pokojowej w celu osadzenia fragmentów tkanki, zebrać supernatant, a następnie zawiesinę komórkową osadzać.

Tym razem wyrzuć supernatant i ponownie zawieś ogniwa w 10 do 50 mililitrach pełnego RPMI. W zależności od wielkości osadu określ liczbę żywotnych komórek przez wykluczenie błękitu trianowego, a następnie umieść zawiesinę komórek w temperaturze 37 stopni Celsjusza z luźną nasadką, aby wyizolować komórki nabłonka grasicy lub t. Następnie Resus zawiesić resztki tkanek w 10 mililitrach świeżego roztworu DNA kolagenazy oraz 10 mililitrach RPMI i trypsyny EDTA.

Dalej trawić fragmenty tkanek przez 40 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza z delikatnym obracaniem. W ciągu ostatnich 10 do 15 minut inkubacji dodaj płodową surowicę cielęcą w stosunku od jednego do pięciu, aby zneutralizować trypsynę. Po zagnieżdżeniu fragmentów tkanek zebrać supernatant i ponownie odwirować zawiesinę komórkową.

Tym razem ostrożnie zassać i wyrzucić supernatant, uważając, aby zachować luźny osad. Po policzeniu liczby żywotnych komórek umieść tę zawiesinę komórek również w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Aby wzbogacić o frakcję o niskiej gęstości lub LDF, komórki zaczynają od granulowania zawiesin komórkowych wcześniej odłożonych do wzbogacania prądem stałym i technologią, podczas gdy komórki się obracają.

Ustaw gradient gęstości połączeń 1,07 grama na mililitr. Zgodnie z tą tabelą, resus zawiesił obie granulki do jednego razy 10 z dziewięciu komórek w sześciu mililitrach przygotowanego roztworu na połączenie. Mieszanie roztworu komórkowego na tyle, aby uzyskać jednorodną zawiesinę, a następnie przeniesienie roztworów do 50-mililitrowych probówek wirówkowych z poliwęglanu Oakridge.

Następnie za pomocą pipety powoli nałóż 30 mililitrów całkowitego RPMI na probówkę na zawiesinę komórek perca. Uważając, aby nie wymieszać warstw, ostrożnie przenieś probówki do wstępnie schłodzonej wirówki z wirnikiem o stałym kącie i oddziel komórki na 35 minut. Następnie użyj sterylnych pipet tylnych, aby ostrożnie przenieść wzbogacone frakcje komórek o niskiej gęstości z granicy faz między wywołaniem a pożywką do 50-mililitrowych probówek zawierających zimne pełne obroty na minutę.

Następnie napełniam rurki dodatkowym kompletnym RPMI, aby rozcieńczyć pozostałą część na wezwanie. Na koniec umyj wzbogacone komórki dwa razy niepełne RPMI, a następnie ponownie zawieś osad w świeżym podłożu i określ liczbę żywotnych komórek na tym pierwszym rysunku. Dość duży, dziewięciocentymetrowy fragment tkanki pobrany od 6-letniego dziecka pokazano tak, jak właśnie pokazano.

Ważnym pierwszym krokiem jest oczyszczenie tkanki z niepożądanych części. Jak wskazują białe strzałki, następnie uzyskano jednokomórkową zawiesinę tkanki grasicy i wzbogacono ją o komórki frakcji o niskiej gęstości. Podczas gdy typowa zawiesina pojedynczej komórki zawiera około 3% komórek dodatnich H-L-A-D-R po separacji gradientu gęstości, odsetek ten wzrasta do 15 do 40% w komórce o dużych rozmiarach.

Frakcja o niskiej gęstości we frakcji o wysokiej gęstości, która składa się głównie z jednorodnych. Małe tymocyty. Takich komórek praktycznie nie ma. Grasica.

Szpikowe komórki dendrytyczne można zidentyfikować na podstawie ekspresji wielu markerów powierzchniowych, w tym CD 11 C. Rysunek ten przedstawia skuteczną izolację komórek CD 11 C dodatnich przy użyciu zmodyfikowanego protokołu magnetycznej separacji komórek po izolacji. Czystość CD 11 C dodatniego DC wynosiła 93%, jak ustalono na podstawie barwienia immunologicznego izolowanych komórek. Średnio odzysk izolowanych komórek CD 11 C dodatnich wynosi pięć razy 10 do pięciu do pięciu do pięciu razy 10 do sześciu szpikowych komórek dendrytycznych na 10 do dziewięciu całkowitych komórek grasicy.

W tej tabeli reprezentatywne dane uzyskane z kilku pojedynczych próbek grasicy w różnym wieku i o różnej masie tkankowej z zakresem wejściowych zawiesin pojedynczych komórek, a także całkowita liczba komórek frakcji o niskiej gęstości i wynikająca z niej dodatnia wydajność i czystość CD 11 C są pokazane tylko w antygenie prezentującym frakcję wzbogaconą w komórki. Około 0,5% komórek to CD 45, nisko EPCA dodatnie lub CD 45 ujemne EPAM dodatnie komórki nabłonka korowego i komórki nabłonka rdzeniastego można odsortować z trawionych trypsyną CD 45 o niskiej ujemnej wzbogaconej bazie komórek zrębu odpowiednio jako epam, niski CDR dwa dodatnie i epam wysoki CD dwa ujemne. Ululacja komórek dendrytycznych i podzbiorów komórek nabłonka grasicy z ludzkich ths.

Zależy na czasie. Im szybsza procedura ululacji, tym lepsza kondycja komórek. Po opanowaniu tego protokołu komórki dendrytyczne można wyizolować w ciągu pięciu do sześciu godzin, a komórki nabłonka grasicy w ciągu ośmiu do 10 godzin.

Po obejrzeniu tego dzisiejszego filmu powinieneś bardzo dobrze zrozumieć, jak obchodzić się z ludzką tkanką grasicy w celu skutecznej izolacji komórek dendrytycznych i komórek nabłonka grasicy. Wyizolowane komórki mogą być następnie wykorzystane w wielu różnych zastosowaniach dalszych do późniejszych badań, aby dokładniej scharakteryzować komórki, a także lepiej zrozumieć ich biologię.