Ocena funkcji kończyn przednich po jednostronnym SCI szyjki macicy za pomocą nowych zadań: zmiana kroku kończyny, niestabilność postawy i obchodzenie się z makaronem

Ogólnym celem niniejszej procedury jest ocena deficytów funkcjonalnych oraz regeneracji po urazie szyjnego odcinka rdzenia kręgowego. Jest to realizowane poprzez uprzednie przyuczenie zwierząt do manipulacji oraz środowiska testowego. Następnie oceniana jest zdolność szczurów do naprzemiennego stawiania kończyn.

Następnie zwierzęta są badane pod kątem zdolności do reagowania na zmiany środka ciężkości oraz do odpowiedniego korygowania postawy ciała. Na koniec, podczas zadania z zakresu małej motoryki, wymagającego od zwierząt zjedzenia makaronu, analizowana jest funkcja czterech łap i czterech kończyn. W rezultacie można uzyskać dane wykazujące różnice w deficytach po urazie szyjnego odcinka rdzenia kręgowego, co pozwala na pogrupowanie zwierząt na podstawie deficytów funkcjonalnych korelujących z różnicami anatomicznymi.

Główną zaletą opisanych tutaj metod w porównaniu z innymi istniejącymi metodami, takimi jak analiza śladów stóp (footprint gate analysis), jest znacznie większa łatwość ich stosowania oraz brak konieczności użycia drogiego sprzętu lub oprogramowania. Metody te pozwalają ocenić powrót funkcji po urazie rdzenia kręgowego, ale mogą być również wykorzystane w innych modelach chorób, takich jak choroba Parkinsona, udar lub inne zaburzenia neurologiczne powodujące deficyty ruchowe. Zwierzęta wykorzystane w niniejszym badaniu zostaną poddane bocznemu urazowi rdzenia kręgowego na poziomie C3-C4 od dwóch do trzech tygodni przed operacją. Należy przyzwyczaić zwierzęta do obchodzenia oraz do środowiska testowego, które jest wyłożone papierem ściernym, aby zapobiec poślizgom, podpieraniu się lub ciągnięciu kończyn.

Test naprzemienności kroków czterech kończyn pozwala określić, czy zwierzę w pełni wykorzystuje kończyny przednie; test ten można przeprowadzać codziennie przed rozpoczęciem procedury, aby upewnić się, że zwierzę przestało się szamotać, a jego mięśnie są rozluźnione. Następnie należy utrzymać zwierzę na blacie w pozycji z obciążeniem spoczywającym wyłącznie na kończynach przednich lub w pozycji „taczkowej”, tak aby jego ciało znajdowało się pod kątem niemal 90 stopni względem blatu. Gdy zwierzę wyda się rozluźnione w dłoniach, należy pchnąć je do przodu, aby poruszało się po powierzchni blatu.

Ustal i odnotuj, czy szczur naprzemiennie używa przednich kończyn podczas poruszania się po powierzchni. Powtórz ten test co najmniej dwukrotnie, trzymając zwierzę w jednej ręce, a następnie dwukrotnie, trzymając je w drugiej ręce.

Jeśli szczur pomyślnie wykazał naprzemienność kroków, należy powtórzyć test, wprowadzając pięciosekundowy czas oczekiwania po pierwszym kroku, aby sprawdzić, czy wzorzec naprzemienności utrzymuje się po opóźnieniu. Wyniki należy odnotować w arkuszu ocen. Test niestabilności postawy bada odległość, jaką zwierzę musi pokonać, wykonując krok przednią kończyną, aby odzyskać równowagę.

Podobnie jak w teście naprzemienności, zwierzę powinno rozluźnić mięśnie przed rozpoczęciem badania. Należy wykorzystać blat stołu pokryty papierem ściernym, pozwolić zwierzęciu przyjąć pozycję „taczki”, w której ciało znajduje się pod kątem bliskim 90 stopni względem stołu, lekko przytrzymać jedną z kończyn przednich przy tułowiu zwierzęcia i ustawić nos w linii zerowej, patrząc z góry. Następnie należy przesunąć szczura do przodu. Spowoduje to przesunięcie środka ciężkości zwierzęcia i pobudzi je do wykonania kroku w celu odzyskania równowagi.

Wyznacz nową pozycję nosa po wykonaniu przez szczura dwóch kroków, a średnią z tych dwóch kroków przyjmij jako dystans niezbędny do wywołania kroku. Zapisz wyniki w arkuszu oceny testu niestabilności postawy dołączonym do protokołu tekstowego. Przebadaj każdą kończynę pięć razy.

Test manipulacji makaronem służy do pomiaru czasu spożycia standardowego kawałka makaronu oraz określenia preferencji łapy podczas każdej sesji. Na jeden do dwóch tygodni przed operacją należy codziennie podawać szczurowi w jego klatce domowej od pięciu do sześciu kawałków cienkiego spaghetti o długości 4,0 cm, aby przygotować go do pomiarów bazowych. Następnie szczura umieszcza się w komorze testowej, a kawałki makaronu kładzie w przedniej części komory, co umożliwia łatwą obserwację pracy kończyn. Na koniec należy zarejestrować czas potrzebny na zjedzenie każdego kawałka makaronu.

Pozwól zwierzęciu zjeść co najmniej trzy kawałki podczas jednej sesji. Jeśli zwierzę przerwie jedzenie, wstrzymaj pomiar czasu. Wznów pomiar czasu, gdy zwierzę ponownie zacznie jeść.

Gdy szczur wykaże stały czas jedzenia makaronu przez co najmniej trzy dni podczas treningu, zwierzę jest gotowe do pomiarów bazowych w celu zebrania danych; należy położyć kawałki makaronu na podłodze przed komorą, korzystając z arkusza oceny manipulacji makaronem dostarczonego w protokole tekstowym, a następnie zarejestrować czas, w jakim szczur zjada kawałek makaronu, które kończyny zostały użyte oraz pozycje kończyn przednich, jak pokazano tutaj. Stosując test naprzemiennego kroku kończyn przednich, po chirurgicznym uszkodzeniu rdzenia kręgowego tylko 50% zwierząt było w stanie naprzemiennie używać kończyn przednich, a 50% z osobników wykazujących skuteczną naprzemienność było w stanie użyć kończyn naprzemiennie po pięciosekundowej przerwie.

Korelacja uzyskanych wyników z badaniami anatomicznymi wykazała, że osobniki naprzemienne mają znacznie większy obszar zachowanego korowo-rdzeniowego szlaku piramidowego oraz sznura tylnego po stronie przeciwległej do uszkodzenia, co wskazuje, że test naprzemienności kroków kończyn przednich może przewidywać stopień nasilenia uszkodzenia, a także jego jednostronność. Zastosowanie tego testu pozwoli na podział grup w zależności od stopnia nasilenia uszkodzenia. Na przykład, pomiary w czterokończynowej skali lokomocyjnej mogą zostać rozdzielone na podstawie stopnia nasilenia uszkodzenia w celu uzyskania jaśniejszych wyników.

W niniejszym przypadku dane zebrane podczas testu niestabilności postawy wykazują zmiany w kończynach ipsilateralnych, uszkodzonych i kontralateralnych po urazie rdzenia kręgowego. Jednostronne uszkodzenia rdzenia kręgowego mogą powodować zmiany nie tylko w kończynie upośledzonej i/lub dotkniętej urazem, ale również w kończynie nieupośledzonej. Zastosowanie testu niestabilności postawy po urazie szyjnego odcinka rdzenia kręgowego wykazało istotny wpływ stanu uszkodzenia.

Dodatkowo przemieszczenie kończyny było znacznie większe po stronie ipsilateralnej do uszkodzenia u zwierząt z urazem w porównaniu do zwierząt po operacji pozorowanej (sham). Chociaż dystans przemieszczenia kończyny po stronie kontralateralnej był znacznie mniejszy w porównaniu do zwierząt z grupy sham, jak pokazano na tej rycinie w chronicznych punktach czasowych po urazie, zarówno zwierzęta z grupy sham, jak i z grupy z uszkodzeniem poświęciły podobną ilość czasu na zjedzenie makaronu. Jednakże, podczas gdy zarówno zwierzęta z grupy sham, jak i zwierzęta z uszkodzeniem wykazujące naprzemienność (alternators) jadły makaron, używając obu łap w okresie testowym, mniejszy odsetek ciężko rannych zwierząt niewykazujących naprzemienności (non alternators) był w stanie użyć przednich kończyn po stronie ipsilateralnej do zjedzenia makaronu.

Testy te mogą zostać przeprowadzone w czasie krótszym niż pięć minut na szczura, jeśli są wykonywane prawidłowo. Opisane tutaj testy behawioralne mogą być stosowane w połączeniu z innymi istniejącymi testami behawioralnymi, takimi jak testy preferencji łapy w cylindrze (foot fault cylinder paw preference tests) oraz testy skali lokomocyjnej kończyn, aby w pełni ocenić funkcję kończyn po stronie ipsilateralnej (miejsce uszkodzenia), jak i kontralateralnej po urazie szyjnego odcinka rdzenia kręgowego.