Name: Nowatorskie trójwymiarowe urządzenie z komorą przepływową do badania wynaczynienia komórek krążących w fizjologicznych warunkach przepływu kierowanego przez chemokinę (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 56 s
Description: Poznaj metodę badania wynaczynienia komórek w trójwymiarowej komorze przepływowej z gradientem chemokin. Technika umożliwia ilościową analizę migracji komórek krążących w warunkach fizjologicznego przepływu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Chuckowi Scottowi i Victorowi McKnightowi z C.B.S. Scientific Company Inc. (<a href="http://www.cbsscientific.com/" target="_blank">www.cbsscientific.com</a>) za pomoc inżynieryjną i produkcję komory 3D, wymiennika gazowego i wkładek. Prace te były wspierane przez Narodowe Instytuty Zdrowia (granty R21DK067084 i R43CA141782 dla SKK).

1. Przygotuj górne i dolne wkładki do wzrostu komórek poprzez powlekanie kolagenem
<ol>
	<li>Oblicz liczbę wkładek potrzebnych do eksperymentu. Umieścić każdą wkładkę na oddzielnej sterylnej szalce Petriego (35 x 10 mm) i wysterylizować przez napromieniowanie (11 Gy).</li>
	<li>Przygotować roztwór kolagenu do powlekania membran: 50 μg/ml, 154 μl na wkładkę (powierzchnia wkładki 1,54 cm2).</li>
	<li>Umieść kilka kropli (~20 μl na kroplę) roztworu kolagenu w okręgu na powierzchni membrany wkładki (nie pozwól, aby końcówka pipety dotykała powierzchni), a następnie ostrożnie dodaj resztę podwielokrotności, aby utworzyć jedną dużą kroplę na powierzchni membrany. Upewnij się, że roztwór kolagenu pozostaje półkulisty i nie spływa z powierzchni błony.</li>
	<li>Przykryj szalkę Petriego pokrywką i inkubuj przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej na płaskiej powierzchni.</li>
	<li>Odessać roztwór kolagenu i raz przemyć membranę, pokrywając 160 μl PBS.</li>
	<li>Zassać PBS i założyć pokrywę. Jeśli używasz tego samego dnia, umieść szalkę Petriego w suchym miejscu w temperaturze pokojowej. W przeciwnym razie umieść naczynie w temperaturze 4 °C i zużyj wkładkę w ciągu 7 dni.</li>
</ol>
2. Hodowla komórek śródbłonka na górnych wkładkach
<ol>
	<li>Przygotować zawiesinę EC w żądanej pożywce hodowlanej. Upewnij się, że żywotność ogniw wynosi >98% i natychmiast zużyć.</li>
</ol>
Uwaga: Dla ludzkiej żyły pępowinowej EC (HUVEC), stosuje się 4 x 105 komórek po 160 μl na wkładkę.
<ol start="2">
	<li>Wziąć szalki Petriego z wkładkami pokrytymi kolagenem, przygotowanymi w sekcji 1; nie wyjmować wkładek z szalek. Umieść kilka małych kropel zawiesiny komórek (około 20 μl na kroplę) w kółko na powierzchni membrany pokrytej kolagenem (nie pozwól, aby końcówka pipety dotykała powierzchni), a następnie ostrożnie dodaj resztę zawiesiny komórek, aby utworzyć jedną dużą kroplę. Upewnij się, że zawiesina komórek pozostaje półkulista i nie spływa z powierzchni błony.</li>
	<li>Założyć pokrywki i ostrożnie umieścić szalki w inkubatorze do hodowli komórkowych o stężeniu 5% CO2 i inkubować (bez wstrząsania) w temperaturze 37 °C przez 30 minut, aby umożliwić komórkom przyczepienie się do membrany.</li>
	<li>Delikatnie dodać 5 ml pożywki hodowlanej do każdej płytki Petriego, upewniając się, że wkładka pozostaje na dnie szalki i jest całkowicie pokryta pożywką. Załóż pokrywki i ostrożnie włóż naczynia z powrotem do inkubatora. Hodować komórki w temperaturze 37 °C przez noc.</li>
	<li>W ten sam sposób należy przygotować drugą (opcjonalną) dolną wkładkę z komórkami reprezentującymi lokalne mikrośrodowisko, która zostanie umieszczona poniżej wkładki zawierającej warstwę EC.</li>
</ol>
Uwaga: jeśli dolne wkładki są uwzględnione w eksperymentach, górne i dolne wkładki są najpierw połączone ze sobą przed umieszczeniem wkładek w urządzeniu 3D (Rysunek 4B).
3. Montaż urządzenia z komorą przepływową 3D
<ol>
	<li>Przykręć ze sobą górną i dolną płytę, podłącz płytki do wymiennika gazowego za pomocą rurki, umieść zmontowane urządzenie w czystej plastikowej torbie i wysterylizuj worek i zawartość przez napromieniowanie (11 Gy).</li>
	<li>Wyjmij półkę z tacą z inkubatora do hodowli komórkowych, umieść ją w sterylnym kapturze do hodowli tkankowych, spryskaj 70% etanolem, wytrzyj, a następnie przykryj tacę dużą sterylną serwetką.</li>
	<li>Umieścić napromieniowaną plastikową torbę w kapturze, wyjąć urządzenie z worka i umieścić na sterylnej tacy inkubatora. Podłącz urządzenie do pompy perystaltycznej za pomocą dostarczonego wężyka. Zaprogramuj pompę na optymalną prędkość 0,2 ml/min. </li>
 </ol>
 Uwaga: Aby podłączyć pompę do gniazdka elektrycznego, przeciągnij przewód elektryczny przez otwór w tylnej części inkubatora. Użyj wtyczki złodziejskiej wokół przewodu, aby upewnić się, że otwór jest szczelny.
 <ol start="4">
	<li>Umieścić 5 - 7 ml żądanej pożywki hodowlanej w sterylnej probówce o pojemności 15 ml (do "wlotu").</li>
</ol>
4. Zalej urządzenie 3D Flow Chamber
<ol>
	<li>Odłącz rurkę dopływową od wylotu, wyciągając metalową igłę z rurki (użyj małych sterylnych serwetek, aby zachować sterylność rurki). Użyj metalowej igły podłączonej do rurki jako "wlotu", a odłączonego końca rurki jako "wylotu". Umieścić metalowy wlot igły w probówce o pojemności 15 ml z podłożem; Umieścić wylot w pustej probówce o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Włącz pompę tak, aby przepływ był przeciwny do ruchu wskazówek zegara i ustaw natężenie przepływu na 0,2 ml/min. Pozwól, aby podciśnienie wciągnęło medium z rurki doprowadzającej 15 ml do rurki i zatrzymaj pompę, gdy medium dotrze do końca rurki bezpośrednio przed podłączeniem do urządzenia (Rysunek 2, Przystanek #1).</li>
	<li>Odkręć górną i dolną płytę urządzenia. Ostrożnie zdjąć górną płytkę i umieścić 1 500 - 1 550 μl pożywki (samej pożywki lub z eksperymentalnymi chemokinami) w dolnych studzienkach. Upewnij się, że studzienka zawiera wystarczającą ilość podłoża, aby utworzyć półkulę, która sięga około 1 - 2 mm powyżej dolnej płyty.</li>
	<li>Przenieś przygotowaną wkładkę z szalki Petriego do dołków dolnej płytki za pomocą sterylnych kleszczy, upewniając się, że pod wkładkami nie utknęły pęcherzyki. Odessać wszelkie media, które pojawiają się na powierzchni dolnej płytki, aby upewnić się, że płytka pozostaje sucha. Umieść górną płytę z powrotem na dolnej płycie i ponownie połącz płyty za pomocą.</li>
	<li>Natychmiast włącz pompę perystaltyczną i pozwól medium przepłynąć przez urządzenie 3D. Podnieś końcówkę wylotową urządzenia i utrzymuj komorę w tej pozycji, aby zapobiec tworzeniu się pęcherzyków w przestrzeni między płytami.</li>
	<li>Pozwól, aby medium wypełniło komorę i rurkę łączącą komorę z wymiennikiem gazowym. Zatrzymać pompę natychmiast przed dotarciem medium do wymiennika gazowego (rysunek 2; Przystanek #2). Umieścić 3 ml pożywki w wymienniku gazowym, włączyć pompę i pozwolić, aby pęcherzyki powietrza uciekły przez wymiennik gazowy. Podnieś jednostkę wymiany gazu, aby medium wypełniło rurkę wychodzącą z wymiennika gazowego i zatrzymaj pompę, gdy medium osiągnie 2 - 3 cm przed końcem rurki wylotowej (Rysunek 2, Stop #3).</li>
	<li>Podłącz metalową igłę wlotową do wylotu za pomocą małych sterylnych serwetek. Przeprogramuj pompę tak, aby medium przepływało w przeciwnym kierunku (zgodnie z ruchem wskazówek zegara) w kierunku wymiennika gazowego i upewnij się, że wszelkie pęcherzyki powietrza zostały usunięte po dotarciu do wymiennika gazowego. Sprawdź, czy w systemie nie pozostały pęcherzyki powietrza.</li>
	<li>Przeprogramuj pompę tak, aby medium przepływało w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara. Dodać 100 μl zawiesiny komory testowej do jednostki wymiany gazowej. Zamknij pokrywę wymiennika gazowego, umieść tackę z systemem roboczym z powrotem w inkubatorze i pozwól komórkom testowym krążyć w urządzeniu 3D w temperaturze 37 °C przez żądany czas. 	</li>
</ol>
Uwaga: Oczyść przewód elektryczny pompy 70% etanolem i umieść go w inkubatorze.
5. Zakończ test i zbierz próbki do testu
<ol>
	<li>Wyjmij tackę z systemem roboczym z inkubatora i umieść w okapie. Zatrzymaj pompę, odłącz wlot i wylot, a końce umieść w pustych sterylnych probówkach o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Włączyć pompę i pobrać zawiesinę komórek z systemu; umieścić zawiesinę komórek na lodzie, jeśli to właściwe, do czasu użycia.</li>
	<li>Zdemontuj komorę, odkręcając i podnosząc górną płytę. Wyjmij wkładki z dolnej płyty i przenieś je na szalki Petriego.</li>
</ol>
Uwaga: Wkładki mogą być barwione w celu wizualizacji i liczenia komórek in situ (fiolet krystaliczny 0,05% w dH2O) lub trypsynizowane w celu pobrania EC do dalszych testów.
<ol start="4">
	<li>Usunąć pożywkę i komórki z dolnych studzienek do probówek i wirować przez 5 minut przy 210 x g. Usunąć supernatant, umyć i ponownie zawiesić komórki zgodnie z życzeniem, a następnie przetworzyć komórki zgodnie z określonymi celami eksperymentalnymi (omówionymi poniżej).</li>
</ol>

<ol><li>Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+promise+and+perils+of+stem+cell+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">The promise and perils of stem cell therapeutics.</a> Cell Stem Cell. 10, 740-749 (2012).</li>
<li>Khaldoyanidi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directing+stem+cell+homing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Directing stem cell homing.</a> Cell Stem Cell. 2, 198-200 (2008).</li>
<li>Laird, D. J., von Andrian, U. H., Wagers, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+trafficking+in+tissue+development%2C+growth%2C+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Stem cell trafficking in tissue development, growth, and disease.</a> Cell. 132, 612-630 (2008).</li>
<li>Lapidot, T., Kollet, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+brain-bone-blood+triad%3A+traffic+lights+for+stem-cell+homing+and+mobilization%5BTitle%5D)+AND+%22Hematology+Am.+Soc.+Hematol.+Educ.+Program%22%5BJournal%5D)">The brain-bone-blood triad: traffic lights for stem-cell homing and mobilization.</a> Hematology Am. Soc. Hematol. Educ. Program. 2010, 1-6 (2010).</li>
<li>Sackstein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycoengineering+of+HCELL%2C+the+human+bone+marrow+homing+receptor%3A+sweetly+programming+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Glycoengineering of HCELL, the human bone marrow homing receptor: sweetly programming cell migration.</a> Ann. Biomed. Eng. 40, 766-776 (2012).</li>
<li>Smart, N., Riley, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+stem+cell+movement%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">The stem cell movement.</a> Circ. Res. 102, 1155-1168 (2008).</li>
<li>Khaldoyanidi, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MDA-MB-435+human+breast+carcinoma+cell+homo-+and+heterotypic+adhesion+under+flow+conditions+is+mediated+in+part+by+Thomsen-Friedenreich+antigen-galectin-3+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">MDA-MB-435 human breast carcinoma cell homo- and heterotypic adhesion under flow conditions is mediated in part by Thomsen-Friedenreich antigen-galectin-3 interactions.</a> J. Biol. Chem. 278, 4127-4134 (2003).</li>
<li>Le Devedec, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-Photon+Intravital+Multicolour+Imaging+to+Study+Metastatic+Behaviour+of+Cancer+Cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Two-Photon Intravital Multicolour Imaging to Study Metastatic Behaviour of Cancer Cells in vivo.</a> Methods Mol. Biol. 769, 331-349 (2011).</li>
<li>Barakat, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Responsiveness+of+vascular+endothelium+to+shear+stress%3A+potential+role+of+ion+channels+and+cellular+cytoskeleton+%28review%29%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Responsiveness of vascular endothelium to shear stress: potential role of ion channels and cellular cytoskeleton (review).</a> Int. J. Mol. Med. 4, 323-332 (1999).</li>
<li>Fisher, A. B., Chien, S., Barakat, A. I., Nerem, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cellular+response+to+altered+shear+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Lung+Cell+Mol.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Endothelial cellular response to altered shear stress.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 281, L529-L533 (2001).</li>
<li>Nerem, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shear+force+and+its+effect+on+cell+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22ASGSB+Bull%22%5BJournal%5D)">Shear force and its effect on cell structure and function.</a> ASGSB Bull. 4, 87-94 (1991).</li>
<li>Topper, J. N., Gimbrone, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+flow+and+vascular+gene+expression%3A+fluid+shear+stress+as+a+modulator+of+endothelial+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Med.+Today%22%5BJournal%5D)">Blood flow and vascular gene expression: fluid shear stress as a modulator of endothelial phenotype.</a> Mol. Med. Today. 5, 40-46 (1999).</li>
<li>Giavazzi, R., Foppolo, M., Dossi, R., Remuzzi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rolling+and+adhesion+of+human+tumor+cells+on+vascular+endothelium+under+physiological+flow+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Rolling and adhesion of human tumor cells on vascular endothelium under physiological flow conditions.</a> J. Clin. Invest. 92, 3038-3044 (1993).</li>
<li>Cinamon, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+chemokine+functions+in+lymphocyte+migration+through+vascular+endothelium+under+shear+flow%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Leukoc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Novel chemokine functions in lymphocyte migration through vascular endothelium under shear flow.</a> J. Leukoc. Biol. 69, 860-866 (2001).</li>
<li>Mazo, I. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+progenitor+cell+rolling+in+bone+marrow+microvessels%3A+parallel+contributions+by+endothelial+selectins+and+vascular+cell+adhesion+molecule+1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic progenitor cell rolling in bone marrow microvessels: parallel contributions by endothelial selectins and vascular cell adhesion molecule 1.</a> J. Exp. Med. 188, 465-474 (1998).</li>
<li>Arber, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Graft+source+determines+human+hematopoietic+progenitor+distribution+pattern+within+the+CD34%28%2B%29+compartment%5BTitle%5D)+AND+%22Bone+Marrow+Transplant%22%5BJournal%5D)">Graft source determines human hematopoietic progenitor distribution pattern within the CD34(+) compartment.</a> Bone Marrow Transplant. 46, 650-658 (2012).</li>
<li>Fuji, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+blood+as+a+preferable+source+of+stem+cells+for+salvage+transplantation+in+patients+with+graft+failure+after+cord+blood+transplantation%3A+a+retrospective+analysis+of+the+registry+data+of+the+Japanese+Society+for+Hematopoietic+Cell+Transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Blood+Marrow+Transplant%22%5BJournal%5D)">Peripheral blood as a preferable source of stem cells for salvage transplantation in patients with graft failure after cord blood transplantation: a retrospective analysis of the registry data of the Japanese Society for Hematopoietic Cell Transplantation.</a> Biol. Blood Marrow Transplant. 18, 1407-1414 (2012).</li>
<li>Haspel, R. L., Miller, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cells%3A+source+matters%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Stem+Cell+Res.+Ther%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cells: source matters.</a> Curr. Stem Cell Res. Ther. 3, 229-236 (2008).</li>
<li>Schraufstatter, I. U., Discipio, R. G., Zhao, M., Khaldoyanidi, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C3a+and+C5a+are+chemotactic+factors+for+human+mesenchymal+stem+cells%2C+which+cause+prolonged+ERK1%2F2+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">C3a and C5a are chemotactic factors for human mesenchymal stem cells, which cause prolonged ERK1/2 phosphorylation.</a> J. Immunol. 182, 3827-3836 (2009).</li>
</ol>

Cascade LifeSciences Inc. posiada wyłączne prawa do patentu nr. US 7,927,867 B2 "Urządzenie do oceny migracji komórek in vitro w warunkach przepływu oraz metody jego zastosowań". SKK jest wynalazcą technologii urządzeń z komorą przepływową 3D oraz naukowym współzałożycielem i udziałowcem Cascade LifeSciences Inc.

Urządzenie 3D może być przydatną technologią do badań w różnych dziedzinach, w tym biologii komórek macierzystych, biologii naczyniowej, hematologii, onkologii, autoimmunizacji i zapaleń. Urządzenie 3D będzie szczególnie przydatne dla naukowców zajmujących się komórkami krwiotwórczymi, mezenchymalnymi, nerwowymi i innymi komórkami macierzystymi w celu zbadania mechanizmów molekularnych regulujących każdy etap kaskady wynaczynienia komórek macierzystych. Naukowcy badający migrację komórek mogą również używać tego urządzenia do badania różnych mechanizmów migracji limfocytów T i B, monocytów, neutrofili, eozynofili, komórek NK i innych komórek migrujących. W biologii naczyniowej urządzenie będzie przydatne do oceny wpływu lokalnego mikrośrodowiska na zdolność EC do wspomagania rekrutacji komórek i naśladowania bariery krew-mózg in vitro. Dla naukowców zajmujących się patogenezą chorób urządzenie może być wykorzystywane do badania migracji cytotoksycznych limfocytów T do trzustki podczas cukrzycy typu I, migracji eozynofili do płuc pacjentów z astmą, migracji neutrofili, monocytów i limfocytów do miejsc zapalenia w różnych zaburzeniach, rekrutacji komórek do miejsc gojenia się ran, oddziaływanie cytotoksycznych limfocytów T z neowaskulaturą i rekrutacja cytotoksycznych limfocytów T do nowotworów.
Nowatorskie urządzenie 3D będzie również użytecznym narzędziem w naukach translacyjnych oraz w przedklinicznym opracowywaniu leków i badaniach przesiewowych. Na przykład urządzenie może być wykorzystywane do optymalizacji przygotowania zawiesin komórek terapeutycznych do podawania dożylnego, do testowania rekrutacji komórek terapeutycznych do uszkodzonych tkanek w porównaniu z normalnymi tkankami oraz do badania roli określonego narządu lub śródbłonka tkankowego i mikrośrodowiska w tym procesie. W celu opracowania leku urządzenie może być wykorzystywane do testowania kandydatów na leki, które celują w komórki nowotworowe i blokują każdy etap kaskady wynaczynienia, do testowania migrujących komórek jako nośnika leku do miejsc guza, do testowania leków, które regulują funkcję śródbłonka specyficznego dla narządu ludzkiego lub lokalnego mikrośrodowiska specyficznego dla tkanki, oraz do testowania kombinacji leków, które regulują różne etapy kaskady naprowadzającej. Wreszcie, po przekształceniu w system o wysokiej przepustowości, urządzenie może być używane do badań przesiewowych małych cząsteczek, peptydów i przeciwciał, które celują w cząsteczki pośredniczące w transporcie komórkowym.
Szczegóły techniczne i wskazówki
Walcowanie i adhezja pod przepływem są krytycznymi etapami kaskady wynaczynienia i znacząco przyczyniają się do efektywności migracji komórek in vivo. Warto zauważyć, że etapy te nie przyczyniają się do statycznych testów in vitro. Jednak statyczne testy transmigracji są przydatne jako kontrole ujemne w eksperymentach testujących wpływ naprężeń ścinających na przeżycie i funkcję komórek, w tym zdolność EC do wspierania interakcji o niskim powinowactwie (toczenia) i mocnej adhezji.
Ważny jest wybór podłoża do eksperymentów w urządzeniu 3D. Pożywki zawierają różne czynniki wzrostu, które mogą wpływać na przeżycie krążących komórek, szczególnie podczas długich okresów inkubacji. Ponadto stężeniaCa2+ iMg2+, które mogą wpływać na interakcje adhezyjne w warunkach przepływu fizjologicznego, różnią się znacznie w komercyjnych pożywkach hodowlanych. Inne szczegóły techniczne, które należy wziąć pod uwagę przy planowaniu eksperymentów z urządzeniem 3D, omówiono poniżej.
Wybór monowarstwy EC
Na sygnaturę EC na powierzchni komórki mają wpływ różne parametry, w tym gatunek i tkanka, z której pochodzą, oraz warunki hodowli komórkowej, które powinny być uwzględnione w projekcie doświadczalnym. Niektóre powszechnie stosowane EC obejmują EC mikronaczyniowe pochodzące z płuc (LDMVEC), EC pochodzące ze szpiku kostnego (BMDEC), EC pochodzące z mózgu (BDEC) i HUVEC. Właściwości EC różnią się również w zależności od ich pochodzenia. Na przykład BMDEC konstytutywnie eksprymują selektyny i VCAM-1, które są odpowiedzialne za walcowanie i adhezję, podczas gdy BDEC, LDMVEC i HUVEC nie wyrażają tych cząsteczek w normalnych warunkach. Dlatego wkładki pokryte BDEC, LDMVEC i HUVEC mogą być wstępnie traktowane α TNF (10 ng / ml, 4 godz.) lub innymi czynnikami w celu naśladowania stanu zapalnego i indukowania ekspresji cząsteczek naprowadzających.
Testowanie przesłuchów z lokalnym mikrośrodowiskiem
Rośnie zainteresowanie zrozumieniem, w jaki sposób lokalne mikrośrodowisko reguluje funkcje EC i uczestniczy w wynaczynieniu komórek. Nasze wyniki pokazują, że wprowadzenie monowarstwy komórek zrębu pod monowarstwę EC znacznie zwiększa wynaczynienie krążących komórek. Odkrycie to pokazuje, że przesłuch między EC a zrębem zwiększa zdolność EC do wspierania wynaczynienia krążących komórek. Co więcej, wprowadzenie komórek z różnych mikrośrodowisk (np. mezenchymalnych komórek macierzystych, fibroblastów płuc, komórek nowotworowych, astrocytów) może pomóc w naśladowaniu określonych łożysk naczyniowych. W szczególności połączenie EC pochodzącego z mózgu i astrocytów może być użytecznym podejściem do naśladowania bariery krew-mózg. Podobnie, komórki uzyskane od pacjentów lub normalne komórki zmanipulowane in vitro, mogą pomóc naśladować określone chore mikrośrodowisko.
W naszych badaniach zastosowaliśmy dolne wkładki z komórkami zrębu wyhodowanymi do 50% konfluencji. Chociaż optymalna gęstość komórek mikrośrodowiskowych na wkładkach będzie zależeć od celów badania, można nią łatwo manipulować i kontrolować.
Wybór szybkości naprężenia ścinającego 
Wykorzystano tutaj naprężenie ścinające 0,8 dyn/cm2 , ponieważ zostało to wykazane przez Von Andriana i wsp. być naprężeniem ścinającym w mikrokrążeniu szpiku kostnego, w którym krwiotwórcze komórki progenitorowe opuszczają krążenie i dostają się do tkanek w normalnych warunkach fizjologicznych 15. Natomiast wyższe poziomy naprężeń ścinających obserwuje się w większych naczyniach, w których wynaczynienie komórek jest ograniczone. W związku z tym wysokie wskaźniki naprężeń ścinających mogą być wykorzystywane jako dodatkowe kontrole w eksperymentach badających wynaczynienie różnych typów komórek.
Przeżywalność komórek pod wpływem naprężeń ścinających zależy od kilku czynników, w tym od typu komórki i leczenia komórkami ex vivo (Goncharova i wsp., niepublikowane obserwacje), a zatem powinna być dokładnie oceniona podczas badania. Wrażliwość ogniwa na różne poziomy naprężeń ścinających (odporność na naprężenia ścinające) można ocenić, programując pompę perystaltyczną tak, aby stopniowo zwiększała szybkość naprężeń ścinających z 0,8 dyn/cm2 do 6 dyn/cm2. Podczas tych testów komórki mogą być okresowo pobierane z komory wymiany gazowej w celu monitorowania śmierci komórek za pomocą testów, takich jak wykluczenie błękitu trypanowego, barwienie aneksyną V i PI oraz ekspresja markera apoptozy.
Jeżeli eksperymenty mają na celu zbadanie odporności na naprężenia ścinające komórek zmodyfikowanych ex vivo lub komórek pochodzących z miąższu, zaleca się włączenie do doświadczeń dodatkowych kontroli pozytywnych, takich jak komórki przenoszone przez krew.
Wybór wielkości porów płytki i powłoki ECM
Wkładki są dostępne z kilkoma wielkościami porów (3, 5 i 8 μm). Wybór wielkości porów będzie zależał od wielkości i właściwości krążących komórek testowych, co ma również miejsce w przypadku statycznych testów Transwell. Wkładki o dużej wielkości porów (8 μm) są zalecane do badania wynaczynienia dużych komórek, takich jak komórki nowotworowe pochodzenia nabłonkowego. Leukocyty lub krwiotwórcze komórki macierzyste są częściej testowane za pomocą wkładek porów 5 μm, a wkładki porów 3 μm są najlepiej zarezerwowane do testowania wynaczynienia mniejszych komórek. Jednak sam rozmiar komórki testowej nie jest jedynym ważnym czynnikiem i zalecamy testowanie wkładek o kilku rozmiarach porów.
W naszych wstępnych badaniach przetestowaliśmy różne ECM pod kątem ich zdolności do podtrzymywania wzrostu EC na płytkach i wytrzymywania naprężeń ścinających przez >4 godziny. Testowane ECM obejmowało Matrigel, poli-D-lizynę, fibronektynę, lamininę, kolagen typu I, hydrożel, meta-keratynę I, II, III, IV i Extracel. Najlepsze wyniki dla wzrostu EC uzyskano przy użyciu Extracel, fibronektyny i kolagenu. Jednak w naszych rękach Extracel w stężeniu 0,8 μg/cm2 znacznie zmniejszył transmigrację komórek testowych przez błonę. Dlatego teraz używamy fibronektyny (5 μg/cm2) lub kolagenu (5 μg/cm2) do powlekania wkładek. Jednak na optymalny wybór ECM będzie prawdopodobnie miał wpływ zarówno rodzaj EC, jak i właściwości transmigracyjne badanych komórek. Należy przeprowadzić wstępny eksperyment w celu sprawdzenia integralności monowarstwy EC wyhodowanej na wybranym ECM. Na przykład, umieścić wstępnie powlekane wkładki z monowarstwami EC na szalkach Petriego wypełnionych pożywką hodowlaną, umieścić szalki na wytrząsarce w celu wytworzenia naprężenia ścinającego (niskie ustawienie) i inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 12 godzin. Integralność EC po wystawieniu na naprężenie ścinające można ocenić za pomocą barwienia fioletem krystalicznym.
Dobór optymalnych stężeń w komorze testowej
Zdolność komórek testowych do wyjścia z krążenia zależy od wielu cech charakterystycznych dla każdego typu komórki. Aby uzyskać statystycznie istotne wyniki, gęstość komórek krążących musi być zoptymalizowana, aby zapewnić migrację wystarczającej liczby komórek do studzienek kontroli dodatniej. Dlatego zalecamy wykonanie wstępnych testów z różnymi gęstościami komórek (np. 103/ml do 107/ml), aby zrozumieć zależność między liczbą komórek załadowanych do systemu a liczbą komórek, które przechodzą transmigrację.
Ponadto optymalne stężenie we krwi może się różnić dla tego samego typu ogniwa uzyskanego z różnych źródeł. Na przykład komórki CD34+ są niejednorodną populacją komórek zawierającą zarówno hematopoetyczne komórki macierzyste, jak i zaangażowane komórki progenitorowe specyficzne dla linii. Można je uzyskać ze szpiku kostnego, zmobilizowanej krwi obwodowej i krwi pępowinowej. Komórki CD34+ pochodzące z tych trzech źródeł mają różne zdolności naprowadzania i wszczepiania 16-18, więc warunki testowania tych komórek w urządzeniu 3D powinny być zoptymalizowane przed badaniem na pełną skalę.
Dobór optymalnego czasu krążenia komórek
Optymalny czas krążenia należy określić empirycznie dla każdego typu komórki. Minimalny czas wymagany do krążenia można ekstrapolować na podstawie wyników statycznych testów migracji, ale może on zostać wydłużony, gdy komórki są poddawane naprężeniom ścinającym. Zaleca się przeprowadzenie badań pilotażowych sprawdzających czas cyrkulacji od 4 do 96 godzin.
Jednostka wymiany gazowej
Głównym zadaniem centrali gazowej jest utrzymanie optymalnego stężenia CO2 w pożywce krążącej przez urządzenie 3D, podobnie jak w standardowych inkubatorach do hodowli tkankowych. Jednostka wymiany gazowej może być również używana do dodawania komórek testowych i związków oraz do pobierania sond i próbek podczas testu.
Ocena liczby komórek testowych
Próbki z komórek krążących mogą być pobierane w różnych momentach eksperymentu za pomocą jednostki wymiany gazowej. Pod koniec eksperymentu komórki pozostające w krążeniu można było pobrać z wylotu. Kiedy urządzenie 3D zostanie zdemontowane pod koniec eksperymentu, transmigrowane komórki mogą zostać pobrane z dolnych studzienek i zebrane do dalszej analizy. Jeśli komórki wejściowe są nieoznakowane, transmigrowane komórki można zabarwić błękitem trypanowym, a żywe/martwe komórki wyliczyć mikroskopijnie. Alternatywnie, komórki wejściowe mogą być oznaczone jednym z wielu barwników "śledzących komórki" dostępnych do obrazowania żywych komórek przed załadowaniem do urządzenia 3D; W takim przypadku pobrane transmigrowane komórki należy poddać lizie w celu ilościowego określenia fluorescencji.
Dobór optymalnej wielkości próby
Aby umożliwić analizę statystyczną, należy wybrać wielkość próby, która zapewni około 80% mocy do wykrycia hipotetycznej różnicy w średnich procentowych zmianach między dwiema grupami podczas testowania na poziomie istotności 0,05 przy użyciu dwustronnego testu t. Opierając się na naszym doświadczeniu z komórkami szpiku kostnego, używamy trzech studzienek na warunki eksperymentalne do eksperymentów z urządzeniem 3D. Jednak optymalna wielkość próby będzie się różnić w zależności od celu eksperymentu i powinna zostać określona empirycznie. Testy statystyczne regresji wielorakiej, dwustronne testy t i analizy wariancji mogą być wykorzystywane do weryfikacji istotności statystycznej wyników.
Wybór chemokin
Podobnie jak w przypadku wszystkich testów transmigracji, wybór chemoatraktantu będzie podyktowany właściwościami komórek testowych i celem badania. SDF-1 jest dobrze znanym chemoatraktantem dla komórek krwiotwórczych. W naszych rękach stężenie 50 ng/ml SDF-1 było optymalne do stymulowania wynaczynienia krwiotwórczych komórek progenitorowych pochodzących ze szpiku kostnego. Używamy również C3a i bFGF jako chemoatraktantów dla mezenchymalnych komórek macierzystych 19. Zalecamy jednak miareczkowanie każdej chemokiny i mieszanie kombinacji chemokin w celu określenia optymalnego zakresu stężeń przed badaniem na pełną skalę. W przypadku niektórych typów komórek korzystna może być kombinacja czynników chemotaktycznych. Jeśli chemokiny dla określonych komórek testowych są nieznane lub niedostępne, jako źródło chemoatraktantów można użyć kondycjonowanych pożywek ze stymulowanych limfocytów, fibroblastów i innych komórek.
Dobór parametrów odczytu
Wszechstronność urządzenia 3D rozszerzy rodzaj eksperymentów transmigracyjnych, które można przeprowadzić, a powodzenie eksperymentów będzie zależało od przemyślanego rozważenia i zaprojektowania parametrów odczytu. Z reguły komórki pobrane z górnego (krążącego) komory i dolnego (statycznego) komory powinny być badane pod kątem żywotności w tym samym czasie, co liczenie komórek. Niektóre komórki mają niską tolerancję na fizjologiczne naprężenia ścinające obserwowane w mikrokrążeniu. W takim przypadku liczba martwych komórek zostanie zwiększona w górnej komorze. Liczba przylegających komórek zatrzymanych (lub uwięzionych) na warstwie EC może być oceniona za pomocą immunocytochemii markerów wyrażonych specyficznie przez komórki testowe. Przeciwciała specyficzne dla CD31 i vWF mogą być stosowane do wykrywania EC i umożliwienia dyskryminacji między komórkami testowymi a EC. Ponadto integralność monowarstwy EC powinna być monitorowana na końcu każdego badania.
Rodzaje analiz wykonywanych na pobranych komórkach będą zależeć od celów eksperymentalnych badaczy, ale mogą obejmować analizę zmian w ekspresji genów za pomocą mikromacierzy i qPCR, ekspresji cząsteczek powierzchniowych za pomocą analizy FACS, aktywacji szlaków sygnałowych przez FACS i western blotting oraz wydzielania czynników przez ELISA. Na pobranych komórkach in vitro możliwy jest ogromny wachlarz testów funkcjonalnych, o czym świadczy nasza własna praca, w której hodowaliśmy transmigrujące komórki szpiku kostnego w celu zliczenia hematopoetycznych komórek progenitorowych (ryc. 3). Pobrane próbki mogą być również testowane w różnych testach in vivo .
Jednym z ważnych parametrów, który może pomóc w przewidywaniu zachowania komórek testowych in vivo , jest tendencja niektórych komórek do tworzenia agregatów pod wpływem różnych naprężeń ścinających. Na przykład komórki terapeutyczne, które ulegają tworzeniu agregatów w urządzeniu 3D, mogą mieć większą tendencję do tworzenia grudek po podaniu dożylnym i powodować ostrą niedrożność naczyń in vivo (Goncharova i wsp., niepublikowane obserwacje). Tworzenie się agregatów można monitorować pod mikroskopem, pobierając próbki z komórek testowych w trakcie lub po zakończeniu eksperymentu z urządzeniem 3D.

Wynaczynienie komórek to proces, w którym krążące komórki opuszczają krwiobieg i jest kluczowym składnikiem wielu reakcji fizjologicznych w organizmie. Proces ten jest również ważny dla regeneracji tkanek, jak na przykład, gdy komórki terapeutyczne zmobilizowane z tkanek do naczyń krwionośnych (lub wstrzyknięte dożylnie) migrują przez naczynia krwionośne i wychodzą z krążenia do miejsc urazu lub zwyrodnienia. Wynaczynienie jest również kluczowym elementem patogenezy wielu chorób, w tym zapalenia, odrzucenia immunologicznego, autoimmunizacji i przerzutów nowotworowych.
Wynaczynienie to złożony, wieloetapowy proces, który obejmuje interakcję komórek krążących z komórkami śródbłonka (EC) w warunkach przepływu fizjologicznego. Proces ten obejmuje (a) walcowanie komórek, (b) silne przyleganie do powierzchni światła EC oraz (c) transmigrację przez EC. Co ważne, każdy etap kaskady wynaczynienia jest regulowany przez podzbiór cząsteczek specyficznych dla typu komórki i gatunku. Jednak szczegółowe mechanizmy molekularne, które regulują wynaczynienie określonych podzbiorów komórek, nie są dobrze poznane, głównie ze względu na techniczną trudność w rekapitulacji warunków w krwiobiegu. Opisywane tutaj nowatorskie urządzenie 3D zostało zaprojektowane w celu pokonania tych wyzwań technicznych i umożliwienia przeprowadzania eksperymentów, które poprawią nasze zrozumienie biologii migracji komórek.
Cząsteczki, które pośredniczą w migracji komórek, są ważnymi celami terapeutycznymi. Szczegółowe zrozumienie zdarzeń molekularnych, które kontrolują migrację określonych typów komórek, pomoże w identyfikacji nowych celów terapeutycznego promowania lub hamowania wynaczynienia. Na przykład interwencje, które zwiększają migrację terapeutycznych komórek macierzystych (niezależnie od tego, czy pochodzą z tkanek dorosłych, noworodków, czy nawet z tkanek płodu) w kierunku miejsc urazu lub zwyrodnienia, byłyby bardzo przydatne w regeneracji tkanek. Rośnie zainteresowanie generowaniem in vitro terapeutycznych komórek macierzystych, w tym komórek pochodzących ze źródeł pluripotencjalnych, oraz manipulowanych ex vivo dorosłych komórek macierzystych (ekspandowanych, modyfikowanych genetycznie i wstępnie traktowanych różnymi enzymami) 1. W związku z tym istnieje zapotrzebowanie na nowatorskie technologie oceny jakości komórek macierzystych przed ich wykorzystaniem do celów terapeutycznych. Wśród innych parametrów komórki muszą być w stanie skutecznie opuścić krążenie, ponieważ leczenie zaburzeń wieloogniskowych może wymagać dożylnego podania komórek macierzystych 2. Rzeczywiście, jednym z obecnych wyzwań w biologii komórek macierzystych jest przezwyciężenie niezwykle niskiej wydajności, z jaką komórki macierzyste są domem dla miejsc uszkodzenia tkanek 3-6, co podkreśla potrzebę wypełnienia tej luki w naszej wiedzy na temat migracji komórek macierzystych. Natomiast strategie, które blokują migrację komórek poprzez celowanie w określone cząsteczki naprowadzające, byłyby przydatne w leczeniu chorób zapalnych i autoimmunologicznych, a także raka z przerzutami. W związku z tym zrozumienie mechanizmów molekularnych, które pośredniczą w interakcjach między krążącymi komórkami a EC podczas migracji komórek i wynaczynienia, jest istotne dla medycyny translacyjnej i odkrywania leków, a także dla nauk podstawowych.
Obecnie dostępnych jest wiele metod do badania różnych aspektów migracji komórek. Metody te mają jednak wady, które można przezwyciężyć za pomocą nowego urządzenia 3D.
Modele zwierzęce:
Modele zwierzęce, takie jak myszy z obniżoną odpornością i myszy genetycznie modyfikowane, były użytecznymi narzędziami do badania migracji komórek ludzkich in vivo. Jednak jedną istotną wadą tych modeli jest to, że komórki ludzkie słabo oddziałują z cząsteczkami adhezyjnymi obecnymi w EC myszy, częściowo z powodu specyficznych dla gatunku różnic w sekwencji wielu cząsteczek na powierzchni komórki. W związku z tym jest mało prawdopodobne, aby wykorzystanie gryzoni do badania migracji komórek ludzkich autentycznie odzwierciedlało wydarzenia w łożyskach naczyniowych specyficznych dla ludzkich narządów. Ponadto modele in vivo nie nadają się do wysokoprzepustowych badań przesiewowych kandydatów na leki. Konwencjonalne modele in vivo wykorzystywane do badania naprowadzania komórek nie rozróżniają różnych etapów kaskady wynaczynienia, co utrudnia identyfikację i ukierunkowanie na nowe cząsteczki naprowadzające. Podejście oparte na mikroskopii przyżyciowej zostało opracowane w celu zaspokojenia tej potrzeby i dostarczyło informacji; Technika ta jest jednak niezwykle czasochłonna i pracochłonna 7,8.
Statyczne testy transmigracji:
Testy komorowe Transwell lub Boydena mierzą migrację komórek przez porowatą błonę i są szeroko stosowane w badaniach migracji. Test ma tę zaletę, że może być stosowany nie tylko do badania ruchliwości komórek i interakcji komórka-macierz zewnątrzkomórkowa (ECM), ale także migracji komórek za pośrednictwem chemokiny przez monowarstwę EC wyhodowaną na porowatych błonach. Niestety, fenotyp i funkcja EC w warunkach statycznych różnią się znacznie od tych w warunkach przepływu fizjologicznego 9,10. W związku z tym zdarzenia chemotaktyczne, które występują w testach Transwell, nie naśladują wiernie interakcji między migrującymi komórkami a EC pod wpływem stresu ścinającego. Ponadto etap "toczenia" kaskady bazowej, który dodaje dodatkowy wymiar selektywności do całego procesu, nie występuje w statycznych testach Transwell. Tak więc, chociaż technologia ta pozwala na ilościową ocenę migracji komórek za pośrednictwem chemokiny przez monowarstwę EC, jest ograniczona przez jej niezdolność do zapewnienia naprężenia ścinającego, które naśladuje przepływ krwi in vivo.
Testy pod wpływem naprężenia ścinającego:
Naprężenie ścinające ścianę jest znane z tego, że odgrywa ważną rolę w regulacji funkcji EC 9,10. Siły ścinające indukują szybką aktywację kaskad sygnałowych, czynników transkrypcyjnych i zróżnicowanej ekspresji genów w EC 11,12. Informacje te doprowadziły do opracowania nowej generacji testów adhezyjnych - równoległych komór z przepływem laminarnym i kapilar - do badania walcowania i adhezji komórek do EC w warunkach naprężeń ścinających 7,13. Czynnikiem ograniczającym dla tych testów jest to, że mogą one mierzyć tylko walcowanie i adhezję, ale nie rozróżniają między komórką przylegającą, która uległaby transmigracji, a komórką przylegającą, która jest "zatrzymana" na monowarstwie EC i nie uległaby transmigracji. Co więcej, testy te nie mogą mierzyć migracji komórek w kierunku gradientu chemokin.
Kilka raportów opisało zdolność przylegających komórek do pełzania pod monowarstwą EC wyhodowaną na szkiełkach w warunkach przepływu 14. Ograniczenia tej techniki indeksowania obejmują: analizuje tylko ograniczoną liczbę komórek; nie ma charakteru ilościowego; Analizuje pełzanie komórek po macierzy i powierzchni komórki, ale nie migrację w kierunku gradientu chemotaktycznego; i nie pozwala na odizolowanie transmigrowanych komórek. Tak więc, chociaż test ten ma tę zaletę, że stosuje naprężenie ścinające do monowarstwy EC, nie może określić ilościowo migracji komórek w kierunku gradientu chemokin.
Nowatorska technologia 3D opisana tutaj przezwycięża wiele z tych niedociągnięć, łącząc siłę ścinającą (górny przedział) ze statycznym gradientem chemokiny (dolny przedział) i pozwala na ilościową ocenę każdego kroku kaskady wynaczynienia (Rysunek 1). Urządzenie może być również wykorzystane do zbadania, w jaki sposób przesłuchy między EC a mikrośrodowiskiem wpływają na zdolność EC do wspierania wynaczynienia krążących komórek. Poniższy protokół opisuje krok po kroku metodologię korzystania z urządzenia z komorą przepływową 3D.

<table><tbody><tr><td colspan="4"><silny>odczynnik/Materiał</mocny></td></tr><tr><td>rurka PVC (otwór 1,42, ścianka 0,8)</td><td>Watson-Marlow Limitid</td><td>981.0142.000</td><td></td></tr><tr><td>Komora 3D</td><td>C.B.S.Scientific</td><td>FC-1000</td><td></td></tr><tr><td>Jednostka wymiany gazowej</td><td>C.B.S.Scientific</td><td>FCR-1000</td><td></td></tr><tr><td>Wkładki</td><td>C.B.S.Scientific</td><td>FCI-1005U</td><td></td></tr><tr><td>Kolagen Bydlęce, typ I</td><td>BD Biosciences</td><td>354231</td><td></td></tr><tr><td>Kwas solny 0,1 M</td><td>VWR</td><td>BDH3200-1</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Invitrogen</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>HUVEC</td><td>Lonza</td><td>CC-2517</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw pocisków EGM (cc - 3121 i cc - 4133)</td><td>Lonza</td><td>CC - 3124</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór neutralizujący trypsynę</td><td>Lonza</td><td>CC-5002</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna</td><td>Lonza</td><td>CC-5012</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Lonza</td><td>CC-5024</td><td></td></tr><tr><td>SDF-1</td><td>R7D System</td><td>460-SD</td><td></td></tr><tr><td>Extracel Trial 2.5 Kit</td><td>Glycosam Byosystems</td><td>GS211</td><td></td></tr><tr><td>Fibronektyna, człowiek, natura</td><td>BD Biosciences</td><td>356008</td><td></td></tr><tr><td>Poli-D-lizyna</td><td>Milipor</td><td>A-003-E</td><td></td></tr><tr><td>BD Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>354277</td><td></td></tr><tr><td>Komórki śródbłonka mikronaczyniowego ludzkiego mózgu</td><td>ScienCell</td><td>1000</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka z komórek śródtelowych (ECM) do komórek mózgowych</td><td>ScienCell</td><td>1001</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>StemCells Tecnologies</td><td>7050</td><td></td></tr><tr><td>TNF-alfa, 10 &mu; g</td><td>Invitrogen</td><td>PHC3015</td><td></td></tr><tr><td>VCAM-1, mysi anty-ludzki, CD106-FITC</td><td>Southern Bioteck</td><td>9519-02</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór do barwienia jodku propidyny</td><td>BD Pharmingen</td><td># 556463</td><td></td></tr><tr><td>Zamrożona ludzka krew pępowinowa CD34+</td><td>komórki StemCell</td><td>CB007F</td><td></td></tr><tr><td>Zamrożona ludzka krew pępowinowa Komórki CD34+</td><td>Zenbio</td><td>SER - CD34-F</td><td></td></tr><tr><td>MethoCult GF M3434</td><td>Tecnologies StemCells GFM3434</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mysia metyloceluloza kompletne podłoże</td><td>R& D</td><td>HSC007</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciw czynnikowi Von Willibranda</td><td>abcam</td><td>C# ab11713</td><td></td></tr><tr><td>szalka Petry'ego (35 x 10 mm)</td><td>VWR</td><td>CA25373-041</td><td></td></tr><tr><td>Probówki 15 ml</td><td>VWR Fisher</td><td>21008 - 918</td><td></td></tr><tr><td>Kolby do hodowli tkankowych 75cm2</td><td>VWR</td><td>BD353136</td><td></td></tr><tr><td>Cristal fioletowy</td><td>Sigma</td><td>C-3886-25G</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze preparacyjne, zakrzywione</td><td>VWR</td><td>82027-384</td><td></td></tr><tr><td>1 000 &mu; l Końcówki do pipet</td><td>VWR</td><td>83007-380</td><td></td></tr><tr><td>1 - 200 &mu; l Końcówki do pipet</td><td>VWR</td><td>37001-530</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>Pompa perystaltyczna</td><td>Watson-Marlow Limitid</td><td>403U/VM3</td><td></td></tr></tbody></table>

nowatorskie trójwymiarowe urządzenie z komorą przepływową do badania wynaczynienia komórek krążących w fizjologicznych warunkach przepływu kierowanego przez chemokinę

A Novel Three-dimensional Flow Chamber Device to Study Chemokine-directed Extravasation of Cells Circulating under Physiological Flow Conditions

Wynaczynienie krążących komórek z krwiobiegu odgrywa kluczową rolę w wielu procesach fizjologicznych i patofizjologicznych, w tym w naprowadzaniu komórek macierzystych i przerzutach nowotworowych. Trójwymiarowe urządzenie z komorą przepływową (zwane dalej urządzeniem 3D) to nowatorska technologia in vitro, która odtwarza fizjologiczne naprężenia ścinające i umożliwia ilościowe określenie każdego etapu kaskady wynaczynienia komórek. Urządzenie 3D składa się z górnej komory, w której komórki będące przedmiotem zainteresowania krążą pod wpływem naprężeń ścinających, oraz dolnej komory ze studzienkami statycznymi, które zawierają interesujące nas chemoatraktanty. Oba przedziały są oddzielone porowatymi wkładkami pokrytymi monowarstwą komórek śródbłonka (EC). Opcjonalna druga wkładka z interesującymi komórkami mikrośrodowiskowymi może być umieszczona bezpośrednio pod warstwą EC. Jednostka wymiany gazowej pozwala na utrzymanie optymalnego napięcia CO2 i zapewnia punkt dostępu do dodawania lub wycofywania komórek lub związków podczas eksperymentu. Komórki testowe krążą w górnej komorze przy pożądanym naprężeniu ścinającym (natężeniu przepływu) kontrolowanym przez pompę perystaltyczną. Pod koniec eksperymentu komórki krążące i migrujące są zbierane do dalszych analiz. Urządzenie 3D może być używane do badania zwijania się komórek i adhezji do EC pod wpływem naprężeń ścinających, transmigracji w odpowiedzi na gradienty chemokin, odporności na naprężenia ścinające, tworzenia klastrów i przeżycia komórek. Ponadto opcjonalna druga wkładka umożliwia badanie wpływu przesłuchów między EC a komórkami mikrośrodowiskowymi. Translacyjne zastosowania urządzenia 3D obejmują testowanie kandydatów na leki, które są ukierunkowane na migrację komórek, oraz przewidywanie zachowania komórek in vivo po wstrzyknięciu dożylnym. W związku z tym nowatorskie urządzenie 3D jest wszechstronnym i niedrogim narzędziem do badania mechanizmów molekularnych pośredniczących w wynaczynieniu komórkowym.

Linia komórek śródbłonka (EC) pochodząca z szpiku kostnego myszy STR-12 była hodowana na wkładkach z porami o wielkości 5 μm. Tempo wzrostu EC monitorowano pod mikroskopem, a po osiągnięciu przez EC 100% konfluencji wkładki przeniesiono do studni w dolnej komorze urządzenia 3D. Bezpośrednio przed umieszczeniem wkładki, studnie dolnej komory wypełniono samą pożywką hodowlaną (kontrola negatywna) lub pożywką uzupełnioną o czynnik pochodzący z komórek zrębowych-1 (SDF-1; 5 ng/ml i 50 ng/ml). Następnie złożono urządzenie 3D i wypełniono komorę pożywką zgodnie z opisem w protokole. Komórkami testowymi, które miały krążyć w górnej komorze urządzenia, były świeżo wyizolowane komórki szpiku kostnego myszy (3,5 x 106 komórek na komorę). Zastosowano określone naprężenie ścinające o wartości 0,8 dyn/cm2, ustawiając prędkość pompy perystaltycznej na 0,2 ml/min. Cały układ roboczy umieszczono następnie w inkubatorze z 5% CO2 w temperaturze 37 °C, pozwalając komórkom krążyć i oddziaływać z monowarstwą EC przez 4 h. Po tym czasie zebrano krążące komórki, rozmontowano komorę i usunięto wkładki zgodnie z opisem w protokole. Komórki, które przemiegr {transmigrowały}, wyizolowano z dolnych studni, przemyto, resuspenderowano w świeżej pożywce i przeniesiono do kultur w metylocelulozie uzupełnionej o czynniki wzrostu hematopoetycznego w celu przeprowadzenia testu kolonii tworzących (CFC) (Rysunek 3). Zgodnie z oczekiwaniami stwierdzono, że znacznie większa liczba CFC przemiegr {transmigrowała} przez monowarstwę EC do studni zawierających 50 ng/ml SDF-1 niż do studni zawierających 5 ng/ml SDF-1 lub samą pożywkę.
Jak opisaliśmy wcześniej, żadna z obecnie dostępnych technik in vitro służących do badania migracji komórek nie pozwala na przetestowanie wpływu lokalnego mikrośrodowiska na zdolność EC do wspomagania ekstrawazacji migrujących komórek. Aby zilustrować, w jaki sposób można to osiągnąć za pomocą urządzenia 3D, zbadaliśmy ekstrawazację krążących komórek hematopoetycznych przez warstwę EC oraz warstwę komórek zrębowych szpiku kostnego. W tym celu drugi (dolny) insert zawierający warstwę komórek zrębowych został zestawiony z górnym insertem zawierającym monowarstwę EC w dolnej płytce (Rysunek 4). Następnie przeprowadzono eksperyment zgodnie z powyższym opisem, a komórki, które przeszły transmigrację, odzyskano z dołków i policzono. Wyniki wykazały, że wprowadzenie dodatkowej warstwy komórek zrębowych pod monowarstwą EC znacząco zwiększyło migrację komórek hematopoetycznych w kierunku SDF-1 (Rysunek 4). Wynik ten jest zgodny z tezą, że lokalne mikrośrodowisko przyczynia się do rekrutacji krążących komórek do tkanki.
<img alt="Schemat układu organ-on-chip przedstawiający przepływ płynów, komory hodowli komórkowej oraz regulację ciśnienia." fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50959/50959fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50959/50959fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
 Rycina 1. Urządzenie w postaci trójwymiarowej komory przepływowej. A: Hermetycznie zamknięte urządzenie 3D składa się z dwóch przedziałów oddzielonych wymienną membraną porowatą (PM). Na membranie hodowane są komórki EC, która następnie tworzy barierę między przedziałem górnym a dolnym. Zdefiniowane naprężenia ścinające są przykładane do górnego przedziału urządzenia 3D poprzez perfuzję pożywki przy użyciu perystaltycznej pompy infuzyjnej o stałym przepływie. Krążące komórki mogą być nieoddziałujące (NIC), oddziaływać przejściowo z EC („toczenie”; RC) lub przylegać do EC (AC). Subpopulacja komórek przylegających transmigruje przez warstwę EC do dolnego przedziału statycznego urządzenia (TM). B: Rysunek urządzenia 3D widzianego z góry (panel górny). Poziomy przekrój (panel dolny) pokazuje położenie górnej membrany (czerwona), dolnej membrany (zielona) oraz dna dołka (niebieskie). C: Widok izometryczny ilustruje integralne części urządzenia: cztery śruby, akrylowy blok górny, uszczelkę komory górnej, membrany górną i dolną, dolny o-ring oraz akrylowy blok dolny z trzema dołkami. D: Fotografia trójwymiarowej komory przepływowej podłączonej do pompy perystaltycznej i jednostki wymiany gazowej. System jest składany w komorze z laminarem, a następnie przenoszony do inkubatora do hodowli komórkowych.
<img alt="Schemat systemu wymiany gazowej: pompa perystaltyczna, komora 3D, wlot/wylot, jednostka gazowa, zawory odcinające." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50959/50959fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50959/50959fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
 Rycina 2. Schematyczna reprezentacja systemu urządzenia 3D. Rysunek przedstawia trzy zawory wymagane do montażu systemu. Pożywka hodowlana jest zasysana z wlotu przez podciśnienie wytwarzane przez pompę perystaltyczną. Przepływ pożywki jest odcinany przez zawór nr 1 (Stop #1), aby umożliwić umieszczenie wkładów w urządzeniu. Po zamknięciu komory pompę ponownie się włącza, a komora zostaje natychmiast wypełniona pożywką, aby zapobiec wysychaniu komórek hodowanych na wkładach. Zawór nr 2 (Stop #2) umożliwia wprowadzenie pożywki do jednostki wymiany gazowej. Zawór nr 3 (Stop #3) pozwala na zatrzymanie przepływu w celu połączenia wlotu i wylotu. Za pomocą przełącznika na pompie można skierować przepływ zgodnie z ruchem wskazówek zegara lub przeciwnie, aby usunąć pęcherzyki powietrza poprzez jednostkę wymiany gazowej.
<img alt="Metoda oddziaływania komórek indukowana przepływem, schemat; wykres wpływu SDF-1 na CFC; warunki statyczne a przepływowe." fo:content-width="5.75in" fo:src="/files/ftp_upload/50959/50959fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50959/50959fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Urządzenie 3D wspomaga zapośredniczowaną przez SDF-1 transmigrację progenitorów krwiotwórczych w warunkach fizjologicznego naprężenia ścinającego. A: Trzy urządzenia (każde zawierające 3 dołki w dolnej komorze) zostały zmontowane i uruchomione równolegle. Do dołków dolnej komory dodano samo medium lub medium zawierające SDF-1 w stężeniu 5 lub 50 ng/ml. Komórkom szpiku kostnego myszy pozwolono krążyć w urządzeniach przez 4 hr. Następnie każde urządzenie rozmontowano, a komórki, które transmigrowały w kierunku SDF-1 (żółte), zebrano z dolnych dołków, policzono i hodowano w metylocelulozie uzupełnionej o czynniki wzrostu krwiotwórcze (GF). Czternaście dni później kolonie oceniono pod mikroskopem. B: Liczba progenitorów (komórek tworzących kolonie, CFC) odzyskanych z dolnych komór przedstawiona jest jako średnia ± SD z trzech dołków na warunek. * p &lt; 0.05.
<img alt="Schemat równowagi statycznej, układ przepływu, migracja komórek, wyniki eksperymentu, wykres słupkowy liczby komórek." fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50959/50959fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50959/50959fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 4"> 
 Rycina 4. Wpływ mikrośrodowiska na oddziaływania między komórkami krwiotwórczymi a komórkami śródbłonka. A: Ilustracja przedstawia położenie drugiej membrany porowatej z hodowanymi fibroblastami zrębu (SF) pod górną membraną z EC. Pozostałe skróty są opisane w Rycini 1A. B: Dodatkową membranę (dolny wkład) z hodowanymi SF umieszczono pod górną membraną. C: Trzy urządzenia (każde zawierające 3 dołki) prowadzono równolegle. Do dołków dolnej komory dodano samo medium lub medium zawierające SDF-1 w stężeniu 50 ng/ml SDF-1. W komorach kontroli negatywnej pominięto SC, SDF-1 lub oba te elementy. Komórki szpiku kostnego pozostawiono w obiegu przez 4 hr w temperaturze 37 °C. Następnie każde urządzenie rozmontowano, a komórki, które migrowały przez membranę, zebrano z dołków dolnej komory i przeliczono. Liczba odzyskanych komórek transmigrowanych przedstawiona jest jako średnia ± SD z trzech dołków na warunek. * p &lt; 0.05.

Trójwymiarowa komora przepływowa to nowatorska technologia in vitro do ilościowej i stopniowej oceny kaskady wynaczynień komórek krążących w warunkach fizjologicznego stresu ścinającego. W związku z tym urządzenie spełnia krytyczną potrzebę podstawowych, przedklinicznych i klinicznych badań migracji komórek.

Nowatorskie trójwymiarowe urządzenie z komorą przepływową do badania wynaczynienia komórek krążących w fizjologicznych warunkach przepływu kierowanego przez chemokinę

Extravasation of circulating cells from the bloodstream plays a central role in many physiological and pathophysiological processes, including stem cell ...

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest ilościowy pomiar migracji krążących komórek w kierunku gradientu chemokin. W warunkach fizjologicznego stresu ścinającego osiąga się to poprzez uprzednie hodowanie monowarstwy komórek śródbłonka na mikroporowatych wkładkach pokrytych kolagenem, a następnie wbudowanie ich do komory przepływowej, w której przykrywają one oddzielny przedział statyczny zawierający chemokiny. Następnie do komórek przyłożony jest stres ścinający, aby odtworzyć warunki fizjologiczne panujące w naczyniach krwionośnych.W drugim kroku komórki testowe, takie jak leukocyty, komórki macierzyste lub komórki nowotworowe, są wprowadzane do układu 3D w celu umożliwienia ich krążenia. Zawartość komory statycznej wpływa na efektywność oddziaływań między krążącymi komórkami a komórkami śródbłonka, a w konsekwencji na tempo transmigracji komórek testowych przez warstwę śródbłonka. Następnie układ 3D jest demontowany, a transmigrowane komórki testowe są zbierane z dolnej komory statycznej w celu ilościowego pomiaru migracji komórek. Przy zastosowaniu różnych nowoczesnych metod uzyskuje się wyniki wykazujące zdolność krążących komórek testowych do oddziaływania z komórkami śródbłonka w warunkach przepływu fizjologicznego oraz opuszczania krwiobiegu w zależności od stężenia chemokin w komorze statycznej.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak zastosowanie równoległych komór przepływowych o przepływie laminarnym oraz statycznych testów transferu, jest połączenie naprężenia ścinającego w komorze górnej i gradientu chemokin w dolnej komorze statycznej. Pozwala to badaczom na ilościowy pomiar eksternalizacji krążących komórek w odpowiedzi na gradient chemokin oraz warunki przepływu fizjologicznego. Metoda ta może być również wykorzystana do badania wpływu interakcji między komórkami lokalnego mikrośrodowiska a komórkami śródbłonka na ekstrawasację krążących komórek.Aby umożliwić hodowlę dodatkowej warstwy komórek na oddzielnym wkładzie pod komórkami śródbłonka, procedurę zademonstruje Valentina against rova, technik z mojego laboratorium. Na początek należy obliczyć liczbę wkładów potrzebnych do eksperymentu i umieścić każdy wkład w oddzielnej sterylnej szalce Petriego. Następnie należy je wysterylizować za pomocą promieniowania gamma, aż całkowzna dawka osiągnie 11 gray, w zależności od poszczególnych konfiguracji.Następnie rozcieńcz roztwór zapasowy kolagenu typu I do stężenia 50 µg/mL, używając 0,01 M kwasu solnego przechowywanego w temperaturze 4 °C, i przygotuj aliquoty końcowego roztworu o objętości 154 µL dla każdego insertu. Następnie nanieś kilka kropel roztworu na powierzchnię insertu w układzie kolistym.Następnie dodaj resztę alikwotu, aby utworzyć jedną dużą kroplę na powierzchni wkładu. Upewnij się, że końcówka pipety w żadnym momencie nie dotyka wkładu oraz że kolagen pokrywa całą powierzchnię wkładu, ale nie spływa z niego. Po pokryciu wkładu załóż pokrywkę nay szalkę Petriego i ostrożnie postaw ją na płaskiej powierzchni.Inkubować wstawki przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej; po inkubacji odessać roztwór kolagenu i przemyć membranę 160 µL PBS. Następnie odessać PBS. Nałożyć pokrywkę i owinąć szalkę parafirmą.Jeśli wkłady zostaną użyte tego samego dnia, należy umieścić szalkę Petriego w suchym miejscu w temperaturze pokojowej. W przeciwnym razie należy przechowywać szalkę w temperaturze 4 °C i wykorzystać wkład w ciągu siedmiu dni. Hodowane ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej należy zebrać bezpośrednio przed użyciem i resuspender w odpowiednim medium hodowlanym w stężeniu 2,5 miliona komórek na mililitr.Podczas zliczania komórek należy upewnić się, że ich żywotność przekracza 98% przy użyciu błękitu trypanu, a następnie nanieść 160 µL zawiesiny komórkowej na każdy insert. Należy najpierw nanieść kilka małych kropli w okręgu na powierzchnię insertu pokrytego kolagenem, a następnie ostrożnie dodać resztę zawiesiny komórkowej, tworząc jedną dużą kroplę. Po zakończeniu należy założyć pokrywki i ostrożnie umieścić szalki w inkubatorze z 5% carbon dioxide w temperaturze 37 °C i inkubować przez 30 minut, aby umożliwić przywieranie komórek do membrany.Po 30 minutach wyjmij płytki z inkubatora i delikatnie dodaj pięć mililitrów podgrzanej pożywki do każdej wkładki. Należy upewnić się, że wkładka pozostaje na dnie naczynia i jest całkowicie przykryta pożywką. Następnie załóż pokrywki i ostrożnie umieść naczynia z powrotem w inkubatorze.Komórki inkubowano w temperaturze 37 °C przez noc. Aby złożyć komorę przepływową, najpierw skręć ze sobą płytkę górną i dolną. Następnie połącz płytki z jednostką wymiany gazowej, używając rurek z PVC o średnicy wewnętrznej 1,42 mm i grubości ścianek 0,8 mm.Następnie umieść zmontowane urządzenie w czystej plastikowej torbie i wysterylizuj je poprzez napromieniowanie gamma, aż całkowzna dawka osiągnie 11 gray. Kolejnym krokiem jest wyjęcie tacy inkubatora, umieszczenie jej w sterylnej komorze do hodowli tkanek i wysterylizowanie 70% ethanol. Następnie przykryj tacę dużą sterylną serwetką.Następnie wyjmij urządzenie z plastikowej torebki i umieść je na sterylnej tacy inkubatora. Potem podłącz urządzenie do pompy perystaltycznej i zaprogramuj pompę na prędkość 0,2 milliliters per minute. Do sterylnej probówki o pojemności 15 milliliters, która będzie służyć jako wlot, pipetuj od pięciu do siedmiu milliliters pożądanego medium hodowlanego.Następnie odłącz rurkę wlotową od wylotowej, wyciągając metalną igłę z rurki za pomocą małych sterylnych serwetek, aby zachować sterylność rurki; umieść metalną igłę wlotową w probówce 15 ml z medium, a rurkę wylotową w pustej probówce 15 ml. Następnie włącz pompę tak, aby przepływ odbywał się przeciwnie do ruchu wskazówek zegara. Pozostaw podciśnienie, aby zassać medium z wlotowej probówki 15 ml do wnętrza rurki, i wyłącz pompę, gdy medium dotrze do końca rurki, tuż przed wejściem do urządzenia.Następnie otwórz urządzenie, odkręcając płyty rurek, i ostrożnie zdejmij górną płytę. Pipetuj od 1500 do 1550 µL pożywki do dolnych dołków, upewniając się, że dołki zawierają wystarczającą ilość pożywki, aby utworzyła ona półkulę sięgającą od jednego do dwóch milimetrów ponad dolną płytę. Następnie przenieś przygotowane wkładki z szalek Petriego do dołków dolnej płyty. Używając sterylnej pęsety, upewnij się, że pod wkładkami nie uwięzły pęcherzyki powietrza, a następnie odessij nadmiar pożywki, która pojawiła się na powierzchni dolnej płyty.Następnie nałóż górną płytkę z powrotem na dolną płytkę i połącz je ze sobą. Po dokręceniu śrub niezwłocznie włącz pompę perystaltyczną, aby medium zaczęło przepływać przez urządzenie 3D. Unieś koniec wylotowy urządzenia i utrzymuj komorę w tej pozycji, aby zapobiec tworzeniu się pęcherzyków powietrza w przestrzeni między płytkami.Kontynuuj napełnianie pożywką rurki łączącej komorę z jednostką wymiany gazów, aż pożywka dotrze do tej jednostki. Następnie wlej trzy mililitry pożywki do jednostki wymiany gazów. Włącz pompę i pozwól pęcherzykom powietrza przejść przez układ.Podnieś jednostkę, aby umożliwić wypełnienie medium przewodów odpływowych, a następnie zatrzymaj pompę, gdy medium znajdzie się dwa do trzech centymetrów przed końcem. Po całkowitym zaprzeszczeniu połącz igłę wlotową z przewodami wylotowymi za pomocą małych sterylnych serwetek. Następnie odwróć kierunek pompowania, aby medium przepływało zgodnie z ruchem wskazówek zegara w stronę jednostki wymiany gazowej, i upewnij się, że usunięto wszystkie pozostałe pęcherzyki powietrza.Przy ponownym przepływie pompy w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara, należy dodać 100 µL zawiesiny komórek testowych do jednostki wymiany gazowej. Następnie należy zamknąć pokrywę respiratora.Umieść tacę z powrotem w inkubatorze i pozwól komórkom testowym krążyć w urządzeniu w temperaturze 37 °C. Po upływie pożądanego czasu wyjmij tacę z działającym systemem z inkubatora i umieść ją w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Zatrzymaj pompę, odłącz wlot i wylot, a następnie umieść ich końce w pustych, sterylnych probówkach 15 ml.Następnie włącz pompę i zbierz zawiesinę komórkową z systemu. Przechowuj zawiesinę komórkową na lodzie do momentu użycia. Następnie rozmontuj komorę, wykręcając śruby i zdejmując górną płytę.Wyjmij wkłady z dolnej płytki i przenieś je do szalek Petriego w celu przeprowadzenia barwienia lub zbioru komórek. Na koniec usuń zawiesinę komórkową z dolnych studzienek i przelej ją do probówek o pojemności 15 mililitrów. Przepłucz każdą studzienkę dwukrotnie 1,5 mililitrami pożywki i dodaj ją do odpowiedniej probówki.Następnie odwiruj probówki przez pięć minut przy 200 Gs i poddaj komórki dalszej obróbce zgodnie z konkretnymi celami eksperymentalnymi, takimi jak te wymienione w załączonym protokole tekstowym. Oto przykład jednego z wielu testów, które można przeprowadzić przy użyciu tego systemu. Układ składa się z odzwierciedlonych komórek śródbłonka pochodzących z szpiku kostnego, hodowanych na wkładkach z porami o wielkości pięciu mikronów; pod wkładki dodano czynnik pochodzący z komórek zrębowych 1 lub SDF1 w stężeniach 0,5 lub 50 ng/mL.Komórki szpiku kostnego pozostawiono w obiegu w układzie 3D. Komórki, które migrowały przez wkładkę, zebrano, a następnie hodowano na płytkach w pożywce z metylocelulozą. W obecności czynników wzrostu hematopoetycznego powodujących tworzenie kolonii przez komórki progenitorowe, liczbę kolonii oceniono po 14 dniach, aby określić liczbę progenitorów w każdej studzience oraz zbadać ich zdolność do migracji w kierunku sdf.Jeden w warunkach przepływu fizjologicznego. Po dodaniu fibroblastów zrębu hodowanych na dolnym wkładzie w komorze statycznej, więcej komórek hematopoetycznych migrowało z krążenia do komory po dodaniu sdf w stężeniu 50 nanogramów na mililitr niż przy zastosowaniu samego SDF one. Po opracowaniu, technika ta utorowała drogę badaczom z różnych dziedzin nauk medycznych i biologicznych do modelowania specyficznych dla tkanek łożysk naczyniowych in vitro oraz badania mechanizmów komórkowych i molekularnych pośredniczących w migracji krążących komórek w kierunku tkanek zdrowych w porównaniu z chorobowymi.

a-novel-three-dimensional-flow-chamber-device-to-study-chemokine

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Nowe urządzenie do badania trójwymiarowej komory przepływowej do badania ekstrawazacji komórek skierowanej na chemiokiny krążących w warunkach fizjologicznego przepływu

Opisujemy metodę poddawania przylegających komórek naprężeniom ścinającym w przepływie laminarnym w sterylnym obwodzie przepływu ciągłego. Poprzez przezroczystą komorę można badać adhezję i morfologię komórek, a z obwodu można pobierać próbki do analizy metabolitów oraz zbierać komórki po ekspozycji na siły ścinające do dalszych eksperymentów lub hodowli.

Komora przepływowa z równoległymi płytkami i obwód przepływu ciągłego do oceny komórek progenitorowych śródbłonka pod wpływem naprężenia ścinającego w przepływie laminarnym

Przepływ płynu śródmiąższowego jest zwiększony w guzach litych i może modulować inwazję komórek nowotworowych. W niniejszej pracy opisujemy technikę nakładania przepływu płynu śródmiąższowego na komórki zatopione w macierzy, a następnie pomiaru jego wpływu na inwazję komórek. Technika ta może być łatwo zaadaptowana do badania innych układów.

Trójwymiarowy model hodowli komórkowej do pomiaru wpływu przepływu płynu śródmiąższowego na inwazję komórek nowotworowych

Source: Claes, J., et al, In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates a method for studying host-pathogen interactions using a micro-parallel plate flow chamber seeded with human primary endothelial cells. Following endothelial cell activation by an ionophore and perfusion with fluorescently labeled bacteria, the cells release von Willebrand factor (VWF), which binds bacterial adhesins under shear...

Micro-Parallel Plate Flow Chamber Model for Studying Bacterial Adhesion to Human Endothelial Cells

Film demonstruje metodę badania wpływu komórek zrębu na rekrutację leukocytów. W modelu komory z przepływem równoległym cytokiny prozapalne indukują ekspresję receptorów adhezyjnych przez komórki śródbłonka, ułatwiając rekrutację i migrację neutrofili. Wzajemne oddziaływanie między komórkami zrębu a komórkami śródbłonka zmniejsza rekrutację neutrofili do komórek śródbłonka.

Badanie przepływu in vitro wpływu komórek zrębu na rekrutację leukocytów

Ten protokół szczegółowo opisuje test przeznaczony do pomiaru chemotaksji ludzkich neutrofili z jednej kropli krwi pełnej z solidną powtarzalnością. Takie podejście pozwala obejść potrzebę separacji neutrofili i wymaga tylko kilku minut czasu na przygotowanie testu. Chip mikroprzepływowy umożliwia wielokrotny pomiar chemotaksji neutrofili w czasie u niemowląt lub małych ssaków, gdzie objętość próbki jest ograniczona.

Platforma mikroprzepływowa do pomiaru chemotaksji neutrofili z nieprzetworzonej krwi pełnej

Leukocyty przenikają przez monowarstwę śródbłonka drogą parakomórkową lub transkomórkową. Opracowaliśmy prosty test do śledzenia rozkładu endogennej złączowej VE-kadheryny i PECAM-1 podczas transśródbłonkowej migracji leukocytów pod przepływem fizjologicznym, aby rozróżnić dwie drogi transmigracji.

Obrazowanie w czasie rzeczywistym połączeń komórka-komórka śródbłonka podczas transmigracji neutrofili pod wpływem przepływu fizjologicznego

Tutaj prezentujemy protokół, który pozwala badaczowi ocenić dynamikę rekrutacji leukocytów ex vivo poprzez podłączenie komory pokrytej cząsteczkami adhezyjnymi pochodzącymi ze śródbłonka do układu krążenia myszy. Metoda ta ma istotne zalety, ponieważ pozwala na ocenę leukocytów we względnych warunkach biologicznych.

Ocena interakcji leukocytów-śródbłonka w warunkach przepływu w autoperfuzyjnym teście komorowym ex vivo z mikroprzepływem

Migracja komórek jest ważną częścią rozwoju i życia człowieka. Aby zrozumieć mechanizmy, które mogą zmieniać migrację komórek, przedstawiamy planarny system dyfuzji gradientowej do badania chemotaksji w matrycy kolagenu 3D, co pozwala przezwyciężyć nowoczesne ograniczenia komory dyfuzyjnej istniejących testów.

Planarny system dyfuzji gradientowej do badania chemotaksji w matrycy kolagenowej 3D

Ten protokół szczegółowo opisuje konfigurowalną metodę pomiaru migracji komórek w odpowiedzi na chemoatraktanty, które mogą być również użyte do określenia szybkości dyfuzji leku z matrycy polimerowej.

Konfigurowalna komora do pomiaru migracji komórek

Leukocyty chętnie oddziałują z komórkami naczyniowymi i płytkami krwi po uszkodzeniu ściany naczynia lub podczas stanu zapalnego. W tym miejscu opisujemy prosty test oparty na przepływie laminarnym, aby scharakteryzować mechanizmy molekularne, które leżą u podstaw interakcji między leukocytami a ich partnerami komórkowymi.

Testy oparte na przepływie laminarnym w celu zbadania rekrutacji leukocytów na hodowanych komórkach naczyniowych i przylegających płytkach krwi

W tym protokole, do badania interakcji między komórkami leukocytów w chorobie zapalnej stosuje się biomimetyczne badanie mikropłynów, które może odtworzyć fizjologicznie istotne środowisko mikrokrążenia i odtworzyć całą kaskadę adhezji/migracji leukocytów.

System mikrofizjologiczny do badania interakcji między leukocytami a komórkami śródbłonka podczas stanu zapalnego

Poznaj metodę badania wynaczynienia komórek w trójwymiarowej komorze przepływowej z gradientem chemokin. Technika umożliwia ilościową analizę migracji komórek krążących w warunkach fizjologicznego przepływu.

Nowatorskie trójwymiarowe urządzenie z komorą przepływową do badania wynaczynienia komórek krążących w fizjologicznych warunkach przepływu kierowanego przez chemokinę (Wideo) | JoVE Journal

Nowatorskie trójwymiarowe urządzenie z komorą przepływową do badania wynaczynienia komórek krążących w fizjologicznych warunkach przepływu kierowanego przez chemokinę

Przeglądaj więcej filmów