Nowatorskie trójwymiarowe urządzenie z komorą przepływową do badania wynaczynienia komórek krążących w fizjologicznych warunkach przepływu kierowanego przez chemokinę

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest ilościowy pomiar migracji krążących komórek w kierunku gradientu chemokin. W warunkach fizjologicznego stresu ścinającego osiąga się to poprzez uprzednie hodowanie monowarstwy komórek śródbłonka na mikroporowatych wkładkach pokrytych kolagenem, a następnie wbudowanie ich do komory przepływowej, w której przykrywają one oddzielny przedział statyczny zawierający chemokiny. Następnie do komórek przyłożony jest stres ścinający, aby odtworzyć warunki fizjologiczne panujące w naczyniach krwionośnych.

W drugim kroku komórki testowe, takie jak leukocyty, komórki macierzyste lub komórki nowotworowe, są wprowadzane do układu 3D w celu umożliwienia ich krążenia. Zawartość komory statycznej wpływa na efektywność oddziaływań między krążącymi komórkami a komórkami śródbłonka, a w konsekwencji na tempo transmigracji komórek testowych przez warstwę śródbłonka. Następnie układ 3D jest demontowany, a transmigrowane komórki testowe są zbierane z dolnej komory statycznej w celu ilościowego pomiaru migracji komórek. Przy zastosowaniu różnych nowoczesnych metod uzyskuje się wyniki wykazujące zdolność krążących komórek testowych do oddziaływania z komórkami śródbłonka w warunkach przepływu fizjologicznego oraz opuszczania krwiobiegu w zależności od stężenia chemokin w komorze statycznej.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak zastosowanie równoległych komór przepływowych o przepływie laminarnym oraz statycznych testów transferu, jest połączenie naprężenia ścinającego w komorze górnej i gradientu chemokin w dolnej komorze statycznej. Pozwala to badaczom na ilościowy pomiar eksternalizacji krążących komórek w odpowiedzi na gradient chemokin oraz warunki przepływu fizjologicznego. Metoda ta może być również wykorzystana do badania wpływu interakcji między komórkami lokalnego mikrośrodowiska a komórkami śródbłonka na ekstrawasację krążących komórek.

Aby umożliwić hodowlę dodatkowej warstwy komórek na oddzielnym wkładzie pod komórkami śródbłonka, procedurę zademonstruje Valentina against rova, technik z mojego laboratorium. Na początek należy obliczyć liczbę wkładów potrzebnych do eksperymentu i umieścić każdy wkład w oddzielnej sterylnej szalce Petriego. Następnie należy je wysterylizować za pomocą promieniowania gamma, aż całkowzna dawka osiągnie 11 gray, w zależności od poszczególnych konfiguracji.

Następnie rozcieńcz roztwór zapasowy kolagenu typu I do stężenia 50 µg/mL, używając 0,01 M kwasu solnego przechowywanego w temperaturze 4 °C, i przygotuj aliquoty końcowego roztworu o objętości 154 µL dla każdego insertu. Następnie nanieś kilka kropel roztworu na powierzchnię insertu w układzie kolistym.

Następnie dodaj resztę alikwotu, aby utworzyć jedną dużą kroplę na powierzchni wkładu. Upewnij się, że końcówka pipety w żadnym momencie nie dotyka wkładu oraz że kolagen pokrywa całą powierzchnię wkładu, ale nie spływa z niego. Po pokryciu wkładu załóż pokrywkę nay szalkę Petriego i ostrożnie postaw ją na płaskiej powierzchni.

Inkubować wstawki przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej; po inkubacji odessać roztwór kolagenu i przemyć membranę 160 µL PBS. Następnie odessać PBS. Nałożyć pokrywkę i owinąć szalkę parafirmą.

Jeśli wkłady zostaną użyte tego samego dnia, należy umieścić szalkę Petriego w suchym miejscu w temperaturze pokojowej. W przeciwnym razie należy przechowywać szalkę w temperaturze 4 °C i wykorzystać wkład w ciągu siedmiu dni. Hodowane ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej należy zebrać bezpośrednio przed użyciem i resuspender w odpowiednim medium hodowlanym w stężeniu 2,5 miliona komórek na mililitr.

Podczas zliczania komórek należy upewnić się, że ich żywotność przekracza 98% przy użyciu błękitu trypanu, a następnie nanieść 160 µL zawiesiny komórkowej na każdy insert. Należy najpierw nanieść kilka małych kropli w okręgu na powierzchnię insertu pokrytego kolagenem, a następnie ostrożnie dodać resztę zawiesiny komórkowej, tworząc jedną dużą kroplę. Po zakończeniu należy założyć pokrywki i ostrożnie umieścić szalki w inkubatorze z 5% carbon dioxide w temperaturze 37 °C i inkubować przez 30 minut, aby umożliwić przywieranie komórek do membrany.

Po 30 minutach wyjmij płytki z inkubatora i delikatnie dodaj pięć mililitrów podgrzanej pożywki do każdej wkładki. Należy upewnić się, że wkładka pozostaje na dnie naczynia i jest całkowicie przykryta pożywką. Następnie załóż pokrywki i ostrożnie umieść naczynia z powrotem w inkubatorze.

Komórki inkubowano w temperaturze 37 °C przez noc. Aby złożyć komorę przepływową, najpierw skręć ze sobą płytkę górną i dolną. Następnie połącz płytki z jednostką wymiany gazowej, używając rurek z PVC o średnicy wewnętrznej 1,42 mm i grubości ścianek 0,8 mm.

Następnie umieść zmontowane urządzenie w czystej plastikowej torbie i wysterylizuj je poprzez napromieniowanie gamma, aż całkowzna dawka osiągnie 11 gray. Kolejnym krokiem jest wyjęcie tacy inkubatora, umieszczenie jej w sterylnej komorze do hodowli tkanek i wysterylizowanie 70% ethanol. Następnie przykryj tacę dużą sterylną serwetką.

Następnie wyjmij urządzenie z plastikowej torebki i umieść je na sterylnej tacy inkubatora. Potem podłącz urządzenie do pompy perystaltycznej i zaprogramuj pompę na prędkość 0,2 milliliters per minute. Do sterylnej probówki o pojemności 15 milliliters, która będzie służyć jako wlot, pipetuj od pięciu do siedmiu milliliters pożądanego medium hodowlanego.

Następnie odłącz rurkę wlotową od wylotowej, wyciągając metalną igłę z rurki za pomocą małych sterylnych serwetek, aby zachować sterylność rurki; umieść metalną igłę wlotową w probówce 15 ml z medium, a rurkę wylotową w pustej probówce 15 ml. Następnie włącz pompę tak, aby przepływ odbywał się przeciwnie do ruchu wskazówek zegara. Pozostaw podciśnienie, aby zassać medium z wlotowej probówki 15 ml do wnętrza rurki, i wyłącz pompę, gdy medium dotrze do końca rurki, tuż przed wejściem do urządzenia.

Następnie otwórz urządzenie, odkręcając płyty rurek, i ostrożnie zdejmij górną płytę. Pipetuj od 1500 do 1550 µL pożywki do dolnych dołków, upewniając się, że dołki zawierają wystarczającą ilość pożywki, aby utworzyła ona półkulę sięgającą od jednego do dwóch milimetrów ponad dolną płytę. Następnie przenieś przygotowane wkładki z szalek Petriego do dołków dolnej płyty. Używając sterylnej pęsety, upewnij się, że pod wkładkami nie uwięzły pęcherzyki powietrza, a następnie odessij nadmiar pożywki, która pojawiła się na powierzchni dolnej płyty.

Następnie nałóż górną płytkę z powrotem na dolną płytkę i połącz je ze sobą. Po dokręceniu śrub niezwłocznie włącz pompę perystaltyczną, aby medium zaczęło przepływać przez urządzenie 3D. Unieś koniec wylotowy urządzenia i utrzymuj komorę w tej pozycji, aby zapobiec tworzeniu się pęcherzyków powietrza w przestrzeni między płytkami.

Kontynuuj napełnianie pożywką rurki łączącej komorę z jednostką wymiany gazów, aż pożywka dotrze do tej jednostki. Następnie wlej trzy mililitry pożywki do jednostki wymiany gazów. Włącz pompę i pozwól pęcherzykom powietrza przejść przez układ.

Podnieś jednostkę, aby umożliwić wypełnienie medium przewodów odpływowych, a następnie zatrzymaj pompę, gdy medium znajdzie się dwa do trzech centymetrów przed końcem. Po całkowitym zaprzeszczeniu połącz igłę wlotową z przewodami wylotowymi za pomocą małych sterylnych serwetek. Następnie odwróć kierunek pompowania, aby medium przepływało zgodnie z ruchem wskazówek zegara w stronę jednostki wymiany gazowej, i upewnij się, że usunięto wszystkie pozostałe pęcherzyki powietrza.

Przy ponownym przepływie pompy w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara, należy dodać 100 µL zawiesiny komórek testowych do jednostki wymiany gazowej. Następnie należy zamknąć pokrywę respiratora.

Umieść tacę z powrotem w inkubatorze i pozwól komórkom testowym krążyć w urządzeniu w temperaturze 37 °C. Po upływie pożądanego czasu wyjmij tacę z działającym systemem z inkubatora i umieść ją w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Zatrzymaj pompę, odłącz wlot i wylot, a następnie umieść ich końce w pustych, sterylnych probówkach 15 ml.

Następnie włącz pompę i zbierz zawiesinę komórkową z systemu. Przechowuj zawiesinę komórkową na lodzie do momentu użycia. Następnie rozmontuj komorę, wykręcając śruby i zdejmując górną płytę.

Wyjmij wkłady z dolnej płytki i przenieś je do szalek Petriego w celu przeprowadzenia barwienia lub zbioru komórek. Na koniec usuń zawiesinę komórkową z dolnych studzienek i przelej ją do probówek o pojemności 15 mililitrów. Przepłucz każdą studzienkę dwukrotnie 1,5 mililitrami pożywki i dodaj ją do odpowiedniej probówki.

Następnie odwiruj probówki przez pięć minut przy 200 Gs i poddaj komórki dalszej obróbce zgodnie z konkretnymi celami eksperymentalnymi, takimi jak te wymienione w załączonym protokole tekstowym. Oto przykład jednego z wielu testów, które można przeprowadzić przy użyciu tego systemu. Układ składa się z odzwierciedlonych komórek śródbłonka pochodzących z szpiku kostnego, hodowanych na wkładkach z porami o wielkości pięciu mikronów; pod wkładki dodano czynnik pochodzący z komórek zrębowych 1 lub SDF1 w stężeniach 0,5 lub 50 ng/mL.

Komórki szpiku kostnego pozostawiono w obiegu w układzie 3D. Komórki, które migrowały przez wkładkę, zebrano, a następnie hodowano na płytkach w pożywce z metylocelulozą. W obecności czynników wzrostu hematopoetycznego powodujących tworzenie kolonii przez komórki progenitorowe, liczbę kolonii oceniono po 14 dniach, aby określić liczbę progenitorów w każdej studzience oraz zbadać ich zdolność do migracji w kierunku sdf.

Jeden w warunkach przepływu fizjologicznego. Po dodaniu fibroblastów zrębu hodowanych na dolnym wkładzie w komorze statycznej, więcej komórek hematopoetycznych migrowało z krążenia do komory po dodaniu sdf w stężeniu 50 nanogramów na mililitr niż przy zastosowaniu samego SDF one. Po opracowaniu, technika ta utorowała drogę badaczom z różnych dziedzin nauk medycznych i biologicznych do modelowania specyficznych dla tkanek łożysk naczyniowych in vitro oraz badania mechanizmów komórkowych i molekularnych pośredniczących w migracji krążących komórek w kierunku tkanek zdrowych w porównaniu z chorobowymi.