Name: Modele interakcji gen-środowisko w celu ujawnienia mechanizmów podatności w chorobie Parkinsona (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-07T13:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: Odkryj rolę izoenzymów lipooksygenazy w neurodegeneracji związanej z chorobą Parkinsona przy użyciu modelu neurotoksyny MPTP na myszach. Ta metoda pozwala zrozumieć mechanizmy neurozapalne.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta została sfinansowana przez National Institutes of Health NIGMS 056062.

Nie ma nic do ujawnienia.

Projekt tego badania interakcji gen-środowisko pozwolił nam uzyskać nowe informacje na temat podwójnej natury izoenzymu 5-LOX w szlaku nigrostriatalnym. Wykonując HPLC w celu pomiaru monoamin prążkowia po leczeniu solą fizjologiczną lub MPTP u transgeników pozbawionych izoenzymu 5-LOX i ich rodzeństwa z miotu typu dzikiego, byliśmy w stanie zauważyć, że jego niedobór wydaje się być ochronny w warunkach toksycznych (Figura 1), ale w normalnych warunkach brak enzymu obniża poziom dopaminy w prążkowiu i moż...

Wykorzystanie modeli interakcji gen-środowisko dostarcza podejścia do naśladowania czynników ryzyka, które prawdopodobnie wpływają na idiopatyczną chorobę Parkinsona (PD) i daje możliwość dostrzeżenia mechanistycznych spostrzeżeń, które prawdopodobnie nie zostaną wyjaśnione przy użyciu samego systemu genetycznego lub toksycznego1,2. Tutaj ilustrujemy ten punkt i opisujemy zastosowanie mysiego modelu zwyrodnienia nigrostriatalnego 1-metylo-4-fenylo-1,2,3,6-tetrahydropirydyny (MPTP) w celu lepszego zrozumienia selektywności aktywności izoenzymu lipooksygenazy (LOX) na zapalenie nerwów i toksyczność4. Podczas gdy rola izoenzymów LOX została szeroko oceniona w zaburzeniach obwodowych5,6, a także w chorobach OUN, w tym udarze7 i chorobie Alzheimera8,9, rola rodziny izoenzymów w funkcji nigrostriatalnej i zwyrodnieniu związanym z chorobą Parkinsona nie jest dobrze poznana i wymaga badań. Neurotoksyna MPTP wykazuje preferencyjne zwyrodnienie szlaku nigrostriatal i rekapituluje wyczerpanie dopaminy w prążkowiu i utratę komórek dopaminergicznych nigral, które leżą u podstaw zaburzeń motorycznych u pacjentów z PD10. Chociaż model ten nie odtwarza pełnej kadry zachowań niemotorycznych i motorycznych PD oraz szczerej patologii ciał Lewy'ego α-synukleinowo-dodatnich, był przydatny do wyjaśnienia nowych celów mechanistycznych, które przyczyniają się do uszkodzenia nigrostriatal i do testów translacyjnych na wczesnym etapie, ponieważ jest to najlepiej scharakteryzowany nieinwazyjny model dostępny do niezawodnego wytwarzania śmierci komórek nikralnych, której towarzyszy utrata dopaminy w prążkowiu11-15. Szerokie zastosowanie myszy MPTP, z paradygmatami od ostrych, podostrych do przewlekłych16-18, pozwoliło na standaryzację dawkowania w celu uzyskania łagodnego do ciężkiego uszkodzenia nigrostriatale19,20 z aktywacją różnych mechanizmów toksyczności w zależności od schematu leczenia18,21,22. W związku z tym pozwala to na ukierunkowanie "okna uszkodzenia", które może skutkować wzmocnieniem lub zmniejszeniem uszkodzenia nigrostriatal w zależności od zastosowanego środka terapeutycznego lub modelu transgenicznego23-25.
Również niezbędne dla badań biologii translacyjnej i odkrywczej są techniki używane do oceny uszkodzeń oraz dowody dostarczane przez te metody. Dla mysiego modelu MPTP, ustalonymi wskaźnikami do oceny zmian są pomiar markerów tonu dopaminergicznego prążkowia, w tym dopaminy i jej metabolitów za pomocą HPLC, oraz analiza Western blot hydroksylazy tyrozyny (TH), enzymu ograniczającego szybkość syntezy dopaminy, oraz wskaźniki zdarzeń zwyrodnieniowych, takich jak aktywacja gleju przy użyciu analizy Western blot i immunohistochemii4. Chociaż są to klasyczne procedury neurochemiczne, biochemiczne i histologiczne, techniki te zapewniają krytyczne i powtarzalne odczyty zakresu uszkodzeń w obrębie nigrostriatalnej ścieżki dopaminergicznej, wskazują mechanizmy toksyczności i okazały się cennymi narzędziami w zrozumieniu zdarzeń zwyrodnieniowych w PD.

<table><tbody><tr><td>Chlorowodorek 1-metylo-4-fenylo-1,2,3,6-tetra-hydropirydyny (MPTP-HCL)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0896</td><td>do modelowania PD</td></tr><tr><td>4% roztwór formaldehydu (paraformaldehydu), buforowany fosforanem (PFA)</td><td>Amerykański BUP0157 naukowy MasterTech do</td><td></td><td>utrwalania zanurzeniowego</td></tr><tr><td>Odczynnik ACS kwasu nadchlorowego, 70% (PCA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>244252</td><td>do ekstrakcji</td></tr> <tr><td>kwasem HPLCTris Base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td>do homogenizacji tkanek</td></tr><tr><td>Sól disodowa kwasu etylenodiaminotetraoctowego dwuwodna (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1644</td><td>do homogenizacji tkanek</td></tr><tr><td>Koktajl inhibitorów proteazy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8340</td><td>do homogenizacji tkanek</td></tr><tr><td>Koktajl inhibitorów fosfatazy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5726</td><td>do homogenizacji tkanek</td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu (NaOH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5881</td><td>do testu białka Lowry'ego</td></tr><tr><td>Sacharoza, biologia molekularna, &ge; 99,5% (GC)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td>do krioprotekcji</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami, proszek, pH 7,4 (dla 0,01 M PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3813</td><td>do</td></tr><tr><td>zestawu do oznaczania białek IHC BCA</td><td>Pierce/Thermo</td><td>23225</td><td>do oznaczania białek</td></tr><tr><td>Novex 12% Tris-Glycine Mini Gels 1,0 mm, 12-dołkowy</td><td>Invitrogen/Life Technologies</td><td>EC60052BOX</td><td>do próbki SDS-PAGE</td></tr><tr><td>NuPAGE LDS Bufor (4x)</td><td>Invitrogen/Life Technologies</td><td>NP0007</td><td>dla SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Novex Sharp Prestained Protein Standard&nbsp;</td><td>Invitrogen/Life Technologies</td><td>LC5800</td><td>drabinka białkowa</td></tr><tr><td>Glicyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7126</td><td>dla SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Dodecylosiarczan sodu, elektroforeza, 98,5% (SDS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3771</td><td>dla SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Alkohol metylowy, bezwodny, odczynnik&nbsp;</td><td>American MasterTech Scientific</td><td>SPM1057C</td><td>metanol do transferu</td></tr><tr><td>Chlorek sodu (NaCl), odczynnik ACS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td>sól fizjologiczna i</td></tr><tr><td>Beztłuszczowe mleko w proszku w proszku</td><td>Goździk</td><td>nie dotyczy</td> do <td>immunoblottingu</td></tr><tr><td>Roztwór Pąsek w 5% kwasie octowym&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7170</td><td>do immunoblottingu</td></tr><tr><td>Hydroksylaza antytyrozynowa (TH), poliklonalny</td><td>Chemicon/Millipore</td><td>AB1542</td><td>do immunofluorescencji&nbsp;</td></tr><tr><td>Hydroksylaza anty-tyrozynowa (TH), królicza poliklonalna</td><td>Pel-Freez Biologicals</td><td>P40101-0</td><td>do immunoblottingu</td></tr><tr><td>Anti-&beta; Aktyna, królik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2066</td><td>do immunoblottingu</td></tr><tr><td>Anti-Gleial Fibrillary Acidic Protein (GFAP), królik poliklonalny</td><td>Chemicon/Millipore</td><td>AB5804</td><td>do immunofluorescencji</td></tr><tr><td>Anti-Gleal fibrillary acidic protein (GFAP), mysz monoklonalna</td><td>Covance Inc.</td><td>SMI-22R</td><td>do immunoblottingu</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td>do immunoblottingu</td></tr><tr><td>Kozia anty-królicza IgG (H+L), peroksydaza sprzężona&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>31462</td><td>dla immunofluorescencji</td></tr><tr><td>kozy anty-owczej, peroksydaza sprzężona</td><td>Pierce/Thermo</td><td>31480</td><td>dla immunofluorescencji</td></tr><tr><td>kozła anty-mysia, peroksydaza sprzężona</td><td>Pierce/Thermo</td><td>31430</td><td>dla immunofluorescencji</td></tr><tr><td>SuperSignal West Pico Chemiluminescencyjne podłoże</td><td>Pierce/Thermo</td><td>34078</td><td>do immunoblottingu</td></tr><tr><td>CL-XPoliwa 7 cali x 9,5 cala&nbsp;</td><td>Pierce/Thermo</td><td>34089</td><td>do immunoblottingu</td></tr><tr><td>Restore Western Blot Stripping Buffer&nbsp;</td><td>Pierce/Thermo</td><td>21059</td><td>do immunoblottingu</td></tr><tr><td>Kwas cytrynowy jednowodny, odczynnik ACS, &ge; 99.0%&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1909</td><td>dla IHC</td></tr><tr><td>Normal Donkey Serum</td><td>Millipore</td><td>S30-100ML</td><td>dla IHC</td></tr><tr><td>Polyvinylopirolidon (PVP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5288</td><td>dla</td></tr><tr><td>albuminy surowicy bydlęcej IHC (BSA), liofilizowany</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3294</td><td>dla IHC</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-01</td><td>dla IHC</td></tr><tr><td>Ośli anty-królicze IgG, Alexa Fluor 568-labeled&nbsp;</td><td>Invitrogen/Life Technologies</td><td>A10042</td><td>dla IHC</td></tr><tr><td>Donkey IgG przeciwko owcom (H+L), FITC&nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>713-095-147</td><td>dla IHC</td></tr><tr><td>VECTASHIELD Hard-Set Mounting Medium z DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1500</td><td>dla IHC</td></tr><tr><td>Normal Goat Serum</td><td>Millipore</td><td>S26-100ML</td><td>do zestawu IHC</td></tr><tr><td>VECTASTAIN ABC (Rabbit IgG) &nbsp;</td><td>Vector Laboratories</td><td>PK-4001</td><td>dla IHC; 10 &mikro; l każdy z roztworów A i B na 1 ml PBS (zgodnie z instrukcją)</td></tr> <tr><td>Zestaw substratów peroksydazy DAB, 3,3'-diaminobenzydyna</td><td>Vector Laboratories</td><td>SK-4100</td><td>dla IHC; na 5 ml zimnego ddH2O, dodać 2 krople buforowego roztworu podstawowego, 2 krople DAB i 1 kroplę H2O2 (H2 O2 dodaje się bezpośrednio przed użyciem)</td></tr><tr><td>Nadtlenek wodoru, 30%</td> <td>216763 Sigma-Aldrich</td><td></td><td>do etapu hartowania w IHC</td></tr><tr><td>Rabbit anty-Iba1</td><td>Biocare Medicals</td><td>CP290A</td><td>do</td></tr><tr><td>roztworu fioletu krezylowego IHC, regularna moc&nbsp;</td><td>FD Neurotechnologies</td><td>PS102-01</td><td>barwnik przeciwbarwny do Iba1 IHC</td></tr><tr><td>95% etanolu, odczynnik alkoholowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8382</td><td>odwadnianie do</td></tr><tr><td>IHC 100% etanol absolutny</td><td>Mallinckrodt</td><td>7019-10</td><td>odwadnianie dla IHC</td></tr><tr><td>Kwas octowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6283</td><td>odbarwianie dla</td></tr><tr><td>IHC Ksylen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>534056</td><td>środek czyszczący do mocowania IHC</td></tr><tr><td>DPX</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>06522</td><td>medium montażowe do DAB IHC</td></tr><tr><td>O.C.T. Compound - Medium do zatapiania sekcji mrożonych&nbsp;</td><td>Amerykański MasterTech Scientific</td><td>EMOCTCS</td><td>embeddium medium do cięcia kriostatu</td></tr><tr><td>Nadmanganian potasu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>223468</td><td>do odkażania roztworu DAB</td></tr><tr><td>Chlorowodorek dopaminy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8502</td><td>do HPLC</td></tr><tr><td>Kwas 3,4-dihydroksyfenylooctowy (DOPAC)</td><td>850217 Sigma-Aldrich</td><td></td><td>do HPLC</td></tr><tr><td>Kwas homowanilinowy (HVA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1252</td><td>do HPLC</td></tr><tr><td>Kwas nadchlorowy (PCA) - 70%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>244252</td><td>do HPLC</td></tr><tr><td>Monohydrat diwodorofosforanu sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71504</td><td>do HPLC</td></tr><tr><td>Monohydrat kwasu cytrynowego</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1909</td><td>do HPLC</td></tr><tr><td>Sól sodowa kwasu 1-oktanosulfonowego (OSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O8380</td><td>do HPLC</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1644</td><td>dla HPLC</td></tr><tr><td>Acetonitryl</td><td>EMD</td><td>AX0145-1</td><td>do HPLC</td></tr><tr><td>Destylowana woda dejonizowana klasy HPLC (ddH2O)</td><td>Milipor</td><td></td><td>do HPLC</td></tr><tr><td>0,22 i mikro; m Membrana GSTF</td><td>Millipore</td><td></td><td>do filtracji</td></tr><tr><td>Corning Netwells</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3477</td><td>wkład polistyrenowy z dnem z siatki poliestrowej, do IHC</td></tr><tr><td>Ultradźwiękowy rozbijacz komórek (Soniprep 150)</td><td>MSE</td><td>MSE.41371.274</td><td></td></tr><tr><td>Mikrowirówka</td><td>Eppendorf</td><td>5414R</td><td></td></tr><tr><td>ESA MD-150 kolumna z odwróconymi fazami&nbsp;</td><td>Pompa ESA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HPLC (Ultimate 3000)</td>Automatyczny podajnik próbek <td>Dionex</td><td>ISO-3100BM</td><td></td></tr><tr><td>HPLC (Ultimate 3000)</td><td>Dionex</td><td>WPS-3000TSL</td><td></td></tr><tr><td>Detektor elektrochemiczny</td><td>ESA</td><td>Coulochem III</td><td></td></tr><tr><td>Komórka ochronna</td> ESA <td>5020</td><td></td><td>Komórka analityczna ESA</td></tr><tr><td></td><td></td><td>5011A</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie Chromeleon</td><td>Dionex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eclipse E400</td><td>Nikon</td><td>E400</td><td>mikroskop świetlny/fluorescencyjny</td></tr><tr><td>Jednorazowa klatka dla myszy</td><td>Ancare</td><td>N10HT</td><td></td></tr><tr><td>Mikrofiltr górny</td><td>Ancare</td><td>N10MBT</td><td></td></tr><tr><td>5-LOX- myszy z niedoborem</td><td>Laboratorium Jacksona</td><td>004155</td><td></td></tr><tr><td>12/15-LOX Myszy z niedoborem</td> Jackson <td>Laboratory</td><td>002778</td><td></td></tr></tbody></table>

modele interakcji gen-środowisko w celu ujawnienia mechanizmów podatności w chorobie parkinsona

Gene-environment Interaction Models to Unmask Susceptibility Mechanisms in Parkinson's Disease

Aktywność lipooksygenazy (LOX) jest związana z zaburzeniami neurodegeneracyjnymi, takimi jak choroba Alzheimera, ale jej wpływ na patogenezę choroby Parkinsona (PD) jest mniej zrozumiały. Modele interakcji gen-środowisko są użyteczne w demaskowaniu wpływu określonych szlaków komórkowych na toksyczność, której nie można zaobserwować przy użyciu wyłącznie genetycznego lub toksycznego modelu choroby. Aby ocenić, czy różne izoenzymy LOX selektywnie przyczyniają się do neurodegeneracji związanej z PD, myszy transgeniczne (tj. z niedoborem 5-LOX i 12/15-LOX) mogą być prowokowane toksyną, która naśladuje uszkodzenie komórek i śmierć w zaburzeniu. Tutaj opisujemy zastosowanie neurotoksyny, 1-metylo-4-fenylo-1,2,3,6-tetrahydropirydyna (MPTP), która powoduje zmianę nigrostriatalną, aby wyjaśnić wyraźny wkład izoenzymów LOX w neurodegenerację związaną z PD. Zastosowanie MPTP u myszy i naczelnych jest dobrze ugruntowane, aby podsumować uszkodzenie nigrostriatalne w PD. Zakres zmian wywołanych przez MPTP mierzy się za pomocą analizy HPLC dopaminy i jej metabolitów oraz półilościowej analizy Western blot prążkowia pod kątem hydroksylazy tyrozynowej (TH), enzymu ograniczającego szybkość syntezy dopaminy. Aby ocenić markery stanu zapalnego, które mogą wykazywać selektywną wrażliwość izoenzymową LOX, przeprowadza się kwaśne białko fibrylarne gleju (GFAP) i immunohistochemię Iba-1 na odcinkach mózgu zawierających istotę czarną, a analizę GFAP Western blot przeprowadza się na homogenatach prążkowia. To eksperymentalne podejście może dostarczyć nowych informacji na temat interakcji gen-środowisko leżących u podstaw zwyrodnienia nigrostriatal i PD.

Ten model ekspozycji na toksynę może wywołać istotny i wykrywalny 20% spadek poziomu dopaminy w prążkowiu u zwierząt wstrzykniętych MPTP w porównaniu do zwierząt wstrzykniętych solą fizjologiczną. Należy zauważyć, że różne partie MPTP mogą powodować nieco większe lub mniejsze uszkodzenia; dlatego w celu uzyskania lepszej precyzji zaleca się przeprowadzenie wstępnego eksperymentu na myszach typu dzikiego przed zastosowaniem nowej partii neurotoksyny u myszy transgenicznych. Stosowanie łagodnych do umiarkowanych uszkodzeń ...

Izoenzymy lipooksygenazy (LOX) mogą generować produkty, które mogą zwiększać lub zmniejszać stan zapalny układu nerwowego i neurodegenerację. Badanie interakcji gen-środowisko może zidentyfikować efekty specyficzne dla izoenzymu LOX. Wykorzystanie modelu 1-metylo-4-fenylo-1,2,3,6-tetrahydropirydyny (MPTP) uszkodzenia nigrostriatalnego w dwóch liniach transgenicznych z niedoborem izoenzymów LOX pozwala na porównanie wpływu izoenzymów LOX na integralność dopaminergiczną i stan zapalny.

Modele interakcji gen-środowisko w celu ujawnienia mechanizmów podatności w chorobie Parkinsona

Lipoxygenase (LOX) activity has been implicated in neurodegenerative disorders such as Alzheimer&#39;s disease, but its effects in Parkinson&#39;s disease ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest zrozumienie roli izoenzym lipooksygenazy w degeneracji prążkowia i istoty czarnej związanej z chorobą Parkinsona. W tym celu starannie przygotowuje się neurotoksynę wywołującą uszkodzenia w obrębie istoty czarnej i prążkowia. Następnie myszy z niedoborem LOX otrzymują codzienne iniekcje roztworu MPTP przez cztery kolejne dni, a analizy prowadzone są siedem dni po ostatniej iniekcji.Próbki są pobierane i wykorzystywane do analizy biochemicznej lub immunohistochemicznej. Wyniki wykazują, że 1215 locks nie wpływa na toksyczność MPTP w prążkowiu. Jednakże five locks przyczynia się do uszkodzeń w warunkach toksyczności.Metoda TS może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie choroby Parkinsona. Sugeruje ona, jaki jest wpływ interakcji genów z środowiskiem na podatność nistri. Wykorzystując modele genetyczno-środowiskowe, byliśmy w stanie rozpoznać funkcje selektywne ISO i zgłębić dwoistość pięciu lipes.Odpowiednio przeszkolony personel powinien przez cały czas trwania poniższej procedury stosować właściwe środki ochrony indywidualnej. W pierwszej kolejności należy przeprowadzić wszystkie obliczenia niezbędne do przygotowania roztworu neurotoksyny. Następnie należy przygotować cały wymagany sprzęt, materiały i odczynniki.Dodatkowo należy przygotować materiały do usunięcia ewentualnych rozlań. Obszar wokół wagi należy wyłożyć podkładkami lub ręcznikami papierowymi. W ramach środków ostrożności należy trzymać w zasięgu ręki chusteczki oraz 10% roztwór wybielacza, zwilżając nimi powierzchnię w celu zminimalizowania ryzyka związanego z rozsypaniem proszku.Po przygotowaniu wyjmij fiolkę źródłową z odpowiedniego miejsca przechowywania. Oznakuj szklaną fiolkę z MPTP, podając stężenie oraz datę. Za pomocą wagi analitycznej znajdującej się w dygestorium odważ 50 mg MPTP do szklanej fiolki z wtórnym zabezpieczeniem, w której znajduje się chusteczka nasączona 10% roztworem wybielacza.Następnie zamknij fiolkę źródłową i powoli przetrzyj jej zewnętrzną stronę 10%bleach. Do fiolki dodaj 13,763 milliliters sterylnej soli fizjologicznej i zamknij ją przed całkowitym wymieszaniem w dygestorium. Ostrożnie przefiltruj i wysterylizuj roztwór MPTP do oznakowanej fiolki wstrzykiwalnej, umieszczonej w pojemniku wtórnym z chusteczką nasączoną 10%bleach.Aby zmniejszyć ciśnienie, należy lekko poluzować zakrętkę fiolki zawierającej przefiltrowany roztwór MPTP. Ewentualne rozlany materiał należy usunąć za pomocą chusteczki nasączonej wybielaczem, a zużyte materiały zutylizować w odpowiednio oznakowanym pojemniku na odpady biologiczne. Fiolkę z roztworem MPTP należy przechowywać w pojemniku wtórnym wraz z chusteczką nasączoną wybielaczem podczas transportu do pomieszczenia zabiegowego dla zwierząt.Umieść fiolkę z MPTP w pojemniku wtórnym i odstaw ją w odpowiednie miejsce do przechowywania. Na koniec odkaź szpatułkę, wagę analityczną oraz powierzchnię dygestorium przez 10 minut, używając 10% roztworu wybielacza.Przed iniekcją zwierząt należy przygotować jednorazowe klatki z filtrowanymi, perforowanymi pokrywami. Oznaczyć je jako MPTP. Włożyć jednorazowe wyściółki do klatek, uprzednio namoczone granulki karmy oraz hydrożel jako źródło wody.Następnie zważ wszystkie zwierzęta i oblicz objętość roztworu MP TP wymaganą do wykonania wstrzyknięcia w dawce 15 mg/kg. Po przygotowaniu, zachowując szczególną ostrożność, unieruchom mysz nad jednorazową podkładką chłonną i wstrzyknij roztwór MPTP. Powtarzaj tę procedurę codziennie przez cztery dni; nie nakładaj nasadki na igłę, lecz umieść ją w dedykowanym i oznakowanym pojemniku na odpady medyczne i ostre narzędzia zanieczyszczone MPTP.W pobliżu należy przygotować 10% roztwór wybielacza oraz chusteczki. W celu usunięcia przypadkowych wycieków, zwierzęta po iniekcji MPTP należy umieścić w wcześniej przygotowanych jednorazowych klatkach i kwaterować na otwartych regałach. Następnie należy podać MPTP.Stosować tabliczki ostrzegawcze na klatkach oraz na drzwiach pomieszczenia z klatkami do 72 godzin po ostatnim wstrzyknięciu. Przetrzeć powierzchnię roboczą wybielaczem. Po każdym zabiegu zutylizować pozostałą część roztworu MPTP poprzez dodanie równoważnej objętości 10% wybielacza.W celu utylizacji substancji jako biohazardous liquid waste, wszystkie zużyte środki ochrony osobistej należy wyrzucić do dedykowanych pojemników na odpady, w razie potrzeby spryskując je 10% wybielaczem przed wyrzuceniem. W trakcie tej procedury ważne jest regularne sprawdzanie stanu zwierząt oraz codzienne uzupełnianie im pożywienia i wody. Trzy dni po ostatnim wstrzyknięciu należy zutylizować wszystkie materiały i przenieść zwierzęta z powrotem do standardowych klatek.W wcześniej określonych punktach czasowych eksperymentu pobrano zwierzęta w celu pozyskania i opracowania tkanek. Homogenizaty Stri AAL wykorzystano do pomiaru poziomów dopaminy u myszy typu dzikiego oraz myszy z nokautem five locks, traktowanych solą fizjologiczną lub MPTP. W grupach traktowanych solą fizjologiczną odnotowano istotny wpływ genotypu na poziomy DA, z niższymi poziomami DA u myszy transgenicznych. Jednak po zastosowaniu MPTP myszy z niedoborem five locks były chronione przed uszczupleniem poziomu SAL DA.Pięć myszy z nokautem genu locks w grupie MPTP wykazywało podobne poziomy DA w porównaniu z pięcioma myszami z nokautem locks w grupie z solą fizjologiczną. W przeciwieństwie do tego, w przypadku 1215 genotyp z nokautem locks nie odgrywał roli w poziomach dopaminy, niezależnie od grupy terapeutycznej. Barwienie immunofluorescencyjne dla TH i GFAP w istocie czarnej wykazało mniej ciał komórkowych dodatnich dla TH, oznaczonych gwiazdką, oraz zwiększoną immunoreaktywność GFAP w grupie MPTP typu dzikiego. Barwienie DAB dla mikrogleju wykazało rozgałęzione ciała komórkowe i długie, rozgałęzione wypustki u myszy traktowanych solą fizjologiczną, podczas gdy u myszy traktowanych MPTP zaobserwowano aktywowaną mikrogleję z okrągłymi ciałami komórkowymi i krótkimi, pogrubionymi wypustkami. Immunoblotting dla SAL, TH i GFAP dostarczył dalszych dowodów na uszkodzenia i neurostan zapalny wynikające z podania MPTP.Efekty te były zmniejszone u myszy z niedoborem five locks isy. Ze względu na to, że praca z MPTP może być niezwykle niebezpieczna, podczas wykonywania tej procedury należy zawsze przestrzegać środków ostrożności, takich jak noszenie osobistego sprzętu ochronnego i posiadanie pod ręką 10%bridge na wypadek kontaktu z substancją.

gene-environment-interaction-models-to-unmask-susceptibility

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Modele interakcji gen-środowisko do ujawnienia mechanizmów podatności na chorobę Parkinsona

W chorobie Parkinsona i ogólnie w zaburzeniach ruchowych, czułe i wiarygodne testy behawioralne są niezbędne do testowania nowych potencjalnych terapii. W tym miejscu opisujemy łatwą do opanowania baterię testów sensomotorycznych dla myszy, które są wrażliwe na różne stopnie uszkodzenia układu nigrostriatal i przydatne w badaniach przedklinicznych.

Ocena funkcji sensomotorycznych w mysich modelach choroby Parkinsona

Tutaj opisujemy system RatWalker, zbudowany przez przeprojektowanie aparatu MouseWalker, aby dostosować go do zwiększonych rozmiarów i wagi szczurów. System ten wykorzystuje sfrustrowane całkowite odbicie wewnętrzne (FTIR), szybkie przechwytywanie wideo i oprogramowanie do analizy w otwartym dostępie do śledzenia i ilościowego określania parametrów chodu.

Zastosowanie systemu RatWalker do analizy chodu w genetycznym modelu szczurzym choroby Parkinsona

W tym artykule pokazujemy, jak używać siedmiopunktowego systemu punktacji do konsekwentnego ilościowego określania zmian w morfologii dendrytów neuronów dopaminergicznych u C. elegans. System ten jest przeznaczony do analiz testów neurodegeneracji dopaminergicznej z wykorzystaniem genetycznych, chemicznych i opartych na wieku modeli zaburzeń neurodegeneracyjnych.

Kwantyfikacja poziomów zmian morfologicznych i zwyrodnień neuronów dopaminergicznych u Caenorhabditis elegans

Ta praca analizuje dawkę wektora i czas ekspozycji wymagane do wywołania zapalenia nerwów, neurodegeneracji i upośledzenia motorycznego w tym przedklinicznym modelu choroby Parkinsona. Te wektory kodujące ludzką α-synukleinę są dostarczane do istoty czarnej w celu podsumowania patologii synukleiny związanej z chorobą Parkinsona.

Analiza mysiego modelu choroby Parkinsona indukowanego przez wektory wirusowe związane z adenowirusem kodujące ludzką α-synukleinę

Ten protokół opisuje hodowlę komórek ludzkich neuronów dopaminergicznych śródmózgowia, a następnie barwienie immunologiczne i generowanie profili fenotypowych neuronów na podstawie uzyskanych mikroskopowych obrazów o wysokiej zawartości, co pozwala na identyfikację zmian fenotypowych spowodowanych modulacjami genetycznymi lub chemicznymi.

Profilowanie fenotypowe neuronów dopaminergicznych śródmózgowia pochodzących z ludzkich komórek macierzystych

Protokół ten ustanawia paradygmat fenotypowania behawioralnego u larw danio objętych zabiegiem MPTP, aby ocenić deficyty ruchowe i niemotoryczne podobne do choroby Parkinsona.

Profilowanie fenotypowe fenotypów behawioralnych podobnych do parkinsońskiego wywołanych MPTP u larw danio pręgowanego na podstawie eksperymentu behawioralnego

Fibroblasty związane z rakiem (CAFs), bogate w myofibroblasty obecne w zrębie guza, odgrywają kluczową rolę w stymulowaniu progresji nowotworu. Opracowaliśmy model ksenoprzeszczepu guza z jednoczesną implantacją w celu eksperymentalnego generowania CAF z ludzkich fibroblastów gruczołu piersiowego. Protokół opisuje sposób tworzenia myofibroblastów CAF, które nabywają zdolności do promowania tumorigennezy.

Doświadczalne generowanie fibroblastów towarzyszących rakowi (CAF) z ludzkich fibroblastów gruczołu piersiowego

Opisano protokół wykonywania jednostronnych uszkodzeń wiązki przedniej części mózgu (MFB) za pomocą 6-OHDA u myszy. Metoda ta charakteryzuje się niskim wskaźnikiem śmiertelności (13,3 %), przy czym u 89% przeżywających zwierząt stwierdzono &gt;95% ubytku dopaminy w prążkowiu oraz tendencję do rotacji ipsypsilaternej w stronę strony uszkodzenia na poziomie 90,63±-4,02 %.

Opracowanie jednostronnego modelu choroby Parkinsona u myszy z wykorzystaniem lekcji 6-OHDA

Farmakoterapia polegająca na zastępowaniu dopaminy za pomocą L-DOPA jest najczęściej stosowanym leczeniem objawowym choroby Parkinsona, jednak wiąże się z efektami ubocznymi, w tym z mimowolnymi, nieprawidłowymi ruchami, określanymi mianem dyskinezy 1. W niniejszym materiale przedstawiono protokół obrazowania metodą spektrometrii mas MALDI, który pozwala wykryć zmiany w poziomach neuropeptydów w mózgu szczura związane z dyskinezą.

Obrazowanie spektrometrią mas MALDI neuropeptydów w chorobie Parkinsona

Protokół hodowli eksplantów fibroblastów z biopsji wycinanych ze skóry ludzkiej jest technicznie niezawodną i prostą metodą pozyskiwania komórek skóry w ciągu 4-8 tygodni w celu zamrożenia około 15-20 milionów komórek o niskim numerze pasażu.

Kultura eksplantacyjna z biopsji wycinkowej skóry do izolacji pierwotnych ludzkich fibroblastów

Odkryj rolę izoenzymów lipooksygenazy w neurodegeneracji związanej z chorobą Parkinsona przy użyciu modelu neurotoksyny MPTP na myszach. Ta metoda pozwala zrozumieć mechanizmy neurozapalne.

Modele interakcji gen-środowisko w celu ujawnienia mechanizmów podatności w chorobie Parkinsona

Przeglądaj więcej filmów