Wysokoprzepustowy pomiar fluorometryczny potencjalnej aktywności enzymów zewnątrzkomórkowych w glebie

Ogólnym celem niniejszej procedury jest określenie maksymalnych potencjalnych szybkości, z jakimi enzymy zewnątrzkomórkowe w glebach degradują swoje substraty docelowe. Osiąga się to poprzez wstępne połączenie wilgotnej gleby polowej z buforem w blenderze, a następnie pipetowanie zmieszanych próbek do głębokich płytek próbek oraz głębokich płytek ze standardami. Płytki z głębokimi dołkami są inkubowane i wirowane, po czym 250 µL zostaje przeniesione z każdego dołka płytek z głębokimi dołkami do odpowiadających im dołków czarnych płytek z płaskim dnem.

Płytki 96-dołkowe. Następnie trzy płytki odczytuje się na fluorymetrze, a uzyskane dane poddaje się analizie. Ostatecznie potencjalne aktywności zewnątrzkomórkowych enzymów glebowych określa się na podstawie szybkości uwalniania barwnika fluorescencyjnego z substratu w reakcji katalizowanej enzymatycznie, gdzie wyższa fluorescencja wskazuje na większy stopień degradacji substratu.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami jest możliwość pomiaru aktywności enzymów w dużej liczbie próbek dzięki wykorzystaniu formatu głębokich mikropłytek 96-dołkowych. Pomysł na tę metodę pojawił się, gdy dostrzegliśmy możliwość zwiększenia objętości próbki w stosunku do standardowych mikropłytek poprzez adaptację innych protokołów do formatu płytek z głębokimi dołkami. Zastosowanie tej techniki pozwala nam lepiej powiązać fizjologię mikroorganizmów z procesami w skali ekosystemu.

Demonstracja wizualna jest kluczowa dla tej techniki, ponieważ istnieje wiele niuansów i aspektów obchodzenia się z próbkami, których niełatwo jest przestrzegać w formie pisanej procedury. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu ekologii mikrobowej i biogeochemii gleby, takie jak to, w jaki sposób mikroby glebowe reagują na zmiany w swoim środowisku oraz jak ich reakcje fizjologiczne wpływają na krytyczne procesy ekosystemowe, takie jak rozkład i obieg składników odżywczych. Chociaż metoda ta może dostarczyć wiedzy na temat rozkładu organicznej materii glebowej i obiegu składników odżywczych w ekosystemach lądowych, można ją również zastosować w systemach morskich i słodkowodnych.

Zazwyczaj osoby początkujące w tej metodzie mogą mieć trudności z techniką pipetowania oraz kwestiami dotyczącymi wrażliwości czasowej tego protokołu. Ponadto duża ilość danych generowanych podczas tej procedury jest czasem przytłaczająca dla nowych użytkowników. Aby rozpocząć przygotowanie analizy, należy opisać trzy płytki z głębokimi dołkami jako: standard MUB dla czterometylowokumaryny, beone oraz standard MUC dla siedmioaminowokości czterometylowokumaryny.

Wlej każdy standard i substrat do oddzielnych, czystych i wcześniej oznakowanych zbiorników ułożonych w rzędach. Następnie pipetuj odpowiedni standard MUB do odpowiadających im dołków na płytce ze standardami MUB, zgodnie z listą w protokole tekstowym. Powtórz tę procedurę dla standardów MUC w odpowiednich dołkach płytki ze standardami MUC, aby przygotować zawiesiny glebowe.

Dla każdej próbki gleby odważ 2,75 g gleby o wilgotności polowej, a następnie umieść ją w blenderze. Dodaj 91 ml buforu 50 mM i blenduj z wysoką prędkością przez jedną minutę. Przelej zawartość blendera do czystej szklanej misy o szerokości co najmniej odpowiadającej pipecie ośkianałowej, dodając mieszadło magnetyczne.

Zawiesinę glebową można przesiać przez sito o oczkach o rozmiarze około jednego milimetra przed przelaniem do miski. Umieść miskę na mieszalce magnetycznej i wymieszaj zawiesinę glebową. Następnie pipetą przenieś 800 µL zawiesiny glebowej do pierwszej kolumny płytki z próbkami.

Postąp analogicznie w przypadku pierwszej kolumny płytek standardowych MUB oraz MUC. Pomiędzy próbkami gleby płucz blender, mieszadło magnetyczne oraz mieszadełko w wodzie dejonizowanej lub buforze. Powtórz ten proces dla każdej próbki gleby.

Przechodzić do następnej kolumny z każdą kolejną próbką. Następnie pipetować odpowiedni substrat do odpowiadających im studzienek na płytce z próbkami. Zgodnie z opisem w protokole tekstowym, należy przygotować osobną płytkę z próbkami dla każdej testowanej temperatury inkubacji.

Uszczelnij płytki głębokich dołków za pomocą mat do płytek. Odwróć każdą uszczelnioną płytkę ręcznie, aż do całkowitego wymieszania roztworu. Umieść płytki w odpowiednim inkubatorze na wymagany czas inkubacji, zgodnie z protokołem tekstowym; zarejestruj czas początkowy jako czas zero, a także odpowiednie czasy inkubacji na koniec każdego okresu inkubacji.

Odwiruj szczelnie zamknięte płytki przez trzy minuty przy przyspieszeniu około 2 900 G. Po odwirowaniu przenieś 250 µL z każdej studni inkubowanych płytek głębokich do odpowiadających im studni czarnych płytek 96-dołkowych z płaskim dnem. Jedna czarna płytka zostanie wykorzystana dla każdej inkubowanej płytki głębokiej.

Należy przenieść próbki z inkubowanych płytek głębokich do odpowiednich studzienek w czarnych płaskich płytkach 96-dołkowych, zgodnie z instrukcjami producenta używanego fluorometrycznego czytnika płytek. Ustaw długość fali wzbudzenia na 365 nanometrów oraz długość fali emisji na 450 nanometrów.

Wprowadź jedną z płytek standardowych, ustaw fluorymetr na automatyczny dobór wzmocnienia (automatic gain) i odczytaj płytkę. Następnie ustaw wzmocnienie na tryb ręczny i zmniejsz jego wartość z optymalnej do kolejnej niższej liczby zaokrąglonej do najbliższej piątki. Dla każdej płytki standardowej powtórz pomiar dwukrotnie.

Następnie należy załadować płytkę z próbkami. Ustawić wzmocnienie na automatyczne i uruchomić pomiar płytki z próbkami. Ponowić pomiar płytki z próbkami w trybie ręcznym, aby dopasować najwyższe wzmocnienie dla każdej z płytek ze standardami.

Analizę danych należy rozpocząć od wprowadzenia danych fluorescencji krzywej wzorcowej dla standardów MUB i MUC do arkusza kalkulacyjnego. Przelicz stężenia mikromolarne na mikromole dla każdej próbki. Na podstawie danych fluorescencji krzywej wzorcowej oblicz nachylenie, punkt przecięcia z osią y oraz wartości R kwadrat dla stężeń standardów MUB i MUC.

Akceptowalne wartości R² powinny przekraczać 0,98 dla każdej próbki. Krzywe wzorcowe można przedstawić na wykresie punktowym, gdzie odczyty fluorescencji stanowią zmienną zależną, a stężenie standardu zmienną niezależną. Wprowadź surowe dane fluorescencji dla próbki z substratem do nowego arkusza kalkulacyjnego.

Należy również uwzględnić czas inkubacji oraz suchą masę gleby dla każdej próbki, odjąć wartości punktu przecięcia krzywej wzorcowej od odpowiadających im wartości fluorescencji próbek, a następnie podzielić wynik przez nachylenie odpowiedniej krzywej wzorcowej. Korzystając z równania linii wzorcowej, należy pomnożyć mikromole z próbki przez 91 mililitrów, co stanowi objętość buforu użytego w zawiesinie glebowej. Otrzymaną wartość należy podzielić przez czas inkubacji właściwy dla danej próbki oraz suchą masę gleby.

Na koniec pomnóż uzyskaną wartość przez 1000, aby otrzymać pożądane jednostki. Wyniki pochodzą z eksperymentalnego badania klimatycznego porównującego gleby poddane warunkom klimatycznym otoczenia z glebami poddanymi działaniu podwyższonego stężenia dwutlenku węgla oraz ogrzewania; przedstawione tutaj dane to potencjalne aktywności enzymów zewnątrzkomórkowych (EEA) w miejscu ogrzewania preri i wzbogacania w dwutlenek węgla, zarówno w działkach kontrolnych, jak i testowych. W tym przykładzie analizy potencjalnej aktywności enzymów pozyskiwania węgla, azotu i fosforu w głębokości gleby od 0 do 5 cm nie wykazały różnic w zależności od zastosowanej obróbki eksperymentalnej.

Jednakże na głębokości gleby od 5 do 15 cm poziom kilku potencjalnych EEAs różnił się znacząco. Na przykład aktywność enzymów degradujących węgiel, beta-1,4-glukozydazy i beta-D-celobiohydrolazy, była niższa na działkach poddanych działaniu podwyższonego stężenia dwutlenku węgla i ogrzewaniu w porównaniu z działkami w warunkach klimatu naturalnego. Aktywność enzymów mineralizujących azot i fosfor była również niższa na działkach badawczych w porównaniu z warunkami klimatu naturalnego na głębokości gleby od 5 do 15 cm.

Obliczanie i wykreślanie sumy wszystkich potencjalnych aktywności enzymatycznych zewnątrzkomórkowych (EEA) związanych z cyklami węgla, azotu lub fosforu może być użytecznym podejściem do obserwacji szerszych wzorców dotyczących potencjalnych cykli węgla, azotu i/lub fosforu w glebie. W tym przykładzie obliczono sumę potencjalnych aktywności EEA dla $\beta$-1,4-glukozydazy, $\beta$-D-celulobiohydrolazy, $\beta$-ksylozydazy oraz $\alpha$-1,4-glukozydazy, aby reprezentowała ona potencjalną aktywność cyklu węglowego. Sumę potencjalnych aktywności $\beta$-1,4-N-acetylglukozaminidazy i L-leucyloaminopeptydazy obliczono w celu reprezentowania potencjalnej aktywności cyklu azotowego.

Aktywność fosfatazy została wykorzystana do reprezentowania potencjalnych procesów cyklu fosforowego. Potencjalne EEAs dla cykli całkowitego węgla, azotu i fosforu wykazywały tendencję spadkową w działkach z podwyższoną koncentracją dwutlenku węgla i ogrzewaniem w porównaniu do działek w warunkach klimatu otoczenia na głębokościach glebowych od 5 do 15 cm. Tendencja ta była jednak istotna statystycznie jedynie w przypadku aktywności cykli całkowitego azotu i fosforu, a wartości EEAs w glebie nie różniły się znacząco między działkami badawczymi.

Na głębokości od 0 do 5 cm gleby. Wyniki wskazują na przeciwstawne trendy w aktywności enzymów i grup funkcjonalnych pomiędzy działkami doświadczalnymi w zależności od głębokości gleby; stosunek potencjalnych EEAs jest jednym ze sposobów oceny zapotrzebowania mikroorganizmów na składniki odżywcze. W tym przypadku aktywności enzymów glebowych, geometria torchów, stosunek węgla do azotu, węgla do fosforu lub azotu do fosforu różnią się znacząco pomiędzy działkami doświadczalnymi na głębokości od 0 do 5 cm gleby.

Jednakże potencjalne stosunki enzymatycznego węgla do fosforu oraz azotu do fosforu były wyższe na działkach poddanych działaniu podwyższonego poziomu dwutlenku węgla i ogrzewaniu. W porównaniu z warunkami klimatycznymi otoczenia na głębokościach od 5 do 15 cm temperatura może silnie wpływać na glebowe EEAs. Jednak w typowych testach laboratoryjnych enzymy glebowe mierzy się w jednej temperaturze, która może nie odpowiadać warunkom temperatury in C two.

Wykresy Arrheniusa służą do wizualizacji energii aktywacji i są kreślone z wykorzystaniem logarytmu aktywności enzymu jako funkcji odwrotności temperatury przeliczonej na kelwiny na osi x. Energię aktywacji powszechnie definiuje się jako minimalną energię wymaganą do katalizy reakcji chemicznej; w niniejszym przypadku służy ona jako wskaźnik wrażliwości reakcji katalizowanych enzymatycznie na temperaturę. Wyższa energia aktywacji wskazuje na większą wrażliwość enzymu na temperaturę.

Podobnie, energie aktywacji bezpośrednio odpowiadają współczynnikowi Q10. Oceńiono wartości współczynnika temperatury dla potencjalnej kinetyki enzymatycznej aktywności enzymów zewnątrzkomórkowych (EEA) dla węgla, azotu i fosforu w obu działkach doświadczalnych na dwóch głębokościach gleby, a wyniki wykazały, że wrażliwość temperatury EEA nie różniła się znacząco między działkami doświadczalnymi na żadnej z głębokości gleby. Po opanowaniu techniki można zaszczepić 12 próbek w 96-dołkowych płytkach mikrotitracyjnych w ciągu 30 minut lub krócej.

Ponadto, po wyznaczonym czasie inkubacji, zazwyczaj można odwirować, przenieść i ponownie odczytać płytki w urometrze w ciągu pół godziny. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest zachowanie konsekwencji podczas pipetowania. Obecność pęcherzyków powietrza podczas pipetowania negatywnie wpłynie na wyniki uzyskane po przeprowadzeniu tej procedury.

W celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania dotyczące roli składu społeczności mikroorganizmów glebowych w funkcjonowaniu gleby po jej ukształtowaniu można zastosować inne metody, takie jak ekstrakcja i sekwencjonowanie DNA. Technika ta utorowała drogę badaczom z zakresu ekologii mikroorganizmów do zgłębiania obiegów składników odżywczych oraz procesów biogeochemicznych w ekosystemach lądowych. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać pełną wiedzę na temat tego, jak ilościowo określać potencjalną aktywność enzymatyczną.

Ponadto powinni Państwo być w stanie zinterpretować dane tak, aby odzwierciedlały one potencjalne reakcje drobnoustrojów na czynniki takie jak klimat i różne rodzaje gleby w obrębie różnych ekosystemów. Należy pamiętać, że podczas pracy z materiałami fluorescencyjnymi zawsze należy przestrzegać środków ostrożności w celu zminimalizowania ekspozycji na światło ze względu na światłoczułość grupy fluoroforowej.