Name: Wysokoprzepustowy pomiar fluorometryczny potencjalnej aktywności enzymów zewnątrzkomórkowych w glebie (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-15T18:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 33 s
Description: Poznaj wysokoprzepustową metodę fluorometryczną do pomiaru aktywności enzymów zewnątrzkomórkowych w glebie. Technika ta umożliwia efektywną analizę wielu próbek jednocześnie, wspierając badania z zakresu ekologii mikroorganizmów i biogeochemii gleby.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta publikacja została sfinansowana przez Enzymes in the Environment Research Coordination Network Research Research wspierane przez amerykańską Narodową Fundację Nauki (DEB# 1021559). Badania te były wspierane przez amerykańską Narodową Fundację Nauki (DEB# 1021559) oraz Biuro Nauki (Badania Biologiczne i Środowiskowe) Departamentu Energii USA. Wszelkie opinie, ustalenia, wnioski lub zalecenia wyrażone w tym materiale są opiniami autorów i niekoniecznie odzwierciedlają poglądy amerykańskiej NSF.

1. Konfiguracja testu
<ol>
	<li>Oznaczyć 3 płytki z głębokimi studzienkami: "Próbka", "wzorzec MUB" i "wzorzec MUC".</li>
	<li>Wlej każdy wzorzec (MUB 0, 2,5, 5, 10, 25, 50 i 100 μM) i substrat (BG, CB, NAG, PHOS, XYL, AG, LAP) do oddzielnych czystych, wstępnie oznakowanych zbiorników (zorientowanych w rzędach).</li>
	<li>Odpipetować odpowiedni wzorzec MUB do odpowiednich dołków na płytce wzorcowej MUB (Tabela 1).
	<ol>
		<li>Odpipetować 200 μl 0 μM MUB do rzędu A płytki wzorcowej MUB.</li>
		<li>Odpipetować 200 μl 2,5 μM MUB do rzędu B płytki wzorcowej MUB.</li>
		<li>Odpipetować 200 μl 5 μM MUB do rzędu C standardowej płytki MUB.</li>
		<li>Odpipetować 200 μl 10 μM MUB do rzędu D płytki wzorcowej MUB.</li>
		<li>Odpipetować 200 μl 25 μM MUB do rzędu E standardowej płytki MUB.</li>
		<li>Odpipetować 200 μl z 50 μM MUB do rzędu F płytki wzorcowej MUB.</li>
		<li>Odpipetować 200 μl 100 μM MUB do rzędu G płytki wzorcowej MUB.</li>
		<li>Powtórzyć kroki 1.3.1 - 1.3.8 dla wzorców MUC w odpowiednich studzienkach płytki wzorcowej MUC.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj zawiesiny glebowe dla każdej próbki gleby.
	<ol>
		<li>Zważ 2,75 g wilgotnej gleby do blendera.</li>
		<li>Dodać 91 ml buforu o pojemności 50 mM. Miksuj na wysokich obrotach przez 1 min.</li>
		<li>Wlej zawartość blendera do czystej szklanej miski co najmniej tak szerokiej jak pipeta 8-kanałowa z mieszadłem.</li>
		<li>Umieść na talerzu mieszającym, wymieszaj gnojowicę glebową na niskim poziomie.</li>
		<li>Odpipetować 800 μl gnojowicy glebowej do pierwszej kolumny płytki z próbką (tabela 2).</li>
		<li>Powtórzyć te czynności w 1kolumnie płytek wzorcowych MUB i MUC (tabela 1).</li>
		<li>Opłucz blender, płytkę mieszającą i mieszadło za pomocą DIH2O lub buforu między próbkami gleby.</li>
		<li>Powtórzyć kroki 1.4.1 - 1.4.7) dla każdej próbki, przechodząc do następnej kolumny z każdą kolejną próbką gleby (tabele 1 i 2).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odpipetować odpowiedni substrat (w tym przykładzie stężenie 200 μM) do odpowiednich dołków płytki z próbką (tabela 2).
	<ol>
		<li>Odpipetować 200 μl substratu BG do rzędu A płytki z próbką.</li>
		<li>Odpipetować 200 μl substratu CB do rzędu B płytki z próbką.</li>
		<li>Odpipetować 200 μl substratu NAG do rzędu C płytki z próbką.</li>
		<li>Odpipetować 200 μl substratu PHOS do rzędu D płytki z próbką.</li>
		<li>Pobrać pipetą 200 μl substratu XYL do rzędu E płytki z próbką.</li>
		<li>Odpipetować 200 μl substratu AG do rzędu F płytki z próbką.</li>
		<li>Odpipetować 200 μl substratu LAP do rzędu G płytki z próbką.</li>
		<li>Powtórzyć kroki 1.5.1-1.5.7 dla każdej płytki do pobierania próbek o temperaturze inkubacji.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Inkubacja płytek testowych
<ol>
	<li>Uszczelnij płytki głębinowe ("Próbka", "wzorzec MUB" i "wzorzec MUC") matami płytkowymi.</li>
	<li>Odwróć każdą (zapieczętowaną) płytkę ręcznie, aż roztwór dokładnie się wymiesza (~10x).</li>
	<li>Umieścić płytki w odpowiednim inkubatorze na wymagany okres inkubacji (Tabela 3).</li>
	<li>Zapisz czas początkowy jako czas 0. Należy również zanotować odpowiednie czasy inkubacji, aby wiedzieć, kiedy należy wyjąć płytkę z inkubatora (Tabela 3).</li>
	<li>Pod koniec każdego okresu inkubacji odwirować szczelnie zamknięte płytki przez 3 minuty przy ~2,900 x g.</li>
	<li>Po certyfikacji przenieść 250 μl z każdej studzienki inkubowanych płytek głębinowych do odpowiednich studzienek w czarnych płaskodennych 96-dołkowych płytkach (jedna płytka zostanie użyta na każdą inkubowaną płytkę głębinową). Ważne jest, aby przenieść próbki z inkubowanych płytek głębinowych do tych samych studzienek (tj. A1...A12 itd.) w czarnych płaskodennych 96-dołkowych płytkach (tabela 1, 2).</li>
</ol>
3. Pomiary fluorescencyjne na fluorometrze mikropłytkowym
<ol>
	<li>Postępując zgodnie z instrukcją producenta zastosowanego czytnika płytek fluorometrycznych, należy ustawić długość fali wzbudzenia na 365 nm, a długość fali emisji na 450 nm (lub zastosować odpowiednie filtry).</li>
	<li>Odczytaj trzy płytki na fluorometrze. Ważne: próbki i płytki wzorcowe (np. MUB lub MUC) muszą być odczytywane przy użyciu tego samego wzmocnienia.
	<ol>
		<li>Ustaw spektrofotometr na automatyczne wzmocnienie i odczytaj standardowe płytki MUC i MUB.</li>
		<li>Ustaw wzmocnienie na ręczne i zmniejsz wartość od optymalnej do następnej najniższej liczby, zaokrąglonej do najbliższej piątki, dla każdej płyty standardowej. Powtórz 2x dla każdej płytki.</li>
		<li>Ustaw wzmocnienie na automatyczne i uruchom płytkę próbki. Uruchom ponownie płytkę Sample ręcznie, aby dopasować najwyższe wzmocnienie dla każdej z płyt standardowych (tj. MUB i MUC).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Analiza danych
<ol>
	<li>Wprowadź dane fluorescencji krzywej wzorcowej do arkusza kalkulacyjnego dla wzorca MUB (tabela 4a) i wzorca MUC (tabela 4b)
	<ol>
		<li>Przelicz stężenia (μM) na (μmol) (tabele 4a i 4b).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dla danych fluorescencji krzywej standardowej każdej próbki należy obliczyć nachylenie, punkt przecięcia z osią y i wartości R2 dla standardowych stężeń MUB i MUC (μmol). Dopuszczalne wartości R2 powinny przekraczać 0,98 dla każdej próbki (tabele 4a i 4b). Przydatne może być wizualizacja krzywych standardowych na wykresie punktowym; z odczytami fluorescencji wykreślonymi jako zmienna zależna (oś y) i stężeniem wzorca (μmol) wykreślonym jako zmienna niezależna (oś x) (rysunek 1).</li>
	<li>Użyjesz standardowych wartości nachylenia krzywej MUB i MUC oraz wartości przecięcia z osią y, aby obliczyć surowe dane fluorescencji próbki + substratu w potencjalnych EEA. Najpierw należy wprowadzić surowe dane fluorescencyjne próbka + substrat do nowego arkusza kalkulacyjnego (Tabela 5a). Dla każdej próbki należy również wprowadzić czas inkubacji (hr) i suchą masę gleby (tabela 5b). Należy zauważyć, że wartości czasu wprowadzone w tym przykładzie to 3 godziny, ponieważ próbki inkubowano w temperaturze 25 °C (tabela 3).
	<ol>
		<li>Odejmij wartości przecięcia krzywej standardowej od odpowiednich wartości fluorescencji próbki, a następnie podziel przez nachylenie odpowiedniej krzywej wzorcowej (tabela 5c). Aby to osiągnąć, przestaw standardowe równanie liniowe, aby rozwiązać stężenie enzymu w próbce (x); x=(y-b)/m gdzie: [y = odczyt surowej fluorescencji próbki; b = punkt przecięcia z krzywej wzorcowej MUB lub MUC; m = nachylenie z krzywej wzorcowej MUB lub MUC].</li>
		<li>Pomnożyć próbkę μmol z kroku 4.3.1 powyżej przez 91 ml (objętość buforowa stosowana w gnojowicy glebowej) (tabela 5d).</li>
		<li>Podzielić wartość otrzymaną w kroku 4.3.2 przez czas inkubacji właściwy dla próbki i suchą masę gleby (tabela 5e): [ilość enzymu (μmol) x 91 ml x inkubacja (hr) x sucha gleba (g) x 0,8 ml x 1 000] 
		Uwaga: 0,8 ml to objętość gnojowicy użytej w każdej studzience, a 1,000 koryguje rzeczywistą ilość gleby w każdej studzience.</li>
		<li>Pomnóż wartość uzyskaną w kroku 4.3.3 przez 1 000, aby uzyskać żądane jednostki (aktywność nmol/g suchej gleby/godz.) (tabela 5f).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Laboratoryjne pomiary potencjalnych glebowych EEA mogą dostarczyć ważnych informacji na temat reakcji mikroorganizmów na ich środowisko abiotyczne i ich konsekwencji dla funkcjonowania ekosystemów. Wyniki tego przykładowego zestawu danych sugerują, że istnieją minimalne różnice w aktywności enzymów glebowych lub kinetyce między powierzchniami do obróbki klimatu. Jednak odwrotne trendy na wykresach zachęcają do dalszych badań nad zmiennymi towarzyszącymi, które mogą wpływać na produkcję mikrobiologicznych EEA, takimi jak wilgotność gleby, pH gleby lub wzrost roślin. Ogólnie rzecz biorąc, ocena EEA pod względem (1) ogólnej EEA w glebach, (2) stechiometrii EEA, (3) wykresów Arrheniusa/energii aktywacji oraz (4) Q10 zapewnia szerokie spektrum podejść, które mogą wskazywać na procesy na poziomie ekosystemu, na podstawie których można solidnie scharakteryzować dynamikę funkcjonalną ekosystemu glebowego.
Wysokoprzepustowe testy EEA oparte na fluorescencji są użytecznym narzędziem, które jest szeroko stosowane do badania potencjalnych EEA w glebach i innych środowiskach. Co ważne, potencjalne działania odzwierciedlają wielkość puli enzymów, ale same w sobie nie określają ilościowo produkcji enzymów ani wskaźników obrotu46. Chociaż technika ta jest stosunkowo prosta, pozornie niewielkie różnice między protokołami laboratoryjnymi mogą utrudniać porównywalność wyników 13. Niestety, obecnie nie dysponujemy odpowiednimi znormalizowanymi kontrolami pozytywnymi dla EOG. Zastosowanie współczynników stechiometrycznych jest jednym ze sposobów przezwyciężenia tych wyzwań. Poza tym pojawienie się technik wysokoprzepustowych posunęło naprzód badania enzymów w środowisku4. Staranna interpretacja danych wygenerowanych przez te testy może wyjaśnić ważne trendy w aktywności mikrobiologicznej.
Solidność protokołu wynika z możliwości wyboru warunków specyficznych dla poszczególnych próbek, ale może to również skutkować ograniczeniami. Konieczne będzie wprowadzenie szeregu modyfikacji, aby zapewnić dokładny pomiar próbek dla poszczególnych lokalizacji terenowych:
Bufor
Wybrany bufor będzie zależał od pH gleby. Buforowanie stabilizuje również intensywność fluorescencji wzorców fluorescencyjnych, która jest w dużym stopniu zależna od pH27,47. Bufor pH, którego zwykle używamy do wytwarzania gnojowicy glebowej, to octan sodu o stężeniu 50 mM lub bufor Tris, który jest wybierany ze względu na określoną stałą dysocjacji kwasów buforu (pKa), aby jak najlepiej dopasować się do poziomu pH gleby - próbki. Octan sodu ma pKa 4,76, a Tris ma pKa 8,06, więc ilości tych dwóch będą się różnić, aby osiągnąć pożądane pKa dla pojedynczej próbki. Bufor fosforanowy (pKa = 7,2) zaproponowano dla gleb obojętnych/lekko zasadowych. Zalecamy jednak, aby przed użyciem tego buforu przetestować zmienność analityczną we wstępnych badaniach, ponieważ wysokie stężenia fosforanów mogą zakłócać aktywność enzymów.
Obchodzenie się z podłożami fluorescencyjnymi i ich przechowywanie
Testy fluorescencyjne mogą ulegać zakłóceniom spowodowanym zanieczyszczeniami i/lub niestabilnością wielu związków fluorescencyjnych pod wpływem światła, dlatego należy zachować ostrożność podczas obchodzenia się z podłożami fluorescencyjnymi. Zdecydowanie zalecamy zminimalizowanie ekspozycji na światło na podłoża znakowane fluorescencyjnie oraz wzorce MUB i MUC. Zdecydowanie zaleca się używanie butelek ze szkła oranżowego lub przykrywanie szklanych naczyń i pojemników używanych do wytwarzania i przechowywania podłoży fluorescencyjnych i wzorców; Dobrze sprawdza się folia aluminiowa do owijania szkła i pojemników. Podobnie, najlepszą praktyką jest skuteczne inokulowanie płytek i przenoszenie do ciemnych inkubatorów. Zalecamy przechowywanie podłoży i wzorców (-20 °C) nie dłużej niż dwa miesiące (przy jednoczesnej ochronie przed światłem); i substraty do rozmrażania (5 °C) ~ 24-48 godzin przed rozpoczęciem testu (testów) enzymu.
Projektowanie i replikacja
Aby jak najlepiej uwzględnić różnice między próbkami od początku do odwiertu, zaleca się stosowanie kontroli w testach ujemnych i (jeśli to możliwe) powtórzeń testów. Różnice zwykle występują z powodu różnic w ilości cząstek gleby w każdej studzience i błędów pipetowania. W związku z tym mocne mieszanie i dobra technika pipetowania znacznie zminimalizują różnice między nimi. Ponadto zdecydowanie zalecamy wdrożenie kontroli testu ujemnego (bufor + roztwór substratu) w celu monitorowania niespójności substratów w czasie. Można to łatwo monitorować podczas odczytu płytek enzymatycznych, porównując studzienki kontroli ujemnej (zwykle używamy ostatniej kolumny na płytkach 96-dołkowych). Ujemne kontrole podłoża są zazwyczaj stabilne, dlatego sygnał wzrasta znacznie powyżej granicy wykrywalności, co wskazuje na zanieczyszczenie lub niestabilność podłoża, wymagającą wymiany podłoża i/lub roztworów wzorcowych.
Aby zmaksymalizować przepustowość, nasz protokół obejmuje kilka potencjalnych EEA w jednej mikropłytce z głębokiej studni, chociaż inne protokoły wykonują jeden rodzaj testu na płytkę (tj. jeden substrat na płytkę), ponieważ różne EEA występują z różną szybkością. Niezależnie od tego, optymalizacja enzymów musi być przeprowadzona na glebie przed wykonaniem tego wysokiego podejścia przez cały czas lub podejścia jednopłytkowego. Na jednej płytce można zastosować wiele substratów, jeśli szybkość reakcji jest względnie stała dla każdego enzymu w okresie inkubacji.
Nasz protokół zaleca ~2,75 g gleby do przygotowania roztworu gnojowicy, podczas gdy ~1 gram jest zalecany w innych protokołach 24. Sugerujemy, że użycie większej ilości gleby (jeśli to możliwe) jest skutecznym podejściem do lepszego uchwycenia zmienności poziomów aktywności enzymów w glebie w próbce. W tym protokole inkubujemy 800 μl gnojowicy glebowej z 200 μl substratu, podczas gdy inni inkubują tylko 200 μl gnojowicy glebowej z 50 μl substratów. Jest to po prostu funkcja skalowania w górę, która ostatecznie nie zmienia mierzonej aktywności. Istnieją również praktyczne zalety korzystania z większych objętości. Po pierwsze, łatwiej jest uniknąć cząstek stałych w glebie podczas pipetowania do odpowiednich czarnych, płaskodennych 96-dołkowych płytek przed zarejestrowaniem intensywności na fluorometrze. Po drugie, dodatkowa objętość jest przydatna w przypadku przypadkowych rozlań podczas przenoszenia czarnych, płaskodennych 96-dołkowych płytek do fluorometru przed zarejestrowaniem intensywności fluorescencji związanej z enzymami. Nawet niewielkie odchylenia objętości znacznie zmniejszą fluorescencję między studzienkami. Wreszcie, ze względu na wysoką przepustowość tego protokołu, zwykle decydujemy się polegać na replikacji eksperymentalnej w celu przedstawienia zmienności poziomów aktywności enzymów, a nie na wykonywaniu powtórzeń testów. Dołączanie kontrprób analitycznych jest zawsze najlepszą praktyką, ale w praktyce uważamy, że nasz protokół zapewnia zrównoważony kompromis między kontrpróbami analitycznymi i eksperymentalnymi przy ograniczonych zasobach. Podobnie, nasze podejście wykorzystuje stosunkowo lepiej zhomogenizowaną glebę (2,75 g) na test25, co z natury zmniejsza różnice w glebie. Decyzja o zastosowaniu kontrprób analitycznych powinna być starannie przemyślana poprzez przeprowadzenie badań pod kątem błędu analitycznego w badaniach wstępnych48. Zalecamy jednak, aby projekty eksperymentalne z mniej niż 4 kontrpróbami w grupie poddanej działaniu substancji zdecydowanie rozważyły użycie powtórzeń testowych.
Optymalizacja gleby, objętości i stężenia substratu
Stosunek stężenia bufora glebowego do stężenia substratu jest ważną zmienną, która silnie wpływa na mierzoną fluorescencję podczas wykonywania testów enzymatycznych. Ilość gleby w gnojowicy dodanej do oznaczenia lub stężenie substratu może wymagać dostosowania w zależności od aktywności enzymów w próbce gleby. Ilości wybrane do tego przykładu zostały oparte na wcześniejszych testach tych gleb, aby upewnić się, że dostępność substratu jest nieograniczona i że mierzymy maksymalne wskaźniki potencjału w warunkach testu (Vmax) 44,45. Jednak w przypadku próbek gleby, które mają wysokie stężenie enzymów, należy zwiększyć stężenie gleby lub substratu. Odkryliśmy, że zwiększanie stężeń substratów (i odpowiednie dostosowanie krzywej standardowej) może wpływać na liniowość krzywej. Dlatego zalecamy zmniejszenie ilości gleby i/lub proporcjonalne dostosowanie objętości bufora, jeśli to konieczne. Niezależnie od tego ważne jest, aby zoptymalizować stężenie substratu dla każdego badanego rodzaju gleby, ponieważ zmierzone EEA mogą różnić się o rząd wielkości między stężeniami substratów nasyconych i podnasyconych 26. W związku z tym różnice między eksperymentalnymi terapiami (itp.) są podatne na błąd statystyczny typu II i mniejsze prawdopodobieństwo wykrycia w warunkach niedostatecznego nasycenia oraz błąd statystyczny27,35. Aby zoptymalizować stężenia substratów, należy przeprowadzić wstępne testy enzymatyczne na reprezentatywnych próbkach gleby przy użyciu szerokiego zakresu stężeń substratów. Po zarejestrowaniu fluorescencji wystarczy wykreślić dane (podobnie jak w przykładzie z krzywą standardową; Rysunek 1) Identyfikacja stężenia substratu (oś x) odpowiadającego aktywności enzymu (oś y), w którym nachylenie się wyrównuje (~0). Podobnie, stężenie substratu odpowiadające punktowi, w którym nachylenie się wyrównuje (~0), jest dobrym wskaźnikiem optymalnego stężenia substratu dla tej konkretnej gleby.
Test ten ostatecznie mierzy fluorescencję w określonym czasie wytwarzaną przez ugrupowanie fluorogenne, które jest odcinane od substratu w wyniku depolimeryzacji substratu za pośrednictwem enzymów. Dlatego etap 5 (dodawanie substratu) ma kluczowe znaczenie i musi być wykonany tak efektywnie, jak to możliwe, aby zminimalizować czas między dodaniem substratu do gleby a inkubacją testów. Podobnie, gdy substrat wejdzie w kontakt z próbką, zaczną zachodzić reakcje enzymatyczne. Z tego powodu zalecamy korzystanie z pipety wielokanałowej. Zdecydowanie zaleca się, aby zwiększyć wydajność przy użyciu pipety wielokanałowej przed dniem, w którym wykonujesz testy enzymatyczne. Aby to osiągnąć, możesz ćwiczyć pipetowanie wodą, aż będziesz w stanie łatwo przenieść objętość do 96-dołkowych płytek za pomocą pipetatora.
Hartowanie gleby
Hartowanie odnosi się do zmniejszenia intensywności fluorescencji spowodowanego przez cząstki stałe i/lub materiał organiczny w gnojowicach glebowych-inkubacjach26. Na hartowanie można wpłynąć, dostosowując stosunek gleby do bufora25. Ze względu na fluorescencję tła z poszczególnych próbek, bardzo ważne jest przeprowadzenie wzorców z próbkami, aby uwzględnić fluorescencję tła (wygaszanie). Chociaż niektóre protokoły wykorzystują pojedyncze stężenie po przetestowaniu, że sygnał jest liniowy, zdecydowanie zalecamy wdrożenie standardowej kontroli hartowania dla każdej próbki, aby jak najlepiej kontrolować efekty hartowania. Niezastosowanie się do tego spowoduje, że krzywa wzorcowa nie będzie miała zastosowania do próbki i zostanie nieprawidłowo oszacowana aktywność enzymatyczna. Dodawanie wzorców do zawiesin glebowych nie jest zależne od czasu, ponieważ dodawanie wzorca nie wpływa na fluorescencję tła próbki.
Dodawanie NaOH
Dodatek NaOH jest stosowany w niektórych protokołach w celu optymalizacji pomiarów aktywności enzymów fluorometrycznych, ponieważ barwnik fluorescencyjny uwolniony z substratów syntetycznych wykazuje szczytową fluorescencję przy pH>9,026,49. Biorąc pod uwagę tę sugestię, stężenie NaOH niezbędne do pH gnojowicy glebowej (tj. do pH>9) będzie się różnić w zależności od konkretnej gleby i zastosowanego buforu pH26. Inni twierdzą jednak, że NaOH może nie być konieczne, ponieważ intensywność sygnału jest na ogół bardzo wysoka nawet przy niższym pH, a także dlatego, że wprowadza dodatkowe źródło błędu pomiaru. Na przykład wpływ dodatków NaOH na pH gnojowicy, a tym samym fluorescencję MUB lub MUC, zmienia się w czasie25. Wykazano, że substraty połączone z MUB wykazują stałą zwiększoną fluorescencję przez 20 minut po dodatkach NaOH, zanim poziomy się zwężą; podczas gdy MUC wykazywał stałą zmniejszoną fluorescencję przez okres do 60 minut26. Dlatego ważne jest, aby ustandaryzować czas między dodaniem NaOH a pomiarem fluorescencji. Alternatywnie, jeśli poziomy fluorescencji są wystarczająco wykrywalne bez dodawania, przeprowadzenie testów bez dodatku NaOH zostało zasugerowane jako równie akceptowalna alternatywa26.
Temperatura
Przy podejmowaniu decyzji o temperaturze inkubacji należy wziąć pod uwagę wrażliwość na temperaturę. Jeśli głównym celem jest zrozumienie kinetyki enzymów, użycie trzech lub więcej temperatur, jak pokazano za pomocą wykresów Arrheniusa (w sekcji wyników) jest solidnym podejściem. Jeśli miejsce próbki ma charakterystycznie niską temperaturę, taką jak gleba wiecznej zmarzliny, może być konieczne wydłużenie czasu inkubacji, aby umożliwić enzymom reakcję w niższych temperaturach inkubacji. Podczas gdy tradycyjna kinetyka enzymów sugeruje, że wzrost temperatury powinien skutkować zwiększoną aktywnością enzymów, odkryliśmy, że enzymy mogą być specyficzne dla miejsca pod względem wrażliwości na temperaturę50. Dlatego, aby zrozumieć potencjał aktywności enzymów specyficznych dla danego miejsca, bardzo ważne jest, aby temperatura i czas trwania inkubacji były dostosowane tak, aby odzwierciedlały wartości terenowe.
Konkluzja
EE są kluczowymi czynnikami napędzającymi procesy biogeochemiczne w glebie, dlatego musimy być w stanie mierzyć ich aktywność. Pomiar EEA w glebie wiąże się z wieloma wyzwaniami, w tym z interferencją i hamowaniem. Pomimo tych wyzwań, ustandaryzowane protokoły (takie jak ten opisany tutaj) mogą być powszechnie stosowane do pomiaru EEA dla szerokiej gamy enzymów. Chociaż dość łatwo jest wygenerować dane wysokiej jakości zgodnie z tymi protokołami, interpretacja tych danych w kontekście ekologicznym wymaga starannego rozważenia, co te testy naprawdę mierzą i w jaki sposób EEA w warunkach testowych mogą różnić się od tych w warunkach in situ .

Enzymy zewnątrzkomórkowe (EE) wytwarzane przez bakterie glebowe, grzyby i archeony biorą udział w niezliczonych procesach biogeochemicznych i są kluczowe dla przetwarzania, stabilizacji i destabilizacji materii organicznej gleby oraz obiegu składników odżywczych w ekosystemach lądowych 1. Wytwarzając EE, mikroorganizmy glebowe rozkładają i przekształcają polimeryczną materię organiczną w mniejsze rozpuszczalne cząsteczki, uwalniając w ten sposób wcześniej związane mikro- i makroelementy, co umożliwia roślinom i mikroorganizmom asymilację dostępnych składników odżywczych z gleby. EE są badane od dziesięcioleci, głównie poprzez pomiar ich aktywności w testach laboratoryjnych2-4, ponieważ bardzo trudno jest bezpośrednio wykryć i określić ilościowo enzymy.
Aktywność enzymów zewnątrzkomórkowych (EEA) jest najsilniej kontrolowana przez stężenie enzymów i odpowiadających im substratów. Obfitość różnych enzymów rozkładających C, N i P w glebie jest kontrolowana przez wiele czynników, w tym biomasę mikrobiologiczną, skład zbiorowisk, dostępność substratu, mikroklimat i wymagania stechiometryczne5,6. Jednak na EEA in situ w środowisku glebowym wpływa również temperatura7,8 , wiązanie enzymów z glinami glebowymi i właściwości humusowe2 oraz ograniczenia dyfuzji 9 , które ostatecznie regulują aktywną pulę enzymów pod względem wielkości, dostępności substratu i szybkości obrotu10–12. W związku z tym rozpoznanie warunków glebowych in situ ma kluczowe znaczenie w przypadku stosowania laboratoryjnych testów enzymatycznych do interpretacji funkcji mikrobiologicznych gleby w różnych miejscach środowiska.
Wiele różnych klas EEA można określić ilościowo w testach laboratoryjnych przy użyciu różnych syntetycznych substratów (proszę zapoznać się z "Tabelą odczynników", aby uzyskać więcej szczegółów). Niektóre protokoły wykorzystują substraty w testach, które są sprzężone z reakcją kolorymetryczną, którą można wykryć za pomocą spektrofotometru, podczas gdy inne, w tym protokół, który tutaj opisujemy, wykorzystują substraty, które są związane z ugrupowaniem fluorescencyjnym. Testy fluorescencji EE są zazwyczaj bardziej czułe (o rząd wielkości) niż testy kolorymetryczne (które wykorzystują ugrupowanie chromogenne połączone z syntetycznym substratem)12-14. Czułość w wykrywaniu EEA obejmuje dwa aspekty: jeden jest związany z ilością wykrytego związku będącego przedmiotem zainteresowania, a drugi związany jest z najniższą wykrywalną potencjalną aktywnością enzymu. Metody barwienia na bazie P-nitrofenolu (pNP) można znaleźć we wcześniejszych pracach15,16. Krótko mówiąc, gleba (zwykle przesiewana do <2 mm i suszona na powietrzu) jest inkubowana w optymalnej lub odpowiedniej dla pola temperaturze i pH. Szybkość, z jaką uwalniany jest produkt reakcji, określa się kolorymetrycznie za pomocą spektrofotometru14. Wyższa czułość testów enzymów fluorescencyjnych wynika częściowo z bardziej czułego wykrywania oddzielania ugrupowań fluorogenicznych związanych z degradacją substratu, a nie rejestrowania absorbancji po oddzieleniu określonej grupy chromogennej na określonej długości fali. Dwa najczęściej stosowane syntetyczne wskaźniki fluorescencyjne to 4-metylumbiliron (MUB)17 i 7-amino-4-metylokoumaryna (MUC)18,19. Substraty połączone z MUC są powszechnie związane z syntetycznymi substratami bogatymi w N, takimi jak białka i/lub aminokwasy. Techniki fluorescencyjne zostały po raz pierwszy opracowane dla próbek wodnych20,21, a ich zastosowanie w glebie wymaga kontroli tłumienia sygnału i zakłóceń22,23. Testy mogą być przeprowadzane przy użyciu tradycyjnej chemii "laboratoryjnej" z dużymi objętościami lub mogą być stosowane w protokołach opartych na mikropłytkach, ze zwiększoną przepustowością, ale prawdopodobnie wyższym błędem pomiaru. Chociaż istnieje kilka szeroko cytowanych protokołów fluorescencyjnego wykrywania EEA w glebie24, wiele laboratoriów stosuje subtelne wariacje tych protokołów, często nieumyślnie lub z powodu różnic w sprzęcie laboratoryjnym lub odczynnikach. Pozornie niewielkie różnice w szczegółach protokołów mogą mieć duży wpływ na mierzone EEA25,26, a brak standaryzowanych enzymów utrudnia kalibrację testów między różnymi laboratoriami. W związku z tym istnieje istotna potrzeba rozpowszechniania szczegółowych protokołów w celu zachęcenia do standaryzacji testów EEA.
W naszym protokole, próbki gleby są przygotowywane poprzez połączenie próbek gleby z buforem pH i homogenizację za pomocą blendera. Zawiesiny są następnie zaszczepiane nieograniczoną ilością znakowanego fluorescencyjnie substratu bogatego w C, N lub P, wybranego w zależności od konkretnego pytania badawczego. Wykorzystanie zawiesin glebowych w testach enzymatycznych służy jako kontrola w celu zminimalizowania ograniczeń dyfuzji substratu. Ugrupowania fluorescencyjne są hartowane do momentu odcięcia ich od odpowiednich substratów, a zatem aktywność enzymu można wykryć, gdy barwnik fluorescencyjny jest uwalniany z podłoża w reakcji katalizowanej enzymatem. Rosnąca intensywność fluorescencji w czasie odzwierciedla szybkość reakcji katalizowanej enzymem.
Ogólna koncepcja testu enzymatycznego fluorescencji polega na tym, że syntetyczne substraty związane ugrupowaniem fluorogenicznym (barwnikiem fluorescencyjnym) są dodawane do próbek gleby 27. Podczas katalizowanej enzymatycznie degradacji substratu dochodzi do zerwania wiązania między barwnikiem fluorescencyjnym a substratem. Barwnik fluorescencyjny uwolniony z substratu jest następnie wykorzystywany jako pośrednia ocena aktywności enzymu i może być oznaczony ilościowo za pomocą czytnika mikropłytek w celu wykrycia intensywności fluorescencji barwnika. Krótko mówiąc, kwantyfikacja fluorescencji odbywa się, gdy uwolniony barwnik emituje światło o jednej długości fali po wchłonięciu światła o innej długości fali. Intensywność fluorescencji jest rejestrowana przez czytnik płytek, który może zarówno wzbudzić, jak i wykryć. Aktywność enzymu można następnie określić ilościowo na podstawie znanych stężeń barwnika fluorescencyjnego w substracie (tj. znanych ilościach substratu syntetycznego dodanego do próbek gleby) wraz z odniesieniem do standardowej krzywej rozcieńczania intensywności fluorescencji dla określonej części fluorogennej substratu użytego w teście (tj. 4-metylolumbelliferon (MUB) lub 7-amino-4-metylokoumaryna (MUC)). (Szczegółowe informacje na temat kwantyfikacji aktywności enzymów można znaleźć w sekcji dotyczącej protokołu).
Laboratoryjne testy enzymów glebowych są przydatne do oceny funkcji społeczności mikrobiologicznej, ale istnieje kilka ograniczeń technicznych, które użytkownicy powinni rozpoznać10. Testy fluorescencyjne mogą ulegać zakłóceniom spowodowanym zanieczyszczeniami i/lub niestabilnością wielu związków fluorescencyjnych pod wpływem światła, dlatego należy zachować ostrożność podczas obchodzenia się z podłożami fluorescencyjnymi25. Cząstki glebowe i/lub materiał organiczny w gnojowicy glebowej mogą również zakłócać intensywność fluorescencji, znaną jako efekt hartowania 26. Co więcej, laboratoryjne testy enzymatyczne oceniają potencjalne EEA tylko w warunkach laboratoryjnych. Testy in vitro mierzą EEA w warunkach, w których dyfuzja i obfitość substratu jest nieograniczona. W związku z tym dane dostarczone przez te testy mogą nie być dobrym wskaźnikiem zastępczym dla EEA w warunkach glebowych in situ 10. Ogólnie rzecz biorąc, aktywność enzymów jest bardzo przydatna do względnych porównań, w których typy gleb są podobne. Jednak przy stosowaniu tej metody do porównywania aktywności gleb różniących się właściwościami fizycznymi lub chemicznymi należy zachować ostrożność. Wynika to z faktu, że różnice w rodzaju gleby i temperaturze mogą drastycznie zmienić stan kinetyki enzymów in situ. Kolejnym ograniczeniem jest to, że stosunkowo niewiele substratów jest dostępnych na rynku (w porównaniu ze środowiskiem naturalnym). Ponadto substraty syntetyczne stosowane do testów enzymatycznych są stosunkowo proste (łatwo rozpuszczalne) i mogą nie odzwierciedlać dokładnie substratów glebowych obecnych lub dostępnych in situ. Innym czynnikiem, który należy wziąć pod uwagę, jest to, że stosowanie zawiesin glebowych będzie obejmowało aktywność niektórych stabilizowanych enzymów (tj. unieruchomionych przez materię organiczną lub gliny), które mogą nie być aktywne w warunkach in situ 2. Laboratoryjne testy enzymatyczne również nie dostarczają informacji na temat trwałości enzymów w glebie (tempo wymiany enzymów) ani informacji na temat konkretnych gatunków drobnoustrojów, które wytwarzają enzymy glebowe.

<table><tbody><tr><td>Odczynniki: </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4-Methylumbelliferyl &alpha;-D-glukopiranozyd (AG)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M9766</td><td>Degradacja cukru</td></tr><tr><td>4-Methylumbelliferyl &beta;-D-glukopiranozyd (BG)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M3633</td><td>Degradacja cukru</td></tr><tr><td>4-Methylumbelliferyl &beta;-D-cellobioside (CB)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M6018</td><td>Degradacja celulozy</td></tr><tr><td>Chlorowodorek L-leucyno-7-amido-4-metylokoumaryny (LAP)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L2145</td><td>Degradacja białek</td></tr><tr><td>4-metyloubelliferyl N-acetylo-&beta;-D-glukozaminid (NAG)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M2133</td><td>Degradacja chityny</td></tr><tr><td>Fosforan 4-metylobulliferylu (PHOS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8883</td><td>Mineralizacja</td></tr> <tr><td>fosforu4-metylolumbelliferyl-&beta;-D-ksylopiranozyd (XYL)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M7008</td><td>Degradacja hemicelulozy</td></tr><tr><td>4-metylolumbelliferon (MUB)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1381</td><td></td></tr><tr><td>7-amino-4-metylokumaryna (MUC)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9891</td><td></td></tr><tr><td>50 mM bezwodny bufor octanu sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>S210-500</td><td>gleby kwaśne i obojętne</td></tr><tr><td>50 mM Tris bufor bazowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP154-1</td><td>podstawowe gleby</td></tr><tr><td><mocny>Sprzęt</mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bel-Art Scienceware jednorazowe zbiorniki pipetujące</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-512-65</td><td>zbiornik do pipetowania</td></tr><tr><td>Elektroniczny; Eppendorf Xplorer; Pipeta 8-kanałowa</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-684-265</td>, <td>zakres: 50-1,200 &mu; l</td></tr><tr><td>TipOne 101-1,250 &mu; l przedłużone naturalne końcówki</td><td>USA Scientific</td><td>1112 - 1720</td><td>10 stojaków po 96 końcówek (960 końcówek)</td></tr><tr><td>Płyta grzewcza; powierzchnia grzewcza: 10 cali x 10 cali.</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-100-100SH</td><td>Magnetyczna płytka mieszająca z dyskiem laboratoryjnym</td></tr><tr><td>Blender Waring</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-509-7P</td><td>Dwubiegowy; Pojemnik 1 L (34 uncje) ze stali nierdzewnej</td></tr><tr><td>DOZOWNIKI butelkowe BRAND Dispensette III Dozownik</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-688-231</td><td>Dozownik; zakres: 5-50 ml</td></tr><tr><td>Wheaton Unispense &mu; Pompy perystaltyczne</td><td>P Fisher Scientific</td><td>13-683-7</td><td>Opcjonalny dozownik</td></tr><tr><td>Mieszadło magnetyczne Fisherbrand</td><td>Fisher Scientific</td><td>1451363SIX</td><td>Służy do mieszania gnojowicy glebowej po zmieszaniu</td></tr><tr><td>Misek ze szkła pyrexowego</td><td>World Kitchen</td><td>5304218</td><td>Pyrex 10 uncji kubek budyniowy</td></tr><tr><td>Costar 96-dołkowe czarne lite talerze</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-590</td><td>Używany do stopnia czytnika płyt</td></tr><tr><td>Bloki testowe Costar 96-dołkowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-700</td><td>V-dno; 2 ml; sterylne</td></tr><tr><td>Thermo Scientific Nunc 96-dołkowe maty do nasadek</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-387-93</td><td>Sterylna 96-dołkowa mata do studzienek kwadratowych</td></tr><tr><td>Wirówka wyposażona w uchwyty do płytek głębinowych</td><td>Thermo Scientific</td><td>3121</td><td>Centra-GP8 (ten model nie jest już dostępny)</td></tr><tr><td>Wielofunkcyjny czytnik mikropłytek Tecan Infinite serii 200</td> Czytnik <td>płytek Tecan</td><td>30016058</td><td>(ten model nie jest już dostępny)</td></tr></tbody></table>

wysokoprzepustowy pomiar fluorometryczny potencjalnej aktywności enzymów zewnątrzkomórkowych w glebie

High-throughput Fluorometric Measurement of Potential Soil Extracellular Enzyme Activities

Mikroorganizmy w glebach i innych środowiskach wytwarzają zewnątrzkomórkowe enzymy do depolimeryzacji i hydrolizy organicznych makromolekuł, aby mogły być przyswajane na energię i składniki odżywcze. Pomiar aktywności enzymów mikrobiologicznych w glebie ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia dynamiki funkcjonalnej ekosystemu glebowego. Ogólna koncepcja testu enzymów fluorescencyjnych polega na tym, że do próbek gleby dodaje się syntetyczne substraty bogate w C, N lub P związane barwnikiem fluorescencyjnym. W stanie nienaruszonym oznakowane podłoża nie fluoryzują. Aktywność enzymu mierzy się jako wzrost fluorescencji, gdy barwniki fluorescencyjne są odcinane od ich substratów, co pozwala im na fluorescencję. Pomiary enzymów mogą być wyrażone w jednostkach molowości lub aktywności. Aby przeprowadzić ten test, zawiesiny glebowe przygotowuje się przez połączenie gleby z buforem pH. Bufor pH (zwykle octan sodu o objętości 50 mM lub bufor Tris o pojemności 50 mM) dobiera się do określonej stałej dysocjacji kwasowej buforu (pKa), aby jak najlepiej dopasować pH próbki gleby. Gnojowice glebowe zaszczepia się nieograniczoną ilością znakowanego fluorescencyjnie (tj. bogatego w C, N lub P) substratu. Wykorzystanie zawiesin glebowych w teście służy zminimalizowaniu ograniczeń dyfuzji enzymów i substratów. W związku z tym test ten kontroluje różnice w ograniczeniach substratu, szybkościach dyfuzji i warunkach pH gleby; w ten sposób wykrywa potencjalne wskaźniki aktywności enzymu w funkcji różnicy stężeń enzymów (na próbkę).
Testy enzymów fluorescencyjnych są zazwyczaj bardziej czułe niż testy spektrofotometryczne (tj. kolorymetryczne), ale mogą cierpieć z powodu zakłóceń spowodowanych zanieczyszczeniami i niestabilnością wielu związków fluorescencyjnych podczas ekspozycji na światło; dlatego należy zachować ostrożność podczas obchodzenia się z podłożami fluorescencyjnymi. Podobnie, metoda ta ocenia potencjalną aktywność enzymów tylko w warunkach laboratoryjnych, gdy substraty nie są ograniczone. Należy zachować ostrożność podczas interpretowania danych przedstawiających porównania między miejscami o różnych temperaturach lub typach gleby, ponieważ typ gleby i temperatura in situ mogą wpływać na kinetykę enzymów.

Aby zmierzyć potencjalne tempo aktywności enzymów zewnątrzkomórkowych w glebie, do próbek gleby dodaje się syntetyczne substraty, które są związane z barwnikiem fluorescencyjnym. Aktywność enzymu mierzy się, gdy barwnik fluorescencyjny jest uwalniany z substratu w reakcji katalizowanej enzymatem, gdzie wyższa fluorescencja wskazuje na większą degradację substratu.

Wysokoprzepustowy pomiar fluorometryczny potencjalnej aktywności enzymów zewnątrzkomórkowych w glebie

Microbes in soils and other environments produce extracellular enzymes to depolymerize and hydrolyze organic macromolecules so that they can be ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest określenie maksymalnych potencjalnych szybkości, z jakimi enzymy zewnątrzkomórkowe w glebach degradują swoje substraty docelowe. Osiąga się to poprzez wstępne połączenie wilgotnej gleby polowej z buforem w blenderze, a następnie pipetowanie zmieszanych próbek do głębokich płytek próbek oraz głębokich płytek ze standardami. Płytki z głębokimi dołkami są inkubowane i wirowane, po czym 250 µL zostaje przeniesione z każdego dołka płytek z głębokimi dołkami do odpowiadających im dołków czarnych płytek z płaskim dnem.Płytki 96-dołkowe. Następnie trzy płytki odczytuje się na fluorymetrze, a uzyskane dane poddaje się analizie. Ostatecznie potencjalne aktywności zewnątrzkomórkowych enzymów glebowych określa się na podstawie szybkości uwalniania barwnika fluorescencyjnego z substratu w reakcji katalizowanej enzymatycznie, gdzie wyższa fluorescencja wskazuje na większy stopień degradacji substratu.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami jest możliwość pomiaru aktywności enzymów w dużej liczbie próbek dzięki wykorzystaniu formatu głębokich mikropłytek 96-dołkowych. Pomysł na tę metodę pojawił się, gdy dostrzegliśmy możliwość zwiększenia objętości próbki w stosunku do standardowych mikropłytek poprzez adaptację innych protokołów do formatu płytek z głębokimi dołkami. Zastosowanie tej techniki pozwala nam lepiej powiązać fizjologię mikroorganizmów z procesami w skali ekosystemu.Demonstracja wizualna jest kluczowa dla tej techniki, ponieważ istnieje wiele niuansów i aspektów obchodzenia się z próbkami, których niełatwo jest przestrzegać w formie pisanej procedury. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu ekologii mikrobowej i biogeochemii gleby, takie jak to, w jaki sposób mikroby glebowe reagują na zmiany w swoim środowisku oraz jak ich reakcje fizjologiczne wpływają na krytyczne procesy ekosystemowe, takie jak rozkład i obieg składników odżywczych. Chociaż metoda ta może dostarczyć wiedzy na temat rozkładu organicznej materii glebowej i obiegu składników odżywczych w ekosystemach lądowych, można ją również zastosować w systemach morskich i słodkowodnych.Zazwyczaj osoby początkujące w tej metodzie mogą mieć trudności z techniką pipetowania oraz kwestiami dotyczącymi wrażliwości czasowej tego protokołu. Ponadto duża ilość danych generowanych podczas tej procedury jest czasem przytłaczająca dla nowych użytkowników. Aby rozpocząć przygotowanie analizy, należy opisać trzy płytki z głębokimi dołkami jako: standard MUB dla czterometylowokumaryny, beone oraz standard MUC dla siedmioaminowokości czterometylowokumaryny.Wlej każdy standard i substrat do oddzielnych, czystych i wcześniej oznakowanych zbiorników ułożonych w rzędach. Następnie pipetuj odpowiedni standard MUB do odpowiadających im dołków na płytce ze standardami MUB, zgodnie z listą w protokole tekstowym. Powtórz tę procedurę dla standardów MUC w odpowiednich dołkach płytki ze standardami MUC, aby przygotować zawiesiny glebowe.Dla każdej próbki gleby odważ 2,75 g gleby o wilgotności polowej, a następnie umieść ją w blenderze. Dodaj 91 ml buforu 50 mM i blenduj z wysoką prędkością przez jedną minutę. Przelej zawartość blendera do czystej szklanej misy o szerokości co najmniej odpowiadającej pipecie ośkianałowej, dodając mieszadło magnetyczne.Zawiesinę glebową można przesiać przez sito o oczkach o rozmiarze około jednego milimetra przed przelaniem do miski. Umieść miskę na mieszalce magnetycznej i wymieszaj zawiesinę glebową. Następnie pipetą przenieś 800 µL zawiesiny glebowej do pierwszej kolumny płytki z próbkami.Postąp analogicznie w przypadku pierwszej kolumny płytek standardowych MUB oraz MUC. Pomiędzy próbkami gleby płucz blender, mieszadło magnetyczne oraz mieszadełko w wodzie dejonizowanej lub buforze. Powtórz ten proces dla każdej próbki gleby.Przechodzić do następnej kolumny z każdą kolejną próbką. Następnie pipetować odpowiedni substrat do odpowiadających im studzienek na płytce z próbkami. Zgodnie z opisem w protokole tekstowym, należy przygotować osobną płytkę z próbkami dla każdej testowanej temperatury inkubacji.Uszczelnij płytki głębokich dołków za pomocą mat do płytek. Odwróć każdą uszczelnioną płytkę ręcznie, aż do całkowitego wymieszania roztworu. Umieść płytki w odpowiednim inkubatorze na wymagany czas inkubacji, zgodnie z protokołem tekstowym; zarejestruj czas początkowy jako czas zero, a także odpowiednie czasy inkubacji na koniec każdego okresu inkubacji.Odwiruj szczelnie zamknięte płytki przez trzy minuty przy przyspieszeniu około 2 900 G. Po odwirowaniu przenieś 250 µL z każdej studni inkubowanych płytek głębokich do odpowiadających im studni czarnych płytek 96-dołkowych z płaskim dnem. Jedna czarna płytka zostanie wykorzystana dla każdej inkubowanej płytki głębokiej.Należy przenieść próbki z inkubowanych płytek głębokich do odpowiednich studzienek w czarnych płaskich płytkach 96-dołkowych, zgodnie z instrukcjami producenta używanego fluorometrycznego czytnika płytek. Ustaw długość fali wzbudzenia na 365 nanometrów oraz długość fali emisji na 450 nanometrów.Wprowadź jedną z płytek standardowych, ustaw fluorymetr na automatyczny dobór wzmocnienia (automatic gain) i odczytaj płytkę. Następnie ustaw wzmocnienie na tryb ręczny i zmniejsz jego wartość z optymalnej do kolejnej niższej liczby zaokrąglonej do najbliższej piątki. Dla każdej płytki standardowej powtórz pomiar dwukrotnie.Następnie należy załadować płytkę z próbkami. Ustawić wzmocnienie na automatyczne i uruchomić pomiar płytki z próbkami. Ponowić pomiar płytki z próbkami w trybie ręcznym, aby dopasować najwyższe wzmocnienie dla każdej z płytek ze standardami.Analizę danych należy rozpocząć od wprowadzenia danych fluorescencji krzywej wzorcowej dla standardów MUB i MUC do arkusza kalkulacyjnego. Przelicz stężenia mikromolarne na mikromole dla każdej próbki. Na podstawie danych fluorescencji krzywej wzorcowej oblicz nachylenie, punkt przecięcia z osią y oraz wartości R kwadrat dla stężeń standardów MUB i MUC.Akceptowalne wartości R² powinny przekraczać 0,98 dla każdej próbki. Krzywe wzorcowe można przedstawić na wykresie punktowym, gdzie odczyty fluorescencji stanowią zmienną zależną, a stężenie standardu zmienną niezależną. Wprowadź surowe dane fluorescencji dla próbki z substratem do nowego arkusza kalkulacyjnego.Należy również uwzględnić czas inkubacji oraz suchą masę gleby dla każdej próbki, odjąć wartości punktu przecięcia krzywej wzorcowej od odpowiadających im wartości fluorescencji próbek, a następnie podzielić wynik przez nachylenie odpowiedniej krzywej wzorcowej. Korzystając z równania linii wzorcowej, należy pomnożyć mikromole z próbki przez 91 mililitrów, co stanowi objętość buforu użytego w zawiesinie glebowej. Otrzymaną wartość należy podzielić przez czas inkubacji właściwy dla danej próbki oraz suchą masę gleby.Na koniec pomnóż uzyskaną wartość przez 1000, aby otrzymać pożądane jednostki. Wyniki pochodzą z eksperymentalnego badania klimatycznego porównującego gleby poddane warunkom klimatycznym otoczenia z glebami poddanymi działaniu podwyższonego stężenia dwutlenku węgla oraz ogrzewania; przedstawione tutaj dane to potencjalne aktywności enzymów zewnątrzkomórkowych (EEA) w miejscu ogrzewania preri i wzbogacania w dwutlenek węgla, zarówno w działkach kontrolnych, jak i testowych. W tym przykładzie analizy potencjalnej aktywności enzymów pozyskiwania węgla, azotu i fosforu w głębokości gleby od 0 do 5 cm nie wykazały różnic w zależności od zastosowanej obróbki eksperymentalnej.Jednakże na głębokości gleby od 5 do 15 cm poziom kilku potencjalnych EEAs różnił się znacząco. Na przykład aktywność enzymów degradujących węgiel, beta-1,4-glukozydazy i beta-D-celobiohydrolazy, była niższa na działkach poddanych działaniu podwyższonego stężenia dwutlenku węgla i ogrzewaniu w porównaniu z działkami w warunkach klimatu naturalnego. Aktywność enzymów mineralizujących azot i fosfor była również niższa na działkach badawczych w porównaniu z warunkami klimatu naturalnego na głębokości gleby od 5 do 15 cm.Obliczanie i wykreślanie sumy wszystkich potencjalnych aktywności enzymatycznych zewnątrzkomórkowych (EEA) związanych z cyklami węgla, azotu lub fosforu może być użytecznym podejściem do obserwacji szerszych wzorców dotyczących potencjalnych cykli węgla, azotu i/lub fosforu w glebie. W tym przykładzie obliczono sumę potencjalnych aktywności EEA dla $\beta$-1,4-glukozydazy, $\beta$-D-celulobiohydrolazy, $\beta$-ksylozydazy oraz $\alpha$-1,4-glukozydazy, aby reprezentowała ona potencjalną aktywność cyklu węglowego. Sumę potencjalnych aktywności $\beta$-1,4-N-acetylglukozaminidazy i L-leucyloaminopeptydazy obliczono w celu reprezentowania potencjalnej aktywności cyklu azotowego.Aktywność fosfatazy została wykorzystana do reprezentowania potencjalnych procesów cyklu fosforowego. Potencjalne EEAs dla cykli całkowitego węgla, azotu i fosforu wykazywały tendencję spadkową w działkach z podwyższoną koncentracją dwutlenku węgla i ogrzewaniem w porównaniu do działek w warunkach klimatu otoczenia na głębokościach glebowych od 5 do 15 cm. Tendencja ta była jednak istotna statystycznie jedynie w przypadku aktywności cykli całkowitego azotu i fosforu, a wartości EEAs w glebie nie różniły się znacząco między działkami badawczymi.Na głębokości od 0 do 5 cm gleby. Wyniki wskazują na przeciwstawne trendy w aktywności enzymów i grup funkcjonalnych pomiędzy działkami doświadczalnymi w zależności od głębokości gleby; stosunek potencjalnych EEAs jest jednym ze sposobów oceny zapotrzebowania mikroorganizmów na składniki odżywcze. W tym przypadku aktywności enzymów glebowych, geometria torchów, stosunek węgla do azotu, węgla do fosforu lub azotu do fosforu różnią się znacząco pomiędzy działkami doświadczalnymi na głębokości od 0 do 5 cm gleby.Jednakże potencjalne stosunki enzymatycznego węgla do fosforu oraz azotu do fosforu były wyższe na działkach poddanych działaniu podwyższonego poziomu dwutlenku węgla i ogrzewaniu. W porównaniu z warunkami klimatycznymi otoczenia na głębokościach od 5 do 15 cm temperatura może silnie wpływać na glebowe EEAs. Jednak w typowych testach laboratoryjnych enzymy glebowe mierzy się w jednej temperaturze, która może nie odpowiadać warunkom temperatury in C two.Wykresy Arrheniusa służą do wizualizacji energii aktywacji i są kreślone z wykorzystaniem logarytmu aktywności enzymu jako funkcji odwrotności temperatury przeliczonej na kelwiny na osi x. Energię aktywacji powszechnie definiuje się jako minimalną energię wymaganą do katalizy reakcji chemicznej; w niniejszym przypadku służy ona jako wskaźnik wrażliwości reakcji katalizowanych enzymatycznie na temperaturę. Wyższa energia aktywacji wskazuje na większą wrażliwość enzymu na temperaturę.Podobnie, energie aktywacji bezpośrednio odpowiadają współczynnikowi Q10. Oceńiono wartości współczynnika temperatury dla potencjalnej kinetyki enzymatycznej aktywności enzymów zewnątrzkomórkowych (EEA) dla węgla, azotu i fosforu w obu działkach doświadczalnych na dwóch głębokościach gleby, a wyniki wykazały, że wrażliwość temperatury EEA nie różniła się znacząco między działkami doświadczalnymi na żadnej z głębokości gleby. Po opanowaniu techniki można zaszczepić 12 próbek w 96-dołkowych płytkach mikrotitracyjnych w ciągu 30 minut lub krócej.Ponadto, po wyznaczonym czasie inkubacji, zazwyczaj można odwirować, przenieść i ponownie odczytać płytki w urometrze w ciągu pół godziny. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest zachowanie konsekwencji podczas pipetowania. Obecność pęcherzyków powietrza podczas pipetowania negatywnie wpłynie na wyniki uzyskane po przeprowadzeniu tej procedury.W celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania dotyczące roli składu społeczności mikroorganizmów glebowych w funkcjonowaniu gleby po jej ukształtowaniu można zastosować inne metody, takie jak ekstrakcja i sekwencjonowanie DNA. Technika ta utorowała drogę badaczom z zakresu ekologii mikroorganizmów do zgłębiania obiegów składników odżywczych oraz procesów biogeochemicznych w ekosystemach lądowych. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać pełną wiedzę na temat tego, jak ilościowo określać potencjalną aktywność enzymatyczną.Ponadto powinni Państwo być w stanie zinterpretować dane tak, aby odzwierciedlały one potencjalne reakcje drobnoustrojów na czynniki takie jak klimat i różne rodzaje gleby w obrębie różnych ekosystemów. Należy pamiętać, że podczas pracy z materiałami fluorescencyjnymi zawsze należy przestrzegać środków ostrożności w celu zminimalizowania ekspozycji na światło ze względu na światłoczułość grupy fluoroforowej.

high-throughput-fluorometric-measurement-potential-soil-extracellular

Research

JoVE Journal

Environment

Środowisko

Wysoko przepustowe fluorometryczne pomiary potencjalnej aktywności enzymów ekstracelularnych gleby

Przedstawiono protokół wykrywania trichotecenów (mykotoksyn stanowiących zagrożenie dla zdrowia ludzi) z wykorzystaniem nowo opracowanej metody przesiewowej, opartej na konkurencyjnej metodzie immunochemicznej oraz końcowej detekcji elektrochemicznej.

Metoda ELIME (Enzyme Linked Immuno Magnetic Electrochemical) do wykrywania mikotoksyn

Niniejszy protokół opisuje wysokoprzepustową metodę hydrolizy enzymatycznej, w której wykorzystuje się czytnik mikropłytek do pomiaru i klasyfikacji fosforu glebowego jako monoestrów P, diestrów P oraz fosforu nieorganicznego. W standardowych warunkach laboratoryjnych jednorazowo można zmierzyć do 96 próbek.

Wysokoprzepustowy pomiar i klasyfikacja fosforu organicznego w próbkach środowiskowych

Opisujemy niskokosztową, wysokoprzepustową metodę przesiewania aktywności endoglukanazy grzybowej w E. coli. Metoda opiera się na prostym wizualnym odczycie degradacji substratu, nie wymaga oczyszczania enzymu i jest wysoce skalowalna. Umożliwia to szybkie przesiewanie dużych bibliotek wariantów enzymatycznych.

Wysokoprzepustowy screening aktywności grzybowej endoglukanazy w Escherichia coli

Ten protokół zapewnia biochemiczne podejście do pomiaru wskaźnika zakwaszenia zewnątrzkomórkowego (ECAR) i wskaźnika zużycia tlenu (OCR) pierwotnych komórek białaczkowych za pomocą testu strumienia zewnątrzkomórkowego. Ocena profilu metabolicznego tych komórek pomaga scharakteryzować ich zapotrzebowanie, co prowadzi do spersonalizowanej terapii.

Test strumienia zewnątrzkomórkowego: metoda pomiaru profilu metabolicznego komórek

Ten film demonstruje test enzymatyczny oparty na chromatografii cienkowarstwowej do określenia aktywności pirofosfokinazy przy użyciu znakowanych radioaktywnie nukleotydów. Metoda dostarcza informacji na temat syntezy nukleotydów i reakcji fosfotransferu.

Test aktywności enzymatycznej oparty na chromatografii cienkowarstwowej: technika określania aktywności pirofosfokinazy in vitro za pomocą chromatografii cienkowarstwowej

Procedury oparte na mikropłytkach są opisane dla kolorymetrycznej lub fluorometrycznej analizy aktywności enzymów zewnątrzkomórkowych. Procedury te pozwalają na szybkie oznaczenie takiej aktywności na dużej liczbie próbek środowiskowych w rozsądnych ramach czasowych.

Oznaczanie mikrobiologicznej aktywności enzymów zewnątrzkomórkowych w wodach, glebach i osadach za pomocą wysokoprzepustowych testów mikropłytek

Glikoliza jest definiującym markerem metabolicznym w wielu systemach biologicznych. Monitorowanie glikolizy poprzez pomiar zewnątrzkomórkowego strumienia H+ jest powszechne, ale wymaga korekty, aby była ilościowa i jednoznaczna. W tym miejscu pokazujemy, jak zbierać i korygować dane dotyczące strumienia zewnątrzkomórkowego, aby odróżnić oddechowe i glikolityczne źródła zakwaszenia zewnątrzkomórkowego.

Pomiar i analiza produkcji kwasu zewnątrzkomórkowego w celu określenia szybkości glikolitycznej

Ta praca przedstawia metodę wysokoprzepustowych badań przesiewowych przy użyciu uniwersalnego systemu badań przesiewowych enzymów genetycznych, który teoretycznie można zastosować do ponad 200 enzymów. W tym przypadku pojedynczy system przesiewowy identyfikuje trzy różne enzymy (lipazę, celulazę i fosfatazę alkaliczną), po prostu zmieniając zastosowany substrat (octan p-nitrofenylu, p-nitrofenylo-β-D-celobiozyd i fosforan fenylu).

Badania przesiewowe wielu enzymów przy użyciu wysokoprzepustowego systemu badań przesiewowych enzymów genetycznych

Opisano wysokoprzepustowy test do badań przesiewowych enzymów. Ten multipleksowany, gotowy do użycia zestaw testowy składa się z wstępnie wybranych substratów Chromogennego Polymeru Hydrogelu (CPH) i złożonych Inierozpuszczalnych wC hromogennych substratach ioB (ICB). Enzymy docelowe to endoenzymy i proteazy rozkładające polisacharydy.

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe enzymów rozkładających węglowodany przy użyciu nowatorskich zestawów do oznaczania nierozpuszczalnych substratów chromogennych

Ten protokół przedstawia przepływ pracy dla sub-mm wizualizacji 2D wielu labilnych nieorganicznych składników odżywczych i zanieczyszczeń rozpuszczonych za pomocą gradientów dyfuzyjnych w cienkich warstwach (DGT) w połączeniu z obrazowaniem spektrometrii mas. Pobieranie próbek substancji rozpuszczonych i analiza chemiczna o wysokiej rozdzielczości są szczegółowo opisane w celu ilościowego mapowania substancji rozpuszczonych w ryzosferze roślin lądowych.

Dwuwymiarowa wizualizacja i kwantyfikacja labilnych, nieorganicznych składników odżywczych roślin i zanieczyszczeń w glebie

Protokół ten opisuje podejście o wysokiej przepustowości do oceny wycieku jonów roślinnych, aktywności peroksydazy oraz produkcji kalloz w tej samej próbce.

Ocena odpowiedzi liści na metabolity drugorzędne mikroorganizmów przy użyciu formatu o wysokiej przepustowości

Poznaj wysokoprzepustową metodę fluorometryczną do pomiaru aktywności enzymów zewnątrzkomórkowych w glebie. Technika ta umożliwia efektywną analizę wielu próbek jednocześnie, wspierając badania z zakresu ekologii mikroorganizmów i biogeochemii gleby.

Wysokoprzepustowy pomiar fluorometryczny potencjalnej aktywności enzymów zewnątrzkomórkowych w glebie

Przeglądaj więcej filmów