Submilisekundowe zmiany konformacyjne w białkach rozwiązane przez odchylenie wiązki fototermicznej
February 18th, 2014
Tutaj opisujemy zastosowanie techniki odchylania wiązki fototermicznej w połączeniu z umieszczonym w klatce związkiem wapnia, DM-nitrofenem, do monitorowania dynamiki mikrosekund i milisekund oraz energetyki zmian strukturalnych związanych ze związkiem wapnia z neuronalnym czujnikiem wapnia, Modulatorem Antagonisty Elementu Regulatorowego.
Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest scharakteryzowanie potwierdzających zmian związanych z wiązaniem ligandów z przetwornikami wapnia w skali czasowej poniżej milisekundy. Potwierdzenie przejścia między białkiem APO a białkiem związanym z wapniem jest wywoływane przez fotorozszczepienie związku wapnia w klatce calcium DM nitro, co prowadzi do fotouwalniania wolnego wapnia. Związana z tym zmiana współczynnika odbicia jest mierzona jako przemieszczenie wiązki sondy za pomocą poczwórnego detektora czułego na położenie.
Następnie mierzone są ślady ugięcia wiązki fototermicznej w funkcji temperatury zarówno dla próbki, jak i dla punktu odniesienia. Analiza złożona śladów ugięcia wiązki foto dostarcza informacji na temat mechanizmu indukowanej przez wapń zmiany konfirmacyjnej pod względem objętości reakcji i zmian entalpii. Główną zaletą odchylenia wiązki fototermicznej w stosunku do istniejącego masztu, takiego jak przepływ górny, jest to, że technika ta pozwala na jednoczesne wykrywanie zmian objętości i entropii w skali czasu poniżej milisekundy.
Wizualna demonstracja tej techniki jest konieczna, ponieważ precyzyjne ustawienie przyrządu ma kluczowe znaczenie dla odzyskania parametrów termodynamicznych. Procedurę zademonstruje Walter Gonzalez, doktorant z mojego laboratorium, który przeprowadzi przygotowanie próbki i wszystkie manipulacje próbkami w ciemnym pomieszczeniu, aby zapobiec niepożądanemu wyjęciu z klatek. W tym filmie kroki są pokazane w świetle do celów filmowania.
Aby rozpocząć rozpuszczanie DM Nitro w 50 milimolowych hałdach, buforuj 100 milimolowy chlorek potasu, pH 7,0 do końcowego stężenia 400 mikromolowych. Dodać chlorek wapnia z 0,1-molowego roztworu podstawowego, aby uzyskać pożądany stosunek stężenia wapnia do DN nitro. Następnie należy rozpuścić związek odniesienia cyjanek potasu lub chromian sodu w tym samym buforze.
Jeśli chodzi o próbkę, należy zapoznać się z protokołem tekstowym, aby zapoznać się ze schematem podstawowej konfiguracji doświadczalnej dla ugięcia wiązki fototermicznej. Podczas ustawiania eksperymentu rozejdź wiązkę sondy przez środek komórki, umieszczoną w uchwycie na ogniwo o kontrolowanej temperaturze. Następnie za pomocą otworu dostosuj średnicę wiązki sondy do jednego milimetra, użyj drugiego lustra za próbką, aby wyśrodkować wiązkę sondy na środku detektora wrażliwego na położenie.
Skoncentruj wiązkę pro na środku detektora tak, aby różnica napięcia między dwiema górnymi diodami a dwiema dolnymi diodami, a także różnica napięcia między dwiema diodami po lewej i prawej stronie detektora wynosiła zero. Następnie ukształtuj średnicę wiązki pompy, 355 nanometrowe wyjście lasera ND YAG. Za pomocą trzymilimetrowego otworu umieszczonego między lustrami laserowymi o długości 2 355 nanometrów, rozpropaguj wiązkę pompy przez środek vete.
Ważne jest, aby obie wiązki laserowe rozchodziły się przez środek komórki optycznej w sposób prawie kolinowy. Aby uzyskać mierzalny kąt odchylenia, a tym samym wysoką amplitudę odchylenia wiązki fototermicznej lub sygnału PBD, należy użyć związku referencyjnego do wyrównania sondy i wiązki pompy w celu uzyskania zadowalającego sygnału PBD charakteryzującego się dobrym stosunkiem sygnału do szumu i stabilną amplitudą PBD w dłuższych skalach czasowych. Następnie ustaw wiązkę pompy w stosunku do wiązki sondy poprzez stopniową regulację luster laserowych o długości fali 355 nanometrów.
Zmierz amplitudę sygnału referencyjnego PBD jako różnicę między dwiema górnymi i dolnymi diodami fotodiodowymi na detektorze czułym na położenie. Sygnał PBD powinien wykazywać szybki wzrost amplitudy w szybkiej skali czasowej i pozostawać stabilny w skali czasowej 100 milisekund. Sprawdź liniowość amplitudy sygnału PBD w odniesieniu do uwolnionej energii cieplnej, mierząc liniową zależność sygnału PBD od mocy lasera wzbudzającego oraz od liczby pochłoniętych przez Einsteina sygnałów.
Utrzymuj moc lasera poniżej około 1000 mikrodżuli, aby zapobiec absorpcji wielu fotonów. Należy również utrzymywać chłonność próbki lub związku odniesienia na długości fali wzbudzenia mniejszej niż 0,5, aby zapobiec spadkowi mocy wiązki pompy. Kroki te zapewnią liniowość sygnału PBD.
Zacznij od pomiaru śladów PBD. W celu odniesienia umieść roztwór związku odniesienia w kuwetce kwarcowej i umieść ogniwo w uchwycie o kontrolowanej temperaturze. Wykrywa referencyjny sygnał PBD w funkcji temperatury w zakresie temperatur od 16 do 35 stopni Celsjusza z przyrostem temperatury o trzy stopnie Celsjusza.
Przy każdej zmianie temperatury. Sprawdź położenie wiązki sondy na detektorze czułym na położenie i ponownie dostosuj pozycję do środka detektora. W razie potrzeby sprawdzić liniowość sygnału PBD zgodnie z opisem w protokole tekstowym.
Następnie umieść roztwór próbki w tej samej celi optycznej, która jest używana do związku referencyjnego, zachowując tę samą orientację celi optycznej do pomiaru referencyjnego. Przystąpić do wykrywania śladów PBD próbki w tym samym zakresie temperatur, co dla odniesienia, i sprawdzić liniowość amplitudy PBD próbki. Przyjmij amplitudę referencyjnego sygnału PBD jako różnicę między sygnałem PBD wyzwalającym pret a sygnałem PBD po wyzwoleniu.
W podobny sposób należy określić amplitudę fazy szybkiej i wolnej sygnału PBD próbki. Aby wyeliminować parametr odpowiedzi przyrządu, należy przeskalować amplitudę próbki sygnału PBD przez amplitudę sygnału PBD. Dla odniesienia, stosunek sygnału próbki do sygnału odniesienia daje równanie, na podstawie którego uwalnianie ciepła do roztworu i nietermiczna zmiana objętości związana z reakcją zainicjowaną foto mogą być wyznaczone na podstawie nachylenia i punktu przecięcia wykresu stosunku amplitudy pomnożonego przez energię w funkcji składnika zależnego od temperatury w celu wyznaczenia objętości reakcji i zmiany entalpii dla skali procesu szybkiego i wolnego, Obserwowana objętość i entalpia zmieniają się do odpowiedniej wydajności kwantowej.
Zgodnie z równaniami znajdującymi się w protokole tekstowym, amplitudy i czasy życia dla poszczególnych kroków są analizowane poprzez dopasowanie danych do funkcji zależnej od czasu, która opisuje zmiany objętości i entalpii. Amplituda szybkiego kroku odpowiada amplitudzie fazy szybkiej sygnału PBD próbki, a amplituda kolejnego kroku odpowiada amplitudzie wolnej fazy sygnału PBD próbki. Dla każdego pojedynczego procesu na podstawie zależności od temperatury stałej szybkości dla poszczególnych procesów, parametry entalpii aktywacji i entropii można łatwo określić za pomocą wykresów IR.
Reprezentatywny przykład śladów PBD dla uwalniania zdjęcia wapnia z calcium DM nitro pokazano tutaj. Faza szybka odpowiada fotorozszczepieniu wapnia DM nitro i uwolnieniu wapnia, podczas gdy faza wolna odzwierciedla wiązanie wapnia z niefotoedowaną klatką. Ślad PBD dla asocjacji wapnia z domeną końcową C neuronalnego czujnika wapnia będącego za elementem regulatorowym, antagonistą, regulatorem lub snem jest pokazany tutaj po dysocjacji fotowapnia.
Zdjęcie uwolnione ligand wiąże się z końcową domeną snu C ze stałą czasową 1,3 plus minus 0,3 milisekundy w temperaturze 20 stopni Celsjusza od zależności od temperatury obserwowanej stałej szybkości. Bariera aktywacji wiązania wapnia z końcową domeną C snu została określona na 9,2 plus minus 0,4 kilokalorii na mol. Podczas próby wykonania tej procedury należy pamiętać o pomiarze śladów PBD próbki w warunkach identycznych jak w przypadku odniesienia.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować próbkę, wyrównać oprzyrządowanie i przeanalizować dane, aby uzyskać powtarzalny parametr termodynamiczny.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
To badanie wykorzystuje technikę fototermalnego ugięcia wiązki w połączeniu z zablokowanym związkiem wapnia, DM-nitrofenem, aby zbadać dynamikę zmian strukturalnych w neuronalnych czujnikach wapnia. Nacisk kładzie się na mikrosekundowe i milisekundowe skale czasowe zdarzeń wiązania wapnia.
Kluczowe komponenty badania
Obszar nauki
- Neuronauki
- Biofizyka
- Biologia strukturalna
Tło
- Przekaźniki wapnia odgrywają kluczowa rolę w przekazywaniu sygnałów neuronowych.
- Rozumienie zmian konformacyjnych jest istotne dla wyjaśnienia mechanizmów sygnalizacji wapniowej.
- Fototermalne ugięcie wiązki oferuje nowatorskie podejście do badania tych szybkich dynamiki.
- DM-nitrofen to zablokowany związek wapnia, który pozwala na kontrolowane uwalnianie wapnia.
Cel badania
- Charakteryzowanie zmian konformacyjnych związanych z wiązaniem ligandu do przekaźników wapnia.
- Pomiar dynamiki tych zmian w skali podmilisekundowej.
- Analiza zmian objętości reakcji i zmian entalpii podczas wiązania wapnia.
Stosowane metody
- Zastosowanie techniki fototermalnego ugięcia wiązki.
- Użycie DM-nitrofenu do fotochemicznego uwolnienia wolnego wapnia.
- Pomiar zmian indeksu odbicia jako przemieszczenia wiązki sondującej.
- Analiza śladów fototermalnego ugięcia wiązki jako funkcji temperatury.
Główne wyniki
- Udane pomiary przejść konformacyjnych między białkami APO a związanymi z wapniem.
- Wgląd w mechanizm zmian konformacyjnych indukowanych wapniem.
- Wykazanie jednoczesnego wykrywania zmian objętości i entropii.
- Podkreślenie zalet fototermalnego ugięcia wiązki w porównaniu z tradycyjnymi metodami.
Wnioski
- Badanie zapewnia głębsze zrozumienie dynamiki sygnalizacji wapniowej.
- Fototermalne ugięcie wiązki jest cennym narzędziem do badania szybkich zmian molekularnych.
- Przyszłe badania mogą budować na tych odkryciach, aby zbadać inne związane z wapniem procesy.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Photothermal beam deflection enables direct, label-free quantification of submillisecond conformational changes in proteins, providing unique insight into rapid ligand-induced structural transitions. This capability addresses a critical gap in early discovery and mechanistic de-risking, especially for targets lacking intrinsic chromophores or fluorophores. The method enhances predictive confidence in target validation and supports risk-adjusted portfolio decisions by delivering quantitative thermodynamic parameters inaccessible to traditional techniques.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct measurement of ligand-induced conformational changes on microsecond to millisecond timescales.
- Quantifies reaction volume and enthalpy changes, supporting mechanistic de-risking of target engagement.
- Facilitates functional validation of protein targets without the need for extrinsic labels.
- Improves predictive confidence for advancing targets through the discovery pipeline.
Screening & Assay Development
- Provides validated, quantitative readouts of protein conformational dynamics for assay development.
- Supports reproducibility and standardization by enabling simultaneous detection of volume and enthalpy changes.
- Prepares robust biological systems for downstream screening workflows, even for non-fluorescent targets.
- Enables reliable evaluation of compound-induced structural effects in early screening.
Translational & Preclinical Research
- Aligns biophysical measurements with disease-relevant protein function for translational continuity.
- Supports risk-adjusted advancement by quantifying activation barriers and kinetic parameters relevant to preclinical models.
- Provides mechanistic data to inform biomarker strategies when supported by target biology.
Pipeline & Workflow Integration
Photothermal beam deflection integrates into the discovery continuum from early target validation through assay development and preclinical mechanistic studies, particularly where rapid conformational dynamics are critical decision points.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by quantifying fast structural transitions and thermodynamic parameters.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for assay readiness and compound triage.
- Analytics: Provides high-resolution measurements of reaction kinetics, volume, and enthalpy changes for comparative analysis.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical validation by aligning kinetic and thermodynamic data with functional outcomes.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable, label-free platform for diverse protein targets and ligand classes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability across protein systems.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions and capital efficiency by providing early, quantitative biophysical data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of targets with robust mechanistic evidence.
Implementation Considerations
- Requires expertise in photothermal instrumentation alignment and data analysis.
- Demands precise temperature control and optical setup for reproducible measurements.
- Necessitates cross-team standardization of sample preparation and reference calibration.
- Adaptable to proteins lacking chromophores or fluorophores, broadening applicability.
- Instrument sensitivity and alignment are critical for accurate thermodynamic parameter recovery.
