Submilisekundowe zmiany konformacyjne w białkach rozwiązane przez odchylenie wiązki fototermicznej

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest charakterystyka zmian konformacyjnych związanych z wiązaniem liganda przez przetworniki wapniowe w skali submilisekundowej. Przejście konformacyjne między białkiem APO a białkiem związanym z wapniem jest wyzwalane przez fotolizę klatkowanego związku wapnia, calcium DM nitro, co prowadzi do fotouwolnienia wolnego wapnia. Powiązana ze sobą zmiana współczynnika odbicia jest mierzona jako przemieszczenie wiązki sondy przy użyciu detektora czteropunktowego czułego na pozycję.

Następnie pomiarowo wyznacza się przebiegi odchylenia wiązki fototermicznej w funkcji temperatury zarówno dla próbki, jak i wzorca. Analiza złożona przebiegów odchylenia wiązki fotonicznej pozwala na zrozumienie mechanizmu indukowanego wapniem przełączania konformacyjnego pod kątem zmian objętości reakcji i entalpii. Główną zaletą odchylenia wiązki fototermicznej w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak top flow, jest fakt, że technika ta umożliwia jednoczesną detekcję zmian objętości i entropii w skali czasowej poniżej milisekundy.

Wizualna demonstracja tej techniki jest niezbędna, ponieważ precyzyjne ustawienie instrumentu ma krytyczne znaczenie dla odzyskania parametrów termodynamicznych. Procedurę zademonstruje Walter Gonzalez, doktorant z mojego laboratorium. Przygotowanie próbek oraz wszelkie manipulacje nimi należy przeprowadzać w ciemni, aby zapobiec niepożądanemu uwalnianiu cząsteczek z klatek (uncaging). W niniejszym filmie kroki są prezentowane w świetle na potrzeby filmowania.

W celu rozpoczęcia należy rozpuścić DN Nitro w buforze HEPS 50 mM z dodatkiem 100 mM chlorku potasu, pH 7,0, do końcowego stężenia 400 µM. Dodać chlorek wapnia z roztworu stokowego 0,1 M, aby uzyskać pożądany stosunek stężenia jonów wapnia do DN Nitro. Następnie należy rozpuścić związek referencyjny – cyjanek potasu lub chromian sodu – w tym samym buforze.

W odniesieniu do próbki należy zapoznać się z protokołem tekstowym w celu zapoznania się ze schematem podstawowej konfiguracji eksperymentalnej dla fototermalnego odchylenia wiązki. Podczas przygotowywania eksperymentu należy przeprowadzić wiązkę badawczą przez środek kuwety umieszczonej w uchwycie do kuwet z kontrolą temperatury. Następnie, używając otworu dyskowego (pinhole), należy dostosować średnicę wiązki badawczej do 1 mm, a następnie wykorzystać drugie lustro za próbką, aby wycentrować wiązkę badawczą na środku detektora pozycyjnego.

Skup wiązkę sondy na środku detektora w taki sposób, aby różnica napięć między dwiema górnymi a dwiema dolnymi diodami, a także różnica napięć między dwiema diodami po lewej i prawej stronie detektora wynosiła zero. Następnie ukształt średnicę wiązki pompowania, emitowanej z lasera ND YAG o długości fali 355 nanometrów. Wykorzystując otwór o średnicy 3 mm umieszczony pomiędzy dwoma lustrami lasera 355 nanometrów, przeprowadź wiązkę pompowania współbieżnie przez środek vete.

Ważne jest, aby obie wiązki laserowe propagowały przez środek celi optycznej w sposób niemalże kolinearny. Aby uzyskać mierzalny kąt odchylenia, a tym samym wysoką amplitudę fototermalnego odchylenia wiązki lub sygnału PBD, należy użyć związku referencyjnego do wyrównania wiązki badającej i wzbudzającej, tak aby osiągnąć satysfakcjonujący sygnał PBD charakteryzujący się dobrym stosunkiem sygnału do szumu oraz stabilną amplitudą PBD w dłuższych przedziałach czasowych. Następnie należy ustawić pozycję wiązki wzbudzającej względem wiązki badającej poprzez stopniową regulację luster lasera 355 nanometer.

Zmierz amplitudę sygnału referencyjnego PBD jako różnicę między górną a dolną fotodiodą w detektorze czułym na pozycję. Sygnał PBD powinien wykazywać gwałtowny wzrost amplitudy w krótkiej skali czasowej i pozostawać stabilny w skali 100 milisekund. Sprawdź liniowość amplitudy sygnału PBD w stosunku do uwolnionej energii cieplnej, mierząc liniową zależność sygnału PBD od mocy lasera wzbudzającego oraz od liczby pochłoniętych kwantów Einsteina.

Należy utrzymać moc lasera poniżej około 1000 micro joules, aby zapobiec absorpcji wielofotonowej. Należy również zadbać, aby absorbancja próbki lub związku referencyjnego przy długości fali wzbudzenia była mniejsza niż 0,5, aby zapobiec spadkowi mocy wiązki pompy. Kroki te zapewnią liniowość sygnału PBD.

Rozpocznij od pomiaru śladów PBD. W celu uzyskania referencji umieść roztwór związku referencyjnego w kuwecie kwarcowej, a następnie umieść kuwetę w uchwycie z kontrolą temperatury. Wykryj referencyjny sygnał PBD w funkcji temperatury w zakresie od 16 do 35 °C z przyrostem temperatury wynoszącym trzy stopnie Celsjusza.

Przy każdej zmianie temperatury należy sprawdzić położenie wiązki sondy na detektorze czułym na położenie i ponownie wycentrować ją względem detektora. W razie potrzeby należy sprawdzić liniowość sygnału PBD zgodnie z opisem w protokole tekstowym.

Następnie umieść roztwór próbki w tej samej celi optycznej, której użyto dla związku referencyjnego, zachowując tę samą orientację celi optycznej co podczas pomiaru referencyjnego. Przejdź do detekcji śladów PBD próbki w tym samym zakresie temperatur, co w przypadku referencji, i sprawdź liniowość amplitudy PBD próbki. Przyjmij amplitudę sygnału PBD referencyjnego jako różnicę między sygnałem PBD przed wyzwalaniem (pre-trigger) a sygnałem PBD po wyzwalaniu (post-trigger).

W podobny sposób wyznacz amplitudę fazy szybkiej i wolnej sygnału PBD próbki. Aby wyeliminować parametr odpowiedzi instrumentu, przeskaluj amplitudę sygnału PBD próbki względem amplitudy sygnału PBD referencyjnego. Dla wzorca stosunek sygnału próbki do sygnału referencyjnego daje równanie, z którego na podstawie nachylenia i punktu przecięcia wykresu stosunku amplitud pomnożonego przez energię względem członu zależnego od temperatury można wyznaczyć ciepło wydzielone do roztworu oraz nietermiczną zmianę objętości związaną z reakcją zainicjowaną foto-chemicznie; aby określić objętość reakcji i zmianę entalpii dla procesów szybkich i wolnych, przeskaluj zaobserwowaną zmianę objętości i entalpii do odpowiedniej wydajności kwantowej.

Zgodnie z równaniami zamieszczonymi w protokole tekstowym, amplitudy i czasy życia dla poszczególnych etapów analizuje się poprzez dopasowanie danych do funkcji zależnej od czasu, która opisuje zmiany objętości i entalpii. Amplituda szybkiego etapu odpowiada amplitudzie fazy natychmiastowej sygnału PBD próbki, a amplituda kolejnego etapu odpowiada amplitudzie fazy powolnej sygnału PBD próbki. Dla każdego pojedynczego procesu, na podstawie zależności stałej szybkości od temperatury dla poszczególnych procesów, parametry entalpii i entropii aktywacji można łatwo wyznaczyć przy użyciu wykresów IR.

Przedstawiono reprezentatywny przykład śladów PBD dla fotouwalniania wapnia z calcium DM nitro. Faza szybka odpowiada fotolizie calcium DM nitro i uwalnianiu wapnia, podczas gdy faza wolna odzwierciedla wiązanie wapnia do nienaświetlonej klatki. Przedstawiono tutaj ślad PBD dla asocjacji wapnia z domeną C-końcową neuronalnego sensora wapnia downstream regulatory element antagonist, regulator, or dream po fotodysocjacji wapnia.

Uwolniony w wyniku naświetlania ligand wiąże się z domeną C-końcową białka dream ze stałą czasową 1,3 ± 0,3 ms w temperaturze 20 °C, co określono na podstawie zależności stałej szybkości obserwowanej od temperatury. Bariera aktywacji dla wiązania wapnia z domeną C-końcową białka dream została określona na 9,2 ± 0,4 kcal/mol. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pomiary śladów PBD próbek przeprowadzać w warunkach identycznych z warunkami dla referencji.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat przygotowania próbki, kalibracji aparatury oraz analizy danych w celu uzyskania powtarzalnego parametru termodynamicznego.