Name: Submilisekundowe zmiany konformacyjne w białkach rozwiązane przez odchylenie wiązki fototermicznej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 2 s
Description: Poznaj technikę odchylenia wiązki fototermicznej do badania submilisekundowych zmian konformacyjnych w białkach wiążących wapń. Metoda umożliwia jednoczesne wykrywanie zmian objętości i entropii w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez National Science Foundation (MCB 1021831, JM) oraz J. & E. Biomedical Research Program (Departament Zdrowia Florydy, JM).

1. Przygotowanie próbek
<ol>
	<li>Przygotowanie próbek oraz wszystkie manipulacje z nimi należy przeprowadzać w ciemni, aby zapobiec niezamierzonej fotolizie (uncaging).</li>
	<li>Rozpuścić DM-nitrophen ((1-(2-nitro-4,5-dimetoksyfenyl)-N,N,N',N'-tetrakis [(oksy-karbonylo) metylo]-1,2-etanodiaminę) w buforze 50 mM HEPES, 100 mM KCl, pH 7,0 do stężenia końcowego 400 µM (ε350nm = 4330 M-1cm-1 9).</li>
	<li>Dodać CaCl2 z roztworu zapasowego 0,1 M, aby uzyskać pożądany stosunek [Ca2+]:[DM-nitrophen]. Dla białek o wartości Kd dla asocjacji Ca2+ większej niż 10 µM, preferowany jest stosunek [Ca2+]:[DM-nitrophen] wynoszący 1:1, aby zapobiec wiązaniu fotouwolnionego Ca2+ z uwolnionym DM-nitrophenem. Rzeczywiście, przyjmując wartość Kd dla DM-nitrophen na poziomie 10 nM oraz całkowite stężenie DM-nitrophen i Ca2+ wynoszące 400 mM, około 90% białka wiążącego wapń o Kd = 10 μM będzie w formie apo. Z kolei w przypadku badania wiązania Ca2+ z białkami o Kd &lt; 10 µM, zaleca się zmniejszenie stosunku [Ca2+]:[DM-nitrophen] do 0,95, aby zapobiec kompleksowaniu Ca2+ z apo-białkiem przed fotodysocjacją klatki.</li>
	<li>Rozpuścić związek referencyjny, K3[Fe(III)(CN)6] lub Na2CrO4, w tym samym buforze, co w przypadku próbki.</li>
</ol>
2. Przygotowanie eksperymentu
<ol>
	<li>Podstawowa konfiguracja eksperymentalna przedstawiona jest na Rysunku 2.</li>
	<li>Należy użyć otworu przepustowego (P2), aby dostosować średnicę wiązki próbną (wyjście lasera He-Ne 632 nm, moc lasera ~5 mW) do 1 mm i przeprowadzić wiązkę próbną przez środek kuwety umieszczonej w uchwycie z kontrolą temperatury, wykorzystując lustro M1.</li>
	<li>Należy użyć lustra (M2) za próbką, aby wycentrować wiązkę próbną na środku detektora czułego na pozycję.</li>
	<li>Wiązkę próbną należy skupić na środku detektora w taki sposób, aby różnica napięć między dwiema górnymi a dwiema dolnymi diodami, a także różnica napięć między dwiema diodami po lewej i prawej stronie detektora wynosiła zero.</li>
	<li>Następnie należy uformować średnicę wiązki pompową (wyjście lasera Nd:YAG z przełączaniem Q 355 nm, FWHM 5 nsec), używając otworu przepustowego 3 mm (P1) umieszczonego pomiędzy dwoma lustrami lasera 355 nm.</li>
	<li>Wiązkę pompową należy przeprowadzić współbieżnie przez środek kuwety, zgodnie z Rysunkiem 2. Ważne jest, aby obie wiązki laserowe przechodziły przez środek ogniwa optycznego w sposób niemal koliniowy, aby uzyskać mierzalny kąt odchylenia, a tym samym wysoką amplitudę sygnału PBD. W warunkach eksperymentalnych kąt przecięcia się wiązki próbnej i pompowej wynosi mniej niż 15°.</li>
	<li>Należy użyć związku referencyjnego do wyrównania wiązki próbnej i pompowej w celu uzyskania satysfakcjonującego sygnału PBD, tj. dobrego stosunku S/N i stabilnej amplitudy PBD w dłuższych skalach czasowych (~100 msec).</li>
	<li>Pozycję wiązki pompowej względem wiązki próbnej należy regulować poprzez stopniową korektę luster lasera 355 nm.</li>
	<li>Amplitudę referencyjnego sygnału PBD mierzy się jako różnicę między dwiema górnymi a dolnymi fotodiodami na detektorze czułym na pozycję. Sygnał PBD powinien wykazywać gwałtowny wzrost amplitudy w krótkiej skali czasowej (&lt;10 µsec) i pozostawać stabilny w skali 100 msec, jak pokazano na Rysunku 3. Zmienność amplitudy PBD z impulsu na impuls mieści się w granicach 5% amplitudy sygnału, a na powtarzalność sygnału wpływają głównie wibracje.</li>
	<li>Liniowość amplitudy sygnału PBD w stosunku do wydzielonej energii cieplnej należy sprawdzić, mierząc liniową zależność sygnału PBD od mocy lasera wzbudzającego oraz od liczby pochłoniętych Einsteinów, Ea = (1-10-A), gdzie A odpowiada absorbancji referencyjnej przy długości fali wzbudzenia.</li>
	<li>Aby zapobiec absorpcji wielofotonowej oraz spadkowi mocy wiązki pompowej i zapewnić liniowość sygnału PBD, moc lasera należy utrzymywać poniżej około 1,000 µJ, a absorbancję próbki/związku referencyjnego przy długości fali wzbudzenia poniżej 0,5.</li>
</ol>
3. Pomiary PBD
<ol>
	<li>Rozpocząć od pomiaru śladów PBD dla wzorca. Umieścić roztwór związku wzorcowego w kwarcowej kuciecie o wymiarach 1,0 cm x 1,0 cm lub 1,0 cm x 0,5 cm i umieścić kuwetę w uchwycie z kontrolą temperatury. Obie długości drogi optycznej zapewniają porównywalną amplitudę PBD.</li>
	<li>Wykryć sygnał PBD dla wzorca w funkcji temperatury w zakresie od 16-35 °C z przyrostem temperatury wynoszącym 3 °C.</li>
	<li>Po każdej zmianie temperatury sprawdzić pozycję wiązki sondy na detektorze pozycyjnie czułym i w razie potrzeby ponownie ustawić ją na środku detektora.</li>
	<li>Sprawdzić liniowość sygnału PBD w funkcji członu [(dn/dt)/Cpρ] zgodnie z Równaniem 2.</li>
	<li>Umieścić roztwór próbki w tej samej kuciecie optycznej, co w przypadku związku wzorcowego, zachowując tę samą orientację kuwety, co podczas pomiaru wzorca.</li>
	<li>Wykryć ślady PBD próbki w tym samym zakresie temperatur, co dla wzorca, i sprawdzić liniowość amplitudy PBD próbki względem członu [(dn/dt)/Cpρ].</li>
</ol>
4. Analiza danych
Wielkość ugięcia jest bezpośrednio proporcjonalna do zmiany objętości wynikającej z nagrzewania próbki (ΔVth) oraz nietermicznej zmiany objętości (ΔVnonth) zgodnie z Równaniem 1: <img src="/files/ftp_upload/50969/50969eq1.jpg" alt="Równanie ilustrujące analizę zmiany objętości, ΔV, w układzie chemicznym, przedstawiające składowe objętości ΔVth i ΔVnonth." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Equation 1"> 
Amplitudę sygnału PBD próbki (AS) oraz referencji (Ar) można opisać odpowiednio za pomocą Równania 2 i 3.
 <img src="/files/ftp_upload/50969/50969eq2.jpg" alt="Równowaga statyczna; równanie; AS=KEa[(dn/dt)(1/ρCp)Q+ρ(dn/dp)ΔVnonth+Δnabs]." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Equation 2"> 
 <img src="/files/ftp_upload/50969/50969eq3.jpg" alt="Równanie dyfuzyjności cieplnej; wzór: Aᵗ = KEₐEₙ[(dn/dt)(1/ρCₚ)]; stosowane w badaniach nad przekazywaniem ciepła." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Equation 3"> 

Sygnał PBD jest wprost proporcjonalny do parametru odpowiedzi urządzenia (K) oraz liczby pochłoniętych jednostek Einsteina (Ea). Pierwszy człon w równaniu 2, (dn/dt)(1/ρCp)Q, odpowiada zmianie sygnału wynikającej z ciepła oddanego do rozpuszczalnika. Człon dn/dt reprezentuje zależną od temperatury zmianę współczynnika załamania światła, ρ to gęstość rozpuszczalnika, a Cp to pojemność cieplna. Wszystkie parametry dla wody destylowanej są znane i mogą zostać określone dla roztworu buforowego poprzez porównanie sygnału PBD dla związku referencyjnego w wodzie destylowanej i w odpowiednim buforze. Q to ilość ciepła oddanego do rozpuszczalnika. Człon ρ (dn/d ρ ) jest bezwymiarową stałą, która w zakresie temperatur od 10-40 °C jest niezależna od temperatury 10. Człon Δnabs odpowiada zmianie współczynnika załamania światła wynikającej z obecności gatunków absorbujących w roztworze i jest pomijalny, jeśli długość fali wiązki badawczej jest przesunięta względem widm absorpcyjnych jakichkolwiek gatunków w roztworze. Sygnał pochodzący od związku referencyjnego (Ar) jest wyrażony w równaniu 3, gdzie Ehν to energia fotonu przy długości fali wzbudzenia; Ehν = 80.5 kcal/mol dla wzbudzenia przy 355 nm.
<ol>
	<li>Przyjmij amplitudę referencyjnego sygnału PBD jako różnicę między sygnałem PBD przed wyzwalaczem a sygnałem po wyzwalaczu, zgodnie z przedstawionym na Rysunku 3. W podobny sposób wyznacz amplitudę fazy szybkiej (Asfast) i powolnej (Asslow) sygnału PBD próbki.</li>
	<li>Aby wyeliminować parametr odpowiedzi instrumentu, K, przeskaluj amplitudę sygnału PBD próbki przez amplitudę sygnału PBD dla referencji. Stosunek sygnału próbki do sygnału referencyjnego daje Równanie 4 i może być zapisany jako:
	 <img src="/files/ftp_upload/50969/50969eq4.jpg" alt="Równanie termodynamiczne 4, analiza zmian ciśnienia i objętości w kontekście eksperymentalnym." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Równanie 4"> </li>
	<li>Korzystając z tego równania, wyznacz ciepło oddane do roztworu (Q) oraz nietermiczną zmianę objętości (ΔVnonth) związaną z reakcją fotoinicjowaną, odpowiednio z nachylenia i punktu przecięcia wykresu zależności składnika [(As/Ar) Ehν] od składnika zależnego od temperatury [(dn/dt)(1/ρCp)].</li>
	<li>Aby wyznaczyć objętość reakcji i zmianę entalpii dla procesu szybkiego i powolnego, przeskaluj zaobserwowaną zmianę objętości i entalpii do odpowiedniej wydajności kwantowej zgodnie z Równaniami 5-7.
		 <img src="/files/ftp_upload/50969/50969eq5.jpg" alt="Wzór termodynamiczny ΔH=Eₙ-Q/Φ, stosowany w obliczeniach entalpii i analizie przekazywania ciepła." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Równanie 5"> 
		 <img src="/files/ftp_upload/50969/50969eq6.jpg" alt="Równanie przekazywania ciepła ΔH_slow=-Q/Φ; wzór termodynamiczny do analizy absorpcji energii." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Równanie 6"> 
		 <img src="/files/ftp_upload/50969/50969eq7.jpg" alt="Wzór równowagi statycznej ΔV=ΔVnonthr/Φ w kontekście równania dla studiów edukacyjnych." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Równanie 7"> 
		 W przypadku procesu wieloetapowego z kinetyką przebiegającą w skali czasowej od 10 µsec do 200 msec można wyznaczyć zmiany objętości i entalpii związane z poszczególnymi etapami reakcji. Amplitudy i czasy życia dla poszczególnych etapów analizuje się poprzez dopasowanie danych do funkcji F(t), która opisuje profil czasowy zmian objętości i entalpii. 
			<img alt="Absorpcja przejściowa, wzór F(t)=α₀+Σαᵢ[1-exp(-t/τᵢ)], równanie w badaniach naukowych." src="/files/ftp_upload/50969/50969eq8.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Równanie 8"> 
		gdzie α0 odpowiada Asfast, a αi odpowiada Asslow dla każdego poszczególnego procesu, a τ i to czas życia poszczególnych etapów reakcji. Z zależności stałej szybkości dla poszczególnych procesów (ki = 1/τi) od temperatury można łatwo wyznaczyć parametry entalpii i entropii aktywacji, korzystając z wykresów Eyringa.</li>
</ol>

<ol><li>Gensch, T., Viappiani, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-resolved+photothermal+methods%3A+accessing+time-resolved+thermodynamics+of+photoinduced+processes+in+chemistry+and+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem.+Photobiol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Time-resolved photothermal methods: accessing time-resolved thermodynamics of photoinduced processes in chemistry and biology.</a> Photochem. Photobiol. Sci. 2, 699-721 (2003).</li>
<li>Larsen, R. W., Mikšovská, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+resolved+thermodynamics+of+ligand+binding+to+heme+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Coord.+Chem.+Rev%22%5BJournal%5D)">Time resolved thermodynamics of ligand binding to heme proteins.</a> Coord. Chem. Rev. 251 (9-10), 1101-1127 (2007).</li>
<li>Westrick, J. A., Peters, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+photoacoustic+calorimetric+study+of+horse+myoglobin%5BTitle%5D)+AND+%22Bioph.+Chem%22%5BJournal%5D)">A photoacoustic calorimetric study of horse myoglobin.</a> Bioph. Chem. 37 (1-3), 73-79 (1990).</li>
<li>Belogortseva, N., Rubio, M., Terrell, W., Miksovska, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+contribution+of+heme+propionate+groups+to+the+conformational+dynamics+associated+with+CO+photodissociation+from+horse+heart+myoglobin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Inorg.+Biochem%22%5BJournal%5D)">The contribution of heme propionate groups to the conformational dynamics associated with CO photodissociation from horse heart myoglobin.</a> J. Inorg. Biochem. 101 (7), 977-986 (2007).</li>
<li>Mikšovská, J., Suquet, C., Satterlee, J. D., Larsen, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Conformational+Changes+Coupled+to+Ligand+Photodissociation+from+the+Heme+Binding+Domain+of+FixL%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Characterization of Conformational Changes Coupled to Ligand Photodissociation from the Heme Binding Domain of FixL.</a> Biochemistry. 44 (30), 10028-10036 (2005).</li>
<li>Miksovska, J., Gennis, R. B., Larsen, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photothermal+studies+of+CO+photodissociation+from+mixed+valence+Escherichia+coli+cytochrome+bo3%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Photothermal studies of CO photodissociation from mixed valence Escherichia coli cytochrome bo3.</a> FEBS Lett. 579 (14), 3014-3018 (2005).</li>
<li>Losi, A., Michler, I., Gärtner, W., Braslavsky, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-resolved+Thermodynamic+Changes+Photoinduced+in+5%2C12-trans-locked+Bacteriorhodopsin.+Evidence+that+Retinal+Isomerization+is+Required+for+Protein+Activation%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem.+Photobiol%22%5BJournal%5D)">Time-resolved Thermodynamic Changes Photoinduced in 5,12-trans-locked Bacteriorhodopsin. Evidence that Retinal Isomerization is Required for Protein Activation.</a> Photochem. Photobiol. 72, 590-597 (2000).</li>
<li>Kondoh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-Induced+Conformational+Changes+in+Full-Length+Arabidopsis+thaliana+Cryptochrome%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Light-Induced Conformational Changes in Full-Length Arabidopsis thaliana Cryptochrome.</a> J. Mol. Biol. 413 (1), 128-137 (2011).</li>
<li>Kaplan, J. H., Ellis-Davies, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photolabile+chelators+for+the+rapid+photorelease+of+divalent+cations%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Photolabile chelators for the rapid photorelease of divalent cations.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85 (17), 6571-6575 (1988).</li>
<li>Eisenberg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Equation+for+the+Refractive+Index+of+Water%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chem.+Phys%22%5BJournal%5D)">Equation for the Refractive Index of Water.</a> J. Chem. Phys. 43 (11), 3887-3892 (1965).</li>
<li>Ellis-Davies, G. C., Kaplan, J. H., Barsotti, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+photolysis+of+caged+calcium%3A+rates+of+calcium+release+by+nitrophenyl-EGTA+and+DM-nitrophen%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Laser photolysis of caged calcium: rates of calcium release by nitrophenyl-EGTA and DM-nitrophen.</a> Biophys. J. 70, 1006-1016 (1996).</li>
<li>Miksovska, J., Larsen, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-function+relationships+in+metalloproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Structure-function relationships in metalloproteins.</a> Methods Enzymol. 360, 302-329 (2003).</li>
<li>Miksovska, J., Norstrom, J., Larsen, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermodynamic+profiles+for+CO+photodissociation+from+heme+model+compounds%3A+effect+of+proximal+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Inorg.+Chem%22%5BJournal%5D)">Thermodynamic profiles for CO photodissociation from heme model compounds: effect of proximal ligands.</a> Inorg. Chem. 44 (4), 1006-1014 (2005).</li>
<li>Dhulipala, G., Rubio, M., Michael, K., Miksovska, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermodynamic+profile+for+urea+photo-release+from+a+N-%282-nitrobenzyl%29+caged+urea+compound%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem.+Photobiol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Thermodynamic profile for urea photo-release from a N-(2-nitrobenzyl) caged urea compound.</a> Photochem. Photobiol. Sci. 8, 1157-1163 (2009).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Zasada fizyczna metod fototermicznych polega na tym, że fotowzbudzona cząsteczka rozprasza nadmiar energii poprzez relaksację wibracyjną do stanu podstawowego, co powoduje termiczne podgrzanie otaczającego rozpuszczalnika1,12. W przypadku rozpuszczalników, takich jak woda, powoduje to szybkie rozszerzanie objętości (ΔVth). Cząsteczki w stanie wzbudzonym mogą również ulegać procesom fotochemicznym, które powodują nietermiczne zmiany objętości (ΔVnonth) z powodu rozszczepienia/tworzenia wią...

Metody fototermiczne, takie jak kalorymetria fotoakustyczna, fototermiczne odchylanie wiązki (PDB) i przejściowe siatkowanie w połączeniu z nanosekundowym wzbudzeniem laserowym, stanowią potężną alternatywę dla przejściowych spektroskopii optycznych dla czasowo-rozdzielczych badań krótkożyciowych produktów pośrednich1,2. W przeciwieństwie do technik optycznych, takich jak absorpcja przejściowa i spektroskopia w podczerwieni, które monitorują profil czasowy zmian absorpcji w otoczeniu chromoforu; Techniki fototermiczne wykrywają zależność czasową zmian ciepła/objętości i dlatego są cennymi narzędziami do badania profili czasowych optycznie "cichych" procesów. Do tej pory kalorymetria fotoakustyczna i siatka przejściowa były z powodzeniem stosowane do badania dynamiki konformacyjnej procesów fotoindukowanych, w tym dwuatomowej migracji ligandów w globinach3,4, oddziaływań ligandów z białkiem czujnika tlenu FixL5, transportu elektronów i protonów w oksydazach hemowo-miedziowych6 i fotosystemie II, a także fotoizomeryzacji w rodopsyny7 i dynamiki konformacyjnej w kryptochromie8.
Aby rozszerzyć zastosowanie technik fototermicznych do systemów biologicznych, które nie posiadają wewnętrznego chromoforu i/lub fluoroforu, technika PBD została połączona z użyciem związku w klatce, aby fotowywołać wzrost stężenia liganda/substratu w ciągu kilku mikrosekund lub szybciej, w zależności od związku w klatce. Podejście to pozwala na monitorowanie dynamiki i energetyki zmian strukturalnych związanych z wiązaniem liganda/substratu z białkami, które nie mają wewnętrznego fluoroforu lub chromoforu i w skali czasowej, która nie jest dostępna dla komercyjnych instrumentów zatrzymujących przepływ. W artykule przedstawiono zastosowanie PBD do monitorowania termodynamiki związku klatkowego, Ca2 + DM-nitrofenu, fotorozszczepienia, a także kinetyki asocjacji Ca2 + z domeną C-końcową neuronalnego czujnika wapnia Modulator Antagonisty Elementu Regulatorowego (DREAM). Ca2+ jest fotouwalniany z Ca2 + DM-nitrofenu w ciągu 10 μs i ponownie wiąże się z niefotolizowaną klatką o stałej czasowej ~300 μs. Z drugiej strony, w obecności apoDREAM obserwuje się dodatkową kinetykę występującą w milisekundowej skali czasowej, która odzwierciedla wiązanie liganda z białkiem. Zastosowanie PBD do badania przemian konformacyjnych w systemach biologicznych zostało w pewien sposób ograniczone ze względu na trudności instrumentalne; np. żmudne ustawienie sondy i wiązki pompy w celu uzyskania silnego i powtarzalnego sygnału PBD. Jednak skrupulatne zaprojektowanie konfiguracji oprzyrządowania, precyzyjna kontrola temperatury oraz staranne ustawienie sondy i wiązki pompy zapewniają spójny i solidny sygnał PBD, który umożliwia monitorowanie czasowo rozdzielonych zmian objętości i entalpii w szerokiej skali czasowej od 10 μs do około 200 ms. Ponadto modyfikacje procedury eksperymentalnej w celu zapewnienia wykrycia próbek i śladów odniesienia w identycznej temperaturze, składzie buforu, orientacji ogniwa optycznego, mocy lasera itp. znacznie zmniejszają błąd doświadczalny w mierzonych objętościach reakcji i entalpiach.

<table><tbody><tr><td>1-(4,5-dimetoksy-2-nitrofenylo)-1,2-diaminoetan-N,N,N&#039;,N&#039; -Tetraoctowy kwas</td><td>Life Technologies</td><td>D-6814</td><td>DM-nitrofen, klatkowy związek wapnia, roztwory podstawowe należy przechowywać w ciemności, aby zapobiec fotodysocjacji</td></tr><tr><td>Kwas 4-(2-hydroksyetylo)piperazyno-1-etanosulfonowy, N-(2-hydroksyetylo)piperazyna-N&prime; -(kwas 2-etanosulfonowy)</td><td>Sigma Adrich</td><td>0909C</td><td>Bufor HEPES</td></tr><tr><td>Żelazocyjanek potasu (III)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>702587</td><td>związek referencyjny do pomiarów PBD</td></tr><tr><td>Chromian sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>307831</td><td>związek referencyjny do pomiarów PBD</td></tr><tr><td>Dioda laserowa He-Ne 5 mW 635 nm</td><td>Edmund Optics</td><td>54-179</td><td>zastosowanie jako wiązka sondy do pomiarów PBD</td></tr><tr><td>Oscyloskop,&nbsp;</td><td>LeCroy</td><td>Wave Surfer 42Xs</td><td>400 MHz pasmo</td></tr> z <tr><td>laserem Nd:YAG</td><td>Continuum</td><td>ML II</td><td>wiązka pompy do pomiarów PBD</td></tr><tr><td>M355; Lustro laserowe Nd:YAG</td> Zwierciadło <td>laserowe Edmund Optics</td><td>47-324</td><td>do linii laserowej 355 nm</td></tr><tr><td>M1 i M2; Lustro diody laserowej</td><td>Edmund Optics</td><td>43-532</td><td>wijące płaskie zwierciadło laserowe, zakres długości fal 300-700 nm</td></tr><tr><td>P1 i P2; Przysłona irysowa</td><td>Edmund Optics</td><td>62-649</td><td>otwór na pin do kształtowania sondy i wiązki pum</td></tr><tr><td>L1; soczewka dwuwypukła</td><td>Thorlabs</td><td>LB1844</td><td>soczewka do ogniskowania wiązki sondy na detektorze, EFL 50 mm, zakres długości fal 350-2,000 nm</td></tr><tr><td>DM, zwierciadło dichroiczne</td><td>Thorlabs</td><td>DMLP505</td><td>długoprzepustowe zwierciadło dichroiczne o długości fali granicznej 505 nm</td></tr><tr><td>F1; Filtr krawędziowy</td><td>Andower</td><td>500FH90-25</td><td>filtr długoprzepustowy o długości fali granicznej 500 nm</td></tr><tr><td>Uchwyt kuwety z kontrolowaną temperaturą</td><td>Quantum Northwest</td><td>FLASH 300</td><td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

submilisekundowe zmiany konformacyjne w białkach rozwiązane przez odchylenie wiązki fototermicznej

Submillisecond Conformational Changes in Proteins Resolved by Photothermal Beam Deflection

Odchylanie wiązki fototermicznej wraz z kalorymetrią fotoakustyczną i siatką termiczną należy do rodziny metod fototermicznych, które monitorują zmiany profilu czasowego, objętości i entalpii zmian konformacyjnych w białkach wywołanych światłem w mikrosekundowych do milisekundowych skalach czasowych, które nie są dostępne przy użyciu tradycyjnych przyrządów do zatrzymywania przepływu. Ponadto, ponieważ badane są ogólne zmiany objętości i/lub entalpii, techniki te można zastosować do białek i innych biomakrocząsteczek, które nie mają etykiety fluoroforowej i/lub chromoforowej. Do monitorowania dynamiki i energetyki zmian strukturalnych związanych z wiązaniem Ca2+ z przetwornikami wapnia, takie neuronalne czujniki wapnia, związek wapnia w sadzce, DM-nitrofen, jest używany do fotowyzwalania szybkiego (τ < 20 μs) wzrostu stężenia wolnego wapnia, a związane z tym zmiany objętości i entalpii są badane za pomocą techniki odchylania wiązki fototermicznej.

Reprezentatywny przykład śladów PBD dla fotoutwalniania Ca2+ z Ca2+DM-nitrophenu przedstawiono na Rysunku 3. Faza szybka odpowiada fotolizie Ca2+DM-nitrophenu i uwalnianiu Ca2+, natomiast faza wolna odzwierciedla wiązanie Ca2+ do niefotolizowanego klatkowanego związku. Wykresem amplitudy PBD próbki dla fazy szybkiej i wolnej, przeskalowanej do amplitudy związku referencyjnego, w funkcji czynnika zależnego od temperatury [Cpρ/(dn/dt)] zgodn...

Tutaj opisujemy zastosowanie techniki odchylania wiązki fototermicznej w połączeniu z umieszczonym w klatce związkiem wapnia, DM-nitrofenem, do monitorowania dynamiki mikrosekund i milisekund oraz energetyki zmian strukturalnych związanych ze związkiem wapnia z neuronalnym czujnikiem wapnia, Modulatorem Antagonisty Elementu Regulatorowego.

Submilisekundowe zmiany konformacyjne w białkach rozwiązane przez odchylenie wiązki fototermicznej

Photothermal beam deflection together with photo-acoustic calorimetry and thermal grating belongs to the family of photothermal methods that monitor the ...

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest charakterystyka zmian konformacyjnych związanych z wiązaniem liganda przez przetworniki wapniowe w skali submilisekundowej. Przejście konformacyjne między białkiem APO a białkiem związanym z wapniem jest wyzwalane przez fotolizę klatkowanego związku wapnia, calcium DM nitro, co prowadzi do fotouwolnienia wolnego wapnia. Powiązana ze sobą zmiana współczynnika odbicia jest mierzona jako przemieszczenie wiązki sondy przy użyciu detektora czteropunktowego czułego na pozycję.Następnie pomiarowo wyznacza się przebiegi odchylenia wiązki fototermicznej w funkcji temperatury zarówno dla próbki, jak i wzorca. Analiza złożona przebiegów odchylenia wiązki fotonicznej pozwala na zrozumienie mechanizmu indukowanego wapniem przełączania konformacyjnego pod kątem zmian objętości reakcji i entalpii. Główną zaletą odchylenia wiązki fototermicznej w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak top flow, jest fakt, że technika ta umożliwia jednoczesną detekcję zmian objętości i entropii w skali czasowej poniżej milisekundy.Wizualna demonstracja tej techniki jest niezbędna, ponieważ precyzyjne ustawienie instrumentu ma krytyczne znaczenie dla odzyskania parametrów termodynamicznych. Procedurę zademonstruje Walter Gonzalez, doktorant z mojego laboratorium. Przygotowanie próbek oraz wszelkie manipulacje nimi należy przeprowadzać w ciemni, aby zapobiec niepożądanemu uwalnianiu cząsteczek z klatek (uncaging). W niniejszym filmie kroki są prezentowane w świetle na potrzeby filmowania.W celu rozpoczęcia należy rozpuścić DN Nitro w buforze HEPS 50 mM z dodatkiem 100 mM chlorku potasu, pH 7,0, do końcowego stężenia 400 µM. Dodać chlorek wapnia z roztworu stokowego 0,1 M, aby uzyskać pożądany stosunek stężenia jonów wapnia do DN Nitro. Następnie należy rozpuścić związek referencyjny – cyjanek potasu lub chromian sodu – w tym samym buforze.W odniesieniu do próbki należy zapoznać się z protokołem tekstowym w celu zapoznania się ze schematem podstawowej konfiguracji eksperymentalnej dla fototermalnego odchylenia wiązki. Podczas przygotowywania eksperymentu należy przeprowadzić wiązkę badawczą przez środek kuwety umieszczonej w uchwycie do kuwet z kontrolą temperatury. Następnie, używając otworu dyskowego (pinhole), należy dostosować średnicę wiązki badawczej do 1 mm, a następnie wykorzystać drugie lustro za próbką, aby wycentrować wiązkę badawczą na środku detektora pozycyjnego.Skup wiązkę sondy na środku detektora w taki sposób, aby różnica napięć między dwiema górnymi a dwiema dolnymi diodami, a także różnica napięć między dwiema diodami po lewej i prawej stronie detektora wynosiła zero. Następnie ukształt średnicę wiązki pompowania, emitowanej z lasera ND YAG o długości fali 355 nanometrów. Wykorzystując otwór o średnicy 3 mm umieszczony pomiędzy dwoma lustrami lasera 355 nanometrów, przeprowadź wiązkę pompowania współbieżnie przez środek vete.Ważne jest, aby obie wiązki laserowe propagowały przez środek celi optycznej w sposób niemalże kolinearny. Aby uzyskać mierzalny kąt odchylenia, a tym samym wysoką amplitudę fototermalnego odchylenia wiązki lub sygnału PBD, należy użyć związku referencyjnego do wyrównania wiązki badającej i wzbudzającej, tak aby osiągnąć satysfakcjonujący sygnał PBD charakteryzujący się dobrym stosunkiem sygnału do szumu oraz stabilną amplitudą PBD w dłuższych przedziałach czasowych. Następnie należy ustawić pozycję wiązki wzbudzającej względem wiązki badającej poprzez stopniową regulację luster lasera 355 nanometer.Zmierz amplitudę sygnału referencyjnego PBD jako różnicę między górną a dolną fotodiodą w detektorze czułym na pozycję. Sygnał PBD powinien wykazywać gwałtowny wzrost amplitudy w krótkiej skali czasowej i pozostawać stabilny w skali 100 milisekund. Sprawdź liniowość amplitudy sygnału PBD w stosunku do uwolnionej energii cieplnej, mierząc liniową zależność sygnału PBD od mocy lasera wzbudzającego oraz od liczby pochłoniętych kwantów Einsteina.Należy utrzymać moc lasera poniżej około 1000 micro joules, aby zapobiec absorpcji wielofotonowej. Należy również zadbać, aby absorbancja próbki lub związku referencyjnego przy długości fali wzbudzenia była mniejsza niż 0,5, aby zapobiec spadkowi mocy wiązki pompy. Kroki te zapewnią liniowość sygnału PBD.Rozpocznij od pomiaru śladów PBD. W celu uzyskania referencji umieść roztwór związku referencyjnego w kuwecie kwarcowej, a następnie umieść kuwetę w uchwycie z kontrolą temperatury. Wykryj referencyjny sygnał PBD w funkcji temperatury w zakresie od 16 do 35 °C z przyrostem temperatury wynoszącym trzy stopnie Celsjusza.Przy każdej zmianie temperatury należy sprawdzić położenie wiązki sondy na detektorze czułym na położenie i ponownie wycentrować ją względem detektora. W razie potrzeby należy sprawdzić liniowość sygnału PBD zgodnie z opisem w protokole tekstowym.Następnie umieść roztwór próbki w tej samej celi optycznej, której użyto dla związku referencyjnego, zachowując tę samą orientację celi optycznej co podczas pomiaru referencyjnego. Przejdź do detekcji śladów PBD próbki w tym samym zakresie temperatur, co w przypadku referencji, i sprawdź liniowość amplitudy PBD próbki. Przyjmij amplitudę sygnału PBD referencyjnego jako różnicę między sygnałem PBD przed wyzwalaniem (pre-trigger) a sygnałem PBD po wyzwalaniu (post-trigger).W podobny sposób wyznacz amplitudę fazy szybkiej i wolnej sygnału PBD próbki. Aby wyeliminować parametr odpowiedzi instrumentu, przeskaluj amplitudę sygnału PBD próbki względem amplitudy sygnału PBD referencyjnego. Dla wzorca stosunek sygnału próbki do sygnału referencyjnego daje równanie, z którego na podstawie nachylenia i punktu przecięcia wykresu stosunku amplitud pomnożonego przez energię względem członu zależnego od temperatury można wyznaczyć ciepło wydzielone do roztworu oraz nietermiczną zmianę objętości związaną z reakcją zainicjowaną foto-chemicznie; aby określić objętość reakcji i zmianę entalpii dla procesów szybkich i wolnych, przeskaluj zaobserwowaną zmianę objętości i entalpii do odpowiedniej wydajności kwantowej.Zgodnie z równaniami zamieszczonymi w protokole tekstowym, amplitudy i czasy życia dla poszczególnych etapów analizuje się poprzez dopasowanie danych do funkcji zależnej od czasu, która opisuje zmiany objętości i entalpii. Amplituda szybkiego etapu odpowiada amplitudzie fazy natychmiastowej sygnału PBD próbki, a amplituda kolejnego etapu odpowiada amplitudzie fazy powolnej sygnału PBD próbki. Dla każdego pojedynczego procesu, na podstawie zależności stałej szybkości od temperatury dla poszczególnych procesów, parametry entalpii i entropii aktywacji można łatwo wyznaczyć przy użyciu wykresów IR.Przedstawiono reprezentatywny przykład śladów PBD dla fotouwalniania wapnia z calcium DM nitro. Faza szybka odpowiada fotolizie calcium DM nitro i uwalnianiu wapnia, podczas gdy faza wolna odzwierciedla wiązanie wapnia do nienaświetlonej klatki. Przedstawiono tutaj ślad PBD dla asocjacji wapnia z domeną C-końcową neuronalnego sensora wapnia downstream regulatory element antagonist, regulator, or dream po fotodysocjacji wapnia.Uwolniony w wyniku naświetlania ligand wiąże się z domeną C-końcową białka dream ze stałą czasową 1,3 ± 0,3 ms w temperaturze 20 °C, co określono na podstawie zależności stałej szybkości obserwowanej od temperatury. Bariera aktywacji dla wiązania wapnia z domeną C-końcową białka dream została określona na 9,2 ± 0,4 kcal/mol. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pomiary śladów PBD próbek przeprowadzać w warunkach identycznych z warunkami dla referencji.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat przygotowania próbki, kalibracji aparatury oraz analizy danych w celu uzyskania powtarzalnego parametru termodynamicznego.

submillisecond-conformational-changes-proteins-resolved-photothermal

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Submikrosekundowe zmiany konformacyjne w białkach rozdzielone za pomocą deflekcji wiązki fototermicznej

Kluczowe etapy funkcjonowania białka, w szczególności zmiany konformacyjne szkieletu i reakcje transferu protonów, często odbywają się w skali od mikrosekund do milisekund. Te dynamiczne procesy można badać za pomocą spektroskopii w podczerwieni z transformacją Fouriera ze skanowaniem czasowo-rozdzielczym, w szczególności w przypadku białek, których funkcja jest wyzwalana przez światło.

Transfer protonów i dynamika konformacji białek w białkach światłoczułych za pomocą spektroskopii w podczerwieni z transformacją Fouriera ze skanowaniem czasowym i transformacją Fouriera

Prezentujemy protokół tworzenia w czasie rzeczywistym filmu pakietu molekularnej fali rotacyjnej przy użyciu wysokorozdzielczego zestawu do obrazowania eksplozji kulombowskiej.

Bezpośrednie obrazowanie ultraszybkiej rotacji molekularnej sterowanej laserem

Tutaj prezentujemy protokoły analiz detekcji różnicowej czasowo-rozdzielczej spektroskopii oscylacyjnej w podczerwieni i dyfrakcji elektronów, które umożliwiają obserwacje deformacji lokalnych struktur wokół fotowzbudzonych cząsteczek w kolumnowym ciekłym krysztale, dając atomową perspektywę na związek między strukturą a dynamiką tego fotoaktywnego materiału.

Nowatorskie techniki obserwacji dynamiki strukturalnej fotoczułych ciekłych kryształów

Powodzenie eksperymentu z seryjną krystalografią femtosekundową z rozdzielczością czasową zależy od efektywnego dostarczania próbki. W tym miejscu opisujemy protokoły optymalizujące wytłaczanie mikrokryształów bakteriorodopsyny z wtryskiwacza do mikroekstruzji o wysokiej lepkości. Metodologia opiera się na homogenizacji próbki za pomocą nowatorskiego łącznika trójdrożnego i wizualizacji za pomocą szybkiej kamery.

Poprawa ekstruzji mikrokryształów o wysokiej lepkości w celu czasowo-rozdzielczej seryjnej krystalografii femtosekundowej w laserach rentgenowskich

Przedstawiamy protokół do unieruchamiania pojedynczych makrocząsteczek w urządzeniach mikroprzepływowych i ilościowego określania zmian w ich konformacji pod wpływem przepływu ścinającego. Protokół ten jest przydatny do charakteryzowania właściwości biomechanicznych i funkcjonalnych biomolekuł, takich jak białka i DNA, w środowisku przepływu.

Charakterystyka zmian konformacyjnych pojedynczych cząsteczek pod wpływem przepływu ścinającego za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Prezentujemy obszerny przewodnik po przygotowywaniu próbek do stałego celu, zbieraniu danych i przetwarzaniu danych dla szeregowej krystalografii synchrotronowej na linii badawczej Diamond I24.

Poprawiono zbieranie danych szeregowych celu w Diamond Light Source

Czasowo-rozdzielcze wzmocnienie fluorescencji pojedynczej cząsteczki jest użytecznym czujnikiem zbliżeniowym spektroskopowym fluorescencji, wrażliwym na lokalne zmiany strukturalne w białkach. Tutaj pokazujemy, że można go użyć do odkrycia stabilnych lokalnych konformacji w α-synukleinie, która jest inaczej znana jako kulisto nieustrukturyzowana i niestabilna, gdy jest mierzona za pomocą linijki FRET o większym zasięgu.

Wykorzystanie czasowo rozdzielczego wzmocnienia fluorescencji indukowanego białkiem w celu identyfikacji stabilnych lokalnych konformacji po jednym monomerze α-synukleiny na raz

Spektroskopia wstecznego rozpraszania neutronów oferuje nieniszczący i wolny od znaczników dostęp do dynamiki ps-ns białek i wody do ich hydratacji. Przebieg pracy przedstawiono w dwóch badaniach nad białkami amyloidowymi: nad czasowo-rozdzielczą dynamiką lizozymu podczas agregacji oraz nad dynamiką wody hydratacyjnej tau po tworzeniu włókien.

Spektroskopia neutronów o wysokiej rozdzielczości do badania dynamiki pikosekund-nanosekund białek i wody hydratacyjnej

Tutaj pokazujemy protokół obrazowania do obserwacji oddziaływań biomolekularnych za pomocą fototermicznego odsłuchu off-rezonansowego (PORT), gdzie zoptymalizowaliśmy parametry obrazowania, zidentyfikowaliśmy ograniczenia systemu i zbadaliśmy potencjalne ulepszenia w obrazowaniu montażu motywu DNA gwiazdy trzypunktowej.

Obrazowanie motywu trzypunktowej gwiazdy DNA za pomocą szybkiej mikroskopii sił atomowych Obrazowanie samoorganizacji motywu trójpunktowej gwiazdy za pomocą fototermicznego stukania rezonansowego

Tutaj prezentujemy protokół do badania lokalnej elastyczności i dynamiki biomolekuł za pomocą czasowo-rozdzielczej anizotropii fluorescencji na poziomie pojedynczej cząsteczki w trybie mikroskopii konfokalnej.

Anizotropia fluorescencji rozdzielczo-rozdzielczej z pojedynczych cząsteczek do charakteryzowania lokalnej elastyczności w biomolekułach

Plazmoniczne pęsety wykorzystują zlokalizowany powierzchniowy rezonans plazmonów w nanostrukturach złota, aby uwięzić pojedyncze nanocząsteczki, w tym białka, w polu optycznym o skali nanometrowej. Zmiany w rozproszonym sygnale ujawniają obecność białka i dynamikę konformacyjną, umożliwiając monitorowanie bez modyfikacji fluoroforu lub wiązania powierzchni.

Monitorowanie dynamiki konformacyjnej pojedynczych niemodyfikowanych białek za pomocą plazmonicznej pęsety

Poznaj technikę odchylenia wiązki fototermicznej do badania submilisekundowych zmian konformacyjnych w białkach wiążących wapń. Metoda umożliwia jednoczesne wykrywanie zmian objętości i entropii w czasie rzeczywistym.

Submilisekundowe zmiany konformacyjne w białkach rozwiązane przez odchylenie wiązki fototermicznej

Przeglądaj więcej filmów