Name: Analiza wideomorfometryczna niedotlenionego zwężenia naczyń płucnych tętnic wewnątrzpłucnych przy użyciu mysich precyzyjnie wyciętych plastrów płuc (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-14T14:15:00.000+00:00
Duration: 13 min 32 s
Description: Poznaj metodę analizy niedotlenionego zwężenia naczyń płucnych w mysich tętnicach wewnątrzpłucnych o średnicy 20–100 μm przy użyciu wideomorfometrii precyzyjnie wyciętych plastrów płuc.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie jest sponsorowane przez Excellence Cluster Cardio-Pulmonary System.

1. Przygotowanie mieszanin gazów, sprzętu, przyrządów i roztworów
Ta sekcja opisuje niezbędny sprzęt i ustawienia dla protokołu. Dodatkowe informacje i informacje o producencie można znaleźć w załączonej tabeli.
<ol>
	<li>Otrzymać lub przygotować następujące mieszaniny gazów:
		<ol>
			<li>Dwie butle z normoksyczną mieszaniną gazów składającą się z 21% O2, 5,3% CO2, 73,7% N2.</li>
			<li>Jedna butla z hipoksyjną mieszaniną gazów składającą się z 1% O2, 5,3% CO2 i 93,7% N2.</li>
		</ol>
	</li>
	<li>Zgromadź następujący ekwipunek:
		<ol>
			<li>Kuchenka mikrofalowa do topienia agarozy.</li>
			<li>Szafa grzewcza, do wypłukiwania agarozy z odcinków płuc (patrz poniżej). Włóż rurkę podłączoną do butelki z normoksyczną mieszaniną gazów do szafki.</li>
			<li>Wibratom z odpowiednimi żyletkami, do krojenia płuc na plastry o grubości 200 μm. Jest to korzystne, jeśli wibratom jest wyposażony w zestaw chłodniczy do schładzania bufora w basenie wibratomu.</li>
			<li>Przepływowa komora superfuzyjna zamontowana na odwróconym mikroskopie, do analizy HPV tętnic wewnątrzpłucnych.
				<ol>
					<li>Aby ułatwić mocowanie odcinków płuc do dna komory, połącz nylonowe struny z platynowym pierścieniem (samodzielnie skonstruowanym). Połączyć komorę perfuzyjną z pompą perystaltyczną o natężeniu przepływu dostosowanym odpowiednio do 0,7 ml/min i 6 ml/min.</li>
					<li>Zmontuj sprzęt w taki sposób, aby podczas eksperymentów pożywki były przechowywane w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C i bąbelkowane gazem normoksycznym lub hipoksyjnym za pomocą kaniul 21 G x 4 3/4. Dodatkowo należy użyć drugiego przyłącza z butli gazowej, aby umożliwić wprowadzenie mieszanin gazów normoksycznych/hipoksyjnych do przestrzeni powietrznej komory perfuzyjnej. Upewnij się, że wszystkie rurki tego systemu są gazoszczelne.</li>
				</ol>
			</li>
			<li>Kamera CCD zamontowana na pionowym mikroskopie odwróconym do rejestrowania obrazów analizowanej tętnicy.</li>
			<li>Przygotuj następujące instrumenty:
				<ol>
					<li>Do przygotowania płuc: sterylny zestaw preparacyjny zawierający szorstkie nożyczki i dwie pary kleszczy, cienkie nożyczki do otwierania klatki piersiowej, mikronożyczki do wycinania otworu w tchawicy w celu wypełnienia agarozy oraz bawełniany zestaw do szycia (około 20 cm) do podwiązania tchawicy w celu zapobieżenia odpływowi agarozy.</li>
					<li>W celu wypełnienia dróg oddechowych agarozą: podłączyć strzykawkę o pojemności 2 ml do elastycznej plastikowej rurki kaniuli dożylnej (20 G x 1 1/4).</li>
					<li>Do perfuzji płuc z buforem: umieścić strzykawkę o pojemności 50 ml jako zbiornik buforowy około 40 cm powyżej miejsca pracy dla preparatu dla myszy.</li>
					<li>W celu wypływu buforu: podłączyć strzykawkę do rurki, do której podłączona jest kaniula 25 G x 1. Użyj zacisku na probówce, aby wyregulować odpływ do około 1 kropli/s (około 0,3-0,4 ml/min).</li>
				</ol>
			</li>
			<li>Przygotuj następujące i pożywki:
				<ol>
					<li>Przygotować 1 000 ml buforu HEPES-Ringer (10 mM HEPES, 136,4 mM NaCl, 5,6 mM KCl, 1 mM MgCl2•6H2O, 2,2 mM CaCl2•2H2O, 11 mM glukozy, pH 7,4). Przechowywać sterylny przefiltrowany bufor (wielkość porów filtra: 0,2 μm) w temperaturze 4 °C.</li>
				</ol>
			</li>
			<li>Na około 30 minut przed rozpoczęciem izolacji płuc należy przygotować następujące roztwory:
				<ol>
					<li>Rozpuść 1,5% w/v agarozy o niskiej temperaturze topnienia w buforze HEPES-Ringer (całkowita objętość 10 ml) i rozpuść go gotując w kuchence mikrofalowej. Następnie schłodzić go do temperatury 37 °C, przechowując go w komorze grzewczej. Rozgrzej strzykawkę o pojemności 2 ml do napełnienia agarozy do płucnych dróg oddechowych.</li>
					<li>Pobrać 20 ml buforu HEPES-Ringer, dodać heparynę do końcowego stężenia 250 j.m./ml i podgrzać bufor do temperatury 37 °C. Bezpośrednio przed użyciem dodać nitroprusydek sodu do końcowego stężenia 75 μM. Jest to bufor perfuzyjny do odprowadzania krwi z naczyń płucnych.</li>
					<li>Umieścić 200 ml buforu HEPES-Ringer w szklanej zlewce i przechowywać na lodzie. Ten bufor będzie potrzebny do schładzania izolowanych płuc wypełnionych agarozą.</li>
					<li>Napełnić około 200 ml MEM uzupełnionego 1% penicyliną/streptomycyną w szklanej zlewce i przechowywać w temperaturze 37 °C w komorze grzewczej. Bąbelkować podłoże normoksyczną mieszaniną gazów. Zostanie to wykorzystane do usunięcia agarozy z odcinków płuc.</li>
					<li>Rozgrzej 2 butelki MEM uzupełnione 1% penicyliną/streptomycyną w łaźni wodnej do temperatury 37 °C i bąbelkuj je odpowiednio normoksyczną i hipoksyjną mieszaniną gazów przez co najmniej 2 godziny przed rozpoczęciem pomiarów wideomorfometrycznych. Na pomiar wymagane będzie około 250 ml MEM.</li>
				</ol>
			</li>
			<li>Zbierz następujące materiały dodatkowe:
				<ol>
					<li>70% EtOH do dezynfekcji.</li>
					<li>Roztwór podstawowy heparyny (25 000 j.m./5 ml), przechowywany w temperaturze 4 °C (patrz wyżej).</li>
					<li>Roztwór podstawowy nitroprusydku sodu (Nipruss) będącego donorem NO: 10 mM wH2O, przechowywany na lodzie (patrz wyżej).</li>
					<li>Roztwór podstawowy analogu tromboksanu U46619: 10 μM w etanolu, przechowywany na lodzie.</li>
					<li>Klej Superglue.</li>
					<li>Szycie bawełny do podwiązania tchawicy po wypełnieniu agarozą.</li>
				</ol>
			</li>
		</ol>
	</li>
</ol>
2. Zwierzęta
Używaj myszy (na przykład szczepu C57Bl6) obu płci w wieku 10-25 tygodni. HPV może być również analizowany w szczepach nokautujących i odpowiadających im szczepach typu dzikiego.
Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi NIH dotyczącymi opieki i użytkowania zwierząt doświadczalnych i zostały zatwierdzone przez lokalne rady instytucjonalne.
3. Izolacja płuc myszy i przygotowanie precyzyjnie ciętych plastrów płuc (PCLS)
<ol>
	<li>Zabij mysz przez zwichnięcie szyjki macicy. Natychmiast po uśmierceniu wysterylizuj brzuszną powierzchnię ciała 70% EtOH i użyj szorstkich nożyczek, aby przeciąć skórę wzdłuż brzusznej linii środkowej od podbródka do miednicy. 
		Uwaga: Ponieważ wiadomo, że wziewne środki znieczulające, takie jak izofluran, mają wpływ na napięcie naczyniowe18,19, nie należy stosować lotnych środków znieczulających.</li>
	<li>Po otwarciu jamy brzusznej odłóż pętle jelitowe na bok i odetnij duże naczynia brzuszne w celu krwawienia. Po przebiciu przepony cienkimi nożycami płuca zapadną się w wyniku wniknięcia powietrza do jamy opłucnej. Użyj nożyczek, aby odłączyć membranę od dolnego otworu klatki piersiowej. Przetnij żebra i obojczyk z boku, aby usunąć brzuszną część klatki rozrywającej. 
		Uwaga: Ważne jest, aby na tym etapie nie doszło do uszkodzenia płuc, ponieważ w przeciwnym razie wzdęcia płuc z agarozą będą niemożliwe! Używaj wyłącznie sterylnych narzędzi i szkła laboratoryjnego.</li>
	<li>Przed rozpoczęciem perfuzji układu krążenia płucnego należy wyciąć mały otwór w lewej komorze serca w celu odprowadzenia buforu. Napełnić zbiornik strzykawki ciepłym (37 °C) buforem HEPES-Ringer zawierającym heparynę i nitroprusydek sodu (bufor perfuzyjny) i powoli perfekować układ płucny przez prawą komorę. 
		Uwaga: Perfuzja jest skuteczna, gdy płuca zmieniają kolor i uzyskują biały wygląd. Na tym etapie ważne jest, aby dodać nitroprusydek sodu do buforu perfuzyjnego; Zapobiega to odrywaniu się tętnic przedgroniastych od otaczającej tkanki.</li>
	<li>Usuń gruczoły ślinowe, małe mięśnie i tkankę łączną z tchawicy. Odłącz tchawicę od otaczającej tkanki łącznej i nawij bawełnę do wszywania nici między przełykiem a tchawicą w celu późniejszego podwiązania.</li>
	<li>Użyj mikronożyczek, aby wyciąć mały otwór w górnej części tchawicy między dwiema sąsiednimi chrząstkami tchawicy. Teraz włóż elastyczną plastikową rurkę kaniuli dożylnej przez mały otwór do tchawicy i ostrożnie przymocuj ją bawełną do szycia. Powoli napełniaj drogi oddechowe ciepłą (37 °C) agarozą o niskiej temperaturze topnienia. Obserwuj płuca: Najpierw prawe płuco zaczyna się rozszerzać, a następnie lewe płuco. Napełnianie jest zakończone, gdy oba płuca są napompowane do objętości porównywalnej z sytuacją in vivo (około 1,2-2,0 ml w zależności od płci, wieku i masy ciała). 
		Uwaga: Jeśli rozszerza się tylko jedno płuco, plastikowa rurka mogła zostać włożona zbyt głęboko, tak że dotarła do oskrzeli. W takim przypadku trzeba go trochę wyciągnąć. Należy pamiętać, że agaroza zestala się, gdy stopniowo ostygnie.</li>
	<li>Gdy płuca są pełne, jednocześnie wyciągnij plastikową rurkę i podwiąż tchawicę bawełną do szycia, aby zapobiec odpływowi agarozy. Następnie przeciąć tchawicę powyżej ligatury i odłączyć płuca i serce na bloku od klatki piersiowej. 
		Uwaga: Dla początkujących pomocne może być poproszenie kolegi o wsparcie na etapie podwiązywania.</li>
	<li>Przenieś pakiet narządów do lodowatego buforu HEPES-Ringer w celu zestalenia agarozy. Dzieje się to w ciągu kilku minut.</li>
	<li>Oddziel poszczególne płaty płuc i przymocuj jeden płat za pomocą superglue do uchwytu próbki wibratomu. 
		Uwaga: Pomocne jest przyklejenie kawałka korka od szampana na uchwycie, który służy jako odchylenie do tyłu podczas cięcia elastycznej tkanki płucnej. W zależności od użytego płata płuca i jego ułożenia na uchwycie próbki, uzyskany PCLS może być bardziej odpowiedni do analizy małych lub dużych naczyń. Najczęściej używamy lewego płata i prawego płata czaszki do przygotowania PCLS. Aby uzyskać przecięte małe tętnice wewnątrzzrazikowe, przyklej prawy płat czaszki z wnęką do uchwytu i przetnij od obwodu. Aby uzyskać przecięte tętnice przedziarniaste, wyrównaj wnękę prawego płata z korkiem od szampana.</li>
	<li>Użyj wibratomu wyposażonego w świeżą żyletkę, aby pociąć płat płuca na plastry o grubości 200 μm (prędkość: 12 = 1,2 mm/s; częstotliwość: 100; amplituda: 1,0). Zebrać PCLS w misce wibratomu wypełnionej zimnym buforem HEPES-Ringer o temperaturze 4 °C. 
		Uwaga: Chłodzenie dzwonka HEPES-Ringer jest zalecane, ale nie jest to konieczne.</li>
	<li>W celu usunięcia agarozy należy przenieść skrawki narządów do szklanej zlewki wypełnionej około 200 ml ciepłego MEM o temperaturze 37 °C. Włóż zlewkę do szafki grzewczej, do której wkładana jest rurka połączona z butelką z normoksyczną mieszanką gazów. Pęcherzyk MEM z gazem normoksykowym tak, aby sekcje płuc powoli poruszały się w pożywce. Po około 2 godzinach "blaszki agarozowe" wypełniające przestrzenie powietrzne zostaną usunięte z tkanki płucnej. Można to rozpoznać po tym, że sekcje nie pływają już na górze podłoża, ale osiadają na dnie zlewki.</li>
</ol>
4. Analiza wideomorfometryczna tętnic wewnątrzpłucnych PCLS
<ol>
	<li>W celu analizy wideomorfometrycznej tętnic wewnątrzpłucnych należy przenieść jeden PCLS do przepływowej komory superfuzyjnej wypełnionej 1,2 ml normoksycznego gazowanego MEM. Zamocuj PCLS na dnie komory za pomocą nylonowych sznurków połączonych z platynowym pierścieniem (średnica zewnętrzna/wewnętrzna: 14/10 mm).</li>
	<li>Skanuj PCLS pod mikroskopem w poszukiwaniu tętnic o przekroju poprzecznym o średnicach wewnętrznych między 20-100 μm. 
		 
		Uwaga: Światło tętnic jest wyściełane płaskimi komórkami śródbłonka. Otaczające komórki mięśni gładkich można zidentyfikować na obrazie kontrastu fazowego jako "ciemny pierścień" otaczający światło (patrz obrazy kontrastu fazowego na rycinie 2). W przeciwieństwie do tego, drogi oddechowe można zidentyfikować po początkowo pseudostratyfikowanym nabłonku walcowatym, który przechodzi w drodze do powierzchni opłucnej do prostego nabłonka walcowatego, a następnie prostego nabłonka prostopadłościennego. 
		<ol>
			<li>Zmierz średnicę wewnętrzną na początku każdego eksperymentu. 
				Uwaga: W naczyniach o lekko ukośnym cięciu rzeczywistą średnicę wewnętrzną konstrukcji rurowej można określić pod kątem 90° do najdłuższej osi światła. Duże tętnice przedziarniaste o średnicach wewnętrznych >40 μm biegną w sąsiedztwie oskrzeli i oskrzelików. Małe tętnice wewnątrzzrazikowe o średnicy wewnętrznej <40 μm zlokalizowane są w klinach przegród pęcherzykowych obok wyrostka zębodołowego i wyrostka zębodołowego6.</li>
		</ol>
	</li>
	<li>Projekt eksperymentalny:
		<ol>
			<li>Każdy eksperyment należy rozpocząć od "fazy adaptacyjnej", w której komora jest perfundowana normoksycznym medium gazowym (natężenie przepływu: 0,7 ml/min; 10 min). Następnie przetestuj żywotność naczynia: Przeanalizuj kurczliwość tętnicy przez dodanie 12 μl 10 μM U46619 (końcowe stężenie 0,1 μM; 10 min; brak przepływu). 
				Uwaga: W tej pracy naczynie definiuje się jako żywotne, gdy powierzchnia światła jest zmniejszona o co najmniej 30% (metoda pomiaru patrz poniżej).</li>
			<li>Po wypłukaniu leku normoksycznym medium gazowym (przepływ: 6 ml/min; 10 min) rozszerzyć tętnicę przez zastosowanie 3 μl 10 mM Nipruss (stężenie końcowe 25 μM; 10 min; brak przepływu).</li>
			<li>Ponownie usunąć lek przez 10-minutowe przemycie normoksycznym medium gazowym (szybkość przepływu: 6 ml/min), a następnie 10 minut przy przepływie 0,7 ml/min.</li>
			<li>Wywołać niedotlenienie naczyń płucnych poprzez inkubację PCLS z niedotlenionym gazowym medium (szybkość przepływu: 0,7 ml/min; 40 min). Za pomocą dodatkowego systemu rurek wprowadzić mieszaninę gazów hipoksycznych do przestrzeni powietrznej komory perfuzyjnej.</li>
			<li>Usunąć podłoże hipoksyjne przez 20-minutowe przemycie gazowym medium normoksyjnym (natężenie przepływu: 6 ml/min).</li>
			<li>Na koniec każdego eksperymentu dodaj 1,2 μl 10 μM U46619 (końcowe stężenie 0,01 μM; 20 min; brak przepływu) do komory perfuzyjnej, aby wywołać zwężenie naczyń krwionośnych. 
				Uwaga: Ten ostatni etap pozwala na określenie, czy zmiana w odpowiedzi hipoksyjnej (na przykład wywołana przez jednoczesne zastosowanie leku w fazie niedotlenienia lub zaobserwowana w PCLS przygotowanym z nokautującego szczepu myszy) jest specyficzna dla zwężenia wywołanego hipoksją, czy też odzwierciedla ogólny wpływ na kurczliwość. Stężenie 0,01 μM odpowiada wartości EC50 U46619, która została oszacowana w poprzednich pomiarach stężenia-skurczu (nieopublikowanych).</li>
			<li>Użyj innego PCLS do przeprowadzenia eksperymentów kontrolnych z normoksycznym zamiast hipoksyjnego MEM gazowanego i normoksyjną mieszaniną gazów w przestrzeni powietrznej komory perfuzyjnej.</li>
		</ol>
	</li>
</ol>
5. Analiza wazoreaktywności i prezentacja graficzna
<ol>
	<li>Za pomocą odpowiedniego oprogramowania wykonuj zdjęcia z przeciętej tętnicy co minutę podczas całego eksperymentu.</li>
	<li>Za pomocą odpowiedniego oprogramowania oceń zmiany obszaru świetlnego naczyń, ręcznie wykładając wewnętrzne granice, korzystając z pełnoekranowych obrazów. 
		Uwaga: Wystarczy przeanalizować co drugi obraz, aby uzyskać wyraźne wykresy. Jednakże, gdy jeden warunek w przepływowej komorze superfuzyjnej zostanie zmieniony na inny, przeanalizuj każdy obraz. Pozostałe zdjęcia służą jako kopia zapasowa na wypadek, gdyby jedno zdjęcie nie mogło zostać przeanalizowane. 
		Niestety, ten czasochłonny krok musi być wykonany ręcznie, a nie za pomocą odpowiednich programów, ponieważ czasami komórki krwi są przyczepione do ściany naczyniowej, która porusza się podczas pomiaru lub nie jest to idealny przekrój naczynia, ale przekrój styczny, w którym wiarygodną lokalizację wewnętrznych granic można wykonać tylko pod kontrolą wzrokową.</li>
	<li>Określ wartość uzyskaną dla obszaru światła naczynia na początku eksperymentu jako 100% i wyraź zwężenie lub rozszerzenie naczyń krwionośnych jako względny spadek lub wzrost tej wartości.</li>
	<li>Dla każdego eksperymentu należy wykreślić względny obszar światła w funkcji czasu za pomocą odpowiedniego oprogramowania.</li>
	<li>Aby podsumować kilka eksperymentów, wykreśl średnie względnych obszarów świetlnych +/- błąd standardowy średniej (SEM) w funkcji czasu. 
		Uwaga: W celu jasnego przedstawienia wpływu różnych substancji na zwężenie naczyń płucnych wywołane niedotlenieniem lub U46619 lub niedotlenienie reakcji szczepów myszy z nokautem, początkowa faza doświadczeń, w której badana jest żywotność naczynia, może być pominięta na wykresie. W tym przypadku wartości uzyskane na początku ekspozycji na zredukowany tlen określa się jako 100%.</li>
</ol>
6. Analiza statystyczna
<ol>
	<li>Analizuj różnice między grupami eksperymentalnymi za pomocą testu Kruskala-Wallisa i Manna-Whitneya, przy czym p≤0,05 jest uważane za istotne, a p≤0,01 za wysoce istotne. 
		Uwaga: Dodatkowe informacje na temat przygotowania i operacyjnego stosowania PCLS można znaleźć wpkt 20,21.</li>
</ol>

<ol><li>Weissmann, N., Akkayagil, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+features+of+hypoxic+pulmonary+vasoconstriction+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Respir.+Physiol.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Basic features of hypoxic pulmonary vasoconstriction in mice.</a> Respir. Physiol. Neurobiol. 139, 191-202 (2004).</li>
<li>Leach, R. M., Hill, H. M., Snetkov, V. A., Robertson, T. P., Ward, J. P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Divergent+roles+of+glycolysis+and+the+mitochondrial+electron+transport+chain+in+hypoxic+pulmonary+vasoconstriction+of+the+rat%3A+identity+of+the+hypoxic+sensor%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Divergent roles of glycolysis and the mitochondrial electron transport chain in hypoxic pulmonary vasoconstriction of the rat: identity of the hypoxic sensor.</a> J. Physiol. 536, 211-224 (2001).</li>
<li>Tabuchi, A., Mertens, M., Kuppe, H., Pries, A. R., Kuebler, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy+of+the+murine+pulmonary+microcirculation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy of the murine pulmonary microcirculation.</a> J. Appl. Physiol. 104 (2), 338-3346 (2008).</li>
<li>Sylvester, J. T., Shimoda, L. A., Aaronson, P. I., Ward, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxic+pulmonary+vasoconstriction%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Hypoxic pulmonary vasoconstriction.</a> Physiol. Rev. 92 (1), 367-520 (2012).</li>
<li>Schumacker, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+cell+hypoxia%3A+role+of+mitochondrial+reactive+oxygen+species+signaling+in+triggering+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Am.+Thorac.+Soc%22%5BJournal%5D)">Lung cell hypoxia: role of mitochondrial reactive oxygen species signaling in triggering responses.</a> Proc. Am. Thorac. Soc. 8 (6), 477-4784 (2011).</li>
<li>Paddenberg, R., König, P., Faulhammer, P., Goldenberg, A., Pfeil, U., Kummer, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxic+vasoconstriction+of+partial+muscular+intra-acinar+pulmonary+arteries+in+murine+precision+cut+lung+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Respir.+Res%22%5BJournal%5D)">Hypoxic vasoconstriction of partial muscular intra-acinar pulmonary arteries in murine precision cut lung slices.</a> Respir. Res. 29 (7), 93-109 (2006).</li>
<li>Paddenberg, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+complex+II+is+essential+for+hypoxia-induced+pulmonary+vasoconstriction+of+intra-+but+not+of+pre-acinar+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial complex II is essential for hypoxia-induced pulmonary vasoconstriction of intra- but not of pre-acinar arteries.</a> Cardiovasc. Res. 93 (4), 702-710 (2012).</li>
<li>Wang, L., Yin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxic+pulmonary+vasoconstriction+requires+connexin+40-mediated+endothelial+signal+conduction%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Hypoxic pulmonary vasoconstriction requires connexin 40-mediated endothelial signal conduction.</a> J. Clin. Invest. 122 (11), 4218-4230 (2012).</li>
<li>Archer, S. L., Huang, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+distribution+of+electrophysiologically+distinct+myocytes+in+conduit+and+resistance+arteries+determines+their+response+to+nitric+oxide+and%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Differential distribution of electrophysiologically distinct myocytes in conduit and resistance arteries determines their response to nitric oxide and.</a> 78, 431-442 (1996).</li>
<li>Yamaguchi, K., Suzuki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+of+intra-acinar+pulmonary+microvessels+to+hypoxia%2C+hypercapnic+acidosis%2C+and+isocapnic+acidosis%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Response of intra-acinar pulmonary microvessels to hypoxia, hypercapnic acidosis, and isocapnic acidosis.</a> Circ. Res. 82, 722-728 (1998).</li>
<li>Bennie, R. E., Packer, C. S., Powell, D. R., Jin, N., Rhoades, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biphasic+contractile+response+of+pulmonary+artery+to+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+261%282+Pt%22%5BJournal%5D)">Biphasic contractile response of pulmonary artery to hypoxia.</a> Am. J. Physiol. 261(2 Pt. 1, 156-163 (1991).</li>
<li>Glazier, J. B., Murray, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sites+of+pulmonary+vasomotor+reactivity+in+the+dog+during+alveolar+hypoxia+and+serotonin+and+histamine+infusion%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Sites of pulmonary vasomotor reactivity in the dog during alveolar hypoxia and serotonin and histamine infusion).</a> J. Clin. Invest. 50 (12), 2550-2558 (1971).</li>
<li>Bhattacharya, J., Staub, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+measurement+of+microvascular+pressures+in+the+isolated+perfused+dog+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Direct measurement of microvascular pressures in the isolated perfused dog lung.</a> Science. 210, 327-328 (1980).</li>
<li>Kuebler, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+imaging+assessment+of+pulmonary+vascular+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Am.+Thorac.+Soc%22%5BJournal%5D)">Real-time imaging assessment of pulmonary vascular responses.</a> Proc. Am. Thorac. Soc. 8 (6), 458-4565 (2011).</li>
<li>Martin, C., Uhlig, S., Ullrich, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Videomicroscopy+of+methacholine-induced+contraction+of+individual+airways+in+precision-cut+lung+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+Respir.+J%22%5BJournal%5D)">Videomicroscopy of methacholine-induced contraction of individual airways in precision-cut lung slices.</a> Eur. Respir. J. 9 (12), 2479-2487 (1996).</li>
<li>Grimminger, F., Spriestersbach, R., Weissmann, N., Walmrath, D., Seeger, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitric+oxide+generation+and+hypoxic+vasoconstriction+in+buffer-perfused+rabbit+lungs%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Nitric oxide generation and hypoxic vasoconstriction in buffer-perfused rabbit lungs.</a> J. Appl. Physiol. 78, 1509-1515 (1995).</li>
<li>Ng, L. C., Kyle, B. D., Lennox, A. R., Shen, X. M., Hatton, W. J., Hume, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+culture+alters+Ca2%2B+entry+pathways+activated+by+store-depletion+or+hypoxia+in+canine+pulmonary+arterial+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cell culture alters Ca2+ entry pathways activated by store-depletion or hypoxia in canine pulmonary arterial smooth muscle cells.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 294 (1), 313-323 (2008).</li>
<li>Fehr, D. M., Larach, D. R., Zangari, K. A., Schuler, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Halothane+constricts+bovine+pulmonary+arteries+by+release+of+intracellular+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Exp.+Ther%22%5BJournal%5D)">Halothane constricts bovine pulmonary arteries by release of intracellular calcium.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 277 (2), 706-713 (1996).</li>
<li>Oshima, Y., Ishibe, Y., Okazaki, N., Sato, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isoflurane+inhibits+endothelium-mediated+nitric+oxide+relaxing+pathways+in+the+isolated+perfused+rabbit+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Can.+J.+Anaesth%22%5BJournal%5D)">Isoflurane inhibits endothelium-mediated nitric oxide relaxing pathways in the isolated perfused rabbit lung.</a> Can. J. Anaesth. 44 (10), 1108-1114 (1997).</li>
<li>Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+lung+physiology+in+health+and+disease+with+lung+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Pulm.+Pharmacol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Exploring lung physiology in health and disease with lung slices.</a> Pulm. Pharmacol. Ther. 24 (5), 452-465 (2011).</li>
<li>Davies, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDavies%2C+J+%22Replacing+Animal+Models%3A+A+Practical+Guide+to+Creating+and+Using+Culture-based+Biomimetic+Alternatives+%28Google+eBook%22">Replacing Animal Models: A Practical Guide to Creating and Using Culture-based Biomimetic Alternatives (Google eBook</a>. , John Wiley & Sons. 57-68 (2012).</li>
<li>Müller-Redetzky, H. C., Kummer, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intermedin+stabilized+endothelial+barrier+function+and+attenuated+ventilator-induced+lung+injury+in+mice%29%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Intermedin stabilized endothelial barrier function and attenuated ventilator-induced lung injury in mice).</a> PLoS One. 7 (5), (2012).</li>
<li>Russell, W. M. S., Burch, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Principles+of+Humane+Experimental+Technique%5BTitle%5D)+AND+%22Universities+Federation+for+Animal+Welfare%22%5BJournal%5D)">The Principles of Humane Experimental Technique.</a> Universities Federation for Animal Welfare. , Wheathampstaed, UK. (1959).</li>
<li>Held, H. D., Martin, C., Uhlig, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+airway+and+vascular+responses+in+murine+lungs%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Characterization of airway and vascular responses in murine lungs.</a> Br. J. Pharmacol. 126 (5), 1191-1199 (1999).</li>
<li>Köhler, D., Schönhofer, B., Voshaar, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pneumologie%3A+Ein+Leitfaden+f%C3%BCr+rationales+Handeln+in+Klinik+und+Praxis%5BTitle%5D)+AND+%22Thieme+Verlag%22%5BJournal%5D)">Pneumologie: Ein Leitfaden für rationales Handeln in Klinik und Praxis.</a> Thieme Verlag. , 198-19 (2009).</li>
<li>Will, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Pulmonary+Circulation%5BTitle%5D)+AND+%22in+Health+and+Disease.+Elsevier+Science%2C+p49%22%5BJournal%5D)">The Pulmonary Circulation.</a> in Health and Disease. Elsevier Science, p49. , (1987).</li>
<li>Faro, R., Moreno, L., Hislop, A. A., Sturton, G., Mitchell, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulmonary+endothelium+dependent+vasodilation+emerges+after+birth+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Pulmonary endothelium dependent vasodilation emerges after birth in mice.</a> Eur. J. Pharmacol. 567 (3), 240-244 (2007).</li>
<li>Wright, J. L., Churg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short-term+exposure+to+cigarette+smoke+induces+endothelial+dysfunction+in+small+intrapulmonary+arteries%3A+analysis+using+guinea+pig+precision+cut+lung+slices%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Short-term exposure to cigarette smoke induces endothelial dysfunction in small intrapulmonary arteries: analysis using guinea pig precision cut lung slices.</a> J. Appl. Physiol. 104, 1462-1469 (2008).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Izolowane, wentylowane i perfundowane płuco myszy jest doskonałym modelem do analizy fizjologicznej odpowiedzi układu naczyniowego płuc na zmiany w dopływie tlenu i umożliwia m.in. ciągły pomiar ciśnienia tętniczego w płucach1. Model ten nie pozwala jednak na identyfikację i analizę tych segmentów naczyń krwionośnych, które wykazują najsilniejszą odpowiedź na niedotlenienie. Jest to zaleta naszej wideomorfometrycznej analizy PCLS, która ułatwia pomiar HPV poszczególnych tętnic o średnicach wewnętrznych 20-100 μm. PCLS stanowią atrakcyjny model in vitro , ponieważ są bardzo podobne do narządu, z którego są przygotowywane. W przeciwieństwie do systemów hodowli komórkowych, wszystkie typy komórek są obecne w swojej pierwotnej konfiguracji tkankowo-macierzowej. Co więcej, jedno płuco wystarcza do przygotowania wielu PCLS, tak że przynajmniej częściowo eksperymenty mogą być ustandaryzowane poprzez użycie wycinków tej samej myszy. Zgodnie z koncepcją 3R (redukcja, udoskonalenie i zastąpienie zwierząt laboratoryjnych w naukach przyrodniczych) Russella i Burcha23 fakt ten również przemawia za stosowaniem PCLS.
Należy jednak pamiętać, że tkanka jest uszkadzana przez cięcie wibratomem i sygnalizację podłużną, na przykład za pośrednictwem komórek śródbłonka, jak postulują Kübler i wsp. 14 nie jest już możliwe.
Początkowo PCLS były stosowane głównie w badaniach biochemicznych, farmakologicznych i toksykologicznych, ale w międzyczasie są również wykorzystywane do pomiaru kurczliwości oskrzeli, funkcji śluzowo-rzęskowej i odpowiedzi naczyniowych (przeglądy patrz Sanderson20 i Davies21). Held i wsp. przeprowadzili badanie, w którym porównali modele izolowanych, perfundowanych i wentylowanych płuc myszy oraz PCLS24. Na podstawie analizy reakcji dróg oddechowych i naczyń płucnych na różne mediatory endogenne odkryli, że w PCLS zachowały się ważne cechy całego płuca.
W PCLS warunki niedotlenienia nie są ustalane przez drogi oddechowe, jak w nienaruszonym płucu, ale przez inkubację odcinka płuca w podłożu podgazowanym hipoksyjnie. Przeanalizowaliśmy ciśnienie parcjalne tlenu (pO2) medium wstępnie zagazowanego odpowiednio 1% O2 , 5,3 % CO2 , 93,7% N2 i 21% O2, 5,3% CO2, 73,7% N2 za pomocą analizatora gazometrii krwi. Bezpośrednio przed wprowadzeniem go do komory perfuzyjnej pO2 hipoksyjnego gazowanego MEM wynosiło 40 mmHg, a normoksycznego gazowanego medium 160 mmHg6. W nienaruszonym płucu HPV jest indukowany, gdy pO2 w pęcherzykach płucnych spada poniżej 50 mmHg25, co można oczywiście naśladować przez zastosowanie pożywki z gazem hipoksyjnym. Nasze dane dotyczące zasięgu HPV dobrze pasują do wyników uzyskanych przy użyciu innego podejścia eksperymentalnego. Yamaguchi i wsp. zastosowali izolowane płuca szczura do badania mikronaczyń o średnicy 20-30 μm za pomocą konfokalnej laserowej skaningowej mikroskopii luminescencyjnej w czasie rzeczywistym sprzężonej z kamerą o wysokiej czułości ze wzmacniaczem obrazu10. Zaobserwowali średnie zmniejszenie średnicy o 2,7 μm po wystawieniu płuc na niedotlenienie. Można obliczyć, że zmniejszenie o 20% powierzchni światła, tak jak ją mierzymy w naszym systemie, odpowiada około 15% zmniejszeniu średnicy.
W naszych doświadczeniach sklasyfikowaliśmy tętnice odpowiednio jako naczynia przed- i wewnątrzziarniaste o średnicach wewnętrznych 40-100 μm i 20-40 μm. U ludzi przejście z tętnic mięśniowych do niemięśniowych następuje w zakresie średnic 70-100 μm. U myszy komórki mięśni gładkich są obecne do średnicy zewnętrznej 20 μm26. Z tego powodu nie jest możliwa analiza tętnic o średnicach poniżej 20 μm, ponieważ nie można ich wiarygodnie zidentyfikować na podstawie obrazu kontrastu fazowego. Na drugim końcu skali znajdują się naczynia o średnicy powyżej 100 μm, które są prawie niemożliwe do znalezienia w PCLS i często są usuwane z otaczającej tkanki.
W rzeczywistości wiele kandydatów molekularnych jest omawianych jako molekularne czujniki tlenu lub jako składnik kaskady sygnalizacyjnej skutkującej HPV (przegląd patrz Sylvester i wsp.4). Gdy dostępne są odpowiednie myszy z nokautem, można zastosować wideomorfometrię do analizy wazoreaktywności tętnic przed- i wewnątrzzrazikowych w porównaniu ze zwierzętami typu dzikiego. Jednak PCLS był również używany do innych problemów: Faro i wsp. wykorzystano je do scharakteryzowania rozwoju zależnego od śródbłonka rozszerzenia płuc po urodzeniu29 , a PCLS przygotowane ze świnek morskich wystawionych na dym lub powietrze codziennie przez 2 tygodnie wykorzystano do wykazania wpływu dymu papierosowego na aktywność naczyniową poprzez indukcję dysfunkcji śródbłonka30.
Krytyczne kroki w ramach protokołu
W naszych doświadczeniach sklasyfikowaliśmy tętnice jako przedziarniaste (średnice wewnętrzne 40-100 μm) i wewnątrzziarniaste (średnice wewnętrzne 20-40 μm). Szczególnie w przypadku przygotowania wycinków płuc, które powinny być używane do analizy większych naczyń, ważne jest dodanie nitroprusydku sodu do buforu perfuzyjnego. Lek ten zapobiega kurczeniu się naczyń podczas przygotowywania próbki, a tym samym ich oderwaniu od otaczającej tkanki, co prowadzi do niepełnego rozszerzenia naczyń krwionośnych. Nitroprusydek sodu w buforze perfuzyjnym nie jest tak istotny dla przygotowania wycinka płuc, który powinien być wykorzystany do analizy małych tętnic, ponieważ są one silnie zakotwiczone w przegrodach pęcherzykowych.
Wszystkie eksperymenty należy rozpocząć od inkubacji, w których badana jest reaktywność tętnic. Rzadko otrzymywaliśmy preparaty płucne, w których nie wykrywano reakcji naczyń krwionośnych na naciągi lub rozszerzacze. Nie znamy przyczyny takiego stanu rzeczy: być może objętość agarozy wypełnionej w płucach była zbyt duża lub zbyt mała, tak że przecięcie narządu na PCLS nie było optymalne. Alternatywnie można sobie wyobrazić, że agaroza ochładzała się zbyt szybko podczas procedury wkraplania, co powodowało szkodliwe naprężenia ścinające. W przypadku, gdy w pojedynczym PCLS nie jest wykrywalna żywa tętnica, odcinek należy odrzucić i zastąpić innym.
Decyzja o żywotności tętnicy została podjęta na podstawie odpowiedzi na U46619. Zastosowanie U46619 w stężeniu 0,1 μM wywołuje zwężenie naczyń krwionośnych, które - po pewnym wysiłku fizycznym - jest widoczne bezpośrednio w sekwencji obrazu na ekranie. Ponieważ istnieją pewne różnice w aktywności naczyniowej, badamy wpływ leku na HPV, mierząc odpowiedź naczyniową w odcinkach płuc narażonych na działanie leku lub na samą pożywkę.
HPV pojedynczej tętnicy jest często ledwo wykrywalny pod mikroskopem, a średnio powoduje zmniejszenie powierzchni światła o około 20-30%. Jednak niewielkie zmiany średnicy tętnicy mają wyraźny wpływ na opór przepływu. Zgodnie z równaniem "R = 1/r4" przy R = rezystancji i r = promieniu, opór przepływu jest odwrotnie proporcjonalny do czwartej potęgi promienia. Podam przykład: "Tętnica idealna" o przekroju kołowym o średnicy 40 μm (r=20 μm) ma pole świetlne około 1 260μm2. Gdy powierzchnia światła zmniejszy się o 20%, możemy obliczyć, że średnica naczynia zmniejsza się o 10,5% do 35,8 μm (r=17,9 μm). Zgodnie z powyższym równaniem, opory przepływu tego naczynia wzrosłyby z 6,25 x 10-6 do 9,71 x 10-6 , czyli o około 55%. W przypadku zmniejszenia powierzchni świetlnej o 30% promień zmniejszyłby się o około 16%, ale opory przepływu wzrosłyby o około 100%. Jakkolwiek obliczenia te są nadmiernym uproszczeniem, w którym zakłada się laminarny przepływ krwi i formę naczynia w postaci sztywnej rury, sugeruje to wpływ już niewielkich zmian średnicy na opory przepływu.

W większości układowych łożysk naczyniowych niedotlenienie powoduje rozszerzenie naczyń krwionośnych, w porównaniu do zwężenia naczyń krwionośnych spowodowanego niedotlenieniem w naczyniach płucnych. Ta specyficzna dla płuc reakcja na obniżone ciśnienie tlenu nazywana jest niedotlenieniem naczyń płucnych (HPV), pojawia się w ciągu kilku sekund i szybko odwraca się po powrocie do wentylacji normoksyjnej. Chociaż wirus HPV jest znany od ponad 60 lat, komórkowy czujnik tlenu i kaskada sygnalizacyjna powodująca zwężenie naczyń krwionośnych są nadal przedmiotem dyskusji. Istnieje względnie szeroki konsensus co do tego, że wywołane niedotlenieniem zmiany redoks i ROS są niezbędne dla HPV i rozwoju nadciśnienia płucnego (przegląd w Sylvester i wsp.4 oraz Schumacker i wsp.5). Nasze własne dane potwierdzają centralną rolę kompleksu II mitochondrialnego łańcucha oddechowego w HPV6,7. Ostatnio Wang i wsp. przedstawili zupełnie nową koncepcję wykrywania tlenu i HPV: Na podstawie swoich danych proponują, że niedotlenienie pęcherzyków płucnych jest wyczuwane przez sąsiednie naczynia włosowate, powodując depolaryzację błony komórek śródbłonka. Odpowiedź jest propagowana poprzez połączenie 40 połączeń szczelinowych komórek śródbłonka, co prowadzi do zwężenia komórek mięśni gładkich tętniczek znajdujących się w górnym biegu8.
Tętnice płuc biegną wzdłuż dróg oddechowych, rozgałęziają się wraz z nimi, stale zmniejszając średnicę, aż w końcu dostarczają krew do systemu naczyń włosowatych znajdujących się w ścianach pęcherzyków płucnych. To krążenie tętnicze składa się z anatomicznie i funkcjonalnie odrębnych segmentów. Po tętnicach proksymalnych przewodowych, charakteryzujących się dużą ilością elastycznych włókien w ścianach, następują w pełni umięśnione tętnice wewnątrzpłucne, które w dużej mierze kontrolują opór naczyniowy płuc. Krok po kroku tętnice te przechodzą w segmenty, w których warstwa mięśniowa staje się niekompletna, a ostatecznie naczynia są wolne od komórek immunoreaktywnych aktyny mięśni gładkich. Tętnica wewnątrzgrobkowa zasilająca pojedynczą ziarnienkę płucną krwią reprezentuje częściowo mięśniowy segment6. Podobnie tętniczy układ płucny nie reprezentuje jednolitej struktury pod względem odpowiedzi niedotlenienia, ale wykazuje wyraźną różnorodność regionalną9,10. Na przykład w proksymalnych tętnicach płucnych odizolowanych od płuc szczura niedotlenienie wywołuje reakcję dwufazową, wykazując początkowy szybki skurcz o krótkim czasie trwania, po którym - po niepełnym rozluźnieniu - następuje drugi powolny, ale trwały skurcz11. W tętnicach opornych izolowanych z miąższu płuc szczura jako czwarty i piąty podział tętnic płucnych (średnica zewnętrzna <300 μm) niedotlenienie powoduje zwężenie jednofazowe9. Już w 1971 roku Glazier i Murray doszli do wniosku, na podstawie pomiarów zmian stężenia czerwonych krwinek włośniczkowych w płucach psów wentylowanych mieszaninami gazów hipoksycznych, że wywołany niedotlenieniem wzrost oporu naczyniowego występuje głównie przed naczyniami włosowatymi12. Obecnie mikroskopia przyżyciowa nienaruszonych płuc znieczulonych i wentylowanych mechanicznie myszy stanowi potężne narzędzie do analizy mikrokrążenia płucnego13,14. Wycięcie okrągłego okienka w ścianie klatki piersiowej daje mikroskopijny dostęp do powierzchni płuca i umożliwia analizę podopłucnowych naczyń płucnych o średnicy do 50 μm. Łącząc tę technikę z infuzją dekstranu FITC, Tabuchi i wsp. Wykazano, że tylko średniej wielkości tętniczki o średnicy 30-50 μm wykazują wyraźną odpowiedź na niedotlenienie, które utrzymywało się przez okres 60 minut z niewielkim osłabieniem po 30 minutach. Natomiast małe tętniczki o średnicach 20-30 μm wykazywały tylko niewielką odpowiedź na niedotlenienie3. Technika ta nie pozwala jednak na analizę tętnic o średnicy większej niż 50 μm, ponieważ naczynia te znajdują się zbyt głęboko w tkance płucnej.
Aby wypełnić lukę w analizie dużych i bardzo małych tętnic płucnych (takich jak naczynia podopłucnowe) mysich płuc, przyjęliśmy metodę opisaną przez Martina i wsp. do analizy reaktywności dróg oddechowych15. Oparty na technice wkraplania żelu agarozowego, ułatwia przygotowanie precyzyjnie wyciętych plastrów płuc (PCLS) z tego stosunkowo miękkiego i elastycznego narządu. W obrębie PCLS aktywność naczyniową tętnic o przekroju poprzecznym o średnicy wewnętrznej od 20 do 100 μm można bezpośrednio obserwować za pomocą wideomikroskopii. Stosowanie leków podczas inkubacji hipoksyjnej PCLS pozwala na analizę ich wpływu na HPV. Szczególnie ważne jest, że technika ta może być również stosowana w przypadku myszy modyfikowanych genetycznie. Na podstawie ich lokalizacji w płucach klasyfikujemy tętnice jako naczynia przed- i wewnątrzziarniaste, o średnicach wewnętrznych odpowiednio 20-40 μm i 40-100 μm. W ujęciu funkcjonalnym tętnica wewnątrzzrazikowa zaopatruje w krew pojedynczą wycinkę zrazikową płuc, a tętnica przedzrazikowa to odcinki naczynia poprzedzającego. Zapis obrazów na aparacie cyfrowym pozwala na późniejsze ilościowe określenie reakcji wazologicznej. Oczywistą cechą tego modelu PCLS jest brak naprężeń ścinających działających na śródbłonek. Natomiast w naczyniach perfundowanych ostry HPV prowadzi do wzrostu naprężeń ścinających, indukując w ten sposób mechanizmy wtórne, takie jak uwalnianie NO16. Dodatkowo zastosowanie PCLS pozwala na pomiary HPV bez pozapłucnych wpływów nerwowych lub hormonalnych. W przeciwieństwie do systemów hodowli komórkowych, na przykład przygotowanych z komórek mięśni gładkich tętnic płucnychpsów 17, architektura histologiczna ściany naczynia jest prawie całkowicie zachowana.
Podsumowując, ten protokół dostarcza pomocnej metody do analizy potencjalnych czujników tlenu molekularnego i/lub szlaków komórkowych odpowiedzialnych za HPV tętnic wewnątrzpłucnych o średnicach wewnętrznych między 20-100 μm w warunkach wolnych od naprężeń ścinających.

<table><tbody><tr><td>Vibratome "Microm HM 650 V"</td> <td>Microm/Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kuchenka mikrofalowa</td><td>Bosch, Frankfurt, Niemcy</td><td>HMT 702C</td><td></td></tr><tr><td>Szafa grzewcza</td><td>Heraeus/Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Przepływowa komora superfuzyjna&nbsp;</td><td>Hugo Sachs Elektronik, marzec, Niemcy</td><td>Typ wanny PCLS: 847 SN:4017</td><td></td></tr><tr><td>Pionowy mikroskop odwrócony wyposażony w obiektywy 4X, 10X, 20X i 40X&nbsp;</td><td>Leica, Wetzlar, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kamera CCD&nbsp;</td><td>Stemmer Imaging, Puchheim, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pompa perystaltyczna Minipuls 3</td><td>Gilson, Limburgia-Offheim, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Łaźnia wodna " Uniwersalny Wasserbad Isotem 205"</td><td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Niemcy</td><td>9452450</td><td></td></tr><tr><td>Rury gazoszczelne Tygon R3603-13 &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &Oslash; i: 3/32 cala i Oslash; a: 5/32 cala, ściana: 1/32 cala</td><td>VWR, Darmstadt, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Różne nożyczki i kleszcze</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr>Strzykawka<td>do szycia bawełny</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 ml&nbsp;</td><td>Braun-Melsungen AG, Melsungen, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka 50 ml</td><td>Braun-Melsungen AG, Melsungen, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Elastyczna plastikowa rurka kaniuli dożylnej " IntrocanR-W" (kaniula 20 G x 1 i frac14; cal, 1,1 x 32 mm)</td><td>Braun-Melsungen AG, Melsungen, Niemcy</td><td>4254112B</td><td>Do wkraplania agarozy do płuc</td></tr><tr><td>Kaniula 21 G x 4 &frac34; w; 0,8 x 120 mm</td><td>Braun-Melsungen AG, Melsungen, Niemcy</td><td>4665643</td><td>Do bulgotania podłoża</td></tr><tr><td>Kaniula nr 17, 24 G x 1, 0,55 x 25 mm&nbsp;</td><td>Terumo, Eschborn, Niemcy</td><td>NN 2425 88DSF18</td><td>Do perfuzji płuc</td></tr><tr><td>Normoksyjna mieszanina gazów (21% O2, 5,3% CO2, 73,7% N2)</td><td>Linde, Hildesheim, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mieszanina gazów hipoksyjnych (1% O2, 5,3% CO2, 93.7% N2)</td><td>Linde, Hildesheim, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma, Deisenhofen, Niemcy</td><td>H 4034</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Roth, Karlsruhe, Niemcy</td><td>3957.1</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merck, Darmstadt, Niemcy</td><td>1.04936.0500</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2&bull; 6H2O</td><td>Merck, Darmstadt, Niemcy</td><td>1.05833.0250</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2&bull; 2H2O</td><td>Merck, Darmstadt, Niemcy</td><td>1.02382.0500</td><td></td></tr><tr><td>Glukoza D-(+)</td><td>Sigma, Deisenhofen, Niemcy</td><td>G 7021</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza o niskiej temperaturze topnienia&nbsp;</td><td>Bio-Rad, Monachium, Niemcy</td><td>161-3111</td><td></td></tr><tr><td>Heparyna sodowa</td><td>Ratiopharm, Ulm, Niemcy</td><td>5120046</td><td></td></tr><tr><td>Minimalna pożywka egzogenna (MEM) bez fenolu</td>)<td>Invitrogen, Darmstadt, Niemcy</td><td>5120046</td><td></td></tr><tr><td>70% EtOH do dezynfekcji</td><td>Stockmeier Chemie, Dillenburg, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Superglue</td><td>UHU, B&uuml; hl/Baden, Niemcy lub w supermarkecie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>U46619 (analog tromboksanu)</td><td>Calbiochem/Merck, Darmstadt, Niemcy</td><td>538944</td><td></td></tr><tr><td>Nitrorusydek sodu (Nipruss)</td><td>Schwarz Pharma, Monheim, Niemcy</td><td>5332804</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie Optimas 6.5&nbsp;</td><td>Stemmer, Puchheim, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SPSS 19</td><td>AskNet, Karlsruhe, Niemcy</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

analiza wideomorfometryczna niedotlenionego zwężenia naczyń płucnych tętnic wewnątrzpłucnych przy użyciu mysich precyzyjnie wyciętych plastrów płuc

Videomorphometric Analysis of Hypoxic Pulmonary Vasoconstriction of Intra-pulmonary Arteries Using Murine Precision Cut Lung Slices

Ostra hipoksja pęcherzyków płucnych powoduje zwężenie naczyń płucnych (HPV) - znane również jako mechanizm von Eulera-Liljestranda - który służy do dopasowania perfuzji płuc do wentylacji. Do tej pory mechanizmy leżące u podstaw tego zjawiska nie są w pełni poznane. Głównym segmentem naczyniowym przyczyniającym się do HPV jest tętnica wewnątrzgroniasta. Ten odcinek naczynia jest odpowiedzialny za dopływ krwi do pojedynczego acinusa, który definiuje się jako część płuc dystalną do końcowego oskrzelika. Tętnice wewnątrzzrazikowe są najczęściej zlokalizowane w tej części płuca, do której nie można selektywnie dotrzeć za pomocą wielu powszechnie stosowanych technik, takich jak pomiar ciśnienia w tętnicy płucnej w izolowanych perfundowanych płucach lub zapisy siły z wypreparowanych bliższych odcinków tętnicy płucnej1,2. Analiza naczyń podopłucnowych za pomocą konfokalnej skaningowej mikroskopii luminescencyjnej w czasie rzeczywistym jest ograniczona do naczyń o średnicy do 50 μm3.
Udostępniamy technikę badania HPV mysich tętnic wewnątrzpłucnych w zakresie średnic wewnętrznych 20-100 μm. Opiera się ona na analizie wideomorfometrycznej tętnic o przekroju poprzecznym w precyzyjnie wyciętych plastrach płuc (PCLS). Metoda ta pozwala na ilościowy pomiar aktywności naczyniowej małych tętnic wewnątrzgrobiorowych o średnicy wewnętrznej w zakresie 20-40 μm, które znajdują się w klinach przegród pęcherzykowych obok przewodów pęcherzykowych oraz większych tętnic przedgroniastych o średnicach wewnętrznych w zakresie 40-100 μm, które biegną w sąsiedztwie oskrzeli i oskrzelików. W przeciwieństwie do obrazowania naczyń podopłucnowych w czasie rzeczywistym u znieczulonych i wentylowanych myszy, analiza wideomorfometryczna PCLS odbywa się w warunkach wolnych od naprężeń ścinających. W naszym modelu eksperymentalnym oba odcinki tętnic wykazują jednofazowy HPV pod wpływem medium gazowanego 1%O2, a odpowiedź zanika po 30-40 minutach w niedotlenieniu.

Na Rysunku 1 przedstawiono wyniki pomiarów HPV dla dużej tętnicy przedacinarnej, a na Rysunku 2 dla małych tętnic wewnątrzacinarnych. Na obrazach w kontraście fazowym (Rysunki 1A oraz 2A) wyraźnie widać, że możliwe jest rozróżnienie tych dwóch klas tętnic na podstawie ich lokalizacji w tkance płucnej: tętnice przedacinarne przebiegają w bliskim sąsiedztwie oskrzeli i oskrzelików (Rysunek 1A), natomiast tętnice wewnątrzacinarne znajdują się w zagięciach przegród pęcherzykowych i są otoczone przez pęcherzyki płucne (Rysunek 2A). Przy niewielkiej praktyce na zdjęciach w kontraście fazowym (Rysunki 1A oraz 2A) można dostrzec zmiany powierzchni światła naczynia w odpowiedzi na U46619. Jednakże hipoksyczny skurcz naczyń płucnych często nie jest tak wyraźny i staje się widoczny dopiero po pełnej ocenie zmian powierzchni światła (Rysunki 1B, 1C, 2B oraz 2C). Z powodów dydaktycznych przedstawiliśmy przykład tętnicy przedacinarnej wykazującej nietypowo silny skurcz naczyń. Średnio HPV skutkuje zmniejszeniem powierzchni światła o 20-30%.
Na Rysunku 2 przedstawiono zapisy z badań małych tętnic wewnątrzacynarnych inkubowanych w medium napowietrzonym gazem hipoksycznym z dodatkiem lub bez dodatku 50 µM pinacidylu (nieselektywnego otwieracza mitochondrialnych kanałów potasowych wrażliwych na ATP), gdzie wyraźnie widoczny jest efekt hamujący leku. Końcowa część eksperymentu wykazuje selektywność działania leku na HPV: skurcz naczyń wywołany analogiem tromboksanu U46619 nie ulega zmianie po dodaniu pinacidylu. Rzeczywiście, krzywa dla tętnicy poddanej działaniu pinacidylu przebiega wyraźnie niżej niż dwie pozostałe, jednak stopień redukcji pola światła naczynia przez sam U46619 jest porównywalny. W tym przypadku różnica między krzywymi wynika z niepełnego odwrócenia HPV. Na tym wykresie uwzględniono również tętnicę eksponowaną na medium napowietrzone gazem normoksycznym jako dodatkową kontrolę. W tych warunkach nie stwierdzono zmian pola światła naczynia.
Na Ryc. 3 przedstawiono dane z pełnej serii pomiarów dotyczących wpływu pinacidylu na HPV. W celu porównania różnic statystycznych między dwiema grupami, zestawy danych dla wskazanych punktów czasowych przeanalizowano za pomocą testu Kruskala-Wallisa oraz testu Manna-Whitneya. HPV zostało wyraźnie zniesione w obecności pinacidylu, podczas gdy skurcz indukowany U46619 pozostał bez zmian.
Alternatywnie można zidentyfikować różnice między grupami poprzez porównanie pola pod krzywą, zgodnie z opisem w pracy Müller-Redetzky et al.22
<img alt="Analiza odpowiedzi komórkowej w warunkach hipoksji; wykres powierzchni w funkcji czasu; oznaczone warunki eksperymentalne." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50970/50970fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50970/50970fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
	Rysunek 1. Pomiar HPV dużej tętnicy przedacinkowej. (A) Obrazy w kontraście fazowym przekroju tętnicy przedacinkowej (a), która biegnie w bliskim sąsiedztwie przekroju oskrzela (B). Zdjęcia wykonano w punktach czasowych zaznaczonych na wykresie (B) okręgami: na początku pomiaru (a), po zakończeniu podawania U46619 (b), po zakończeniu ekspozycji na Nipruss (c), po 30 lub 40 min w medium napowietrzonym w warunkach hipoksji (d, e), po przepłukaniu medium napowietrzonym w warunkach normoksji (f) oraz po końcowej aplikacji U46619 (g). Na wykresie (B) zmiany powierzchni światła naczynia przedstawiono w funkcji czasu, przyjmując powierzchnię światła na początku eksperymentu za 100%, natomiast skurcz i rozszerzenie naczyń podano jako wartości względne. W tym przypadku hipoksja indukuje 60% redukcję powierzchni światła. (C) Dla jaśniejszej prezentacji odpowiedzi na hipoksję pominięto początkową fazę eksperymentu, w której testowano reaktywność naczyniową, a wartość uzyskaną bezpośrednio przed ekspozycją na obniżone stężenie tlenu przyjęto za 100% (patrz również Rysunek 2). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50970/50970fig1highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz.</a>
<img alt="Odpowiedź komórkowa na hipoksję; obrazy mikroskopowe; wykresy liniowe przedstawiające zmiany powierzchni w czasie w warunkach normoksji, hipoksji i leczenia farmakologicznego." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50970/50970fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50970/50970fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
	Rycina 2. Wpływ pinacidylu (nieselektywnego otwieracza mitochondrialnych kanałów potasowych wrażliwych na ATP; mitoKATP) na HPV małych tętnic wewnątrz pęcherzykowych. (A) Tętnice wewnątrz pęcherzykowe (a) znajdują się w zagięciach przegród pęcherzykowych. Alv = pęcherzyk płucny. Sekwencja poszczególnych warunków zastosowanych w tych eksperymentach jest podana w nagłówku wykresu (B). Ekspozycja na hipoksję jest przeprowadzana w obecności lub w nieobecności 50 µM pinacidylu. Inkubacje kontrolne są wykonywane w medium nasyconym gazem normoksycznym. Zdjęcia przedstawione w (A) zostały wykonane na początku pomiaru (a, a', a"), na koniec podawania U46619 (b, b', b"), na koniec ekspozycji na Nipruss (c, c', c"), po 30 lub 40 min w medium nasyconym gazem hipoksycznym lub normoksycznym (d, d', d"; e, e', e"), po przemyciu medium nasyconym gazem normoksycznym (f, f', f") oraz po końcowym podaniu U46619 (g, g', g"). Dla przejrzystszego przedstawienia odpowiedzi na normoksję/hipoksję/hipoksję+pinacidyl, wartości uzyskane bezpośrednio przed ekspozycją na medium nasycone gazem normoksycznym/hipoksycznym przyjęto jako 100% (C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50970/50970fig2highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz.</a>
<img alt="Wyniki eksperymentu z pinacidylem w warunkach hipoksji; wykresy liniowe A i B przedstawiają analizę procentowej powierzchni w czasie." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50970/50970fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50970/50970fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> 
	Rysunek 3. Hamowanie HPV przez pinacidyl. Rejestracje z małych tętnic wewnątrzakinarnych poddanych działaniu medium napowietrzonego gazem hipoksycznym z dodatkiem lub bez dodatku 50 µM pinacidylu zostały podsumowane i przedstawione jako średnie ± SEM. Na wykresie (A) przedstawiono pełne rejestracje, a na wykresie (B) dane względne w odniesieniu do wartości na początku inkubacji w warunkach hipoksji. W PCLS poddanych działaniu medium napowietrzonego gazem hipoksycznym zawierającego pinacidyl nie stwierdzono reaktywności naczyniowej. Skurcz naczyń wywołany przez U46619 nie uległ zmianie pod wpływem leku. „n” w nawiasach odnosi się do liczby tętnic/liczby zwierząt, z których przygotowano PCLS. Innymi słowy pierwsza liczba opisuje liczbę analizowanych przekrojów płuc, a druga liczba podaje liczbę myszy, z których przygotowano te przekroje. W określonych punktach czasowych różnice między obiema grupami zostały przetestowane pod kątem istotności. n.s.: brak istotności, *: p≤0.05, **: p≤0.01, ***: p≤0.001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50970/50970fig3highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz.</a>
<img alt="Przebieg od ekstrakcji tkanki do obrazowania, schemat mikroskopii, wykres analizy danych, badanie komórek." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50970/50970fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50970/50970fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 4"> 
	Rycina 4. Schematyczny przegląd metody. W skrócie, myszy są uśmiercane poprzez zwichnięcie szyi. Po otwarciu klatki piersiowej płuca są wypełniane agarozą o niskiej temperaturze topnienia, a po ochłodzeniu cięte na precyzyjne plastry płuc (PCLS) o grubości 200 µm. Po usunięciu agarozy w temperaturze 37 °C jeden plaster PCLS jest przenoszony do przepływowej komory superfuzyjnej, w której jest eksponowany na medium normoksyczne lub medium napowietrzone 1% O2. Wasoreaktywność jest rejestrowana jako zmiany powierzchni światła naczynia. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50970/50970fig4highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz.</a>

Niedotlenienie naczyń płucnych (HPV) jest ważnym zjawiskiem fizjologicznym, dzięki któremu przy niedotlenieniu pęcherzyków płucnych perfuzja płuc jest dopasowana do wentylacji. Głównym segmentem naczyniowym przyczyniającym się do HPV jest tętnica wewnątrzgroniasta. W tym miejscu opisujemy nasz protokół analizy HPV mysich naczyń płucnych o średnicach 20-100 μm.

Analiza wideomorfometryczna niedotlenionego zwężenia naczyń płucnych tętnic wewnątrzpłucnych przy użyciu mysich precyzyjnie wyciętych plastrów płuc

Acute alveolar hypoxia causes pulmonary vasoconstriction (HPV) - also known as von Euler-Liljestrand mechanism - which serves to match lung perfusion to ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest analiza hipoksycznego skurczu naczyń płucnych w odzwierciedlonych tętnicach wewnątrz płucnych o średnicach wewnętrznych od 20 do 100 mikronów. Osiąga się to poprzez uprzednie wypełnienie dróg oddechowych płuc niskotopliwą agarozą. Drugim krokiem jest wykorzystanie wibrotomu do przecięcia wyizolowanych płuc na plastry o grubości 200 mikronów.Następnie aros jest usuwany z przekrojów płuc poprzez inkubację w temperaturze 37 °C w ciepłym medium, przez które przepuszczany jest gaz normoksyczny. Dzięki temu przekroje powoli poruszają się w cieczy. Następnie poszczególny przekrój płuca jest przenoszony do komory superfuzji przepływowej, po czym przeprowadzana jest wideomorfometryczna analiza reaktywności naczyniowej przekrojonej tętnicy.Ostatecznie ocenia się zmiany w polu przekroju światła naczynia w odpowiedzi na różne traktowania. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak mikroskopia witalna naczyni mikro naczyni podplewkowych czy pomiar napięcia naczyniowego w izolowanych proksymalnych tętnicach płucnych, jest możliwość ilościowej analizy reaktywności tętnic wewnątrz płucnych o średnicach od 20 do 100 mikrometrów. Procedurę zaprezentuje Anna Goldenberg oraz dwóch techników z tego laboratorium.Niezwłocznie po uśmierceniu myszy poprzez zwichnięcie kręgów szyjnych należy otworzyć jamę brzuszną, odsunąć pętle jelitowe i przeciąć duże naczynia brzuszne w celu upuszczenia krwi. Następnie za pomocą cienkich nożyczek należy przebić przeponę. Powoduje to zapadnięcie się płuc w wyniku przedostania się powietrza do jamy opłucnej.Kontynuuj nacinanie, aby oddzielić przeponę od dolnego otworu klatki piersiowej. Teraz przetnij żebra i obojczyk bocznie. Aby usunąć brzuszną część klatki piersiowej, wyjmij grasicę.Napełnić strzykawkę ciepłym buforem perfuzyjnym. Następnie wykonać niewielki otwór w lewej komorze serca. Dostosować przepływ buforu perfuzyjnego i powoli perfundować naczynia płucne poprzez prawą komorę, aż płuca staną się białe.Następnie usuń gruczoły ślinowe, niewielkie mięśnie oraz tkankę łączną z tchawicy. Oddziel tchawicę od otaczającej ją tkanki łącznej i wprowadź kawałek nici bawełnianej między przełyk a tchawicę w celu późniejszego podwiązania. Następnie za pomocą mikronożyczek wykonaj niewielki otwór w górnej części tchawicy, pomiędzy dwiema sąsiednimi chrząstkami tchawiczymi.Po napełnieniu strzykawki podgrzanym do 37°C agaroza niskotopliwą, należy podłączyć ją do elastycznej plastikowej kaniuli i powoli nacisnąć tłok, aż z kaniuli zostanie usunięte powietrze. Wprowadź kaniulę do niewielkiego otworu w tchawicy i ostrożnie przymocuj ją w tym miejscu za pomocą bawełnianej nici. Następnie powoli wypełnij drogi oddechowe agarozą i obserwuj płuca.W pierwszej kolejności zaczyna rozprężać się prawe płuco, a następnie lewe. Po 30 do 40 sekundach napełnianie zostaje zakończone i oba płuca są nadmuchane do objętości zbliżonej do stanu in vivo, która wynosi około 1,2 do 2,0 ml. W zależności od płci, wieku i masy ciała, ważne jest, aby wstrzykiwać emulsję jajeczną wystarczająco szybko, aby nie zdążyła ona zbyt mocno stężeć podczas procedury, ale nie tak szybko, by uszkodzić płuca.Po jednoczesnym napełnieniu płuc wyciągnij plastikową kaniulę i podwiąż tchawicę nicią bawełnianą, aby zapobiec wyciekowi materiału. Następnie przetnij tchawicę powyżej podwiązania, a aby oddzielić płuca i serce w bloku od klatki piersiowej, przenieś organy do lodowatego buforu Ringera-Hepsa w celu utwardzenia tkanek, co następuje w ciągu kilku minut oczekiwania. Użyj superkleju, aby przymocować kawałek korka od szampana do uchwytu preparatu w wibratorze, który będzie służył jako podkładka dla tkanki płucnej. Po utwardzeniu materiału oddziel poszczególne płaty płuc.Następnie za pomocą superkleju przymocuj jeden płat do uchwytu na preparaty. Aby uzyskać przekroje poprzeczne małych tętnic wewnątrzmiąższowych, pobierz płat czaszkowy prawego płuca i przyklej go powierzchnią wnęki do uchwytu; korzystając z mikrotomu wyposażonego w nową żyletkę, wykonaj cięcia od strony obwodowej, dzieląc płat płuca na plastry o grubości 200 µm. Aby uzyskać przekroje poprzeczne większych tętnic przedmiąższowych, ustaw wnękę lewego płuca w pozycji pionowej (pod kątem) i przyklej płat w tej orientacji do uchwytu, a następnie wykonaj cięcia od strony obwodowej w celu usunięcia arosów.Przenieś przekroje organów do szklanego zlewka wypełnionego około 200 mililitrami MEM o temperaturze 37 °C. Umieść zlewkę w inkubatorze i przedmuchaj gazem normoksycznym tak, aby przekroje płuc powoli poruszały się w medium. Po około dwóch godzinach pęcherzyki powietrza wypełniające tkankę płuc zostaną usunięte, a przekroje opadną na dno zlewki.W celu analizy morfometrycznej tętnic płucnych w wideo, przenieś jeden przekrój płuca do komory przepływowej, która jest zamontowana na mikroskopie i wypełniona 1,2 ml normoksycznego, napowietrzonego MEM. Przymocuj przekrój płuca do dna komory za pomocą nylonowych nici połączonych z platynowym pierścieniem. Rozpocznij perfuzję komory normoksycznym, napowietrzonym medium.Użyj mikroskopu fazokontrastowego z obiektywem 10x, aby przeszukać przekrój płuca w poszukiwaniu tętnic w przekroju poprzecznym o średnicach wewnętrznych od 20 do 100 mikronów. Po zlokalizowaniu odpowiedniego naczynia, użyj obiektywu 20x, aby zrobić zdjęcie naczynia przed podaniem asnera lub, jak pokazano tutaj, obiektywu 40x, aby zrobić zdjęcie tętnicy w trakcie podania asnera w celu pomiaru średnicy wewnętrznej naczynia. Przed rozpoczęciem eksperymentu skonfiguruj oprogramowanie tak, aby wykonywało zdjęcia tętnicy w przekroju poprzecznym w każdej minucie przez cały czas trwania eksperymentu.Po wykonaniu zdjęcia kontynuuj perfuzję komory medium gast normoksycznym przez 10 minut. Następnie zanurz przekrój płuca w roztworze U 466 19 na 10 minut bez przepływu, aby przeanalizować kurczliwość tętnicy, uwzględniając jedynie naczynia, których pole powierzchni światła uległo zmniejszeniu o co najmniej 30% pod wpływem U 466 19. Wypłucz lek medium gast normoksycznym przez 10 minut.Następnie rozszerz tętnicę poprzez aplikację res przez 10 minut przy braku przepływu. Ponownie usuń lek, przepłukując przez 10 minut ośrodkiem napowietrzonym normoksycznie z prędkością przepływu 6 ml/min, a następnie przez 10 minut przy przepływie 0,7 ml/min. Następnie inkubuj skrawka płuca w ośrodku napowietrzonym hipoksycznie przez 40 minut.Jednocześnie wprowadzić mieszaninę gazów hipoksycznych do przestrzeni powietrznej komory perfuzyjnej za pomocą dodatkowego zestawu drenów. Usunąć medium hipoksyczne, wykonując 20-minutowe przemywanie medium napowietrzonym normoksycznie, a następnie zmienić przepływ gazu w przestrzeni powietrznej komory z hipoksycznego na normoksyczny, aby sprawdzić żywotność naczynia. Na koniec eksperymentu wprowadzić U 466 19 do komory perfuzyjnej i inkubować przez 20 minut bez przepływu w celu wywołania skurczu naczyń.Powtórz te kroki na nowym przekroju płuca, aby zmierzyć reaktywność naczyniową innego naczynia. Rozpocznij analizę od wczytania obrazów tętnic w przekroju poprzecznym do programu do analizy obrazu. Następnie za pomocą kursora obrysuj obszar światła naczynia.Osuszanie dłoni jest konieczne, aby uniknąć artefaktów wynikających na przykład z przywierania komórek krwi do ścian naczyń. Kontynuuj analizę obrazów przekrojowych w podobny sposób. Każdy obraz powinien zostać poddany analizie w momencie zmiany jednej z warunków w przepływowej komorze inkubacyjnej, natomiast w przypadku braku zmian warunków wystarczająca jest analiza co drugiego obrazu.Skurcz naczyń płucnych indukowany hipoksją jest widoczny na tych obrazach w kontraście fazowym przekroju tętnicy przed ASIN, która biegnie w bliskim sąsiedztwie przekroju oskrzela. Zdjęcia wykonano w punktach czasowych zaznaczonych okręgami na wykresie: na początku pomiaru, na koniec pomiaru z zastosowaniem U 466 19, na koniec ekspozycji na RAs, po 30 lub 40 minutach w medium z gazem hipoksycznym, po płukaniu medium z gazem normoksycznym oraz po końcowej aplikacji U 466 19. Reaktywność naczyniową zapisano jako względne zmiany powierzchni światła tętnicy w przekroju w funkcji czasu. Powierzchnię na początku eksperymentu określono jako 100%, a skurcz naczyń podano jako wartości względne do powierzchni początkowej.W tym przypadku ekspozycja na hipoksję indukuje 60% redukcję powierzchni światła naczynia, aby zapewnić wyraźniejszą prezentację odpowiedzi hipoksycznej. Początkowa faza eksperymentu, w której badano reaktywność naczyń, nie została tutaj przedstawiona, a wartość uzyskaną bezpośrednio przed ekspozycją na obniżone stężenie tlenu przyjęto za 100%. Innym typem naczyń badanym w tych studiach są tętnice wewnątrzacinarnowe, które znajdują się w przegrodach pęcherzyków płucnych. W tym zestawie eksperymentów analizowany jest wpływ sidalu, nieselektywnego otwieracza mitochondrialnych kanałów potasowych wrażliwych na ATP, na hipoksyczny skurcz naczyń płucnych w małych tętnicach wewnątrzacinarnych.Przekroje są inkubowane w medium hipoksycznym. W obecności lub przy braku 50 µM sidalu przeprowadzane są inkubacje kontrolne w normoksycznym medium gast, aby uzyskać przejrzystszą prezentację odpowiedzi na normoksję, hipoksję lub hipoksję z dodatkiem sidalu. Wartości uzyskane bezpośrednio przed wystawieniem na normoksyczne lub hipoksyczne medium gast przyjmuje się za 100%. Tętnica wystawiona na działanie pineal nie wykazuje zmniejszenia powierzchni, podobnie jak tętnica inkubowana w medium hipoksycznym bez dodatków.W medium normoksycznym nie stwierdzono zmian w powierzchni światła naczynia. Rejestracje małych tętnic wewnątrz ASIN wystawionych na działanie hipoksycznego medium z dodatkiem lub bez dodatku 50 µM sidalu przedstawiono jako średnie plus lub minus SEM. Na wykresie zaprezentowano dane względne w stosunku do wartości z początku inkubacji w warunkach hipoksji.Nie wykryto reaktywności naczyniowej. W plastrach płuc poddanych działaniu gazu hipoksycznego, medium zawierające skurcz naczyń szyszynkowych wywołany przez U 466 19 nie jest pod wpływem leku. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak przygotować precyzyjne lustro, wyciąć plastry płuc oraz jak wykorzystać je do ilościowego pomiaru reaktywności VA małych tętnic wewnątrzprzewodowych o średnicach od 20 do 40 µm, które znajdują się w ścianach przegród pęcherzykowych, oraz większych tętnic przedprzewodowych o średnicach od 40 do 100 µm, przebiegających obok oskrzeli i oskrzelików.

videomorphometric-analysis-hypoxic-pulmonary-vasoconstriction-intra

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Analiza wideomorfometryczna skurczu naczyń płucnych w warunkach niedotlenienia za pomocą precyzyjnie ciętych krojów płuca mysiego

Przedstawiono metodę pomiaru prędkości przepływu krwi mikrokrążącej w raku płuc z przerzutami do powierzchni opłucnej u szczurów w sposób zautomatyzowany, przy użyciu mikroskopii przyżyciowej płuc z zamkniętą klatką piersiową. Model ten ma potencjał do wykorzystania jako szeroko rozpowszechnione narzędzie do prowadzenia badań fizjologicznych nad przerzutami do płuc u gryzoni.

Zautomatyzowany pomiar prędkości przepływu krwi w mikrokrążeniu w przerzutach do płuc szczurów

Nadciśnienie płucne wiąże się ze znacznym zmniejszeniem pulsatności, kurczliwości i elastyczności tętnicy płucnej, przyczyniając się do wzrostu ciśnienia w tętnicy płucnej i oporu płucnego. Wykorzystując niedotleniony model prosiąt, badanie to wykazało, że poprawa plastyczności tętnicy płucnej za pomocą nowo opracowanego cewnika pulsacyjnego poprawia niedotlenienie nadciśnienia płucnego.

Zwiększenie pulsacyjnego przepływu w tętnicy płucnej poprawia niedotlenienie nadciśnienia płucnego u prosiąt

Tętnicze nadciśnienie płucne (PAH) to choroba tętniczek płucnych, która prowadzi do ich zatarcia i rozwoju niewydolności prawej komory. Modele WWA u gryzoni mają kluczowe znaczenie dla zrozumienia patofizjologii WWA. Tutaj pokazujemy charakterystykę hemodynamiczną, z cewnikowaniem prawego serca i echokardiografią, u myszy i szczura.

Charakterystyka hemodynamiczna modeli tętniczego nadciśnienia płucnego u gryzoni

Ten protokół opisuje indukcję nadciśnienia płucnego (PH) u myszy na podstawie ekspozycji na niedotlenienie i wstrzyknięcia antagonisty receptora VEGF. U zwierząt rozwija się PH i przerost prawej komory (RV) 3 tygodnie po rozpoczęciu protokołu. Przedstawiono również charakterystykę funkcjonalną i morfometryczną modelu.

Indukcja i charakterystyka nadciśnienia płucnego u myszy przy użyciu modelu hipoksji/SU5416

Tutaj prezentujemy protokół do przeprowadzenia inwazyjnej oceny hemodynamicznej prawej komory i tętnicy płucnej u myszy przy użyciu metody chirurgicznej na otwartej klatce piersiowej.

Inwazyjna ocena hemodynamiczna układu prawej komory i tętniczego nadciśnienia płucnego wywołanego niedotlenieniem u myszy

Celem tej techniki jest wizualizacja ex vivo sieci tętnic płucnych u myszy wcześnie urodzonych i dorosłych poprzez napompowanie płuc i wstrzyknięcie przez tętnicę płucną nieprzezroczystego związku na bazie polimeru radiologicznego. Omówiono również potencjalne zastosowania tkanek odlewanych.

Odlew naczyniowy płuc myszy dorosłych i wczesnych po urodzeniu do obrazowania mikro-CT

Przedstawiony tutaj jest protokół zachowania kurczliwości naczyniowej mysiej tkanki płucnej PCLS, co daje wyrafinowany trójwymiarowy obraz układu oddechowego i dróg oddechowych, który może być zachowany przez okres do 10 dni, który jest podatny na liczne zabiegi.

Precyzyjnie wycięte plastry płuc jako skuteczne narzędzie do badań ex vivo struktury i kurczliwości naczyń płucnych

Ten protokół krok po kroku przeprowadza wielokrotne dożylne podawanie dawki bolusa i inwazyjne monitorowanie hemodynamiczne u myszy. Badacze mogą wykorzystać ten protokół do przyszłych badań przesiewowych związków terapeutycznych w kierunku nadciśnienia tętniczego płucnego.

Wielokrotne dożylne dawkowanie bolusa i inwazyjna ocena hemodynamiczna w modelu nadciśnienia tętniczego płucnej myszy wywołanego niedotlenieniem

Obecny protokół opisuje przygotowanie i wykorzystanie precyzyjnie wyciętych plastrów płuc myszy do oceny kurczliwości dróg oddechowych i mięśni gładkich tętnic wewnątrzpłucnych w środowisku prawie in vivo.

Wykorzystanie precyzyjnie wyciętego wycinka płuc do badania regulacji skurczowej dróg oddechowych i mięśni gładkich tętnic śródpłucnych

Tutaj opisujemy prosty i ekonomiczny protokół do przeprowadzenia bezstronnej kwantyfikacji gęstości mikrokrążenia płuc dla całej tkanki płucnej myszy za pomocą pojedynczego barwienia izolektyny B4.

Kwantyfikacja gęstości mikronaczyniowej płuc u myszy w poprzek zrazików

Poznaj metodę analizy niedotlenionego zwężenia naczyń płucnych w mysich tętnicach wewnątrzpłucnych o średnicy 20–100 μm przy użyciu wideomorfometrii precyzyjnie wyciętych plastrów płuc.

Analiza wideomorfometryczna niedotlenionego zwężenia naczyń płucnych tętnic wewnątrzpłucnych przy użyciu mysich precyzyjnie wyciętych plastrów płuc (Wideo) | JoVE Journal

Analiza wideomorfometryczna niedotlenionego zwężenia naczyń płucnych tętnic wewnątrzpłucnych przy użyciu mysich precyzyjnie wyciętych plastrów płuc

Przeglądaj więcej filmów