Analiza wideomorfometryczna niedotlenionego zwężenia naczyń płucnych tętnic wewnątrzpłucnych przy użyciu mysich precyzyjnie wyciętych plastrów płuc

Ogólnym celem niniejszej procedury jest analiza hipoksycznego skurczu naczyń płucnych w odzwierciedlonych tętnicach wewnątrz płucnych o średnicach wewnętrznych od 20 do 100 mikronów. Osiąga się to poprzez uprzednie wypełnienie dróg oddechowych płuc niskotopliwą agarozą. Drugim krokiem jest wykorzystanie wibrotomu do przecięcia wyizolowanych płuc na plastry o grubości 200 mikronów.

Następnie aros jest usuwany z przekrojów płuc poprzez inkubację w temperaturze 37 °C w ciepłym medium, przez które przepuszczany jest gaz normoksyczny. Dzięki temu przekroje powoli poruszają się w cieczy. Następnie poszczególny przekrój płuca jest przenoszony do komory superfuzji przepływowej, po czym przeprowadzana jest wideomorfometryczna analiza reaktywności naczyniowej przekrojonej tętnicy.

Ostatecznie ocenia się zmiany w polu przekroju światła naczynia w odpowiedzi na różne traktowania. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak mikroskopia witalna naczyni mikro naczyni podplewkowych czy pomiar napięcia naczyniowego w izolowanych proksymalnych tętnicach płucnych, jest możliwość ilościowej analizy reaktywności tętnic wewnątrz płucnych o średnicach od 20 do 100 mikrometrów. Procedurę zaprezentuje Anna Goldenberg oraz dwóch techników z tego laboratorium.

Niezwłocznie po uśmierceniu myszy poprzez zwichnięcie kręgów szyjnych należy otworzyć jamę brzuszną, odsunąć pętle jelitowe i przeciąć duże naczynia brzuszne w celu upuszczenia krwi. Następnie za pomocą cienkich nożyczek należy przebić przeponę. Powoduje to zapadnięcie się płuc w wyniku przedostania się powietrza do jamy opłucnej.

Kontynuuj nacinanie, aby oddzielić przeponę od dolnego otworu klatki piersiowej. Teraz przetnij żebra i obojczyk bocznie. Aby usunąć brzuszną część klatki piersiowej, wyjmij grasicę.

Napełnić strzykawkę ciepłym buforem perfuzyjnym. Następnie wykonać niewielki otwór w lewej komorze serca. Dostosować przepływ buforu perfuzyjnego i powoli perfundować naczynia płucne poprzez prawą komorę, aż płuca staną się białe.

Następnie usuń gruczoły ślinowe, niewielkie mięśnie oraz tkankę łączną z tchawicy. Oddziel tchawicę od otaczającej ją tkanki łącznej i wprowadź kawałek nici bawełnianej między przełyk a tchawicę w celu późniejszego podwiązania. Następnie za pomocą mikronożyczek wykonaj niewielki otwór w górnej części tchawicy, pomiędzy dwiema sąsiednimi chrząstkami tchawiczymi.

Po napełnieniu strzykawki podgrzanym do 37°C agaroza niskotopliwą, należy podłączyć ją do elastycznej plastikowej kaniuli i powoli nacisnąć tłok, aż z kaniuli zostanie usunięte powietrze. Wprowadź kaniulę do niewielkiego otworu w tchawicy i ostrożnie przymocuj ją w tym miejscu za pomocą bawełnianej nici. Następnie powoli wypełnij drogi oddechowe agarozą i obserwuj płuca.

W pierwszej kolejności zaczyna rozprężać się prawe płuco, a następnie lewe. Po 30 do 40 sekundach napełnianie zostaje zakończone i oba płuca są nadmuchane do objętości zbliżonej do stanu in vivo, która wynosi około 1,2 do 2,0 ml. W zależności od płci, wieku i masy ciała, ważne jest, aby wstrzykiwać emulsję jajeczną wystarczająco szybko, aby nie zdążyła ona zbyt mocno stężeć podczas procedury, ale nie tak szybko, by uszkodzić płuca.

Po jednoczesnym napełnieniu płuc wyciągnij plastikową kaniulę i podwiąż tchawicę nicią bawełnianą, aby zapobiec wyciekowi materiału. Następnie przetnij tchawicę powyżej podwiązania, a aby oddzielić płuca i serce w bloku od klatki piersiowej, przenieś organy do lodowatego buforu Ringera-Hepsa w celu utwardzenia tkanek, co następuje w ciągu kilku minut oczekiwania. Użyj superkleju, aby przymocować kawałek korka od szampana do uchwytu preparatu w wibratorze, który będzie służył jako podkładka dla tkanki płucnej. Po utwardzeniu materiału oddziel poszczególne płaty płuc.

Następnie za pomocą superkleju przymocuj jeden płat do uchwytu na preparaty. Aby uzyskać przekroje poprzeczne małych tętnic wewnątrzmiąższowych, pobierz płat czaszkowy prawego płuca i przyklej go powierzchnią wnęki do uchwytu; korzystając z mikrotomu wyposażonego w nową żyletkę, wykonaj cięcia od strony obwodowej, dzieląc płat płuca na plastry o grubości 200 µm. Aby uzyskać przekroje poprzeczne większych tętnic przedmiąższowych, ustaw wnękę lewego płuca w pozycji pionowej (pod kątem) i przyklej płat w tej orientacji do uchwytu, a następnie wykonaj cięcia od strony obwodowej w celu usunięcia arosów.

Przenieś przekroje organów do szklanego zlewka wypełnionego około 200 mililitrami MEM o temperaturze 37 °C. Umieść zlewkę w inkubatorze i przedmuchaj gazem normoksycznym tak, aby przekroje płuc powoli poruszały się w medium. Po około dwóch godzinach pęcherzyki powietrza wypełniające tkankę płuc zostaną usunięte, a przekroje opadną na dno zlewki.

W celu analizy morfometrycznej tętnic płucnych w wideo, przenieś jeden przekrój płuca do komory przepływowej, która jest zamontowana na mikroskopie i wypełniona 1,2 ml normoksycznego, napowietrzonego MEM. Przymocuj przekrój płuca do dna komory za pomocą nylonowych nici połączonych z platynowym pierścieniem. Rozpocznij perfuzję komory normoksycznym, napowietrzonym medium.

Użyj mikroskopu fazokontrastowego z obiektywem 10x, aby przeszukać przekrój płuca w poszukiwaniu tętnic w przekroju poprzecznym o średnicach wewnętrznych od 20 do 100 mikronów. Po zlokalizowaniu odpowiedniego naczynia, użyj obiektywu 20x, aby zrobić zdjęcie naczynia przed podaniem asnera lub, jak pokazano tutaj, obiektywu 40x, aby zrobić zdjęcie tętnicy w trakcie podania asnera w celu pomiaru średnicy wewnętrznej naczynia. Przed rozpoczęciem eksperymentu skonfiguruj oprogramowanie tak, aby wykonywało zdjęcia tętnicy w przekroju poprzecznym w każdej minucie przez cały czas trwania eksperymentu.

Po wykonaniu zdjęcia kontynuuj perfuzję komory medium gast normoksycznym przez 10 minut. Następnie zanurz przekrój płuca w roztworze U 466 19 na 10 minut bez przepływu, aby przeanalizować kurczliwość tętnicy, uwzględniając jedynie naczynia, których pole powierzchni światła uległo zmniejszeniu o co najmniej 30% pod wpływem U 466 19. Wypłucz lek medium gast normoksycznym przez 10 minut.

Następnie rozszerz tętnicę poprzez aplikację res przez 10 minut przy braku przepływu. Ponownie usuń lek, przepłukując przez 10 minut ośrodkiem napowietrzonym normoksycznie z prędkością przepływu 6 ml/min, a następnie przez 10 minut przy przepływie 0,7 ml/min. Następnie inkubuj skrawka płuca w ośrodku napowietrzonym hipoksycznie przez 40 minut.

Jednocześnie wprowadzić mieszaninę gazów hipoksycznych do przestrzeni powietrznej komory perfuzyjnej za pomocą dodatkowego zestawu drenów. Usunąć medium hipoksyczne, wykonując 20-minutowe przemywanie medium napowietrzonym normoksycznie, a następnie zmienić przepływ gazu w przestrzeni powietrznej komory z hipoksycznego na normoksyczny, aby sprawdzić żywotność naczynia. Na koniec eksperymentu wprowadzić U 466 19 do komory perfuzyjnej i inkubować przez 20 minut bez przepływu w celu wywołania skurczu naczyń.

Powtórz te kroki na nowym przekroju płuca, aby zmierzyć reaktywność naczyniową innego naczynia. Rozpocznij analizę od wczytania obrazów tętnic w przekroju poprzecznym do programu do analizy obrazu. Następnie za pomocą kursora obrysuj obszar światła naczynia.

Osuszanie dłoni jest konieczne, aby uniknąć artefaktów wynikających na przykład z przywierania komórek krwi do ścian naczyń. Kontynuuj analizę obrazów przekrojowych w podobny sposób. Każdy obraz powinien zostać poddany analizie w momencie zmiany jednej z warunków w przepływowej komorze inkubacyjnej, natomiast w przypadku braku zmian warunków wystarczająca jest analiza co drugiego obrazu.

Skurcz naczyń płucnych indukowany hipoksją jest widoczny na tych obrazach w kontraście fazowym przekroju tętnicy przed ASIN, która biegnie w bliskim sąsiedztwie przekroju oskrzela. Zdjęcia wykonano w punktach czasowych zaznaczonych okręgami na wykresie: na początku pomiaru, na koniec pomiaru z zastosowaniem U 466 19, na koniec ekspozycji na RAs, po 30 lub 40 minutach w medium z gazem hipoksycznym, po płukaniu medium z gazem normoksycznym oraz po końcowej aplikacji U 466 19. Reaktywność naczyniową zapisano jako względne zmiany powierzchni światła tętnicy w przekroju w funkcji czasu. Powierzchnię na początku eksperymentu określono jako 100%, a skurcz naczyń podano jako wartości względne do powierzchni początkowej.

W tym przypadku ekspozycja na hipoksję indukuje 60% redukcję powierzchni światła naczynia, aby zapewnić wyraźniejszą prezentację odpowiedzi hipoksycznej. Początkowa faza eksperymentu, w której badano reaktywność naczyń, nie została tutaj przedstawiona, a wartość uzyskaną bezpośrednio przed ekspozycją na obniżone stężenie tlenu przyjęto za 100%. Innym typem naczyń badanym w tych studiach są tętnice wewnątrzacinarnowe, które znajdują się w przegrodach pęcherzyków płucnych. W tym zestawie eksperymentów analizowany jest wpływ sidalu, nieselektywnego otwieracza mitochondrialnych kanałów potasowych wrażliwych na ATP, na hipoksyczny skurcz naczyń płucnych w małych tętnicach wewnątrzacinarnych.

Przekroje są inkubowane w medium hipoksycznym. W obecności lub przy braku 50 µM sidalu przeprowadzane są inkubacje kontrolne w normoksycznym medium gast, aby uzyskać przejrzystszą prezentację odpowiedzi na normoksję, hipoksję lub hipoksję z dodatkiem sidalu. Wartości uzyskane bezpośrednio przed wystawieniem na normoksyczne lub hipoksyczne medium gast przyjmuje się za 100%. Tętnica wystawiona na działanie pineal nie wykazuje zmniejszenia powierzchni, podobnie jak tętnica inkubowana w medium hipoksycznym bez dodatków.

W medium normoksycznym nie stwierdzono zmian w powierzchni światła naczynia. Rejestracje małych tętnic wewnątrz ASIN wystawionych na działanie hipoksycznego medium z dodatkiem lub bez dodatku 50 µM sidalu przedstawiono jako średnie plus lub minus SEM. Na wykresie zaprezentowano dane względne w stosunku do wartości z początku inkubacji w warunkach hipoksji.

Nie wykryto reaktywności naczyniowej. W plastrach płuc poddanych działaniu gazu hipoksycznego, medium zawierające skurcz naczyń szyszynkowych wywołany przez U 466 19 nie jest pod wpływem leku. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak przygotować precyzyjne lustro, wyciąć plastry płuc oraz jak wykorzystać je do ilościowego pomiaru reaktywności VA małych tętnic wewnątrzprzewodowych o średnicach od 20 do 40 µm, które znajdują się w ścianach przegród pęcherzykowych, oraz większych tętnic przedprzewodowych o średnicach od 40 do 100 µm, przebiegających obok oskrzeli i oskrzelików.