Analiza wideomorfometryczna niedotlenionego zwężenia naczyń płucnych tętnic wewnątrzpłucnych przy użyciu mysich precyzyjnie wyciętych plastrów płuc

Ogólnym celem tej procedury jest analiza niedotlenionego zwężenia naczyń płucnych lustrzanych tętnic wewnątrzpłucnych o średnicach wewnętrznych od 20 do 100 mikronów. Osiąga się to poprzez pierwsze wypełnienie dróg oddechowych płuc aros o niskiej temperaturze topnienia. Drugim krokiem jest użycie wibratora do pokrojenia izolowanych płuc na plastry o grubości 200 mikronów.

Następnie aros jest usuwany z odcinków płuc przez inkubację w 37 stopniach Celsjusza, ciepłym podłożu, które jest bąbelkowane gazem normoksycznym. Tak więc sekcje poruszają się powoli w płynie. Następnie pojedynczy wycinek płuca jest przenoszony do komory przepływowej przez superfuzję, po czym następuje wideomorfometryczna analiza reaktywności naczyń krwionośnych tętnicy o przekroju poprzecznym.

Ostatecznie oceniane są zmiany w obszarze świetlnym naczynia w odpowiedzi na różne zabiegi. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak mikroskopia przyżyciowych mikronaczyń podopłucnowych, jest pomiar napięcia naczyniowego w izolowanych proksymalnych tętnicach płucnych, jest to, że umożliwia ona ilościową analizę reaktywności VA tętnic wewnątrzpłucnych o średnicach od 20 do 100 mikrometrów. Procedurę zademonstruje Anna Goldenberg i dwoje techników z tego laboratorium.

Natychmiast po zabiciu myszy przez zwichnięcie szyjki macicy otwórz jamę brzuszną, odsuń pętle jelitowe na bok i odetnij duże naczynia brzuszne w celu krwawienia. Następnie użyj cienkich nożyczek, aby przebić membranę. Powoduje to zapadanie się płuc w wyniku wnikania powietrza do jamy opłucnej.

Kontynuuj cięcie, aby odłączyć membranę od dolnego otworu klatki piersiowej. Teraz odetnij żebra i obojczyk na boki. Aby usunąć brzuszną część klatki piersiowej, wyjmij grasicę.

Napełnij strzykawkę ciepłym buforem perfuzyjnym. Następnie wytnij mały otwór w lewej komorze serca. Wyreguluj odpływ buforu perfuzyjnego i powoli perfunduj naczynia płucne przez prawą komorę, aż płuca staną się białe.

Następnie usuń gruczoły ślinowe, małe mięśnie i tkankę łączną z tchawicy. Odłącz tchawicę od otaczającej tkanki łącznej i włóż kawałek bawełny do szycia między przełyk a tchawicę w celu późniejszego podwiązania. Następnie za pomocą mikronożyczek wytnij mały otwór w górnej części tchawicy między dwiema sąsiednimi chrząstkami tchawicy.

Po napełnieniu strzykawki ciepłym agrosem o temperaturze 37 stopni Celsjusza, podłącz go do elastycznej plastikowej kaniuli i powoli wciskaj tłok, aż powietrze zostanie usunięte z kaniuli. Włóż kaniulę do małego otworu w tchawicy i ostrożnie zakotwicź ją na miejscu za pomocą bawełny do szycia. Następnie powoli wypełnij drogi oddechowe aros i obserwuj płuca.

Na początku zaczyna się rozszerzać prawe płuco, a następnie lewe płuco. Po 30 do 40 sekundach napełnianie jest zakończone, a oba płuca są napełniane do objętości porównywalnej z sytuacją in vivo, która wynosi około 1,2 do 2,0 mililitrów. W zależności od płci, wieku i wagi, Ważne jest, aby wstrzyknąć różę jajową na tyle szybko, aby nie zestaliła się tak podczas zabiegu, ale nie tak szybko, aby uszkodzić płuca.

Po jednoczesnym napełnieniu płuc wyciągnij plastikową kaniulę i podwiąż tchawicę bawełną do szycia, aby zapobiec wyciekaniu aros. Następnie przeciąć tchawicę powyżej ligatury i odłączyć płuca i serce w bloku od klatki piersiowej, przenieś narządy do lodowatego bufora dzwonka w celu zestalenia agros, co następuje w ciągu kilku minut podczas oczekiwania. Użyj super kleju, aby przymocować kawałek korka od szampana do uchwytu na próbkę wibratora, aby działał jako odchylenie do tyłu dla tkanki płucnej Po zestaleniu się agrosu oddziel poszczególne płaty płuc.

Następnie super klej, jeden płatek do uchwytu próbki. Aby uzyskać przekroje poprzeczne małych tętnic wewnątrzczaszkowych, weź płat czaszki prawego płuca i przyklej go powierzchnią wnęki do uchwytu, używając vibrato wyposażonego w świeżą żyletkę pokrojoną z obrzeża, tnąc płat płuca na plastry o grubości 200 mikronów. Aby uzyskać przekroje poprzeczne większych tętnic przedwstępnych, wyrównaj wnękę lewego płuca z korkiem od szampana i przyklej płat w tej orientacji do uchwytu, a następnie odetnij od obwodu w celu usunięcia aros.

Przenieś skrawki organów do szklanej zlewki wypełnionej około 200 mililitrami o temperaturze 37 stopni Celsjusza. MEM umieścić zlewkę w komorze grzewczej i bańkować gazem normoksycznym, aby sekcje płuc powoli poruszały się w pożywce. Po około dwóch godzinach blaszki arosowe wypełniające powietrze zostaną usunięte z tkanki płucnej, a skrawki osiądą na dnie zlewki.

W celu wideoanalizy morfometrycznej tętnic wewnątrzpłucnych należy przenieść jeden odcinek płuca do komory przepływowej przez fuzję, która jest zamontowana na mikroskopie i wypełniona 1,2 mililitra gazowania normoksycznego. MEM. Przymocuj część płucną na dnie komory za pomocą nylonowych sznurków połączonych z platynowym pierścieniem. Rozpocznij perfuzję komory za pomocą normoksycznego medium gazowego.

Użyj mikroskopu z kontrastem fazowym z obiektywem 10x, aby zeskanować odcinek płuc w poszukiwaniu tętnic o przekroju poprzecznym o średnicach wewnętrznych od 20 do 100 mikronów. Po zlokalizowaniu rozsądnego naczynia kandydackiego, użyj obiektywu 20 x, aby zrobić zdjęcie naczynia pre asner lub, jak pokazano tutaj, obiektywu 40 x, aby zrobić zdjęcie tętnicy wewnątrz asnera w celu zmierzenia wewnętrznej średnicy naczynia. Przed rozpoczęciem eksperymentu skonfiguruj oprogramowanie tak, aby robiło zdjęcia przeciętej tętnicy co minutę podczas całego eksperymentu.

Po wyzwoleniu fotografii kontynuuj perfuzję komory normoksycznym medium gazowym przez 10 minut. Następnie kąpać odcinek płucny w U 466 19 przez 10 minut bez przepływu, aby przeanalizować kurczliwość tętnicy przy użyciu tylko naczyń, których obszary świetlne zostały zmniejszone o co najmniej 30%Z U 466 19. Umyj lek normoksycznym podłożem gazowym przez 10 minut.

Następnie rozszerz tętnicę przez zastosowanie res przez 10 minut bez niskiego przepływu. Ponownie usuń lek przez 10-minutowe mycie normoksycznym gazowanym medium o natężeniu przepływu sześciu mililitrów na minutę, a następnie 10 minut przy przepływie 0,7 mililitra na minutę. Następnie inkubować wycinek płuca z wysoko hipoksyjnym gazowanym podłożem przez 40 minut.

Mieszaninę gazów niedotlenionych należy również wprowadzić do przestrzeni powietrznej komory perfuzyjnej za pomocą dodatkowego zestawu przewodów. Usunąć podłoże hipoksyjne przez 20-minutowe przemycie normoksycznym medium gazowym i przełączyć przepływ gazu z hipoksycznego na normoksyjny do przestrzeni powietrznej komory w celu sprawdzenia żywotności naczynia. Pod koniec eksperymentu nałożyć U 466 19 do komory perfuzyjnej i inkubować przez 20 minut bez przepływu w celu wywołania zwężenia naczyń krwionośnych.

Powtórz te kroki ze świeżym wycinkiem płuca, aby zmierzyć reaktywność naczyń krwionośnych w innym naczyniu. Rozpocznij analizę od załadowania obrazów tętnic o przekroju poprzecznym do programu do analizy obrazu. Następnie użyj kursora, aby obrysować obszar świetlny naczynia.

Suszenie rąk jest konieczne, ponieważ pozwala uniknąć artefaktów spowodowanych na przykład przez komórki krwi przyczepione do ściany naczyniowej. Kontynuuj analizę obrazów przekrojowych w podobny sposób. Każdy obraz powinien być analizowany, gdy jeden warunek w komorze inkubacyjnej przepływu jest zmieniany na inny, ale analiza każdego innego obrazu jest wystarczająca, gdy warunki się nie zmieniają.

Niedotlenienie naczynia płucnego można zaobserwować na tych obrazach z kontrastem fazowym tętnicy pre ASIN o przekroju poprzecznym, która biegnie w bliskiej odległości od oskrzela o przekroju poprzecznym. Zdjęcia wykonywane są w punktach czasowych oznaczonych okręgami na wykresie na początku pomiaru, na końcu pomiaru z U 466 19, na końcu ekspozycji na RA po 30 lub 40 minutach w niedotlenionym środowisku gazowym, po przemyciu normoksycznym medium gazowym, a po końcowym zastosowaniu U 466 19 reaktywność naczynkową rejestruje się jako względne zmiany pola świetlnego przekroju poprzecznego tętnica przeciwko czasowi. Obszar na początku eksperymentu definiuje się jako 100%, a zwężenie naczyń krwionośnych podaje się jako wartości względem obszaru początkowego.

W tym przypadku narażenie na niedotlenienie powoduje zmniejszenie obszaru światła o 60%, co zapewnia wyraźniejszą prezentację reakcji niedotlenienia. Początkowa faza eksperymentu, w której badano reaktywność naczyń, nie jest tutaj pokazana, a wartość uzyskana bezpośrednio przed ekspozycją na zredukowany tlen jest ustalona na 100%Innym typem naczyń badanych w tych badaniach są tętnice intra ASIN, które znajdują się w klinach przegród pęcherzykowych. W tym zestawie eksperymentów w tym celu przeanalizowano wpływ sidala, nieselektywnego otwieracza mitochondrialnych kanałów potasowych wrażliwych na A TP na niedotlenienie naczyń płucnych małych tętnic wewnątrzczaszkowych.

Plastry inkubuje się w podłożu hipoksyjnym. W przypadku braku lub obecności 50 mikromolowych kontrolnych sydlanów przeprowadza się inkubacje w normoksyjnym pożywce żołądkowej w celu wyraźniejszego przedstawienia odpowiedzi na normoksję lub niedotlenienie lub niedotlenienie plus sidal. Wartości uzyskane bezpośrednio przed ekspozycją na normoksyjne lub niedotlenione podłoże żołądka ustala się na 100%Tętnica wystawiona na działanie szyszynki nie wykazuje zmniejszenia powierzchni, podobnie jak tętnica inkubowana w podłożu hipoksyjnym bez dodatków.

W ośrodku normoksycznym nie są wykrywalne żadne zmiany w obszarze światła. Zapisy małych tętnic wewnątrzwewnątrzcząsteczkowych ASIN wystawionych na działanie niedotlenionego podłoża żołądkowego z lub bez sidal 50 mikromolowych są przedstawione jako średnie plus lub minus SEM. Na tym wykresie przedstawiono dane względne w stosunku do wartości na początku inkubacji niedotlenienia.

Nie jest wykrywalna reaktywność nazóbr. W wycinkach płuc narażonych na niedotlenienie żołądka lek nie ma wpływu na podłoże zawierające zwężenie naczyń szyszynki wywołane przez U 466 19. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować precyzję lustra, wyciąć plastry płuc i jak je wykorzystać do ilościowego pomiaru reaktywności VA małych tętnic intraazjatyckich o średnicach od 20 do 40 mikrometrów, które znajdują się w Gazy przegród pęcherzykowych, oraz większych tętnic pre Atena o średnicach od 40 do 100 mikrometrów, które biegną w sąsiedztwie Bronchi i Bronchioli.