Autonomicznie bioluminescencyjne komórki ssaków do ciągłego monitorowania cytotoksyczności w czasie rzeczywistym
28 października 2013
Komórki ssaków wyrażające kasetę genu bioluminescencji bakteryjnej (luksy) wytwarzają światło autonomicznie. Wykazano, że uzyskana dynamika bioluminescencyjna po ekspozycji chemicznej odzwierciedla wpływ leczenia na wzrost i metabolizm komórek, dzięki czemu komórki te są niedrogim, ciągłym narzędziem do badań przesiewowych toksyczności w czasie rzeczywistym, które można łatwo dostosować do automatyzacji o wysokiej przepustowości.
Ogólnym celem niniejszej procedury jest wykorzystanie autonomicznie luminescencyjnych ludzkich komórek do ciągłego i w czasie rzeczywistym monitorowania cytotoksyczności. Jest to realizowane poprzez najpierw uzyskanie odpowiedniej liczby aktywnie rosnących komórek autobioluminescencyjnych. W drugim kroku równa liczba komórek jest wysiewana do poszczególnych studzienek płytki wielodołkowej.
Następnie komórki poddaje się działaniu badanego związku w różnych stężeniach. W ostatnim kroku sygnał bioluminescencyjny jest pomierzony przy użyciu odpowiedniego urządzenia. Ostatecznie dynamika emisji bioluminescencji może posłużyć do wykazania wpływu badanego związku na aktywność metaboliczną komórek.
Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak te wykorzystujące lucyferazę izolowaną z owadów lub gatunków głębinowych, jest fakt, że do uzyskania wykrywalnego sygnału nie jest wymagane niszczenie próbki ani dodawanie substratu. Procedurę zaprezentuje James Webb, student studiów licencjackich z laboratorium. Po wyhodowaniu bioluminescencyjnych komórek zainteresowania do 80% konfluencji w odpowiednim medium hodowlanym, przemyć hodowlę komórkową w PBS, delikatnie kołysząc naczyniem, a następnie poddać komórki działaniu trypsyny w 37 °C, aż odłączą się one od kolby. Następnie zebrać resuspendowane komórki w PBS, przenieść je do czystej probówki wirówkowej i określić liczbę komórek po ich przeliczeniu. Wirować zawiesinę komórkową przez pięć minut przy 300 ×g w temperaturze pokojowej, a następnie resuspendować.
Resuspend osad w świeżym, uprzednio podgrzanym medium, a następnie wysiej równą liczbę komórek do poszczególnych studni nieprzezroczystej płytki wielodołkowej; do jednego zestawu trzech studni wlej samą równą objętość medium jako kontrolę negatywną. Pozostaw trzy studnie z komórkami niepoddanymi działaniu czynnika jako kontrole, a do pozostałych dodaj bezpośrednio badany związek eksperymentalny w odpowiednich stężeniach w trzech powtórzeniach. Bezpośrednio po traktowaniu eksperymentalnym umieść płytkę w komorze obrazującej odpowiedniego urządzenia w celu akwizycji obrazów i pomiaru bioluminescencji.
Następnie ustaw odpowiedni czas integracji dla każdego odczytu i mierz bioluminescencję co 15 minut przez okres 24 godzin. Na koniec użyj odpowiedniego kompatybilnego oprogramowania, aby zdefiniować obszar zainteresowania (ROI) w każdej studzience. Aby określić natężenie bioluminescencji dla każdej próbki doświadczalnej, wyświetl emisję światła w fotonach na sekundę w celu zobrazowania całkowitego strumienia lub w fotonach na sekundę na centymetr kwadratowy na Ceridian, aby wykazać średnią promieniowatość każdej próbki.
W niniejszym badaniu dynamikę autobioluminescencyjnych komórek HEC 2 9 3 monitorowano w sposób ciągły przez okres 24 godzin w odpowiedzi na ekspozycję na antybiotyk. Toksyczne działanie tego antybiotyku, należącego do rodziny Blio Mycin i znanego z wywoływania śmierci komórek poprzez wiązanie i rozcinanie DNA, wykazano poprzez spadek produkcji bioluminescencji w porównaniu z komórkami nieleczonymi, co można bezpośrednio zwizualizować na obrazach w pseudokolorach. Jak tutaj pokazano, bioluminescencyjny charakter komórek HEC 2 9 3 umożliwia powtarzalny, równoległy przesiew próbek w różnych warunkach traktowania, co pozwala na porównanie różnych stężeń w badaniu eksperymentalnym w dowolnym punkcie czasowym w celu łatwej analizy zależności dawka-odpowiedź.
Na przykład na tym wykresie bioluminescencja produkowana przez komórki po 15, 18 lub 20 godzinach traktowania została przedstawiona w zależności od stężeń dodanego związku doświadczalnego, co ilustruje, że zwiększenie dawki antybiotyku prowadzi do redukcji produkcji bioluminescencji przez komórki w sposób zależny od dawki. Technika zaprezentowana w tym filmie nadaje się do śledzenia ostrych efektów toksycznych, ale można ją dostosować do oceny toksyczności o powolnym działaniu lub długoterminowej poprzez wielokrotne obrazowanie komórek w zwiększonych odstępach czasu, przy jednoczesnym utrzymywaniu hodowli w standardowych warunkach inkubacji pomiędzy pomiarami.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie demonstruje zastosowanie bioluminescencyjnych ludzkich komórek do ciągłego monitorowania cytotoksyczności w czasie rzeczywistym. Poprzez pomiar sygnału bioluminescencyjnego badacze mogą oceniać aktywność metaboliczną komórek w odpowiedzi na różne związki.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia komórki
- Bioluminescencja
- Badania toksyczności
Wstęp
- Komórki ssaków mogą wyrazzać bakteryjne geny bioluminescencji.
- Komórki te emitują światło autonomicznie, co odzwierciedla ich stan metaboliczny.
- Monitorowanie w czasie rzeczywistym oferuje przewagi nad tradycyjnymi metodami.
- Przy zastosowaniu tego podejścia możliwa jest automatyzacja wysokoprzepustowa.
Cel badania
- Opracowanie metody monitorowania cytotoksyczności w czasie rzeczywistym.
- Wykorzystanie sygnału bioluminescencyjnego jako wskaźnika stanu zdrowia komórek.
- Umożliwienie wysokoprzepustowego przesiewu związków.
Zastosowane metody
- Pozyskać aktywnie rosnące bioluminescencyjne komórki ludzkie.
- Wysiać taką samą liczbę komórek do płytek wielodołkowych.
- Poddać komórki działaniu związków w różnych stężeniach.
- Zmierzyć sygnały bioluminescencyjne przy użyciu odpowiednich urządzeń.
Główne wyniki
- Dynamika bioluminescencji koreluje z efektami leczenia.
- Wzrost oraz metabolizm komórkowy można monitorować w czasie rzeczywistym.
- Metoda ta jest kosztowo efektywna i możliwa do zautomatyzowania.
- Wyniki wykazują potencjał do zastosowań wysokoprzepustowych.
Wnioski
- Bioluminescencyjne komórki ludzkie są skuteczne w badaniach przesiewowych toksyczności.
- Metoda ta umożliwia ciągłe monitorowanie reakcji komórkowych.
- Stanowi ona obiecujące narzędzie dla badaczy w dziedzinie toksykologii.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Autonomicznie bioluminescencyjne komórki ssaków umożliwiają ciągłe, nieniszczące monitorowanie cytotoksyczności, rozwiązując problem wysokich kosztów i dużego nakładu czasu charakterystycznych dla tradycyjnych testów niszczących. Podejście to pozwala na odczyty metaboliczne w czasie rzeczywistym, co zwiększa pewność prognostyczną we wczesnej walidacji celów i identyfikacji związków wiodących poprzez powiązanie ekspozycji na związek z dynamiką kondycji komórek. Kompatybilność tej metody z istniejącą infrastrukturą obrazowania oraz potencjał automatyzacji zwiększają skalowalność w ramach korporacyjnych procesów badawczo-rozwojowych (R&D).
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez korelację emisji bioluminescencyjnej z metabolizmem i wzrostem komórek w czasie rzeczywistym.
- Wartość operacyjna: Wspiera funkcjonalną walidację celu poprzez zapewnienie odczytu biosentynela, który odzwierciedla niekorzystny wpływ na żywotność komórek bez niszczenia próbki.
- Wartość prognostyczna: Ułatwia analizę zależności dawka-odpowiedź oraz redukcję ryzyka mechanistycznego dzięki możliwości wielokrotnych pomiarów w różnych stężeniach i punktach czasowych.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Gotowość do analizy: Przygotowanie zwalidowanych systemów biologicznych do dalszego przesiewu poprzez stworzenie stabilnych, autonomicznych linii komórkowych emitujących światło.
- Powtarzalność: Zapewnienie spójnych wyników ilościowych dzięki normalizacji wysiewu oraz kontrolowanym warunkom środowiskowym.
- Skalowalność: Możliwość równoległego przetwarzania próbek na płytkach wielodołkowych z wykorzystaniem standardowego sprzętu obrazującego, co wspiera wysokoprzepustową ocenę związków.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Zapewnia monitorowanie istotne z punktu widzenia choroby od etapu odkrywania po etapy przedkliniczne poprzez śledzenie adaptacji metabolicznej do ekspozycji na toksykant.
- Decyzje skorygowane o ryzyko: Wspiera kryteria postępu badań poprzez powiązanie dynamiki bioluminescencji z progami zdrowia komórkowego obserwowanymi w krzywych dawka-odpowiedź.
- Zgodność z biomarkerami: Wykorzystuje emisję światła jako funkcjonalny biomarker stanu metabolicznego, umożliwiając korelację z wynikami fenotypowymi w modelach przedklinicznych.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta integruje się z kontinuum procesu odkrywania leków – od wczesnych badań biologicznych po identyfikację wiodących związków (lead identification), gdzie monitorowanie cytotoksyczności w czasie rzeczywistym pozwala na priorytetyzację związków przed rozpoczęciem inwestycji w fazie przedklinicznej.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez poprzez powiązanie zmian sygnału bioluminescencyjnego z zaburzeniami metabolicznymi indukowanymi przez związek.
- Screening: Zapewnia gotowość testu dzięki powtarzalnemu pomiarowi sygnału w czasie, co umożliwia wiarygodne porównanie warunków traktowania.
- Analityka: Dostarcza ilościowych odczytów strumienia i promieniowania, które pozwalają zespołom ocenić kinetykę cytotoksyczności oraz siłę działania.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość przedkliniczną poprzez utrzymanie żywotności komórek podczas monitorowania podłużnego, co odzwierciedla odpowiedzi metaboliczne zbliżone do warunków in vivo.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy wielokrotnego użytku platformę biosensorową, którą można dostosować do wielu celów i klas związków w ramach różnych projektów.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej dzięki ciągłemu, bezznakowemu śledzeniu metabolizmu.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację i powtarzalność poprzez eliminację etapów dodawania odczynników oraz niszczenia próbek.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową, umożliwiając ponowne wykorzystanie próbek i redukując koszty materiałów eksploatacyjnych w badaniach cytotoksyczności.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko, dostarczając wczesnych danych o obciążeniach metabolicznych, co ułatwia podejmowanie decyzji go/no-go.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w hodowli komórek ssaków oraz stabilnej transfekcji w celu utrzymania linii wykazujących ekspresję lucyferazy.
- Zależy od dostępu do sprzętu do obrazowania przy słabym oświetleniu, zdolnego do detekcji bioluminescencji metodą zliczania fotonów.
- Wymaga standaryzacji gęstości wysiewu, warunków inkubacji oraz odstępów czasowych między pomiarami we wszystkich zespołach badawczych.
- Wiąże się z koniecznością uwzględnienia adaptacji przy rozszerzeniu metody na pierwotne linie komórkowe lub linie niepochodzące od ludzi o różnej wydajności transfekcji.
- Jest ograniczony przez zależność sygnału od metabolizmu, co może nie pozwolić na uchwycenie niemetabolicznych mechanizmów cytotoksyczności.
