Name: Nukleofekcja neuroblastów gryzoni do badania migracji neuroblastów in vitro (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-12T19:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 32 s
Description: Poznaj metodę nukleofekcji neuroblastów gryzoni do badania migracji komórkowej in vitro. Technika ta umożliwia analizę wpływu białek docelowych na ruch neuroblastów przy użyciu immunofluorescencji i mikroskopii czasowo-przestrzennej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta została sfinansowana z grantu Wellcome Trust Project Grant przyznanego P.D. i G.L. (089236/Z/09/Z). S.G. S.G. była wspierana przez stypendium doktoranckie Rady ds. Badań Biotechnologii i Nauk Biologicznych. Dziękujemy Matthieu Vermerenowi za miły dar w postaci wektora shRNA oraz Jennifer Shieh za cenne porady dotyczące nukleofekcji neuroblastów.

Ta procedura jest zgodna z przepisami brytyjskiego Ministerstwa Spraw Wewnętrznych (Animal Scientific Procedures Act, 1986). Naukowcy powinni postępować zgodnie z wytycznymi ustanowionymi i zatwierdzonymi przez ich instytucje i krajowe organizacje regulacyjne zajmujące się zwierzętami.
1. Sekcja i dysocjacja neuroblastów RMS szczura
<ol>
	<li>Przygotuj roztwory wymagane do rozwarstwienia i dysocjacji RMS:</li>
</ol>
Podłoże do preparacji (100 ml) 
Zbilansowany roztwór soli Hank's (HBSS) - 98,5 ml 
5 M HEPES pH 7,4 - 0,5 ml 
Penicylina-streptomycyna (10 000 jednostek/ml i 10 000 μg/ml) - 1 ml
Medium dysocjacyjne (2 ml) 
HBSS - 1.760 ml 
10x Trypsyna (2,5%) - 200 μl 
DNAse1 (1 mg/ml) - 40 μl
Dulbecco Modified Eagle's Medium (DMEM) + 10% Płodowa Surowica Cielęca (FCS) (40 ml) 
DMEM - 36 ml 
FCS - 4 ml
Kompletne medium (12 ml)
Pożywka neuropodstawowa - 11,46 ml 
B27 Suplement - 250 μl 
L-Glutamina (200 mM) - 125 μl 
Glukoza (45%) - 165 μl
2. Przefiltrować-wysterylizować DMEM + 10% FCS i całe podłoże i wstępnie zrównoważyć je w inkubatorze o temperaturze 37 °C / 5% CO2 .
<ol>
	<li>Rozwarstwienie
	<ol>
		<li>Poświęć miot szczurów P6-P7 (około 12 młodych) przez zwichnięcie szyjki macicy i odetnij głowę nożyczkami.</li>
		<li>Wykonaj przednio-tylne nacięcie w skórze wzdłuż szwu środkowego strzałkowego od nosa do móżdżku za pomocą ostrza skalpela. Zdejmij skórę i powtórz to samo nacięcie wzdłuż czaszki.</li>
		<li>Delikatnie usuń płaty czaszki za pomocą kleszczy i ostrożnie usuń mózg szpatułką, uważając, aby uwzględnić opuszki węchowe.</li>
		<li>Wytnij najbardziej ogonową jedną trzecią mózgu i wyrzuć ją.</li>
		<li>Pokrój tkankę mózgową na plastry koronalne o grubości 1,4 mm za pomocą rozdrabniacza do tkanek.</li>
		<li>Umieść plastry w naczyniach zawierających zimne podłoże do preparacji i ostrożnie oddziel je za pomocą igły.</li>
		<li>RMS pojawia się jako trójkątny, półprzezroczysty obszar w środku sekcji położniczej i jako mały, okrągły obszar w bardziej ogonowych wycinkach mózgu. Wytnij RMS z każdego plasterka nożem mikrochirurgicznym, uważając, aby nie uwzględnić otaczającej tkanki. U szczeniąt szczurów P7 zwykle ~8 najbardziej rostralnych plasterków (w tym OB) zawiera RMS.</li>
		<li>Zebrać fragmenty RMS za pomocą plastikowej pipety Pasteura i umieścić je w małym naczyniu zawierającym zimne podłoże preparacyjne na lodzie.</li>
		<li>Po zakończeniu sekcji przenieś fragmenty RMS do probówki o pojemności 15 ml za pomocą plastikowej pipety. Pozostaw fragmenty, aby osiadły na dnie tuby.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dysocjacji
	<ol>
		<li>Zastąp pożywkę do rozwarstwiania 2 ml pożywki dysocjującej.</li>
		<li>Rozcierać fragmenty RMS, delikatnie pipetując zawiesinę fragmentów w górę i w dół około 10 razy za pomocą pipety P1000.</li>
		<li>Pozostaw probówkę z fragmentami tkanek w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na 2 minuty.</li>
		<li>Ponownie odpipetować roztwór 10 razy i upewnić się, że fragmenty uległy dysocjacji (zawiesina powinna stać się mętna).</li>
		<li>Dezaktywuj trypsynę, dodając 5 ml wstępnie podgrzanego DMEM + 10% FCS.</li>
		<li>Odwirować zawiesinę komórkową o sile 433 x g przez 5 minut.</li>
		<li>W międzyczasie należy podwielokrotnić wymaganą ilość siRNA/DNA do probówek Eppendorfa (zwykle 3-5 μg DNA/shRNA lub 5-9 μg oligo siRNA na nukleofekcję, jednak ilość DNA/siRNA może wymagać optymalizacji).</li>
		<li>Usunąć nadmiar pożywki i ponownie zawiesić osad komórkowy przez delikatne pipetowanie w 5 ml wstępnie podgrzanego DMEM + 10% FCS.</li>
		<li>Wykonaj zliczanie komórek. Spodziewaj się ~1 x 106 komórek na mózg szczeniaka szczura. Do każdej nukleofekcji wymagane jest minimum 2,5 x 106 komórek, podczas gdy optymalne wyniki osiąga się przy użyciu 3-4 x 106 komórek na nukleofekcję.</li>
		<li>Odwirować zawiesinę komórkową o sile 433 x g przez 5 minut. Upewnij się, że usunąłeś jak najwięcej pożywki.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Nucleofekcja
<ol>
	<li>Natychmiast ponownie zawiesić osad komórkowy w roztworze jądra neuronu szczura (lub myszy, jeśli używa się komórek myszy) uprzednio inkubowanym w temperaturze pokojowej. Użyj 100 μl na nukleofekcję. Uwaga: zazwyczaj miot szczurów składający się z 12 szczeniąt wystarcza do wykonania 4 zarodków, a miot myszy (12 młodych) wystarcza do wykonania 2 zarodków.</li>
	<li>Przenieść 100 μl zawiesiny komórkowej do każdej probówki Eppendorfa zawierającej siRNA/DNA i delikatnie wymieszać 2-3 razy pipetując pipetą P200.</li>
	<li>Dodaj próbkę (zawiesinę komórka-DNA/siRNA) na dno kuwety nukleofekcyjnej, uważając, aby uniknąć pęcherzyków.</li>
	<li>Nucleofect za pomocą programu G-013 (dla komórek szczura) lub O-005 (dla komórek myszy). Jedna nukleofekcja trwa około 5 sekund.</li>
	<li>Szybko dodać 1 ml wstępnie podgrzanego DMEM + 10% FCS do nukleofektowanej próbki.</li>
	<li>Powtórzyć kroki 2.4 i 2.5 dla wszystkich pozostałych próbek. Uwaga: dla uzyskania optymalnych rezultatów cała procedura nukleofekcji nie powinna trwać dłużej niż 5 minut.</li>
	<li>Przenieść każdą próbkę do probówki o pojemności 15 ml zawierającej 5 ml wstępnie podgrzanego DMEM + 10% FCS za pomocą plastikowej pipety dostarczonej przez zestaw do nukleofekcji. Unikaj przenoszenia jakichkolwiek zanieczyszczeń komórkowych do tuby.</li>
	<li>Odwirować próbki o masie 433 x g przez 5 minut.</li>
	<li>Ostrożnie usunąć nadmiar pożywki i ponownie zawiesić osad w 25-30 μl wstępnie podgrzanego DMEM + 10% FCS za pomocą pipety P20. Nie należy używać więcej niż 30 μl podłoża.</li>
	<li>Odpipetować zawiesinę w postaci kropli na wewnętrzną stronę pokrywki naczynia p35.</li>
	<li>Odwrócić pokrywkę nad szalką p35 zawierającą 2 ml kompletnej pożywki (patrz również rysunek 1).</li>
	<li>Pozostawić w inkubatorze (37 °C/5% CO2 ) na co najmniej 5 godzin do 7 godzin. Dłuższy czas inkubacji pozwala na lepszą ponowną agregację klastrów komórek.</li>
	<li>Przenieś wiszące krople z pokrywki do kompletnego podłoża w naczyniu za pomocą pipety P1000 z odciętą końcówką.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 37 °C/5% CO2 przez 24 godziny w przypadku nukleofekcji DNA i 48 godzin w przypadku nukleofekcji siRNA/shRNA.</li>
</ol>
3. Osadzanie
<ol>
	<li>Przygotować kompletną pożywkę (25 ml) i wstępnie ją zrównoważyć w temperaturze 37 °C/5% CO2 przez kilka godzin.</li>
	<li>Z zamrażarki w temperaturze -80 °C wyjąć zamrożone cząstki matrycy membrany podstawnej i rozmrozić na lodzie w chłodni.</li>
	<li>Dla każdego nukleofekcji przygotuj 6-centymetrowe naczynie zawierające do ośmiu sterylnych warg nakrywkowych o średnicy 13 mm.</li>
	<li>Umieść naczynia na pojemniku na lód pokrytym folią spożywczą. Ważne jest, aby szkiełka nakrywkowe były chłodne, aby zapobiec zastyganiu matrycy podczas procedury zatapiania.</li>
	<li>Aby utrzymać wilgotność, umieść pasek wilgotnej tkanki w 15-centymetrowym naczyniu, które posłuży do przechowywania do trzech 6-centymetrowych naczyń zawierających osadzone neuroblasty.</li>
	<li>Dodaj kompletną pożywkę do rozmrożonej matrycy w stosunku 1:3. Na przykład, zmieszać 40 μl kompletnej pożywki ze 120 μl matrycy przez pipetowanie. Taka ilość matrycy jest wystarczająca do zatopienia kruszywa na ośmiu szkiełkach nakrywkowych o średnicy 12 mm.</li>
	<li>Przenieść zgrupowane komórki do probówki o pojemności 15 ml i wirować przy 433 x g przez 5 minut.</li>
	<li>Usunąć nadmiar pożywki i ponownie zawiesić osad w 10 μl kompletnego podłoża.</li>
	<li>Umieścić 2 μl zawiesiny agregatu komórkowego na każdym sterylnym szkiełku nakrywkowym i dodać 18 μl mieszaniny matrycy/kompletnego podłoża. Za pomocą końcówki pipety rozprowadź matrycę na całym szkiełku nakrywkowym.</li>
	<li>Natychmiast umieścić 6 cm naczynie zawierające szkiełka nakrywkowe w naczyniu o średnicy 15 cm i pozostawić w inkubatorze (37°C / 5% CO2) na 15-20 minut. Gdy matryca stwardnieje, delikatnie dodaj 5 ml kompletnej pożywki do każdego 6-centymetrowego naczynia, uważając, aby docisnąć pływające szkiełko nakrywkowe końcówką pipety.</li>
	<li>Inkubować przez 24 godziny w temperaturze 37 °C / 5% CO2 , aby umożliwić neuroblastom migrację z agregatów komórkowych.</li>
</ol>
4. 3D Test migracji
<ol>
	<li>Przygotuj roztwory wymagane do barwienia immunologicznego.
	<ol>
		<li>Przygotować roztwór blokowy: 
		Roztwór blokowy kóz (50 ml) 
		Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) - 5 ml 
		Kozia surowica - 7,5 ml 
		10% Triton X-100 - 1,5 ml 
		BSA - 50 mg 
		H2O - 36 ml</li>
		<li>Przefiltrować i przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Przygotuj roztwór utrwalający: 
		Roztwór utrwalający (100 ml) 
		Paraformaldehyd (PFA) - 4 g UWAGA: PFA należy zawsze przechowywać pod kapturem 
		Sacharoza - 20 g (opcjonalnie) 
		PBS do 100 ml</li>
		<li>Na gorącej płycie i przy ciągłym mieszaniu rozpuścić PFA w 80 ml PBS utrzymywanym w temperaturze 65 °C.</li>
		<li>Po rozpuszczeniu PFA dodać 20 g sacharozy.</li>
		<li>Dostosuj pH do 7,4 (zwykle dodając ~60 μl 1 M NaOH na 100 ml roztworu).</li>
		<li>Doprowadzić do całkowitej objętości 100 ml za pomocą PBS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Barwienie immunologiczne
	<ol>
		<li>Umieść szkiełka nakrywkowe w płytce 24-dołkowej.</li>
		<li>Spłukać szkiełka nakrywkowe za pomocą PBS 2x.</li>
		<li>Utrwalić agregaty neuroblastów RMS roztworem utrwalającym przez 45 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Spłucz szkiełka nakrywkowe PBS 3x (5 min/pranie - na bujanej platformie).</li>
		<li>Blokuj przez 30-60 minut roztworem bloku kozy.</li>
		<li>Rozcieńczyć przeciwciała pierwszorzędowe w roztworze bloku koziego i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C. (W razie potrzeby do roztworu przeciwciała pierwszorzędowego można również dodać fluorescencyjną falloidynę (1:400) i barwnik Hoechsta (1:10 000) w celu uwidocznienia nitkowatej aktyny i jąder).</li>
		<li>Spłucz szkiełka nakrywkowe PBS 3x (5 min/pranie).</li>
		<li>Rozcieńczyć przeciwciała drugorzędowe w roztworze bloku koziego i inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Spłucz szkiełka nakrywkowe PBS 3x (5 min/pranie)</li>
		<li>Szkiełka nakrywkowe zamontować za pomocą fluorescencyjnego podłoża montażowego i pozostawić do wyschnięcia na noc w temperaturze pokojowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza migracji
	<ol>
		<li>Rejestruj obrazy stałych agregatów neuroblastów RMS za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego przy użyciu obiektywu 10X. Dołączanie paska skali do przykładowego obrazu.</li>
		<li>Aby skonfigurować skalę do oceny ilościowej, zmierz pasek skali na obrazie, wybierając narzędzie "Linia prosta" na pasku narzędzi ImageJ.</li>
		<li>Wybierz opcję "Analizuj" i kliknij "ustaw skalę".</li>
		<li>W oknie skali ustaw "znaną odległość" i zaznacz pole "globalne", aby zachować te same ustawienia dla wszystkich pomiarów.</li>
		<li>Użyj narzędzia "Linia segmentowana" na pasku narzędzi ImageJ, aby zmierzyć odległość od krawędzi agregatu do najdalej migrującego neuroblastu w 6 różnych sektorach wokół całego agregatu (Rysunek 3B). Do analizy należy brać pod uwagę tylko izolowane agregacje.</li>
		<li>Obliczyć średnią odległość migracji na podstawie 6 wartości uzyskanych dla każdego agregatu.</li>
		<li>Zmierz 10–20 wartości zagregowanych dla każdego warunku w każdym niezależnym eksperymencie i zbierz wyniki z co najmniej trzech niezależnych eksperymentów. Zawsze dołączaj kontrolę nukleofekcji (np. GFP lub kontrolną sh/siRNA).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Ming, G. L., Song, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+Neurogenesis+in+the+Mammalian+Brain%3A+Significant+Answers+and+Significant+Questions%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Adult Neurogenesis in the Mammalian Brain: Significant Answers and Significant Questions.</a> Neuron. 70, 687-702 (2011).</li>
<li>Alonso, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+adult-born+neurons+facilitates+learning+and+and+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Activation of adult-born neurons facilitates learning and and memory.</a> Nat. Neurosci. 15, 897-U127 (2012).</li>
<li>Lazarini, F., Lledo, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+adult+neurogenesis+essential+for+olfaction%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Is adult neurogenesis essential for olfaction?</a> Trends Neurosci. 34, 20-30 (2011).</li>
<li>Arvidsson, A., Collin, T., Kirik, D., Kokaia, Z., Lindvall, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+replacement+from+endogenous+precursors+in+the+adult+brain+after+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Neuronal replacement from endogenous precursors in the adult brain after stroke.</a> Nat. Med. 8, 963-970 (2002).</li>
<li>Jin, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+stroke-induced+neurogenesis+in+the+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Evidence for stroke-induced neurogenesis in the human brain.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 13198-13202 (2006).</li>
<li>Kim, Y., Szele, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+subventricular+zone+stem+cells+after+neuronal+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Activation of subventricular zone stem cells after neuronal injury.</a> Cell Tissue Res. 331, 337-345 (2008).</li>
<li>Massouh, M., Saghatelyan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De-routing+neuronal+precursors+in+the+adult+brain+to+sites+of+injury%3A+Role+of+the+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">De-routing neuronal precursors in the adult brain to sites of injury: Role of the vasculature.</a> Neuropharmacology. 58, 877-883 (2010).</li>
<li>Pathania, M., Yan, L. D., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+symphony+of+signals+conducts+early+and+late+stages+of+adult+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">A symphony of signals conducts early and late stages of adult neurogenesis.</a> Neuropharmacology. 58, 865-876 (2010).</li>
<li>Lois, C., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-Distance+Neuronal+Migration+in+the+Adult+Mammalian+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Long-Distance Neuronal Migration in the Adult Mammalian Brain.</a> Science. 264, 1145-1148 (1994).</li>
<li>Lois, C., Garcia-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chain+migration+of+neuronal+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Chain migration of neuronal precursors.</a> Science. 271, 978-981 (1996).</li>
<li>Belvindrah, R., Nissant, A., Lledo, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormal+Neuronal+Migration+Changes+the+Fate+of+Developing+Neurons+in+the+Postnatal+Olfactory+Bulb%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Abnormal Neuronal Migration Changes the Fate of Developing Neurons in the Postnatal Olfactory Bulb.</a> J. Neurosci. 31, 7551-7562 (2011).</li>
<li>Battista, D., Rutishauser, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Removal+of+Polysialic+Acid+Triggers+Dispersion+of+Subventricularly+Derived+Neuroblasts+into+Surrounding+CNS+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+.Neurosci%22%5BJournal%5D)">Removal of Polysialic Acid Triggers Dispersion of Subventricularly Derived Neuroblasts into Surrounding CNS Tissues.</a> J .Neurosci. 30, 3995-4003 (2010).</li>
<li>Conover, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+Eph%2Fephrin+signaling+affects+migration+and+proliferation+in+the+adult+subventricular+zone%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Disruption of Eph/ephrin signaling affects migration and proliferation in the adult subventricular zone.</a> Nat. Neurosci. 3, 1091-1097 (2000).</li>
<li>Mobley, A. K., McCarty, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((beta+8+Integrin+is+Essential+for+Neuroblast+Migration+in+the+Rostral+Migratory+Stream%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">beta 8 Integrin is Essential for Neuroblast Migration in the Rostral Migratory Stream.</a> Glia. 59, 1579-1587 (2011).</li>
<li>Nguyen-Ba-Charvet, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+roles+for+slits+in+the+control+of+cell+migration+in+the+rostral+migratory+stream%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Multiple roles for slits in the control of cell migration in the rostral migratory stream.</a> J. Neurosci. 24, 1497-1506 (2004).</li>
<li>Garzotto, D., Giacobini, P., Crepaldi, T., Fasolo, A., De Marchis, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocyte+growth+factor+regulates+migration+of+olfactory+interneuron+precursors+in+the+rostral+migratory+stream+through+Met-Grb2+coupling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Hepatocyte growth factor regulates migration of olfactory interneuron precursors in the rostral migratory stream through Met-Grb2 coupling.</a> J. Neurosci. 28, 5901-5909 (2008).</li>
<li>Platel, J. C., Stamboulian, S., Nguyen, I., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotransmitter+signaling+in+postnatal+neurogenesis%3A+The+first+leg%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res.+Rev%22%5BJournal%5D)">Neurotransmitter signaling in postnatal neurogenesis: The first leg.</a> Brain Res. Rev. 63, 60-71 (2010).</li>
<li>Dityateva, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+efficient+electroporation-based+gene+transfer+into+primary+dissociated+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Meth%22%5BJournal%5D)">Rapid and efficient electroporation-based gene transfer into primary dissociated neurons.</a> J. Neurosci. Meth. 130, 65-73 (2003).</li>
<li>Shieh, J. C., Schaar, B. T., Srinivasan, K., Brodsky, F. M., McConnell, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocytosis+Regulates+Cell+Soma+Translocation+and+the+Distribution+of+Adhesion+Proteins+in+Migrating+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Endocytosis Regulates Cell Soma Translocation and the Distribution of Adhesion Proteins in Migrating Neurons.</a> PloS One. 6, (2011).</li>
<li>Viesselmann, C., Ballweg, J., Lumbard, D., Dent, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleofection+and+Primary+Culture+of+Embryonic+Mouse+Hippocampal+and+Cortical+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons.</a> J. Vis. Exp. , e2373(2011).</li>
<li>Gartner, A., Collin, L., Lalli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleofection+of+primary+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Method+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Nucleofection of primary neurons.</a> Method Enzymol. 406 (06), 374-388 (2006).</li>
<li>Causeret, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+p21-Activated+Kinase+Is+Required+for+Neuronal+Migration+in+the+Cerebral+Cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cereb.+Cortex%22%5BJournal%5D)">The p21-Activated Kinase Is Required for Neuronal Migration in the Cerebral Cortex.</a> Cereb. Cortex. 19, 861-875 (2009).</li>
<li>Bron, R., Eickholt, B. J., Vermeren, M., Fragale, N., Cohen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+knockdown+of+neuropilin-1+in+the+developing+chick+nervous+system+by+siRNA+hairpins+phenocopies+genetic+ablation+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dynam%22%5BJournal%5D)">Functional knockdown of neuropilin-1 in the developing chick nervous system by siRNA hairpins phenocopies genetic ablation in the mouse.</a> Dev. Dynam. 230, 299-308 (2004).</li>
<li>Sonego, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fascin+regulates+the+migration+of+subventricular+zone-derived+neuroblasts+in+the+postnatal+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Fascin regulates the migration of subventricular zone-derived neuroblasts in the postnatal brain.</a> J. Neurosci. 33, 12171-12185 (2013).</li>
<li>Ward, M., Rao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigations+of+neuronal+migration+in+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Investigations of neuronal migration in the central nervous system.</a> Methods Mol. Biol. 294, 137-156 (2005).</li>
<li>Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+Selection+for+High-Expression+Transfectants+with+a+Novel+Eukaryotic+Vector%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Efficient Selection for High-Expression Transfectants with a Novel Eukaryotic Vector.</a> Gene. 108, 193-199 (1991).</li>
<li>Peretto, P., Giachino, C., Aimar, P., Fasolo, A., Bonfanti, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chain+formation+and+glial+tube+assembly+in+the+shift+from+neonatal+to+adult+subventricular+zone+of+the+rodent+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Chain formation and glial tube assembly in the shift from neonatal to adult subventricular zone of the rodent forebrain.</a> J. Comp. Neurol. 487, 407-427 (2005).</li>
<li>Khlghatyan, J., Saghatelyan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-lapse+Imaging+of+Neuroblast+Migration+in+Acute+Slices+of+the+Adult+Mouse+Forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain.</a> J. Vis. Exp. , e4061(2012).</li>
<li>Bozoyan, L., Khlghatyan, J., Saghatelyan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes+Control+the+Development+of+the+Migration-Promoting+Vasculature+Scaffold+in+the+Postnatal+Brain+via+VEGF+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Astrocytes Control the Development of the Migration-Promoting Vasculature Scaffold in the Postnatal Brain via VEGF Signaling.</a> J. Neurosci. 32, 1687-1704 (2012).</li>
<li>Whitman, M. C., Fan, W., Rela, L., Rodriguez-Gil, D. J., Greer, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+Vessels+Form+a+Migratory+Scaffold+in+the+Rostral+Migratory+Stream%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Blood Vessels Form a Migratory Scaffold in the Rostral Migratory Stream.</a> J. Comp. Neurol. 516, 94-104 (2009).</li>
<li>Sonego, M., Ya, Z., Oudin, M. J., Doherty, P., Lalli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+Postnatal+Electroporation+and+Time-lapse+Imaging+of+Neuroblast+Migration+in+Mouse+Acute+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain.</a> J. Vis. Exp. , in press (2013).</li>
<li>Feliciano, D. M., Lafourcade, C. A., Bordey, A., lique, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatal+Subventricular+Zone+Electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Neonatal Subventricular Zone Electroporation.</a> J. Vis. Exp. , e50197(2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Migracja neuroblastów wzdłuż RMS do ostatecznej lokalizacji w OB jest podstawowym krokiem w neurogenezie poporodowej. Jednak mechanizmy molekularne kontrolujące ten złożony proces są dalekie od pełnego zrozumienia.
Opisana tutaj procedura eksperymentalna pozwala na badanie migracji neuroblastów in vitro. Dostosowaliśmy wcześniej opublikowany protokół izolacji neuroblastów RMS od myszy lub szczura we wczesnym okresie poporodowym25. Aby osiągnąć optymalne wyniki, ważne jest, aby opanować etap sekcji, ponieważ ważne jest, aby ograniczyć do minimum odstęp czasu między rozwarstwieniem a nukleofekcją. Po nukleofekcji neuroblasty mogą zostać ponownie zagregowane, osadzone w trójwymiarowej matrycy i pozostawione do migracji w ciągu 24 godzin. Alternatywnie, do celów innych niż migracja (np. immunofluorescencja lub analiza western blot), komórki można natychmiast po nukleofekcji posiać na szkiełkach nakrywkowych pokrytych poliornityną/lamininą, gdzie przeżywają do 4-5 dni. Neuroblasty myszy i szczurów migrują w Matrigel w podobnym stopniu, jednak komórki myszy wydają się mieć silniejszą tendencję do migracji w łańcuchach niż komórki szczurów.
W zależności od celu badania, neuroblasty mogą być nukleofektowane różnymi plazmidami kodującymi białka fluorescencyjne lub białka typu dzikiego/zmutowanego. W celu uzyskania optymalnej ekspresji białek wysoce zalecane są plazmidy z promotorem CAG (promotor β-aktyny ze wzmacniaczem CMV i ogonem poli-A β-globiny)26 . Co więcej, oligonukleukleotydy siRNA lub plazmidy shRNA mogą być nukleekowane w celu powalenia celów będących przedmiotem zainteresowania. Efektywne zubożenie białek można uwidocznić za pomocą immunofluorescencji lub western blot (zwykle liza osadzonych agregatów od 1 szczeniaka szczura z 50 μl standardowego buforu do lizy).
Nucleofekcja jest stosunkowo prostą metodą transfekcji pierwotnych neuroblastów, stanowi łatwiejszą i szybszą alternatywę dla transfekcji za pośrednictwem wektora wirusowego i może osiągnąć wysoką (~ 70-80%) skuteczność transfekcji. Bardzo ważne jest, aby pracować szybko podczas procedury nukleofekcji, ponieważ pozostawienie neuroblastów w roztworze nukleofekcji przez dłuższy czas drastycznie zmniejsza żywotność komórek.
Średnia wydajność komórek z sekcji RMS jest stosunkowo niska dla myszy P7 (~5 x 105 komórek / mózg) w porównaniu ze szczurami P7 (~ 1 x 106 komórek / mózg) i co najmniej 3 x 106 komórek na jądro są wymagane do osiągnięcia transfekcji z ~ 50% wydajnością. Co więcej, neuroblasty szczurów wydają się być bardziej odporne na nukleofekcję w porównaniu z neuroblastami myszy. W związku z tym młode szczurów we wczesnym okresie pourodzeniowym (P6-P7) mogą stanowić wygodne źródło neuroblastów, biorąc również pod uwagę, że organizacja RMS szczurów i myszy jest niezwykle podobna27 i że zakres migracji neuroblastów szczurów i myszy in vitro jest również porównywalny. Zaleca się, aby nie przechowywać ponownie zagregowanych klastrów neuroblastów nukleofektycznych w zawiesinie dłużej niż 48 godzin, aby uniknąć nieprawidłowego wpływu na morfologię i migrację komórek (nasze niepublikowane obserwacje).
Opisany tutaj test 3D może być wykorzystany do ilościowego określenia migracji neuroblastów w ustalonym punkcie czasowym po osadzeniu w matrycy (np. 24 godziny). W analizie można wykorzystać agregaty o różnych rozmiarach, ponieważ nie ma istotnej korelacji między wielkością agregatów a odległością migracji (nasze niepublikowane obserwacje). Aby zobrazować i dalej badać dynamikę migracji neuroblastów, można zastosować obrazowanie poklatkowe. Zaleca się przeprowadzenie analizy migracji w odstępie 24 godzin po osadzeniu, ponieważ prędkość neuroblastów wydaje się drastycznie zmniejszać w dłuższych punktach czasowych (nasze niepublikowane obserwacje).
Istnieją pewne ograniczenia tego protokołu. Po pierwsze, nukleofekcja może być do tej pory stosowana do wczesnych neuroblastów gryzoni po urodzeniu, podczas gdy zakażenie wektorami wirusowymi pozostaje najbardziej efektywną metodą transfekcji dla dorosłych neuroblastów28. Po drugie, test migracji in vitro nie odtwarza w pełni złożonej architektury RMS obserwowanej in vivo. Rzeczywiście, chociaż neuroblasty zachowują zdolność do migracji w podobny sposób jak ich odpowiedniki in vivo , w opisanej tutaj konfiguracji eksperymentalnej brakuje im interakcji z innymi składnikami RMS, takimi jak astrocyty i naczynia krwionośne, które również przyczyniają się do regulacji ich ruchliwości9,29,30. Problem ten może zostać rozwiązany w przyszłości poprzez optymalizację trójwymiarowych systemów modeli kokultury.
Podsumowując, połączenie nukleofekcji z testem migracji 3D stanowi cenne narzędzie do lepszego zrozumienia mechanizmów molekularnych leżących u podstaw migracji neuroblastów. Ta eksperymentalna procedura zapewnia wstępną, szybką i stosunkowo prostą metodę oceny roli potencjalnych regulatorów migracji neuroblastów, która może być dalej zwalidowana za pomocą innych podejść, takich jak elektroporacja poporodowa in vivo i obrazowanie poklatkowe kultur wycinków mózgu28,31,32.

W mózgu ssaków po urodzeniu generowanie nowych neuronów (neurogeneza) zachodzi przez całe życie i jest ograniczone do dwóch nisz neurogennych: strefy podkomorowej (SVZ) komór bocznych i strefy podziarnistej zakrętu zębatego hipokampa1. Kilka ostatnich badań wykazało ważną rolę neurogenezy dorosłych w ułatwianiu zadań związanych z uczeniem się i pamięcią2,3. Co więcej, dowody na proliferację i rekrutację neuronalnych komórek progenitorowych po uszkodzeniu mózgu4-7 zwiększają możliwość farmakologicznej aktywacji neurogenezy w naprawie neuronów.
Neurogeneza poporodowa jest ściśle regulowana we wszystkich swoich fazach, które obejmują proliferację neuronalnych progenitorów, migrację, różnicowanie, przeżycie i końcową integrację synaptyczną nowo narodzonych neuronów8. Progenitory neuronalne (neuroblasty) pochodzące z komórek macierzystych SVZ migrują na dużą odległość przez rostralny strumień migracyjny (RMS) w kierunku opuszki węchowej (OB), gdzie dojrzewają do funkcjonalnych neuronów9. Neuroblasty wędrowne są przeważnie jednobiegunowe, z wydłużonym ciałem komórkowym przedłużającym pojedynczy proces wiodący. Komórki te poruszają się w łańcuchach w sposób zbiorowy, przesuwając się po sobie10. Migracja jest kluczowym krokiem dla późniejszego dojrzewania progenitorów pochodzących z SVZ do funkcjonalnych neuronów11 i jest kontrolowana przez wiele czynników i cząsteczki prowadzące, w tym: polisjalilowaną cząsteczkę adhezyjną komórek nerwowych (PSA-NCAM)12, Efryny13, integryny14, szczeliny15, czynniki wzrostu16 i neuroprzekaźniki17, jednak mechanizmy molekularne leżące u podstaw tego procesu nie są w pełni poznane. Badanie wewnątrzkomórkowych szlaków sygnałowych regulujących migrację neuroblastów nie tylko pozwoli lepiej zrozumieć neurogenezę dorosłych, ale także przyczyni się do opracowania nowych podejść terapeutycznych wspomagających naprawę mózgu.
Ten manuskrypt opisuje szczegółowy protokół do badania roli kandydatów na regulatory migracji neuroblastów in vitro za pomocą nukleofekcji i testu migracji 3D. Nukleofekcja to technika transfekcji komórek oparta na ulepszonej metodzie elektroporacji. Specyficzny dla typu komórki prąd elektryczny i roztwór nukleofekcji umożliwiają przenoszenie makrocząsteczek polianionowych, takich jak wektory DNA i shRNA oraz oligonukleotydy siRNA, bezpośrednio do jądra komórkowego i umożliwiają transfekcję wolno dzielących się lub mitotycznie nieaktywnych komórek, takich jak neurony embrionalne i ssacze18. Metoda ta jest szybka, stosunkowo łatwa do wykonania i skutkuje wysoce powtarzalną transfekcją szerokiego zakresu typów komórek, w tym pierwotnych neuroblastów i neuronów19-21.
Dysocjacja tkanki RMS pozwala na izolację migrujących neuroblastów, które mogą być z powodzeniem nukleofektowane za pomocą wektorów DNA/shRNA lub oligonukleotydów siRNA ukierunkowanych na interesujące geny. Po nukleofekcji neuroblasty są ponownie agregowane w wiszące krople, a następnie osadzane w trójwymiarowej matrycy Matrigel. Warunki te umożliwiają neuroblastom migrację z agregatów komórkowych w celu podsumowania trybu migracji obserwowanego in vivo, zapewniając w ten sposób doskonały system modelowy do badania szlaków sygnałowych zaangażowanych w migrację neuroblastów i oceny wpływu leczenia farmakologicznego na ruchliwość tych komórek.

<table><tbody><tr><td>Hank' s Zrównoważony roztwór soli (HBSS)</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>14175129</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375-25G</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>2,5% Trypsyna-EDTA (10x)</td><td>Gibco</td><td>15090-046</td><td>sklep 200 &mikro; l podwielokrotności przy -20 &deg; </td></tr><tr><td>C DNAzy I Fiolka (D2)</td><td>Worthington</td><td>LK003170</td><td>&ge; 1 000 jednostek na fiolkę; Przechowuj 50 i mikro; l podwielokrotności przy -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Dulbecco Zmodyfikowane podłoże orła (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>11960-044</td><td></td></tr><tr><td>Surowica cielęca płodu (FCS)</td><td>Hyclon</td><td>SH3007902</td><td></td></tr><tr><td>Podłoże neurobazalne</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Suplement B27</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina (200 mM)</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór D-(+)-glukozy (45%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8769</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Matrigel Podstawna membrana membranowa, Zredukowany czynnik wzrostu (GFR), Bez czerwieni fenolowej, 10 ml, bez LDEV</td><td>BD Biosciences</td><td>356231</td><td>przygotować 120 &mikro; l podwielokrotności przy 4 & stopniach; C, a następnie przechowywać w temperaturze -80 & deg; C</td></tr><tr><td>PFA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>441242</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>BDH</td><td>102745C</td><td></td></tr><tr><td>Surowica kozia</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>69023</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>VWR International Ltd.</td><td>306324N</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Fisher Chemical</td><td>BPE9701-100</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescencyjne medium montażowe Dako</td><td></td><td>S3023</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw nukleofekcji neuronów szczurzych</td><td>Lonza</td><td>VPG-1003</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw nuklepekcji neuronów myszy</td><td>Lonza</td><td>VPG-1001</td><td></td></tr><tr><td>Nóż mikrochirurgiczny</td><td>Angiotech</td><td>7516</td><td></td></tr><tr><td>McIlwain rozdrabniacz tkanek</td><td>Mickle Laboratory Engineering Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nucleofector II</td><td>Lonza</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

nukleofekcja neuroblastów gryzoni do badania migracji neuroblastów in vitro

Nucleofection of Rodent Neuroblasts to Study Neuroblast Migration In vitro

Strefa podkomorowa (SVZ) znajdująca się w bocznej ścianie komór bocznych odgrywa fundamentalną rolę w neurogenezie dorosłych. W tym ograniczonym obszarze mózgu nerwowe komórki macierzyste namnażają się i stale generują neuroblasty, które migrują stycznie w łańcuchach wzdłuż rostralnego strumienia migracyjnego (RMS), aby dotrzeć do opuszki węchowej (OB). Po dotarciu do OB neuroblasty przełączają się na migrację promieniową, a następnie różnicują się w dojrzałe neurony zdolne do włączenia się do istniejącej wcześniej sieci neuronalnej. Prawidłowa migracja neuroblastów jest podstawowym etapem neurogenezy, zapewniającym prawidłowe dojrzewanie funkcjonalne nowo narodzonych neuronów. Biorąc pod uwagę zdolność neuroblastów pochodzących z SVZ do celowania w uszkodzone obszary mózgu, badanie mechanizmów wewnątrzkomórkowych leżących u podstaw ich ruchliwości nie tylko poprawi zrozumienie neurogenezy, ale może również przyczynić się do rozwoju strategii neuroregeneracyjnych.
Ten manuskrypt opisuje szczegółowy protokół transfekcji pierwotnych neuroblastów RMS RMS gryzoni oraz analizę ich ruchliwości za pomocą testu migracji 3D in vitro, podsumowującego ich sposób migracji obserwowany in vivo. Zarówno neuroblasty szczurów, jak i myszy mogą być szybko i skutecznie transfekowane poprzez nukleofekcję plazmidowym DNA, małym spinką do włosów (sh)RNA lub krótkimi interferującymi oligonukleotydami (si)RNA ukierunkowanymi na interesujące geny. Aby przeanalizować migrację, komórki nukleofektyczne są ponownie agregowane w "wiszące krople", a następnie osadzane w trójwymiarowej matrycy. Nukleofekcja sama w sobie nie upośledza znacząco migracji neuroblastów. Leczenie farmakologiczne neuroblastów nukleofektycznych i reagregowanych można również przeprowadzić w celu zbadania roli szlaków sygnałowych zaangażowanych w migrację neuroblastów.

Neuroblasty można z sukcesem wyizolować z wyciętej tkanki RMS (Ryc. 1A) i osadzić w macierzy trójwymiarowej. Komórki wyizolowane z postnatalnego RMS szczura lub myszy są immunopozytywne w stosunku do markerów migrujących neuroblastów, takich jak doublecortin (DCX), βIII tubulin lub PSA-NCAM (Ryc. 1B-C).
Rozdzielone neuroblasty można efektywnie poddać nukleofekcji DNA (np. plazmidem kodującym GFP, Rycina 2) lub plazmidami shRNA (Rycina 4>) w celu uzyskania deplekcji białka, co można ocenić za pomocą analizy western blot (Rycina 4B>) lub immunofluorescencji (nie pokazano).
Komórki poddane nukleofekcji plazmidami kodującymi GFP migrują radialnie z rezagregowanych klastrów neuroblastów (Rycina 3A). Ilościowe określenie względnej odległości migracji 24 h po zatopieniu (Rycina 3B) nie wykazuje różnic w migracji między komórkami GFP-dodatnimi a komórkami GFP-ujemnymi, które nie zostały poddane nukleofekcji (Rycina 3C), co wskazuje, że sama nukleofekcja per se nie zaburza migracji. Nie stwierdzono również istotnych różnic w zakresie migracji między nukleofektowanymi neuroblastami a neuroblastami migrującymi bezpośrednio z eksplantów RMS (dane nie zostały przedstawione).
<img alt="Migracja komórek neuronalnych; schemat, mikroskopia; hodowla, nukleofekcja, F-aktyna, DCX, βIII tubulina." fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50989/50989fig1.jpg" width="500px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Wyizolowanie neuroblastów z RMS. (A) Schematyczne przedstawienie wyizolowania neuroblastów z RMS. Szczegółowy opis znajduje się w tekście. (B) Wyizolowane komórki RMS szczura są immunoreaktywne w stosunku do markerów neuroblastów migrujących: DCX i βlll tubuliny. Pasek skali, 20 µm. (C) Komórki migrujące z eksplantów RMS myszy wykazują ekspresję markerów neuroblastów migrujących DCX i PSA-NCAM. Pasek skali, 20 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50989/50989fig1highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększony obraz</a>.
<img alt="Różnicowanie komórek, mikroskopia fluorescencyjna, analiza komórek macierzystych, formowanie neuronów w eksperymencie." fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50989/50989fig2.jpg" width="500px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Nukleofekcja neuroblastów mysich. Dysocjowane neuroblasty mysiego RMS zostały poddane nukleofekcji pMAX-GFP, ponownie zagregowane, osadzone w macierzy trójwymiarowej i inkubowane przez 6 hr w celu umożliwienia migracji. Neuroblasty migrujące z zagregowanego skupiska komórkowego (góra, zdjęcia w kontraście fazowym) wykazują wysoką wydajność transfekcji (dół, zdjęcia w kanale GFP). Panele w prawej kolumnie przedstawiają zdjęcia przy większym powiększeniu, odpowiadające obszarom zaznaczonym w panelach w lewej kolumnie. Paski, 20 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50989/50989fig2highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy obraz</a>.
<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna migracji komórek wykazujących ekspresję GFP; schemat; markery GFP, βIII tubuliny." fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50989/50989fig3.jpg" width="500px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Test migracji 3D. (A) Neuroblasty szczura poddano nukleofekcji pMAX-GFP (GFP) lub pCAG-IRES-EGFP22 (EV), poddano reaggregacji, osadzono w macierzy i pozostawiono do migracji na 24 h. Następnie komórki utrwalono i poddano immunobarwieniu na GFP (zielony) i βIII tubulinę (czerwony). Pasek skali, 50 µm. (B) Pomiar odległości migracji przy użyciu programu ImageJ. Reaggregowany skup komórek podzielono na 6 równych sektorów. W każdym sektorze zmierzono odległość między krawędzią skupu (linia przerywana) a najdalej zmigrowaną komórką. (C) Kwantyfikacja względnej odległości migracji komórek nukleofektowanych (GFP-dodatnich) oraz kontrolnych komórek nienukleofektowanych (GFP-ujemnych). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50989/50989fig3highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy obraz</a>.
<img alt="Mikroskopia GFP shRNA, wyciszenie fascyny; elektroforeza żelowa, wyniki Western blot, wykres migracji." fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50989/50989fig4.jpg" width="500px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Monitorowanie migracji neuroblastów po nukleofekcji shRNA. (A) Neuroblasty szczura poddano nukleofekcji kontrolnym wektorem shRNA (pCA-b-EGFPm5 Silencer 3, który wykazuje również ekspresję EGFP23) lub tym samym wektorem zawierającym shRNA skierowane przeciwko fascynie, białku wiążącemu aktynę24. Komórki reaggregowano przez 48 hr, osadzono w macierzy i pozostawiono do migracji na 24 hr. Agregaty utrwalono, a następnie poddano immunostainingu na GFP (kolor zielony) i βIII tubulinę (kolor czerwony). Pasek skali, 50 µm. (B) Skuteczne wyciszenie fascyny można wykryć 50 hr po nukleofekcji shRNA za pomocą analizy western blot. Aktyna służy tutaj jako kontrola ładunku. (C) Analiza ilościowa względnej odległości migracji wykazująca, że wyciszenie fascyny znacząco upośledza migrację neuroblastów (średnia ± SEM; **p&lt;0.01; n=3 niezależne doświadczenia). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50989/50989fig4highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większy obraz</a>.

Migracja neuroblastów jest kluczowym krokiem w neurogenezie poporodowej. Opisany tutaj protokół może być wykorzystany do zbadania roli kandydatów na regulatory migracji neuroblastów poprzez zastosowanie nukleofekcji DNA/małego RNA spinki do włosów (shRNA) oraz testu migracji 3D z neuroblastami wyizolowanymi z pourodzeniowego strumienia migracyjnego rostralnego gryzoni.

Nukleofekcja neuroblastów gryzoni do badania migracji neuroblastów in vitro

The subventricular zone (SVZ) located in the lateral wall of the lateral ventricles plays a fundamental role in adult neurogenesis. In this restricted ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest transfekcja pierwotnych postnatalnych neuroblastów gryzoni w celu zbadania wpływu białek docelowych na ich migrację. Jest to realizowane poprzez wstępne wyizolowanie neuroblastów z rostralnego prądu migracyjnego (RMS) populacji gryzoni. Drugim krokiem jest ich dysocjacja oraz transfekcja za pomocą nukleofekcji DNA lub shRNA.Następnie neuroblasty poddaje się ponownej agregacji w metodzie wiszących kropli, a następnie hoduje w zawiesinie przez odpowiedni czas. Ostatnim etapem jest osadzenie zagregowanych klastrów neuroblastów w matrycy trójwymiarowej i pozostawienie ich do migracji. Ostatecznie do analizy migracji neuroblastów wykorzystuje się immunofluorescencję lub mikroskopię z obrazowaniem poklatkowym.Niniejsza metoda może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z dziedziny neurogenezy, takie jak kontrola migracji neuroblastów pochodzących z komórek macierzystych w mózgu ponatalnym. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest ona stosunkowo prosta i szybka w porównaniu z wykorzystaniem wektorów wirusowych, co może być trudne i czasochłonne. Po uśpieniu i pobraniu tkanek z miotu szczurów w wieku P6–P7, u każdego szczura należy wykonać skalpelem nacięcie skóry wzdłuż szwu pośrodkowego sagi, od nosa do móżdżku.Następnie zdejmij skórę. Powtórz to samo nacięcie wzdłuż czaszki. Potem delikatnie usuń płaty czaszki za pomocą pęsety i ostrożnie wyjmij mózg wraz z opuszkami węchowymi za pomocą szpatułki.Następnie odetnij najbardziej przednią jedną trzecią mózgu i ją odrzuć. Następnie, używając siekacza do tkanek, pokrój tkankę mózgową na koronalne plastry o grubości 1.4 mm. Przenieś plastry do naczynia zawierającego zimne medium do sekcji.Następnie obejrzyj przekroje pod mikroskopem sekcyjnym. Ostrożnie rozdziel je za pomocą igły. Przednia strugmowa droga migracyjna (rostral migratory stream) jawi się jako trójkątny, półprzezroczysty obszar w centrum przekrojów OB oraz jako mały obszar okrągły.W kolejnych skrawkach mózgu wyciąć RMS z każdego skrawka za pomocą noża mikrosurgicalnego, uważając, aby nie objąć tkanki otaczającej. Następnie zebrać fragmenty RMS za pomocą plastikowej pipety Pasteura i umieścić je w małym naczyniu zawierającym zimny medium do sekcji na lodzie. Następnie delikatnie obrócić naczynie, aby zgromadzić fragmenty RMS w jego centrum.Zebrać fragmenty za pomocą plastikowej pipety i przenieść je do probówki o pojemności 15 mililitrów. Pozostawić fragmenty do osadzenia się na dnie probówki. Zastąpić medium do sekcji dwiema mililitrami medium do dysocjacji T tri.Ujednoliconą zawiesinę fragmentów RMS poprzez delikatne pipetowanie w górę i w dół około 10 razy za pomocą pipety P 1000. Pozostaw probówkę z fragmentami tkanki w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C przez dwie minuty. Następnie ponownie pipetuj roztwór 10 razy, upewniając się, że fragmenty uległy dysocjacji.Następnie należy zneutralizować trypsynę, dodając pięć mililitrów uprzednio ogrzanego DMEM z dodatkiem 10% FCS, a zawiesinę komórkową odwirować z prędkością 433 ×g przez pięć minut. Usunąć nadmiar pożywki i resuspender osad komórkowy, delikatnie pipetując go w jednym mililitrze ogrzanego DMEM z dodatkiem 10% FCS, a następnie dodać kolejne cztery mililitry tej samej pożywki.Następnie należy przeprowadzić zliczenie komórek. Do każdej nukleofekcji wymagane jest minimum 2,5 × 10⁶ komórek, natomiast optymalne wyniki uzyskuje się, stosując od 3 do 4 × 10⁶ komórek na jedną nukleofekcję.Wiruj zawiesinę komórkową z prędkością 433 ×g przez pięć minut. Następnie usuń w tej procedurze jak największą ilość medium. Natychmiast resuspenduj osad komórkowy w uprzednio inkubowanym roztworze do nukleoporacji neuronów szczura.W temperaturze pokojowej przenieś 100 µL zawiesiny komórkowej do każdej probówki EOR zawierającej SI R-N-A-D-N-A. Następnie delikatnie wymieszaj zawartość, pipetując dwa lub trzy razy za pomocą pipety P 200. Potem dodaj próbkę na dno probówki do nukleofekcji, dbając o to, aby nie powstały żadne pęcherzyki powietrza.W celu nukleofekcji należy użyć programu G-013 dla komórek szczura lub O-005 dla komórek myszy. Następnie należy szybko dodać jeden mililitr podgrzanego DMEM z dodatkiem 10% FCS do nukleofektowanej próbki. Przenieś próbkę do probówki o pojemności 15 ml zawierającej pięć mililitrów podgrzanego DMEM z dodatkiem 10% FCS, używając plastikowej pipety dołączonej do zestawu do nukleofekcji.Następnie odwiruj próbkę przy 433 ×g przez pięć minut. Ostrożnie usuń całą nadmiarową pożywkę i resuspenduj osad w 25 do 30 µL podgrzanego DMEM z dodatkiem 10% FCS, używając pipety P 20. Nie używaj więcej niż 30 µL pożywki.Następnie nanieś zawiesinę w formie kropli na wewnętrzną stronę pokrywki naczynia P 35. Po tym odwróć pokrywkę nad naczyniem P 35 zawierającym dwa mililitry pełnej pożywki. Pozostaw je w inkubatorze w temperaturze 37 °C przy 5% carbon dioxide przez co najmniej pięć godzin.Po pięciu godzinach przenieś krople wiszące z pokrywki do pełnej pożywki w naczyniu. Użyj do tego pipety P 1000 z odciętą końcówką. Następnie inkubuj próbki w temperaturze 37°C przy 5% carbon dioxide przez 24 godziny w przypadku infekcji jądrowych DNA NU lub przez 48 godzin w przypadku infekcji jądrowych SI A HRA.Następnie przygotuj 25 mililitrów pożywki kompletnej i inkubuj ją w celu wstępnego wyrównania temperatury w 37°C przy 5% CO2 przez kilka godzin. W tym czasie wyjmij zamrożone alikwoty macierzy błony podstawnej z zamrażarki ustawionej na -80°C i rozmroź je na lodzie w pomieszczeniu chłodniczym. Dla każdej transfekcji jąder przygotuj szalkę o średnicy sześciu centymetrów zawierającą do ośmiu sterylnych szkiełek nakrywkowych o średnicy 13 milimetrów.Umieść naczynia na lodowej kąpieli przykrytej folią spożywczą. Aby utrzymać wilgotność, umieść pasek wilgotnej chusteczki wewnątrz naczynia o średnicy 15 centymetrów, które posłuży do przechowywania do trzech naczyń o średnicy sześciu centymetrów zawierających zatopione w agarozie blastemy kolana. Następnie dodaj pełną pożywkę do macierzy haw w stosunku jeden do trzech, przenieś zagregowane klastry komórek do probówki o pojemności 15 mililitrów i wiruj przy 433 ×g przez pięć minut.Następnie usunąć nadmiar pożywki i resuspender osad w 10 µL pożywki kompletnej. Potem nanieść 2 µL zawiesiny agregatów komórkowych na każdą sterylną szkiełko cover slip. Dodać 18 µL mieszaniny pożywki kompletnej z macierzą i za pomocą końcówki pipety rozprowadzić macierz po całym szkiełku.Niezwłocznie po umieszczeniu płytki o średnicy 6 cm zawierającej szkiełka podstawowe w płytce o średnicy 15 cm, przenieś ją do inkubatora w temperaturze 37 °C przy 5% CO₂ na 15 do 20 minut. Po zestaleniu się macierzy ostrożnie dodaj 5 mL pełnej pożywki do każdej płytki o średnicy 6 cm i dociśnij końcówką pipety wszelkie pływające szkiełka podstawowe, a następnie inkubuj przez 24 godziny w temperaturze 37 °C przy 5% carbogenu, aby umożliwić neuroblastom migrację z agregatów komórkowych.Na tej rycinie pokazano, że wyizolowane komórki RMS szczura wykazują pozytywną immunoreaktywność w odniesieniu do markerów migrujących neuroblastów: DCX i beta three tubulin. Rysunek ten wskazuje również, że markery migrujących neuroblastów DCX i PSA NCA są ekspresowane w komórkach migrujących z mysiego RMS. W celu przeprowadzenia transfekcji jądrowej neuroblastów mysich, dysocjowane neuroblasty mysiego RMS poddano nukleofekcji z użyciem GFP, po czym zostały one ponownie zagregowane, osadzone w macierzy trójwymiarowej i pozostawione do migracji przez sześć godzin.Neuroblasty migrujące z zagregowanego klastra komórkowego wykazują wysoką wydajność transfekcji. W tym przypadku neuroblasty szczura zostały zainfekowane dwoma różnymi plazmidami kodującymi GFP, zagregowane, osadzone w macierzy i pozostawione do migracji przez 24 godziny. Następnie komórki utrwalono i poddano immunostynacji na GFP oraz beta-III tubulinę w celu pomiaru odległości migracji.Zagregowany skup komórek zostaje podzielony na sześć równych sektorów, a dla każdego z nich mierzy się odległość od krawędzi skupu do najdalej migrującej komórki. Rysunek ten przedstawia ilościową ocenę względnej odległości migracji komórek z dodatnim sygnałem GFP dotkniętych NUCLE oraz komórek kontrolnych z ujemnym sygnałem GFP niedotkniętych NUCLE w celu monitorowania migracji neuroblastów. Po zastosowaniu S-H-R-N-A neuroblasty szczura zostały poddane działaniu kontrolnego wektora S-H-R-N-A lub tego samego wektora zawierającego cel HRNA dla białka wiążącego aktynę i przyspieszającego jego wiązanie; komórki były reagregowane przez 48 godzin w osadzeniu w matrycy, a następnie pozostawiono je do migracji na 24 godziny.Następnie agregaty utrwalono i poddano immunobarwieniu na GFP oraz beta-III tubulinę. Skuteczne wyciszenie fastingen można wykryć 50 godzin po infekcji jąder shRNA za pomocą analizy Western blot; aktyna została tutaj przedstawiona jako kontrola ładowania. Poniżej znajduje się analiza ilościowa względnej odległości migracji, wykazująca, że wyciszenie fastingen znacząco upośledza migrację neuroblastów.Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne metody, takie jak electroporacja postnatalna, aby zweryfikować in vivo wyniki uzyskane za pomocą testu migracji NU Nuclear Affection.

nucleofection-rodent-neuroblasts-to-study-neuroblast-migration

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Nukleofekcja neuroblastów gryzoni w celu badania migracji neuroblastów in vitro

Niniejszy protokół opisuje niewirusową metodę dostarczania konstruktów genetycznych do określonego obszaru żywego mózgu gryzonia. Metoda obejmuje przygotowanie plazmidu, wykonanie mikropipety, operację na noworodkach szczura, mikroiniekcję konstruktu oraz elektroporację in vivo.

Dostarczanie genów do postnatalnego mózgu szczura poprzez niekomorowe wstrzykiwanie plazmidów i elektroporację

Niniejszy protokół opisuje test z wykorzystaniem organotypowych przekrojów zoptymalizowany dla mózgu postnatalnego oraz wysokorozdzielcze obrazowanie time-lapse migracji neuroblastów w rostralnym prądzie migracyjnym.

Organotypowy test skrawkowy do wysokorozdzielczego obrazowania poklatkowego migracji neuronalnej w mózgu postnatalnym

Prezentujemy protokół elektroporacji in vivo do transfekcji pojedynczych komórek lub małych skupisk komórek zwojowych siatkówki (RGCs) oraz innych typów komórek siatkówki u myszy postnatalnych w szerokim zakresie wieku. Zdolność do znakowania i genetycznej manipulacji postnatalnymi RGCs in vivo stanowi potężne narzędzie w badaniach nad rozwojem.

Transfekcja komórek zwojowych siatkówki myszy za pomocą elektroporacji in vivo

W celu przeprowadzenia szybkiej oceny funkcji genów w rozwoju kory mózgu opisujemy metody obejmujące elektroporację ex vivo plazmidów koekspresujących inhibicyjne RNA (RNAi) i GFP w zarodkowej korze mysiej. Protokół ten nadaje się do badania różnych aspektów neurorozwoju, takich jak neurogeneza, migracja neuronów oraz morfogeneza neuronów, w tym wzrost dendrytów i aksonów.

Metody badania morfogenezy neuronalnej: Elektroporacja RNAi ex vivo w embrionalnej korze mózgu myszy

Opisujemy protokół obrazowania wideo w czasie rzeczywistym migracji neuronów w przedmózgowiu myszy. Migrację prekursorów neuronalnych oznakowanych wirusowo lub przeszczepionych rejestrowano w ostrych żywych skrawkach, wykorzystując szerokopolowe obrazowanie fluorescencyjne z relatywnie krótkim odstępem między akwizycjami, aby zbadać różne fazy migracji komórek, w tym czas trwania fazy stacjonarnej i migracyjnej oraz prędkość migracji.

Obrazowanie time-lapse migracji neuroblastów w ostrych skrawkach przedmózgowia dorosłej myszy

Kontrola ekspansji somatycznych komórek macierzystych jest głównym czynnikiem utrudniającym ich badanie oraz zastosowanie w terapii. W niniejszym opracowaniu opisujemy system czasowej kontroli ekspansji neuronalnych komórek macierzystych podczas rozwoju oraz w wieku dorosłym, który może zostać wykorzystany do zwiększenia liczby neuronów generowanych w mózgu myszy.

Ekspansja embrionalnych i dorosłych komórek macierzystych układu nerwowego poprzez elektroporację in utero lub stereotaksycyjne wstrzyknięcie wirusowe

Migracja neuroblastów jest fundamentalnym wydarzeniem w neurogenezie poporodowej. Opisujemy protokół skutecznego znakowania neuroblastów za pomocą elektroporacji poporodowej in vivo i późniejszej wizualizacji ich migracji za pomocą obrazowania poklatkowego ostrych wycinków mózgu. Dołączamy opis do ilościowej analizy dynamiki neuroblastów za pomocą śledzenia wideo.

In vivo (in vivo) Poporodowa elektroporacja i obrazowanie poklatkowe migracji neuroblastów w ostrych wycinkach mózgu myszy

Ten protokół dostarcza instrukcji do bezpośredniej obserwacji promieniście migrujących neuronów korowych. Elektroporacja in utero, organotypowa hodowla plastrów i poklatkowe obrazowanie konfokalne są łączone w celu bezpośredniego i dynamicznego badania skutków nadekspresji lub regulacji w dół genów będących przedmiotem zainteresowania w migrujących neuronach oraz analizy ich różnicowania podczas rozwoju.

Poklatkowe obrazowanie konfokalne migrujących neuronów w organotypowej kulturze warstwowej embrionalnego mózgu myszy przy użyciu elektroporacji in utero

W tym protokole opisujemy, jak wstrzyknąć lentiwirusowi do mysiej jamy owodniowej w E7.5, prowadząc do jednolitej transdukcji całej płytki nerwowej, przy minimalnym szkodliwym wpływie na przeżycie lub rozwój embrionalny.

Celowanie w mysią płytkę nerwową za pomocą nanoiniekcji in utero (NEPTUNE) w 7. dniu embrionalnym

Podczas rozwoju kory mózgowej, neurony i komórki glejowe pochodzą ze strefy komorowej wyściełającej komorę i migrują w kierunku powierzchni mózgu. W proces ten zaangażowanych jest wiele genów. Protokół ten wprowadza technikę obrazowania poklatkowego migrujących neuronów i komórek progenitorowych glejowych.

Obrazowanie poklatkowe migrujących neuronów i progenitorów glejowych w embrionalnych wycinkach mózgu myszy

Tutaj opisujemy system nukleofekcji zaprojektowany w celu zwiększenia efektywności dostarczania genów w rozszerzonych nerwowych komórkach macierzystych (NSC) wyizolowanych z dorosłej mysiej strefy podkomorowej. Wyniki pokazują, że metoda ta znacznie poprawia perturbację genów w NSC, przewyższając skuteczność tradycyjnych protokołów transfekcji i zwiększając wskaźnik przeżywalności komórek.

Izolacja, ekspansja i nukleofekcja nerwowych komórek macierzystych z dorosłej mysiej strefy podkomorowej

Poznaj metodę nukleofekcji neuroblastów gryzoni do badania migracji komórkowej in vitro. Technika ta umożliwia analizę wpływu białek docelowych na ruch neuroblastów przy użyciu immunofluorescencji i mikroskopii czasowo-przestrzennej.

Nukleofekcja neuroblastów gryzoni do badania migracji neuroblastów in vitro

Przeglądaj więcej filmów