Nukleofekcja neuroblastów gryzoni do badania migracji neuroblastów in vitro

Ogólnym celem tej procedury jest transfekcja pierwotnego neuroblastu pourodzeniowego gryzoni w celu zbadania wpływu docelowych białek na ich migrację. Osiąga się to poprzez najpierw wypreparowanie neuroblastu z rostralnego strumienia migracyjnego gryzoni. Drugim krokiem jest ich dysocjacja i transfekcja przez przywiązanie jądra za pomocą DNA lub S-H-R-N-A.

Następnie neuroblasty są ponownie agregowane w wiszących kroplach, a następnie hodowane w zawiesinie przez odpowiedni czas. Ostatnim krokiem jest osadzenie ponownie zagregowanych klastrów neuroblastów w trójwymiarowej matrycy i pozostawienie ich do migracji. Ostatecznie do analizy migracji neuroblastów stosuje się mikroskopię immunofluorescencyjną lub obrazowanie poklatkowe.

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytanie w dziedzinie neurogenezy, takie jak kontrola migracji neuroblastów pochodzących z komórek macierzystych w mózgu postnatalnym. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest stosunkowo łatwa i szybka w porównaniu z wykorzystaniem wektorów wirusowych, co może być trudne i czasochłonne. Po złożeniu w ofierze miotu od sześciu do siedmiu szczurów, wykonaj tylne nacięcie w skórze wzdłuż środkowego szwu strzałkowego od nosa do móżdżku za pomocą ostrza skalpela na każdym szczurze.

Następnie zdejmij skórę. Powtórz to samo nacięcie wzdłuż czaszki. Następnie delikatnie usuń płaty czaszki za pomocą kleszczy i ostrożnie usuń mózg wraz z opuszkami węchowymi za pomocą szpatułki.

Następnie odetnij najbardziej rozpieszczoną trzecią część mózgu i wyrzuć ją. Następnie pokrój tkankę mózgową na plastry koronalne o grubości 1,4 milimetra za pomocą rozdrabniacza do tkanek. Przenieś plastry do naczynia zawierającego zimne podłoże preparacyjne.

Następnie obejrzyj plasterki pod mikroskopem preparacyjnym. Ostrożnie oddziel je za pomocą igły. Rostralny strumień migracyjny pojawia się jako trójkątny, półprzezroczysty obszar w środku sekcji OB i jako mały okrągły obszar.

W przypadku większej liczby rozpieszczonych plasterków mózgu wytnij RMS z każdego plasterka nożem mikrochirurgicznym, uważając, aby nie uwzględnić otaczającej tkanki. Następnie zbierz fragmenty RMS za pomocą plastikowej pipety do pasty i umieść je w małym naczyniu zawierającym zimne podłoże preparacyjne na lodzie. Następnie delikatnie obróć naczynie, aby zebrać fragmenty RMS na środku naczynia.

Zbierz fragmenty plastikową pipetą i przenieś je do 15-mililitrowej probówki. Pozostaw fragmenty, aby osiadły na dnie tuby. Zastąp pożywkę separacyjną dwoma mililitrami pożywki dysocjacyjnej T tri.

Oceń fragmenty RMS, delikatnie pipetując zawiesinę fragmentów w górę i w dół około 10 razy za pomocą pipety P 1000. Pozostaw probówkę z fragmentami tkanek w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza na dwie minuty. Następnie ponownie odpipetować roztwór 10 razy i upewnić się, że fragmenty się rozdzieliły.

Następnie dezaktywuj trypsynę, dodając pięć mililitrów wstępnie zrobaczonego DMEM plus 10% FCS i odwiruj zawiesinę komórkową w temperaturze 433 razy G przez pięć minut. Usuń nadmiar pożywki i resus. Zawiesić osad komórkowy, delikatnie pipetując go w jednym mililitrze wstępnie podgrzanego DMEM plus 10% FCS, a następnie dodaj kolejne cztery mililitry tego samego podłoża.

Następnie wykonaj zliczanie komórek. Do każdego uczucia jądra wymagane jest co najmniej 2,5 razy 10 do szóstych komórek, aby osiągnąć optymalne wyniki. Używając od trzech do czterech razy od 10 do sześciu komórek na ognisko jądra.

Odwirować zawiesinę komórkową w temperaturze 433 razy G przez pięć minut. Następnie usuń jak najwięcej pożywki w tej procedurze. Natychmiast Resus zawiesić osad komórkowy w roztworze uczucia jądra neuronu szczura wcześniej inkubowanym.

W temperaturze pokojowej przenieść 100 mikrolitrów zawiesiny komórek do każdej probówki EOR zawierającej SI R-N-A-D-N-A. Następnie delikatnie wymieszać, pipetując dwa do trzech razy pipetą P 200. Następnie dodaj próbkę na dno jądra afektywnego vete, uważając, aby nie generować żadnych pęcherzyków.

W przypadku uczucia jądra użyj programu G kreska 0 1 3 dla komórek szczura lub kreska O 0 0 5 dla komórek myszy. Następnie szybko dodaj jeden mililitr przedwojennego DMEM plus 10% FCS do próbki dotkniętej jądrem. Przenieś próbkę do 15-mililitrowej probówki zawierającej pięć mililitrów przedwojennego DMEM plus 10% FCS za pomocą plastikowej pipety dostarczonej przez zestaw do leczenia jądrowego.

Następnie odwirować próbkę w temperaturze 433 razy G przez pięć minut. Ostrożnie usuń cały nadmiar pożywki i ponownie zawieś osad w 25 do 30 mikrolitrach przedwojennego DMEM plus 10% FCS za pomocą pipety P 20. Nie używaj więcej niż 30 mikrolitrów podłoża.

Następnie odpipetować zawiesinę w postaci kropli na wewnętrzną stronę pokrywki naczynia z tworzywa P 35. Następnie odwróć pokrywkę nad szalką P 35 zawierającą dwa mililitry kompletnego podłoża. Pozostaw go w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla na co najmniej pięć godzin.

Po pięciu godzinach przenieś wiszące krople z pokrywki do całego podłoża w naczyniu. Za pomocą pipety P 1000 z odciętą końcówką. Następnie inkubuj próbki w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez 24 godziny w przypadku infekcji jądrowych DNA NU lub 48 godzin w przypadku chorób jądra SI A HRA.

Teraz przygotuj 25 mililitrów kompletnej pożywki i wstępnie zrównoważ w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez kilka godzin. W międzyczasie wyjmij zamrożone porcje matrycy membrany podstawnej z zamrażarki o temperaturze ujemnej 80 stopni Celsjusza i rozmroź je na lodzie w chłodni. Dla każdego jądra przygotuj sześciocentymetrowe naczynie zawierające do ośmiu 13-milimetrowych sterylnych szkiełek nakrywkowych.

Umieść naczynia w zamrażalniku pokrytym folią spożywczą. Aby utrzymać wilgotność, umieść pasek wilgotnej tkanki w 15-centymetrowym naczyniu, które posłuży do przechowywania do trzech sześciocentymetrowych naczyń zawierających obwody osadzone w kolanach. Następnie dodaj całe podłoże do matrycy haw w stosunku jeden do trzech, przenieś ponownie zagregowane klastry komórek do 15-mililitrowej probówki i odwiruj ją 433 razy G przez pięć minut.

Następnie usuń nadmiar pożywki i ponownie zawieś paletę w 10 mikrolitrach kompletnego podłoża. Następnie umieścić dwa mikrolitry zawiesiny agregatu komórkowego na każdym sterylnym szkiełku nakrywkowym. Dodać 18 mikrolitrów kompletnej mieszaniny pożywki Matrix i za pomocą końcówki pipety rozprowadzić matrycę na całej pokrywie.

Zsunąć natychmiast po umieszczeniu sześciocentymetrowej płytki zawierającej szkiełka nakrywkowe w 15-centymetrowym naczyniu. Przenieś naczynie do inkubatora w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla na 15 do 20 minut. Po zestaleniu się matrycy, delikatnie dodaj pięć mililitrów kompletnej pożywki do każdej sześciocentymetrowej płytki i dociśnij wszelkie pływające szkiełka nakrywkowe końcówką pipety, a następnie inkubuj przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% karbogenem, aby umożliwić neuroblastowi migrację z agregatów komórkowych.

Na tym rysunku wykazano, że izolowane komórki RMS szczura są immunododatnie dla migrujących markerów neuroblastów DCX i tubuliny beta trzy. Rysunek ten pokazuje, że migrujące markery neuroblastów DCX i PSA NCA ulegają ekspresji w komórkach migrujących z myszy. RMS Explan dla mysiego Neuroblast Nu jądrowego afektu, zdysocjowany mysz RMS Neuroblast został dotknięty jądrem ponownie zagregowanym GFP osadzonym w trójwymiarowej matrycy i dopuszczonym do migracji przez sześć godzin.

Neuroblasty migrujące z ponownie zagregowanego klastra komórkowego wykazują wysoką skuteczność transfekcji. W tym przypadku neuroblasty szczurów zostały dotknięte jądrem z dwoma różnymi plazmidami kodującymi GFP, ponownie zagregowanymi, osadzonymi w matrycy i pozostawionymi do migracji na 24 godziny. Komórki zostały następnie utrwalone i wybarwione immunologicznie dla GFP i tubuliny beta trzy w celu zmierzenia odległości migracji.

Zagregowany klaster komórek dzieli się na sześć równych sektorów, a dla każdego sektora mierzy się odległość między krawędzią klastra a najdalszą migrowaną komórką. Rysunek ten przedstawia ilościowe określenie względnej odległości migrowanej przez komórki dotknięte GFP dodatnim NUCLE i kontrolują ujemne komórki niedotknięte GFP w celu monitorowania migracji neuroblastów. Po tym, jak neuroblasty szczurów S-H-R-N-A były dotknięte jądrem z kontrolnym wektorem S-H-R-N-A lub tym samym wektorem zawierającym docelowe białko mocujące HRNA i wiązkę aktyny, komórki zostały ponownie zagregowane w ciągu 48 godzin, osadzone w matrycy i pozostawione do migracji na 24 godziny.

Agregaty zostały następnie utrwalone i wybarwienia immunologiczne dla GFP i tubuliny beta trzy. Efektywne wyczerpanie zapięcia można wykryć 50 godzin po uczuciu jąder S-H-R-N-A przez Western Blood Analysis, a Acton jest tutaj pokazany jako kontrola obciążenia. Poniżej znajduje się analiza ilościowa względnej odległości migracji, która pokazuje, że ubytek fastened znacząco upośledza migrację neuroblastów.

Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak elektroporacja poporodowa, w celu walidacji in vivo wyników uzyskanych za pomocą testu migracji NU Nuclear Affection.