Identyfikacja subpopulacji mysich erytroblastów wzbogaconej w zdarzenia wyłuszczenia za pomocą wielospektralnej cytometrii przepływowej obrazowania

Ogólnym celem tej procedury jest ułatwienie identyfikacji zdarzeń enukleacji z subpopulacją erytroblastów w aurn. Pierwszym krokiem jest stworzenie populacji wzbogaconej w zdarzenia zarodkowania. Osiąga się to poprzez hodowlę erytropoezy in vitro, albo długoterminową, zaczynając od komórek szpiku kostnego o niskiej gęstości wyizolowanych z kości udowych, piszczelowych i miednicznych myszy niezestresowanej, albo krótkoterminową hodowlę.

Począwszy od plecytów ze śledziony myszy poddanej wcześniej flebotomii w celu zamontowania erytropoezy stresowej. Hodowane komórki na ostatnim etapie hodowli są utrwalane, przenikane i barwione interesującymi markerami fluorescencyjnymi. Komórki te są uruchamiane na obrazowym cytometrze przepływowym, a następnie analizowane w celu zidentyfikowania komórek ulegających enukleacji w populacji komórek zarodkujących, można zidentyfikować elementy sygnalizacyjne i cytoszkieletowe, które regulują i pośredniczą w procesie wyłuszczenia.

Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak mikroskopia fluorescencyjna, jest to, że w krótkim czasie można zaobserwować i przeanalizować znacznie większą liczbę komórek zarodkujących. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie erytropoezy, takie jak mechanizmy molekularne zaangażowane w zarodkowanie erytroblastów. Aby odróżnić komórki erytroidalne od komórek szpiku kostnego o niskiej gęstości, zacznij od dodania jednego mililitra pożywki hodowlanej do sterylnej probówki do cytometrii przepływowej.

Następnie przymocuj igłę o wymiarach 25 na pięć ósmych cala do strzykawki tuberkulinowej i delikatnie przepłucz świeżą pożywkę hodowlaną przez pobrane kości udowe i piszczelowe kilka razy do probówki cytometrii przepływowej. Po dostosowaniu objętości zawiesiny komórek do pięciu mililitrów za pomocą IMDM, ostrożnie nałóż warstwę na pięć mililitrów 1.083 grama na mililitr gradientowego medium do separacji komórek w 15-mililitrowej probówce. Przenieś wszystko do oznaczenia dwóch mililitrów do nowej 15-mililitrowej probówki i umyj zebraną powłokę kożuchową świeżą pożywką hodowlaną, czerwone krwinki w trzech mililitrach buforu do lizy czerwonych krwinek przez pięć minut w temperaturze pokojowej po umyciu komórek w pożywce hodowlanej i resusie zawieszając osad na tej samej płytce, komórki w sześciodołkowej płytce do hodowli komórkowej o stężeniu pięć razy 10 piątej komórki na studzienkę do końcowej objętości 2,5 mililitra w pożywce wzrostowej i inkubować komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza pięć dni po posianiu hodowli.

Policz liczbę erytroblastów w każdym dołku oryginalnej płytki hodowlanej, a następnie przenieś każdą studzienkę do odpowiednich pojedynczych stożkowych probówek o pojemności 15 mililitrów. Po odwirowaniu komórek odessać supernatanty i ponownie zawiesić granulki w świeżej pożywce wzrostowej zawierającej tylko erytropoetynę do stężenia dwa razy 10 piątych komórek na mililitr. Następnie odessać supernatant z płytki z pięcioma komórkami MS i dodać komórki erytroidalne do studzienek.

Dwa dni później zastąp supernatant świeżą pożywką wzrostową bez cytokin i erytroblastów z cytów PLE o niskiej gęstości. Użyj tłoka z pięciomililitrowej strzykawki, aby zmacerować śledzionę przez sitko o średnicy 40 mikronów do probówki o pojemności 50 mililitrów. Umyj sitko komórkowe pożywką wzrostową i dostosuj końcową objętość zawiesiny komórek do pięciu mililitrów.

Następnie, po oddzieleniu warstw komórkowych według gradientu gęstości, jak właśnie pokazano, na czerwonych krwinkach i umyj cyty w siedmiu mililitrach pożywki hodowlanej. Następnie Resus zawiesić osad w pożywce wzrostowej uzupełnionej cytokinami i inkubować komórki w ilości od jednego do pięciu razy od 10 do sześciu komórek w końcowej objętości jednego mililitra na studzienkę 24-dołkowej płytki do hodowli komórkowej przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Następnego dnia.

Przenieś komórki do studzienek zawierających przylegające pięć komórek MS, jak opisano wcześniej, i przeanalizuj po sześciu do ośmiu godzinach, zbierz erytroblasty z dołków hodowlanych i utrwal je w 500 mikrolitrach 3,7% formaldehydu w PBS Resus, zawieszając osad za pomocą delikatnego pipetowania. Po 15 minutach wirować komórki w temperaturze 2000 GS przez 20 sekund w mikrowirówce, odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 500 mikrolitrach PBS. Po odwirowaniu komórek w mikrowirówce, ponownie zassać supernatant i umieścić komórki na lodzie na co najmniej 15 minut.

Postaw minus 20 stopni Celsjusza, przechowuj roztwory acetonu na lodzie. Następnie szybko ponownie zawiesić i odwirować komórki w serii płukania acetonem, jak wskazano po przepłukaniu buforem faksu, inkubować granulki komórek w 100 mikrolitrach odpowiedniego koktajlu przeciwciał przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Następnie, po ponownym umyciu komórek w buforze faksu, ponownie zawiesić trwałe granulki w 60 mikrolitrach bufora faksowego zawierającego DRAC 5 i uruchomić próbki na obrazowym cytometrze przepływowym, zbierając co najmniej 10 000 zdarzeń na próbkę eksperymentalną.

Następnie rozpocznij analizę, wybierając komórki na podstawie ich proporcji jasnego pola, stosunku długości ich osi mniejszej do głównej oraz obszaru jasnego pola, który wskazuje na ich rozmiar. Zdarzenia o wartości obszaru jasnego pola mniejszej niż 20 i wyższej niż 200 są w większości odpowiednio szczątkami i agregatami komórkowymi i są wyłączone z analizy. Następnie analizuj pojedyncze komórki na podstawie ich wartości parametru gradientu RMS, który wskazuje ostrość obrazu, tworząc drugą bramkę zawierającą komórki o wartości RMS gradientu większej niż 50. percentyl, aby wybrać obrazy wykonane dobrze w ostrości.

Następnie bramka, komórki na podstawie ich wielkości mierzonej przez ich obszar jasnego pola i ich dodatniości dla markera erytroidalnego TER jeden 19 mierzonego za pomocą TER one 19 barwienie fluorescencyjne średnia parametr piksela komórki bardzo niskie lub bardzo wysokie dla TER one 19 są odpowiednio albo nieerytroidalne, albo pozostałe agregaty komórkowe i są wyłączone z analizy w następnym kroku. Komórki są wybierane na podstawie intensywności współczynnika proporcji DR pięć, stosunku mniejszej do głównej osi ich jądra oraz intensywności ich ekspresji d dr pięć. DR pięć ujemnych komórek, głównie wyłuszczonych komórek, takich jak retikulocyty i czerwone krwinki oraz komórki o niskim współczynniku kształtu pięć.

W większości przypadków dublety są wyłączone z chodu analitycznego. Ciągnie pięć dodatnich komórek DNA, które w tym momencie są w większości erytroblastami. Te erytroblasty są następnie analizowane na podstawie ich obszaru TER jeden 19, który wskazuje rozmiar komórki i ich średniego obszaru pikseli TER jeden 19 lub gęstości ekspresji TER one 19, co wskazuje na jasność ich barwienia TER one 19.

Erytroblasty ortochromatyczne są rozpoznawane jako małe komórki TER o wysokości 19 komórek. Wreszcie, subpopulacja erytroblastów ortochromatycznych charakteryzuje się niskim współczynnikiem kształtu jasnego pola i wysoką delta sentu XY TUR 19. DR pięć, zgodnie z definicją odległości między środkiem początkowego retikulocytu TUR jeden 19 dodatniego a środkiem jądra DR pięć dodatnich wraz z przeciwciałem przeciwko niej jeden 19 i barwieniem DNA DRAAK pięć.

Komórki są zazwyczaj barwione w celu zidentyfikowania lokalizacji f aktyny podczas erytroblastów i zarodkowania. Warto zauważyć, że postęp enukleacji można wizualizować jako komórki o malejących proporcjach. Oznacza to, że obserwuje się komórki, które stają się coraz bardziej wydłużone i wraz ze wzrostem delta OID xy TUR obserwuje się jeden 19 drag pięć.

Aktyna F koncentruje się w bruździe rozszczepienia podczas zarodkowania, a następnie rozprasza się po wytłoczeniu jądra. Inne białka i struktury będące przedmiotem zainteresowania mogą być również barwione odpowiednimi przeciwciałami lub markerami fluorescencyjnymi, aby umożliwić obrazowanie ich roli podczas enukleacji. Na przykład tworzenie spolaryzowanych mikrotubul można uwidocznić w erytroblastach ortochromatycznych typu dzikiego przed zarodkowaniem, ale nie w erytroblastach poddanych działaniu kolchicyny.

Hamowanie polimeryzacji tubuliny przez kolchicynę zmniejsza polaryzację komórek, jak wykazano przez pomiar parametru delta OID XYB FDR pięć między środkiem ciała komórki widocznym w kanale Brightfield a środkiem barwienia jądrowego osiągniętego za pomocą DR pięć. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak mikroskopia fluorescencyjna, aby odpowiedzieć na pytania dotyczące interakcji między różnymi typami komórek biorącymi udział w erytropoezie, takimi jak te obserwowane na wyspach erytroblastów. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wizualizować zdarzenia enukleacji w populacji wzbogaconej o erytroblasty.