Name: Identyfikacja subpopulacji mysich erytroblastów wzbogaconej w zdarzenia wyłuszczenia za pomocą wielospektralnej cytometrii przepływowej obrazowania (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Poznaj metodę identyfikacji wyłuszczających erytroblastów ortochromatycznych u myszy za pomocą wielospektralnej cytometrii przepływowej obrazowania. Technika umożliwia szczegółową analizę procesu erytropoezy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Rdzeniowi Cytometrii Przepływowej w Cincinnati oraz Richardowi Demarco, Sherree Friend i Scottowi Mordecai z Amnis Corporation (część EMD Milllipore) za fachowe wsparcie techniczne. Prace te były wspierane przez granty National Institutes of Health K08HL088126 i R01HL116352 (T.A.K.) oraz P30 DK090971 (Y.Z.).

1. Długoterminowa hodowla erytropoezy in vitro (Ex vivo Erythroid Differentiation Culture Protocol by Giarratana et al.8, zmodyfikowane i przystosowane do komórek myszy)
To jest 3-etapowy długoterminowy protokół erytropoezy in vitro. W pierwszym etapie (dni 0-4) 2 x 105 komórek/ml umieszcza się w pożywce wzrostowej erytroblastów uzupełnionej czynnikiem komórek macierzystych (SCF), interleukiną-3 (IL-3) i erytropoetyną (Epo). W drugim etapie (5-6 dni) komórki są ponownie zawieszane w stężeniu 2 x 105 komórek/ml i hodowane na przylegających komórkach zrębu (MS5) w świeżej pożywce wzrostowej erytroblastów uzupełnionej tylko Epo. W trzecim etapie (dni 7-9) komórki są hodowane na warstwie komórek MS-5 w świeżej pożywce wzrostowej erytroblastów bez cytokin aż do enukleacji (Figura 1A).
Wszystkie protokoły dla zwierząt zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Centrum Medycznego Szpitala Dziecięcego w Cincinnati.
<ol>
	<li>Pobieranie kości i izolacja komórek szpiku kostnego o niskiej gęstości
	<ol>
		<li>Dodać 2 ml sterylnego IMDM zawierającego 2% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i przechowywać na lodzie.</li>
		<li>Poddaj eutanazji 2-6-miesięczną mysz C57/BL6 typu dzikiego (wraz z myszą genetycznie ukierunkowaną lub bez niej) zgodnie z zatwierdzonym przez instytucję protokołem (np. wdychanie CO2 , a następnie zwichnięcie szyjki macicy).</li>
		<li>Odizoluj kości miednicy, kości udowe i piszczelowe obu nóg za pomocą kleszczy i skalpela, dodaj je do probówki zawierającej IMDM+2% FBS i trzymaj na lodzie.</li>
		<li>Dodaj 1 ml IMDM + 2% FBS do sterylnej probówki do cytometrii przepływowej i przepłucz kości za pomocą kleszczy i strzykawki tuberkulinowej z igłą 25 G x 5/8 ". Kilkakrotnie delikatnie przepłukać IMDM+2% FBS przez kości (odsysając ~500 μl z zawiesiny komórkowej i ponownie przepłukując ją przez kość) i zebrać komórki szpiku kostnego do probówki cytometrii przepływowej. Zaczerwienienie jest zakończone, gdy kości wydają się białe.</li>
		<li>Przefiltruj zawiesinę komórek przez sitko o średnicy 40 μm umieszczone na stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Przemyj sitko komórkowe IMDM+2% FBS i za pomocą tego samego podłoża dostosuj końcową objętość zawiesiny komórek do 5 ml.</li>
		<li>Przygotować komórki szpiku kostnego o niskiej gęstości (LDBM) przez wirowanie w gradionym gradieniu gęstości: ostrożnie ułożyć 5 ml zawiesiny komórek na 5 ml pożywki do separacji komórek o gradiacji gęstości 1,083 g/ml w probówce o pojemności 15 ml i wirować z prędkością 750 x g przez 25 minut w temperaturze pokojowej (RT) bez hamowania/przy niskim przyspieszeniu.</li>
		<li>Przenieść supernatant (wszystko do około 2 ml oznaczenia 15 ml probówki w celu uzyskania kożlichowej sierści) do nowej 15-mililitrowej probówki i wykonać jeszcze jedno płukanie za pomocą IMDM+2% FBS przy 525 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Odessać supernatant i poddać lizie pozostałe krwinki czerwone (RBC), zawieszając osad w 3 ml buforu do lizy RBC na 5 minut w temperaturze pokojowej. Jeśli na ostatnim etapie wymagana jest większa czystość erytroblastów (np. do badań biochemicznych), na tym etapie należy oczyścić komórki LDBM do komórek Linneg przez separację magnetyczną.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Protokół hodowli różnicowania erytroidalnego ex vivo, rozpoczynający się od komórek LDBM lub Linneg (Figura 1A)
	<ol>
		<li>Dodać 7 ml IMDM+2% FBS, wirować w 525 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i ponownie zawiesić granulowane komórki w 2 ml pożywki wzrostowej erytroblastów (EGM), składającej się z: 
		a. StemPro-34 pożywka, zawierająca 
		b. 2,6% średni suplement StemPro-34, 
		c. 20% BIT-9500, 
		d. 900 ng / ml siarczanu żelazawego, 
		E. 90 ng / ml azotanu żelaza, 
		f. 100 jednostek/ml penicyliny/streptomycyny, 2 mM L-glutaminy 
		g. 10-6 M hydrokortyzon 
		h. i świeżo dodane cytokiny: 
		i) 100 ng/ml SCF, 
		ii) 5 ng/ml IL-3 i 
		iii) 3 j.m./ml Epo.</li>
		<li>Policz komórki za pomocą automatycznego licznika komórek lub ręcznie pod mikroskopem za pomocą hemocytometru.
		</li>
		<li>Płytkę umieścić na 6-dołkowej płytce do hodowli komórkowej o stężeniu 5 x 105 komórek/basenik do końcowej objętości 2,5 ml w EGM (2 x 105 komórek LDBM/ml) i inkubować w temperaturze 37 °C (uważa się, że jest to dzień #0 hodowli).
		</li>
		<li>Zmienić pożywkę, zasysając 1,5 ml supernatantu, wirując z prędkością 525 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej, ponownie zawieszając w 1,5 ml świeżej pożywki zawierającej wszystkie 3 cytokiny i dodając z powrotem do studzienek codziennie w dniach #2, 3, 4, w celu optymalizacji fazy proliferacyjnej. W dniu 3 usuń wszystkie komórki, policz i podziel na odpowiednią liczbę dołków, aby utrzymać stężenie komórek studzienki ~2 x 105 komórek/ml. Utrzymuj kulturę w temperaturze 37 °C/5% CO2 .</li>
		<li>W dniu 4 umieść komórki MS5 (mysia linia komórek zrębowych) w studzienkach nowej 6-dołkowej płytki do hodowli komórkowej. Pożywka do hodowli komórkowych MS5 to α-MEM zawierająca 20% FBS, 100 jednostek/ml penicyliny/streptomycyny i 2 mM L-glutaminy.</li>
		<li>W 5 dniu policz liczbę komórek (teraz znacznie wzbogaconych w erytroblasty) w każdym dołku oryginalnej płytki hodowlanej za pomocą automatycznego licznika komórek lub ręcznie pod mikroskopem za pomocą hemocytometru.</li>
		<li>Wyjąć wszystkie komórki z każdej studzienki i przenieść do stożkowych probówek o pojemności 15 ml, odwirować przy 525 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej, odessać supernatant i rozpuścić granulki ze świeżym EGM zawierającym tylko Epo (3 j.m./ml) do stężenia 2 x 105 komórek/ml.</li>
		<li>Odessać supernatant z dołków, w których komórki MS-5 zostały posiane poprzedniego dnia (ukierunkowane na 70-80% konfluencji w czasie kohodowli) i dodać komórki erytroidalne w tych studzienkach do EGM zawierających tylko Epo (chociaż nie jest to ich pożywka z wyboru, komórki MS-5 dobrze przeżywają w EGM przez kilka dni).</li>
		<li>Zmień podłoże, dodając świeże EPO w dniu #6.</li>
		<li>Zmień pożywkę w dniu #7, używając EGM bez dodatku cytokin. W dniach od 7 do 9 codziennie badaj próbki do enukleacji za pomocą cytometrii przepływowej po barwieniu anty-Ter119 i Syto-16 i przystąp do barwienia próbek do obrazowania wielospektralnego cytometrii przepływowej (jak opisano w sekcji 3). 
		nuta: Przed posiewem oraz w 2., 4., 6. i 7. dniu hodowli należy monitorować hodowane komórki pod kątem wzbogacenia i różnicowania erytroblastów za pomocą cytometrii przepływowej, oceniając markery powierzchniowe CD44 i Ter119 w zależności od wielkości (FSC). 9 Alternatywnie można również użyć CD71, Ter119 i FSC10,11.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Test szybkiej enukleacji, zgodnie z protokołem opisanym przez Yoshida et al.12 z modyfikacjami (Rysunek 1B)
<ol>
	<li>Indukcja erytropoezy stresowej i przygotowanie komórek zrębu do hodowli erytropoezy in vitro
	<ol>
		<li>Znieczulić 2-6-miesięczną mysz C57/BL6 typu dzikiego zgodnie z wytycznymi IACUC (np. roztworem izofluranu). Upewnij się, że mysz została odpowiednio znieczulona, sprawdzając, czy nie ma odruchowych reakcji na delikatne uszczypnięcie tylnej łapy i czy podczas zabiegu nie ma regularnych oddechów. Użyj maści okulistycznej weterynarza na oczy, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia.</li>
		<li>Wywołać erytropoezę stresową poprzez krwawienie z ogona do końcowej objętości 500 μl. Za pomocą strzykawki z insuliną wstrzyknąć dootrzewnowo równą objętość soli fizjologicznej, aby zapewnić płynną resuscytację zwierzęcia (przed wstrzyknięciem należy przytrzymać zwierzę w pozycji Trendelenburga i wstrzyknąć w dolną część brzucha, aby nie uszkodzić narządów wewnętrznych).</li>
		<li>Nie pozostawiaj myszy bez opieki, dopóki nie odzyska kontroli motorycznej, na co wskazuje to, że zwierzę zaczyna poruszać się po klatce i jest w stanie stać i chodzić bez upadku. Mysz poddana flebotomii jest umieszczana w klatce bez innych myszy.</li>
		<li>Po 2 dniach płytki MS-5 w dołkach 24-dołkowej płytki do hodowli komórkowej. Inkubować komórki MS-5 w temperaturze 37 °C/5% CO2 w pożywce komórkowej MS5 (a-MEM zawierającej 20% FBS, 100 jednostek/ml penicyliny/streptomycyny i 2 mM L-glutaminy) w celu uzyskania 70-80% zlewu w dołkach płytkowych po 48 godzinach.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zbiór śledziony i przetwarzanie splenocytów
	<ol>
		<li>Cztery dni (96 godzin) po indukcji erytropoezy stresowej należy poddać eutanazji wcześniej wykrwawioną mysz za pomocą protokołu zatwierdzonego przez IACUC (np. wdychanie CO2 , a następnie zwichnięcie szyjki macicy).</li>
		<li>Zbierz śledzionę i umieść ją w stożkowej tubie o pojemności 15 ml zawierającej IMDM 2% FBS i trzymaj na lodzie.</li>
		<li>Po powrocie do laboratorium, w kapturze do hodowli tkankowej w sterylnych warunkach, odwróć probówkę zawierającą śledzionę na sitku do komórek o średnicy 40 μm umieszczonym na probówce o pojemności 50 ml. Rozdrobnić śledzionę za pomocą tłoka plastikowej strzykawki o pojemności 5 ml.</li>
		<li>Przemyć sitko komórkowe IMDM+2% FBS i za pomocą tego samego podłoża dostosować końcową objętość zawiesiny komórek do 5 ml.</li>
		<li>Ostrożnie ułóż 5 ml zawiesiny splenocytów na 5 ml pożywki do separacji komórek w gradiacji gęstości 1,083 g/ml w probówce o pojemności 15 ml i wiruj z prędkością 750 x g przez 25 minut w temperaturze pokojowej bez hamowania/niskiego przyspieszenia.</li>
		<li>Przenieść supernatant (roztwór do około 2 ml kreski w 15-ml probówce w celu uzyskania kożuchowego płaszcza) do nowej 15-mililitrowej probówki i wykonać jeszcze jedno płukanie IMDM+2% FBS przy 525 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Odessać supernatant i poddać lizie krwinki czerwone, zawieszając osad w 3 ml buforu do lizy RBC na 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Dodać 7 ml IMDM + 2% FBS do przemywania komórek oraz do rozcieńczania i neutralizowania buforu do lizy RBC i wirować w temperaturze 525 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Odessać supernatant i zawiesić granulowane komórki w 2 ml pożywki wzrostowej erytroblastów (EGM).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Posiew izolowanych splenocytów o małej gęstości, wzbogaconych w erytroblasty, na tworzywie sztucznym (pierwszy etap szybkiej hodowli erytropoezy in vitro)
	<ol>
		<li>Policz komórki na automatycznym liczniku komórek lub ręcznie za pomocą hemocytometru. Zwykle liczba komórek izolowanych na śledzionę na tym etapie wynosi ~15 x 106.</li>
		<li>Zawiesić komórki dalej w EGM zawierające cytokiny (w końcowych stężeniach): SCF 50 ng/ml, IL-3 5 ng/ml i Epo 2 U/ml.</li>
		<li>Płytka 1-5 x 106 komórek w końcowej objętości 1 ml/basenik (taka sama liczba komórek na basenik w zależności od całkowitej liczby komórek) na 24-dołkowej płytce do hodowli komórkowej i inkubować O/N w temperaturze 37 °C/5% CO2 .</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Hodowla erytroblastów na komórkach MS5 (drugi etap szybkiej hodowli erytropoezy in vitro
	<ol>
		<li>Odessać supernatant z plastikowej studzienki i podnieść komórki (wysoko wzbogacone w erytroblasty) poprzez dodanie 2 ml zimnego 10 mM EDTA w PBS przez 5 minut, na lodzie do każdej studzienki.</li>
		<li>Umieść komórki w świeżych probówkach, umyj raz w EGM (bez cytokin) i ponownie zawieś w tymże.</li>
		<li>Płytka 5 x 105-1 x 106 komórek w objętości 1-2 ml do każdego dołka pokrytego komórkami MS5 na płytce 24-dołkowej. Jeśli w eksperymencie stosowane są inhibitory farmakologiczne, dodaj je teraz w odpowiednich stężeniach.</li>
		<li>Inkubować przez 6 do 8 godzin (czas oparty na obserwacji mikroskopowej około 30%-40% enukleacji w nietraktowanej próbce WT). Wiązanie erytroblastów z komórkami MS-5 przyspiesza ich enukleację.</li>
		<li>Wyjmij komórki z każdej studzienki, dodając 2 ml zimnego PBS + 10 mM EDTA przez 5 minut na lodzie. Wraz z erytroblastami zostaną również pobrane komórki MS-5, ale można je później łatwo wykluczyć podczas analizy cytometrii przepływowej jako komórki FSChi Ter119-.</li>
		<li>Na tym etapie komórki można utrwalić i wybarwić do analizy za pomocą cytometrii przepływowej obrazowania wielospektralnego.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Barwienie erytroblastów w celu lokalizacji białek wewnątrzkomórkowych lub tratw lipidowych podczas enukleacji za pomocą wielospektralnej cytometrii przepływowej obrazowania 
<ol>
	<li>Umyć komórki w PBS, wirować 525 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i odessać supernatant.</li>
	<li>Utrwal komórki poprzez ponowne zawieszenie granulek komórkowych w 500 μl 3,7% formaldehydu w PBS na 15 minut (czas utrwalania może się różnić w zależności od badanego antygenu) i delikatne pipetowanie.</li>
	<li>Przenieść do plastikowych probówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Wirować na mikrowirówce stołowej 2 000 x g przez 20 sekund, odessać supernatant i wykonać jedno płukanie, dodając 500 μl PBS do każdej probówki i delikatnie pipetując.</li>
	<li>Wirować na mikrowirówce stołowej 2 000 x g przez 20 sekund, odsysać supernatant i trzymać probówki na lodzie przez co najmniej 15 minut. Etapy permeablacji 3,6-3,9 powinny być wykonane szybko i skutecznie, a po wirowaniu/aspiracji w temperaturze pokojowej granulki komórek należy natychmiast umieścić z powrotem na lodzie, aby komórki lepiej zachowały swoją integralność.</li>
	<li>Wyjmij roztwory acetonu z zamrażarki o temperaturze -20 °C i połóż na lodzie. Przepuszczalność komórek polega na ponownym zawieszeniu granulek komórkowych najpierw w 500 μl lodowatego 50% acetonu (1:1 z dH2O) i delikatnym pipetowaniu.</li>
	<li>Wirować na wirówce laboratoryjnej 2 000 x g przez 20 sekund, odessać supernatant i ponownie zawiesić granulki komórkowe w 500 μl lodowatego 100% acetonu, delikatnie pipetując.</li>
	<li>Wirować na wirówce laboratoryjnej o masie 2 000 x g przez 20 sekund, odessać supernatant i ponownie zawiesić granulki komórkowe w 500 μl lodowatego 50% acetonu, delikatnie pipetując.</li>
	<li>Wirować na mikrowirówce stołowej 2 000 x g przez 20 sekund, odessać supernatant i przemyć komórki raz w zimnym buforze FACS (PBS + 0,5% BSA) przez delikatne pipetowanie.</li>
	<li>Przygotuj koktajl znakujący z przeciwciałami lub markerami dla interesujących nas cząsteczek: 0,1 U/100 μl AF488-falloidyny do barwienia F-aktyną i 1 μl/100 μl Ter119-PECy7 do barwienia komórek erytroidalnych. Alternatywne lub dodatkowe barwienie można również wykonać przy użyciu przeciwciała AF-488-anty-β-tubuliny (1:50), podjednostki B sprzężonej z toksyną AF-594 do znakowania tratw lipidowych (1:200), przeciwciała pierwszorzędowego anty-pMRLC (Ser19) dla fosforylowanego łańcucha lekkiego regulatora miozyny (1:50), a następnie przeciwciała drugorzędowego sprzężonego z anty-królikiem AF-488 (1:400) i pierwotnego przeciwciała królika anty-γ-tubuliny (1:100), a następnie przeciwciała drugorzędowego sprzężonego z anty-królikiem AF-555 (1:300).</li>
	<li>Po aspiracji supernatantu ponownie zawiesić osady komórkowe w 100 μl koktajlu markerowego, delikatnie pipetować i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przygotować bufor FACS zawierający 2,5 μM barwnika jądrowego Draq5.</li>
	<li>Umyć komórki w buforze FACS, odwirować na mikrowirówce stołowej 2 000 x g przez 20 sekund, odessać supernatant i ponownie zawiesić w 60 μl buforze FACS zawierającym Draq5.</li>
	<li>Uruchom próbki na obrazowym cytometrze przepływowym, aby zebrać co najmniej 10 000 zdarzeń na eksperyment, skompensuj pliki danych surowych zgodnie z poprzednio opublikowanymi13 i przeanalizuj wyniki, jak pokazano na rysunku 2, przy użyciu oprogramowania analitycznego specyficznego dla obrazowego cytometru przepływowego.</li>
</ol>

<ol><li>McGrath, K. E., Kingsley, P. D., Koniski, A. D., Porter, R. L., Bushnell, T. P., Palis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enucleation+of+primitive+erythroid+cells+generates+a+transient+population+of+%26%2334%3Bpyrenocytes%26%2334%3B+in+the+mammalian+fetus%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Enucleation of primitive erythroid cells generates a transient population of &#34;pyrenocytes&#34; in the mammalian fetus.</a> Blood. 111, 2409-2417 (2008).</li>
<li>Chasis, J. A., Mohandas, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Erythroblastic+islands%3A+niches+for+erythropoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Erythroblastic islands: niches for erythropoiesis.</a> Blood. 112, 470-478 (2008).</li>
<li>Koury, S. T., Koury, M. J., Bondurant, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoskeletal+distribution+and+function+during+the+maturation+and+enucleation+of+mammalian+erythroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cytoskeletal distribution and function during the maturation and enucleation of mammalian erythroblasts.</a> J Cell Biol. 109, 3005-3013 (1989).</li>
<li>Ji, P., Jayapal, S. R., Lodish, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enucleation+of+cultured+mouse+fetal+erythroblasts+requires+Rac+GTPases+and+mDia2%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Enucleation of cultured mouse fetal erythroblasts requires Rac GTPases and mDia2.</a> Nat Cell Biol. 10, 314-321 (2008).</li>
<li>Keerthivasan, G., Small, S., Liu, H., Wickrema, A., Crispino, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicle+trafficking+plays+a+novel+role+in+erythroblast+enucleation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Vesicle trafficking plays a novel role in erythroblast enucleation.</a> Blood. 116, 3331-3340 (2010).</li>
<li>McGrath, K. E., Bushnell, T. P., Palis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multispectral+imaging+of+hematopoietic+cells%3A+where+flow+meets+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Multispectral imaging of hematopoietic cells: where flow meets morphology.</a> J Immunol Methods. 336, 91-97 (2008).</li>
<li>Konstantinidis, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+and+cytoskeletal+requirements+in+erythroblast+enucleation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Signaling and cytoskeletal requirements in erythroblast enucleation.</a> Blood. 119, 6118-6127 (2012).</li>
<li>Giarratana, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+generation+of+fully+mature+human+red+blood+cells+from+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Ex vivo generation of fully mature human red blood cells from hematopoietic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 23, 69-74 (2005).</li>
<li>Chen, K., Liu, J., Heck, S., Chasis, J. A., An, X., Mohandas, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolving+the+distinct+stages+in+erythroid+differentiation+based+on+dynamic+changes+in+membrane+protein+expression+during+erythropoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Resolving the distinct stages in erythroid differentiation based on dynamic changes in membrane protein expression during erythropoiesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. , (2009).</li>
<li>Kalfa, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rac1+and+Rac2+GTPases+are+necessary+for+early+erythropoietic+expansion+in+the+bone+marrow+but+not+in+the+spleen%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Rac1 and Rac2 GTPases are necessary for early erythropoietic expansion in the bone marrow but not in the spleen.</a> Haematologica. 95, 27-35 (2010).</li>
<li>Koulnis, M., Pop, R., Porpiglia, E., Shearstone, J. R., Hidalgo, D., Socolovsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+analysis+of+mouse+erythroid+progenitors+using+the+CD71%2FTER119+flow-cytometric+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Identification and analysis of mouse erythroid progenitors using the CD71/TER119 flow-cytometric assay.</a> J Vis Exp. , (2011).</li>
<li>Yoshida, H., Kawane, K., Koike, M., Mori, Y., Uchiyama, Y., Nagata, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatidylserine-dependent+engulfment+by+macrophages+of+nuclei+from+erythroid+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Phosphatidylserine-dependent engulfment by macrophages of nuclei from erythroid precursor cells.</a> Nature. 437, 754-758 (2005).</li>
<li>Ortyn, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitivity+measurement+and+compensation+in+spectral+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Sensitivity measurement and compensation in spectral imaging.</a> Cytometry A. 69, 852-862 (2006).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

W ostatnich latach badania nad enukleacją erytroblastów nabierają coraz większego rozpędu, ponieważ jest to etap w hodowlach erytropoezy in vitro , który jest najtrudniejszy do efektywnego rozmnażania w celu osiągnięcia udanej produkcji czerwonych krwinek na dużą skalę ex vivo. Do niedawna badania nad enukleacją erytroblastów wykorzystywały głównie metody mikroskopii fluorescencyjnej i cytometrii przepływowej. Metody mikroskopii fluorescencyjnej, Chociaż są pomocne w identyfikacji uczestniczących cząst...

Końcowe różnicowanie w linii erytroidalnej u ssaków kończy się dramatycznym procesem enukleacji, przez który ortochromatyczny erytroblast wydala swoje otoczone błoną jądro (pyrenocyt)1, tworząc retikulocyt2. Dokładny mechanizm tego procesu, który jest również etapem ograniczającym szybkość udanej produkcji czerwonych krwinek in vitro na dużą skalę, nie jest jeszcze w pełni wyjaśniony. Lokalizacja kluczowych białek i struktur w wyłuszczeniu erytroblastów opiera się na zastosowaniu mikroskopii fluorescencyjnej i elektronowej3-5. Ten żmudny proces zazwyczaj prowadzi do identyfikacji ograniczonej liczby zdarzeń enukleacji i nie zawsze pozwala na miarodajną analizę statystyczną. Rozwijając metodę identyfikacji erytroblastów opisaną wcześniej przez McGratha i wsp.6, opracowaliśmy nowatorskie podejście do identyfikacji i badania zdarzeń enukleacji za pomocą obrazowania wielospektralnego Cytometria przepływowa (wieloparametrowe obrazowanie komórek o dużej prędkości w przepływie, metoda łącząca mikroskopię fluorescencyjną z cytometrią przepływową)7, która może zapewnić wystarczającą liczbę obserwacji do uzyskania pomiarów i przeprowadzenia analizy statystycznej.
Tutaj opisujemy pierwsze dwie metody hodowli erytropoezy in vitro używane w celu synchronizacji erytroblastów i zwiększenia prawdopodobieństwa wychwytywania enukleacji w momencie oceny. Następnie szczegółowo opisujemy barwienie erytroblastów po utrwaleniu i przepuszczalności w celu zbadania lokalizacji białek wewnątrzkomórkowych lub tratw lipidowych podczas enukleacji za pomocą wielospektralnej cytometrii przepływowej obrazowania.
Próbki są badane na obrazowym cytometrze przepływowym, a zebrane komórki są odpowiednio bramkowane, aby zidentyfikować erytroblasty ortochromatyczne6. Ortochromatyczne erytroblasty są następnie analizowane na podstawie ich współczynnika kształtu, mierzonego w obrazowaniu w jasnym polu, w porównaniu z ich wartością parametru centroidu delta XY Ter119-DNA, który definiuje się jako odległość między środkami obszarów barwionych odpowiednio dla Ter119 i DNA. Populacja komórek o niskim współczynniku kształtu i centroidzie XY Ter119 / DNA o wysokim współczynniku delta jest wysoce wzbogacona w komórki wyłuszczające. Wykorzystanie erytroblastów typu dzikiego (WT) w porównaniu z erytroblastami z warunkową delecją Rac1 za pośrednictwem Mx-Cre na Rac2-/- lub połączonym Rac2-/-; Rac3-/- tło genetyczne i ten nowatorski protokół analizy wielospektralnej obrazowania cytometrii przepływowej, niedawno wykazaliśmy, że enukleacja przypomina cytokinezę asymetryczną i że tworzenie pierścienia aktomiozyny regulowanego częściowo przez GTPazy Rac jest ważne dla progresji enukleacji7.

<table><tbody><tr><td>&alfa; MEM pożywka</td><td>CellGro</td><td>15-012-CV</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka IMDM</td><td>Hyklon (Thermo Scientific)</td><td>SH30228.01</td><td></td></tr><tr><td>Stempro-34 SFM</td><td>GIBCO (Life Tech)</td><td>10640</td><td></td></tr><tr><td>Stempro-34 Suplement odżywczy</td><td>GIBCO (Life Tech)</td><td>10641-025</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>512450</td><td></td></tr><tr><td>BIT9500</td><td>Stemcell Technologie</td><td>09500</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP-1600-100</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Hyklon (Thermo Scientific)</td><td>SH30028.02</td><td></td></tr><tr>Hyklon<td>penicyliny/streptomycyny</td><td>(Thermo Scientific)</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr>Hyklon<td>L-glutaminy</td><td>(Thermo Scientific)</td><td>SH30590.01</td><td></td></tr><tr><td>Isothesia (Isoflurane)</td><td>Butler-Schein</td><td>029405</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque 1,083 mg / ml</td><td>Sigma</td><td>10831</td><td></td></tr><tr><td>BD Pharmlyse (bufor do lizy RBC)</td><td>BD Biosciences</td><td>555899</td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>534064</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyd</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP 531-500</td><td></td></tr><tr><td>Hydrokortyzon</td><td>Sigma</td><td>H4001</td><td></td></tr><tr><td>Czynnik komórek macierzystych (SCF)</td><td>Peprotech</td><td>250-03</td><td></td></tr><tr><td>Interleukina-3 (IL-3)</td><td>Peprotech</td><td>213-13</td><td></td></tr><tr><td>EPOGEN Epoetyna Alfa (Erytropoetyna, EPO)</td><td>AMGEN</td><td>dostępne w aptece</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało CD44-FITC</td><td>BD Pharmingen</td><td>553133</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało CD71-FITC</td><td>BD Pharmingen</td><td>553266</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało Ter119-PECy7</td><td>BD Pharmingen</td><td>557853</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin-AF488</td><td>Invitrogen (Life Technologies)</td> <td>Przeciwciało A12379</td><td></td></tr> <tr><td>i beta;-tubulina-AF488</td><td>Cell Signaling</td><td>#3623</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało anty-królicze AF488-drugorzędowe</td><td>Invitrogen (Life Technologies)</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało anty-królicze AF555-drugorzędowe</td><td>Invitrogen (Life Technologie)</td><td>A21428</td><td></td></tr><tr><td>AF594-podjednostka B toksyny</td><td>Invitrogen (Life Technologies)</td><td>C34777</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało pMRLC (Ser19)</td><td>Sygnalizacja komórkowa</td> <td># 3671</td><td></td></tr><tr><td>&gamma;-tubulina</td><td>przeciwciało Sigma</td><td>T-3559</td><td></td></tr><tr><td>Syto16</td><td>Invitrogen (Life Technologies)</td> <td>S7578</td><td></td></tr><tr><td>Draq5</td><td>Biostatus</td><td>DR50200</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan żelazawy</td><td>Sigma</td><td>F7002</td><td></td></tr><tr><td>Azotan żelaza</td><td>Sigma</td><td>F3002</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP120500</td><td></td></tr><tr><td>probówki 15 ml</td><td>BD Falcon</td><td>352099</td><td></td></tr><tr><td>50 ml probówki</td><td>BD Falcon</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>płytki 6-dołkowe</td><td>BD Falcon</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>24- płytki studzienkowe</td><td>BD Falcon</td><td>351147</td><td></td></tr><tr><td>Rurki przepływowe</td><td>BD Falcon</td><td>352008</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka tuberkulinowa</td><td>BD</td><td>309602</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka insulinowa</td><td>BD</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>Igła strzykawkowa 25-G 5/8</td><td>BD</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>Rurki przepływowe z nakrętką</td><td>BD</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>40-&mu; m Sitko do komórek</td><td>BD Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Skalpel (jednorazowy)</td> <td>Feather</td><td>2975#21</td><td></td></tr><tr><td>FACS Canto Cytometr przepływowy</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImagestreamX Mark II Obrazowy cytometr przepływowy</td><td>AMNIS (EMD Millipore)</td> Oprogramowanie do eksploracji i analizy danych obrazowych (IDEAS) <td></td><td></td></tr><tr><td>w wersji 4.0 i nowszych.</td><td>AMNIS (EMD Millipore)</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Hemavet 950 Licznik komórek</td><td>Drew Scientific</td><td>CDC-9950-002</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator NAPCO serii 8000WJ</td><td>Thermo scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wirówka Allegra X-15R Beckman</td><td>Coulter</td><td>392932</td><td></td></tr><tr><td>Mini Mouse Wirówka stołowa</td><td>Denville</td><td>C0801</td><td></td></tr></tbody></table>

identyfikacja subpopulacji mysich erytroblastów wzbogaconej w zdarzenia wyłuszczenia za pomocą wielospektralnej cytometrii przepływowej obrazowania

Identification of a Murine Erythroblast Subpopulation  Enriched in Enucleating Events by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

Erytropoeza u ssaków kończy się dramatycznym procesem enukleacji, który prowadzi do powstania retikulocytów. Mechanizm enukleacji nie został jeszcze w pełni wyjaśniony. Częstym problemem napotykanym podczas badania lokalizacji kluczowych białek i struktur w obrębie wyłuszczających erytroblastów za pomocą mikroskopii jest trudność w zaobserwowaniu wystarczającej liczby komórek ulegających enukleacji. Opracowaliśmy nowatorski protokół analizy wykorzystujący wieloparametrowe szybkie obrazowanie komórek w przepływie (Multi-Spectral Imaging Flow Cytometry), metodę łączącą mikroskopię immunofluorescencyjną z cytometrią przepływową, W celu skutecznej identyfikacji znacznej liczby zdarzeń enukleacyjnych, pozwala to na uzyskanie pomiarów i przeprowadzenie analizy statystycznej.
Najpierw opisujemy tutaj dwie metody hodowli erytropoezy in vitro używane w celu synchronizacji mysich erytroblastów i zwiększenia prawdopodobieństwa wychwytywania enukleacji w czasie oceny. Następnie szczegółowo opisujemy barwienie erytroblastów po utrwaleniu i przepuszczalności, aby zbadać lokalizację białek wewnątrzkomórkowych lub tratw lipidowych podczas enukleacji za pomocą wielospektralnej cytometrii przepływowej obrazowania. Wraz z rozmiarem i Barwienie DNA / Ter119, które służy do identyfikacji erytroblastów ortochromatycznych, wykorzystujemy parametry "proporcji" komórki w kanale jasnego pola, który pomaga w rozpoznawaniu wydłużonych komórek i "centroid delta XY Ter119 / Draq5", który umożliwia identyfikację zdarzeń komórkowych, w których centrum barwienia Ter119 (powstający retikulocyt) jest daleko od centrum barwienia Draq5 (jądro poddawane ekstruzji), wskazując w ten sposób na komórkę, która ma się wyłuszczyć. Podzbiór ortochromatycznej populacji erytroblastów o wysokim środku ciężkości delta i niskim współczynniku kształtu jest wysoce wzbogacony w komórkach wyłuszczających.

W pierwszej kolejności analizowane są komórki pod kątem ich współczynnika proporcji w jasnym polu (Brightfield Aspect Ratio – stosunek długości osi mniejszej do osi większej) oraz pola powierzchni w jasnym polu (Brightfield Area, wskazującego na ich wielkość). Zdarzenia o wartości pola Brightfield Area mniejszej niż 20 i większej niż 200 stanowią odpowiednio głównie debris oraz agregaty komórkowe i są wykluczane z analizy (Rysunek 2A). Pojedyncze komórki (bramka „R1”) są następnie analizowane pod kątem w...

Obecny protokół opisuje nowatorską metodę identyfikacji populacji enukleujących się ortochromatycznych erytroblastów za pomocą wielospektralnej cytometrii przepływowej, zapewniając wizualizację procesu enukleacji erytroblastów.

Identyfikacja subpopulacji mysich erytroblastów wzbogaconej w zdarzenia wyłuszczenia za pomocą wielospektralnej cytometrii przepływowej obrazowania

Erythropoiesis in mammals concludes with the dramatic process of enucleation that results in reticulocyte formation. The mechanism of enucleation has not ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest ułatwienie identyfikacji zdarzeń enukleacji z subpopulacją erytroblastów. Pierwszym krokiem jest stworzenie populacji wzbogaconej w zdarzenia enukleacji. Osiąga się to poprzez hodowlę erytropoezy in vitro, albo w wariancie długoterminowym, rozpoczynając od komórek szpiku kostnego o niskiej gęstości izolowanych z kości udowych, piszczelowych i miedniczych myszy niestresowanej, albo poprzez hodowlę krótkoterminową.Proces rozpoczyna się od pobrania erytroblastów ze śledziony myszy, której wcześniej wykonano flebotomię w celu wywołania stresowej erytropoezy. Hodowane komórki w końcowym etapie hodowli są utrwalane, permeabilizowane i barwione odpowiednimi markerami fluorescencyjnymi. Komórki te są poddawane analizie w cytometrze przepływowym z obrazowaniem, a następnie analizowane w celu zidentyfikowania komórek przechodzących enukleację w populacji komórek jądrzastych, co pozwala na identyfikację sygnałowych i cytoszkieletowych komponentów regulujących i pośredniczących w procesie enukleacji.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak mikroskopia fluorescencyjna, jest możliwość obserwacji i analizy znacznie większe

identification-murine-erythroblast-subpopulation-enriched-enucleating

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Identyfikacja podpopulacji erytroblastów mysich wzbogaconych w zdarzenia enuclearyzacji za pomocą wielospektralnej cytometrii przepływowej z obrazem

Metoda cytometrii przepływowej do identyfikacji i analizy molekularnej mysich progenitorów i prekursorów erytroidalnych specyficznych dla stadium różnicowania, bezpośrednio w świeżo pobranym szpiku kostnym, śledzionie lub wątrobie płodowej myszy. Analiza opiera się na markerach powierzchniowych CD71, Ter119 oraz wielkości komórek.

Identyfikacja i analiza prekursorów erytroidalnych myszy z wykorzystaniem analizy cytometrycznej CD71/TER119

Manipulowanie czasową ekspresją genów w różnicujących się embrionalnych komórkach macierzystych (ESC) można osiągnąć za pomocą indukowalnych systemów genetycznych. Jednak wytwarzanie tych linii komórkowych jest kosztowne i czasochłonne. Protokół ten zapewnia szybką ekspresję transgenu w różnicujących się komórkach pochodzących z ES, a następnie analizę dalszego różnicowania układu krwiotwórczego.

Zakażenie retrowirusowe mysich embrionalnych komórek ciała zarodkowego pochodzących z embrionalnych komórek macierzystych do analizy różnicowania układu krwiotwórczego

Hematopoetyczne komórki macierzyste i progenitorowe (HSPC) pochodzą z wyspecjalizowanych (hemogennych) komórek śródbłonka podczas rozwoju, jednak niewiele wiadomo o procesie, w którym niektóre komórki śródbłonka decydują się na ukrwienie. Przedstawiono metodę opartą na cytometrii przepływowej, pozwalającą na jednoczesną izolację hemogennych komórek śródbłonka i HSPC z mysich tkanek embrionalnych.

Izolacja mysich embrionalnych hemogennych komórek śródbłonka

Podczas gdy infiltrujące makrofagi są stale rekrutowane do tkanek dorosłych z krążących prekursorów, makrofagi rezydentne zasiewają swoją tkankę podczas rozwoju, gdzie są utrzymywane bez dalszego wkładu ze strony przodków. Niedawno zidentyfikowano prekursorów rezydujących makrofagów. W tym miejscu przedstawiono metody genetycznego mapowania losów rezydentnych przodków makrofagów.

Identyfikacja przodków erytromieloidów i ich potomstwa w zarodku myszy za pomocą cytometrii przepływowej

Ten artykuł opisuje cytometrię spektralną, nowe podejście w cytometrii przepływowej, które wykorzystuje kształty widm emisyjnych do rozróżniania fluorochromów. Algorytm zastępuje kompensacje i może traktować autofluorescencję jako niezależny parametr. To nowe podejście pozwala na prawidłową analizę komórek wyizolowanych z narządów stałych.

Analiza zawiesin komórkowych wyizolowanych z tkanek stałych za pomocą spektralnej cytometrii przepływowej

Celem tego protokołu jest identyfikacja populacji komórek śródbłonka limfatycznego w wątrobie za pomocą opisanych markerów. Wykorzystujemy kolagenazę IV i DNazę oraz delikatne mielenie tkanki w połączeniu z cytometrią przepływową, aby zidentyfikować odrębną populację komórek śródbłonka limfatycznego.

Trawienie mysiej wątroby do analizy cytometrycznej przepływowej komórek śródbłonka limfatycznego

Test mikrojądrowy in vitro jest dobrze znaną metodą oceny genotoksyczności i cytotoksyczności, ale ocena testu za pomocą mikroskopii manualnej jest pracochłonna i cierpi z powodu subiektywności i zmienności między punktorami. W artykule opisano protokół opracowany w celu przeprowadzenia w pełni zautomatyzowanej wersji testu z wykorzystaniem cytometrii przepływowej obrazowania wielospektralnego.

Zautomatyzowana metoda wykonywania testu mikrojądrowego in vitro przy użyciu cytometrii przepływowej obrazowania wielospektralnego

Opisujemy tutaj prostą analizę heterogeniczności przedziału mysich komórek odpornościowych B w tkankach otrzewnej, śledziony i szpiku kostnego za pomocą cytometrii przepływowej. Protokół można dostosować i rozszerzyć na inne tkanki myszy.

Charakterystyka cytometrii przepływowej rozwoju mysich komórek B

Tutaj opisujemy prosty protokół izolacji i barwienia mysich komórek szpiku kostnego do fenotypu hemopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych wraz z wspierającymi je niszowymi komórkami macierzystymi śródbłonka i mezenchymalnymi komórkami macierzystymi. Uwzględniono również metodę wzbogacania komórek zlokalizowanych w obszarach śródkostnych i centralnych szpiku kostnego.

Analiza cytometrii przepływowej mysich komórek macierzystych i progenitorowych szpiku kostnego oraz komórek niszowych zrębu

Tutaj opisujemy nowatorską metodę cytometrii przepływowej do prospektywnej izolacji wczesnych prekursorów erytroidalnych (BFU-e) i erytroidalnych tworzących kolonie (CFU-e) bezpośrednio ze świeżego szpiku kostnego i śledziony myszy. Protokół ten, opracowany na podstawie danych transkryptomicznych pojedynczych komórek, jest pierwszym, który izoluje wszystkie erytroidalne komórki progenitorowe tkanki o wysokiej czystości.

Identyfikacja i izolacja progenitorów erytroidalnych jednostek tworzących pęknięcia i kolonii z tkanki myszy za pomocą cytometrii przepływowej

Ten artykuł opisuje metodę izolacji mysich komórek śródbłonka z naczyń włosowatych limfatycznych skóry za pomocą kulek magnetycznych. Wyizolowane komórki śródbłonka limfatycznego można wykorzystać do dalszych eksperymentów in vitro i analizy ekspresji białek.

Mysia izolacja komórek śródbłonka limfatycznego skóry

Poznaj metodę identyfikacji wyłuszczających erytroblastów ortochromatycznych u myszy za pomocą wielospektralnej cytometrii przepływowej obrazowania. Technika umożliwia szczegółową analizę procesu erytropoezy.

Identyfikacja subpopulacji mysich erytroblastów wzbogaconej w zdarzenia wyłuszczenia za pomocą wielospektralnej cytometrii przepływowej obrazowania (Wideo) | JoVE Journal

Identyfikacja subpopulacji mysich erytroblastów wzbogaconej w zdarzenia wyłuszczenia za pomocą wielospektralnej cytometrii przepływowej obrazowania

Przeglądaj więcej filmów