Name: Izolacja żywotnych gruczołów wielokomórkowych z tkanki rośliny mięsożernej, Dzbanecznik (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-22T20:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 8 s
Description: Naucz się izolować gruczoły z mięsożernej rośliny Nepenthes metodą mechaniczną mikropreparatyki. Technika umożliwia analizę molekularną i biochemiczną tych struktur odpowiedzialnych za biosyntezę związków.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy zespołowi szklarniowemu z MPI-CE w Ogrodzie Botanicznym Uniwersytetu Friedricha Schillera w Jenie za uprawę roślin oraz Wilhelmowi Bolandowi i Towarzystwu Maxa Plancka za wsparcie.

1. Przygotowanie materiału roślinnego
<ol>
	<li>Wszystkie gatunki Dzbaneczników były uprawiane w szklarniach MPI for Chemical Ecology lub w Ogrodzie Botanicznym w Jenie w Niemczech.</li>
	<li>W celu przygotowania tkanki wydzielającej należy pobrać dzbanek i usunąć górną jedną trzecią, w tym pokrywkę, perystom i strefę śliskości. Dzbanek może być używany zarówno świeży, jak i zamrożony w ciekłym azocie i przechowywany w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
2. Mikrodysekcja tkanki dzbanka
<ol>
	<li>Platforma do mikropróbkowania składa się z mikroskopu stereoskopowego i mikromanipulatora, który jest bezpośrednio przymocowany do korpusu mikroskopu i jest obsługiwany za pomocą joysticka 3D. W tym przypadku wykorzystano wczesny prototyp aureki, jak udokumentowano (ryc. 2A).</li>
	<li>Do preparacji gruczołów wydzielniczych z dzbanów Dzbanecznika użyj mikrokleszczyków i przymocuj je do manipulatora (ryc. 2A i 2B).</li>
	<li>W celu ekstrakcji RNA należy potraktować wszystkie narzędzia (żyletki, pęsetę, mikromanipulator, mikrokleszcze, szkiełko do przedmiotów) za pomocą RNaseZAP.</li>
	<li>Przygotuj probówki zbiorcze, dodając 9 μl wody wolnej od nukleaz i 1 μl inhibitora RNazy do probówki PCR do ekstrakcji RNA. Do bezpośredniego PCR z próbek tkanek należy używać wyłącznie wody wolnej od nukleaz (10 μl).
	<ol>
		<li>Weź świeży lub zamrożony dzbanek i usuń 1-2cm2 kawałek tkanki zawierającej gruczoły wydzielnicze za pomocą żyletki i pęsety. Umyj chusteczkę wodą; dodać 0,1% dietylopirowęglanu (DEPC), jeśli RNA ma być ekstrahowane.</li>
		<li>Przymocuj materiał roślinny za pomocą dwustronnej taśmy klejącej na szkiełku przedmiotowym (powierzchnia pokryta dławikiem powinna być skierowana do góry, rysunki 2C i 2D) i zabezpiecz szkiełko taśmą klejącą na uniwersalnym stoliku, który należy przykleić za pomocą ruchomego stołu.</li>
		<li>Do ekstrakcji kwasów nukleinowych preparat należy wykonać na lodzie. Dlatego weź płaskie pudełko styropianowe, umieść w nim uniwersalny stolik zawierający próbkę i napełnij pudełko lodem. Następnie umieść pudełko pod mikroskopem.</li>
		<li>Do przygotowania bardzo ważne jest ułożenie gruczołów. Gruczoły wydzielnicze są częściowo zakryte kapturem ochronnym (ryc. 3) i dostępne tylko przez kleszcze z jednej strony. Ponadto kąt nachylenia próbki do kleszczy należy wyregulować, przechylając stół stolika uniwersalnego o około 135°, w zależności od gatunków Dzbaneczników.</li>
		<li>Mikrodysekcja odbywa się pod kontrolą wizualną. Do izolacji gruczołów użyj filtra innego niż UV, aby ograniczyć degradację DNA i RNA.</li>
		<li>Przesuń mikromanipulator i kleszcze za pomocą panelu sterowania do wybranego dławika. Po dotarciu do gruczołu umieść każde ramię kleszczy po obu stronach gruczołu. Usuń gruczoł z pozostałej tkanki, zamykając kleszcze (ryc. 4A).</li>
		<li>Skieruj gruczoł przymocowany do kleszczy z dala od przedmiotu i do probówki zbiorczej. Doprowadź same końcówki kleszczy do kontaktu z roztworem w probówce (Rysunek 4B). Należy dobrze obserwować uwalnianie gruczołu poprzez otwarcie kleszczy, ponieważ gruczoły mają tendencję do przyklejania się do końcówki narzędzia. Tkanka może być przechowywana w temperaturze -80 °C do czasu ekstrakcji PCR lub RNA.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Bezpośrednia amplifikacja PCR z tkanki dzbanecznika
<ol>
	<li>Aby udowodnić skuteczność metody przygotowania, można przeprowadzić podejście PCR bezpośrednio z tkanki gruczołu bez etapu ekstrakcji DNA.</li>
	<li>Do amplifikacji PCR należy użyć starterów specyficznych dla genu; tutaj kodując sekwencję białka podobnego do taumatyny (TLP) (do przodu: 5'-CAATGAGCCAATTCATAAAATTCATTG-3', odwrotnie: 5'-CAGTTATACTTTAAGGGCAAAACACAAC-3').
	<ol>
		<li>Zbierz 1-5 gruczołów w probówce PCR zawierającej 10 μl wody wolnej od nukleaz. Do reakcji 50 μl dodać 5 μl 10x buforu Taq, 1 μl 10 mM trifosforanów deoksynukleozydów (dNTP), 3 μl 25 mM MgCl2, 0,4 μl (1,25 U) polimerazy DNA Taq, 1 μl (100 pmol) każdego startera i 28,6 μl wody wolnej od nukleaz</li>.
		<li>Przeprowadzić reakcje PCR w termocyklerze z następującym programem: początkowa denaturacja 94 °C przez 3 minuty, 35 cykli denaturacji (94 °C przez 30 sekund), wyżarzanie (59 °C przez 30 sekund) i przedłużenie (72 °C przez 1 minutę) i końcowy etap przedłużania trwający 10 minut w temperaturze 72 °C.</li>
		<li>Udowodnić amplifikację produktu PCR za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym. Dlatego użyj 1,5% (w/v) agarozy i rozpuść ją w 1x buforze TAE (40 mM zasady Tris, 20 mM lodowatego kwasu octowego, 1 mM EDTA, pH 8). Podgrzej roztwór w kuchence mikrofalowej, aż agaroza się rozpuści. Do 100 ml roztworu agarozy dodać 1 μl bromku etydyny (10 μg/μl) w celu dalszej wizualizacji. Uruchom żel w 1x buforze TAE przy napięciu 300 V, 115 mA przez około 20 minut w komorze elektroforetycznej. Prawidłowy rozmiar amplikonu TLP musi wynosić 690 pz.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Ekstrakcja RNA z małych próbek tkanek i odwrotna transkrypcja
<ol>
	<li>Wykonaj następujące czynności na lodzie. Do ekstrakcji RNA zastosowano dwie metody ekstrakcji: Micro Kit do ekstrakcji całkowitego RNA oraz zestaw do izolacji mRNA nakładany za pomocą kulek magnetycznych.</li>
	<li>Zebrać co najmniej 30 gruczołów wydzielniczych za pomocą mikropreparatu do probówki PCR zawierającej 1 μl inhibitora RNazy i 9 μl wody wolnej od nukleaz. Następnie poddać elektrolizie tkankę w termocyklerze przez 10 minut w temperaturze 75 °C.</li>
	<li>Ekstrakcja całkowitego RNA.
	<ol>
		<li>Po przygotowaniu dodać 90 μl roztworu do lizy do próbki i inkubować przez 10 minut w temperaturze 75 °C. Następnie załadować mieszaninę reakcyjną do kolumny (dostarczonej z zestawem) i postępować zgodnie z etapami płukania opisanymi w instrukcji producenta.</li>
		<li>Eluować RNA dwa razy odpowiednio 10 μl roztworu elucyjnego i kontynuować leczenie DNazą I.</li>
		<li>Do 20 μl wyekstrahowanego RNA dodać 2 μl 10x buforu DNazy I i 1 μl DNazy I (dostarczonej z zestawem do ekstrakcji RNA) i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. Zatrzymać reakcję dodając 2 μl odczynnika do inaktywacji DNazy i inkubować przez 2 minuty w temperaturze pokojowej. Po etapie wirowania przez 1,5 minuty z maksymalną prędkością, RNA można przenieść do świeżej probówki wolnej od RNazy. Oznaczyć stężenie RNA w każdej próbce za pomocą spektrofotometru. Próbki należy przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ekstrakcja mRNA za pomocą kulek magnetycznych.
	<ol>
		<li>Dostosować objętość próbki do 100 μl za pomocą buforu do lizy/wiązania (dostarczanego w zestawie) i inkubować przez 10 minut w temperaturze 75 °C. Dodać 20 μl kulek magnetycznych dostarczonych z zwisem Oligo (dT)25 i mieszać reakcję przez 5 minut w temperaturze pokojowej. mRNA wiąże się przez ogon poli(A) z zwisem oligonukierykulkowym (dT)25 kulek.</li>
		<li>Wykonaj etapy płukania mRNA związanego z kulkami magnetycznymi, postępując zgodnie z protokołem producenta. Roztwory można usuwać za pomocą magnesu. Ponownie zawiesić kulki w 20 μl 10 mM buforze Tris-HCl (pH 7,5).</li>
		<li>Usunąć zanieczyszczenia genomowego DNA, traktując próbkę 2U (1 μl) DNazy (2 μl 10x bufor DNazy i 17 μl wody wolnej od nukleaz) przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. Następnie roztwór enzymu jest usuwany przez magnes, a kulki są ponownie zawieszane w 20 μl 10 mM buforu Tris-HCl. Nie jest możliwe zmierzenie stężenia RNA, ponieważ jest ono przyczepione do kulek. Próbki należy przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Do odwrotnej transkrypcji użyj zestawu do syntezy cDNA. Reakcje przeprowadzono zgodnie z protokołem producenta.
	<ol>
		<li>Do odwrotnej transkrypcji całkowitego RNA dodać 1 μl (100 pmol) startera Oligo (dT)20 lub 1 μl (0,4 μg) losowych heksamerów, 1 μl inhibitora RNazy i 1 μl 10 mM dNTP Mix do 1 μg RNA i dostosować objętość do 14 μl wodą wolną od nukleaz. Inkubować w temperaturze 65 °C przez 5 minut, a następnie umieścić próbki na lodzie. Dodaj 1 μl 0,1 M DTT, 1 μl odwrotnej transkryptazy i 4 μl buforu 5x RT. Reakcje inkubuje się przez 55 minut w temperaturze 50 °C, a następnie następuje etap inaktywacji w temperaturze 70 °C przez 10 minut. Po odwrotnej transkrypcji próbki mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C.</li>
		<li>W przypadku mRNA związanego z kulkami magnetycznymi należy zastąpić bufor Tris-HCl pierwszą mieszanką reakcyjną (1 μl inhibitora RNazy, 1 μl 10 mM dNTP Mix i 12 μl wody wolnej od nukleaz) i inkubować przez 5 minut w temperaturze 65 °C. Ze względu na zwis kulek Oligo (dT)25 nie jest konieczne dodawanie do próbek startera Oligo (dT)20 ani heksamerów losowych. Następnie postępuj zgodnie z powyższym protokołem (krok 4.5.1).</li>
		<li>Zmierz stężenie cDNA za pomocą spektrofotometru. Próbki należy przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. PCR w czasie rzeczywistym
<ol>
	<li>Do analiz za pomocą Real-time PCR należy użyć całkowitego RNA wyekstrahowanego za pomocą Micro Kit i SYBR Green QPCR Master Mix. Aby zapewnić równą liczbę transkryptów, dostosuj stężenie cDNA w każdej próbce do tej samej wartości po odwrotnej transkrypcji.</li>
	<li>Oprócz próbek wstawia się reakcje kontrolne. Użyj kontroli bez szablonu, aby przesiać odczynniki pod kątem zanieczyszczeń i sprawdzić jakość starterów. Aby zweryfikować brak genomowego DNA, należy przeprowadzić kontrolę inną niż RT. Obie reakcje powinny być ujemne (brak sygnału fluorescencji) w Real-time PCR.</li>
	<li>Aby zagwarantować równy poziom transkryptu między różnymi próbkami, należy użyć co najmniej jednego genu referencyjnego. Użyto tu zaprojektowanych par starterów kodujących aktynę (przód: 5'-CTCTTAACCCCAAAGCAAACAGG-3', rewers: 5'-GTGAGAGAACAGCCTGGATG-3') oraz 18SrRNA (do przodu: 5'-CTTGATTCTATGGGGTGGTG-3', odwrotnie: GTTAGCAGGCTGAGGTCTC-3'). Jako gen docelowy wybrano TLP (przód: 5'- GTGGGCAACAATTGGACCCAG-3', odwrócony: 5'-CATTCGATCCGGAAAGGCTAC-3'). Wielkość każdego amplifikowanego fragmentu wynosiła około 100 pz.</li>
	<li>Aby uzyskać reakcję 25 μl, dodać 12,5 μl 2x SYBR Green QPCR Master Mix, cDNA (≥20 ng), 400 nM każdego startera i 30 nM pasywnego barwnika referencyjnego ROX (dostarczonego z zestawem). Dostosować objętość próbki do 25 μl za pomocą wody wolnej od nukleaz.</li>
	<li>Reakcje przeprowadzono w termocyklerze QPCR z następującym programem: wstępna denaturacja w temperaturze 95 °C przez 10 minut w celu uaktywnienia polimerazy; 40 cykli denaturacji (95 °C przez 30 sekund), wyżarzanie (61 °C przez 60 sekund) i wydłużanie (72 °C przez 1 min), a następnie krzywa dysocjacji (95 °C przez 60 sekund, 55 °C przez 30 sekund, 95 °C przez 30 sekund). Krzywa dysocjacji jest niezbędna do określenia braku dimerów starterów, które można wykryć za pomocą dodatkowego piku.</li>
	<li>Określ skuteczność (E) każdej reakcji PCR przy użyciu metody Liu i Saint8. Wydajność można odchylić od liniowej części krzywej wzmocnienia. Tutaj względna liczba amplikonów (Rn, A) jednego punktu cyklu (CPA) jest powiązana z ilością amplikonów (Rn, B) innego cyklu (CPB).</li>
	<li>Analizuj wyniki PCR w czasie rzeczywistym za pomocą narzędzia programowego do wyrażeń względnych (REST 2009, <a href="http://www.gene-quantification.de/rest-2009.html" target="_blank">http://www.gene-quantification.de/rest-2009.html</a>) lub podobnego oprogramowania. Użyj programu, aby obliczyć współczynnik ekspresji genu w próbce poddanej działaniu substancji w porównaniu z kontrolą.</li>
</ol>

<ol><li>Adlassnig, W., Peroutka, M., Land, I., Lichtscheidl, I. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glands+of+carnivorous+plants+as+a+model+system+in+cell+biological+research%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Bot.+Gall%22%5BJournal%5D)">Glands of carnivorous plants as a model system in cell biological research.</a> Acta Bot. Gall. 152, 111-124 (2005).</li>
<li>Darwin, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDarwin%2C+C+%22Insectivorous+plants%22">Insectivorous plants</a>. , John Murray. London. (1875).</li>
<li>Mithöfer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carnivorous+pitcher+plants%3A+Insights+in+an+old+topic%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemistry%22%5BJournal%5D)">Carnivorous pitcher plants: Insights in an old topic.</a> Phytochemistry. 72, 1678-1682 (2011).</li>
<li>Owen Jr., T. P., Lennon, K. A., Santo, M. J., Anderson, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathways+for+nutrient+transport+in+the+pitchers+of+the+carnivorous+plant%5BTitle%5D)+AND+%22Nepenthes+alata+Ann.+Bot%22%5BJournal%5D)">Pathways for nutrient transport in the pitchers of the carnivorous plant.</a> Nepenthes alata Ann. Bot. 84, 459-466 (1999).</li>
<li>Brandt, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microgenomics%3A+gene+expression+analysis+at+the+tissue-specific+and+single-cell+levels%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Bot%22%5BJournal%5D)">Microgenomics: gene expression analysis at the tissue-specific and single-cell levels.</a> J. Exp. Bot. 56, 495-505 (2005).</li>
<li>Hölscher, D., Schneider, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+laser-assisted+microdissection+for+tissue+and+cell-specific+analysis+of+RNA%2C+proteins%2C+and+metabolites%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Bot%22%5BJournal%5D)">Application of laser-assisted microdissection for tissue and cell-specific analysis of RNA, proteins, and metabolites.</a> Prog. Bot. 69, 141-167 (2008).</li>
<li>Rottloff, S., Müller, U., Kilper, R., Mithöfer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micropreparation+of+single+secretory+glands+from+the+carnivorous+plant+Nepenthes%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Micropreparation of single secretory glands from the carnivorous plant Nepenthes.</a> Anal. Biochem. 394, 135-137 (2009).</li>
<li>Liu, W. H., Saint, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+quantitative+method+of+real+time+reverse+transcription+polymerase+chain+reaction+assay+based+on+simulation+of+polymerase+chain+reaction+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A new quantitative method of real time reverse transcription polymerase chain reaction assay based on simulation of polymerase chain reaction kinetics.</a> Anal. Biochem. 302, 52-59 (2002).</li>
<li>Werker, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trichome+diversity+and+development%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Bot.+Res.+Inc.+Adv.+Plant+Pathol%22%5BJournal%5D)">Trichome diversity and development.</a> Adv. Bot. Res. Inc. Adv. Plant Pathol. 31, 1-35 (2000).</li>
<li>Fahn, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+secretory+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Bot.+Res.+Inc.+Adv.+Plant+Pathol%22%5BJournal%5D)">Structure and function of secretory cells.</a> Adv. Bot. Res. Inc. Adv. Plant Pathol. 31, 37-75 (2000).</li>
<li>Juniper, B. E., Robins, R. J., Joel, D. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJuniper%2C+BE+%22The+carnivorous+plants%22">The carnivorous plants</a>. , Academic Press. London. (1989).</li>
<li>Gershenzon, J., McCaskill, D., Rajaonarivony, J., Mihaliak, C., Karp, F., Croteau, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+secretory-cells+from+plant+glandular+trichomes+and+their+use+in+biosynthetic-studies+of+monoterpenes+and+other+gland+products%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Isolation of secretory-cells from plant glandular trichomes and their use in biosynthetic-studies of monoterpenes and other gland products.</a> Anal. Biochem. 200, 130-138 (1992).</li>
<li>Rontein, D., Onillon, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CYP725A4+from+yew+catalyzes+complex+structural+rearrangement+of+taxa-4%285%29%2C11%2812%29-diene+into+the+cyclic+ether+5%2812%29-oxa-3%2811%29-cyclotaxane%5BTitle%5D)+AND+%22J.+of+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">CYP725A4 from yew catalyzes complex structural rearrangement of taxa-4(5),11(12)-diene into the cyclic ether 5(12)-oxa-3(11)-cyclotaxane.</a> J. of Biol. Chem. 283 (5), 6067-6075 (2008).</li>
<li>Aharoni, A., Jongsma, M. A., Bouwmeester, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volatile+science%3F+Engineering+of+terpenoid+biosynthesis+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Volatile science? Engineering of terpenoid biosynthesis in plants.</a> Trends Plant Sci. 10, 594-602 (2005).</li>
<li>Mithöfer, A., Boland, W., Maffei, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+ecology+of+plant-insect+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Plant+Rev%22%5BJournal%5D)">Chemical ecology of plant-insect interactions.</a> Ann. Plant Rev. 34, 261-291 (2009).</li>
<li>Kennedy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tomato+pests%2C+parasitoids%2C+and+predators%3A+Tritrophic+interactions+involving+the+genus+Lycopersicon%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Rev.+Entomol%22%5BJournal%5D)">Tomato pests, parasitoids, and predators: Tritrophic interactions involving the genus Lycopersicon.</a> Ann. Rev. Entomol. 48, 51-72 (2003).</li>
<li>Mithöfer, A., Boland, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+defense+against+herbivores%3A+Chemical+aspects%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Rev.+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Plant defense against herbivores: Chemical aspects.</a> Ann. Rev. Plant Biol. 63, 431-450 (2012).</li>
<li>Rottloff, S., Stieber, R., Maischak, H., Turini, F. G., Heubl, G., Mithöfer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+characterization+of+a+class+III+acid+endochitinase+from+the+traps+of+the+carnivorous+pitcher+plant+genus%2C+Nepenthes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Bot%22%5BJournal%5D)">Functional characterization of a class III acid endochitinase from the traps of the carnivorous pitcher plant genus, Nepenthes.</a> J. Exp. Bot. 62, 4649-4647 (2011).</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

Przez długi czas badania struktur wydzielniczych roślin, w szczególności trichomów, były prowadzone głównie na podstawie anatomii i miały charakter czysto opisowy. Istnieje duża liczba publikacji tego typu, które zostały podsumowane w recenzjach9-11. Nasza biochemiczna i molekularna wiedza na temat struktur wydzielniczych roślin jest nadal ograniczona, pomimo pewnych wczesnych godnych uwagi prac, np. nad włoskami gruczołowymi mięty, które wykazały, że trichomy gruczołowe są miejscem biosyntezy monoter...

Rośliny wytwarzają ogromną różnorodność związków o różnych zastosowaniach przemysłowych i farmaceutycznych, od cząsteczek o niskiej masie cząsteczkowej po polimery. Związki te są często produkowane i wydzielane przez wysoce wyspecjalizowane struktury, z których wiele znajduje się na powierzchni roślin, takie jak trichomy gruczołowe lub nektarniki, lub wewnątrz, jak odpowiednio idioblasty czy kanały mleczne i żywiczne. Wiadomo jednak stosunkowo niewiele o biologii tych wyspecjalizowanych struktur wydzielniczych, mimo że wszystkie rodzaje tych gruczołów wykazują wiele cech wskazujących na aktywny metabolizm. W szczególności gruczoły roślin mięsożernych, takich jak Nepenthes, mogą być traktowane jako systemy modelowe w biologii komórki roślinnej1.
Rośliny mięsożerne są przedmiotem licznych badań od 1875 roku, kiedy opublikowano dzieło Charlesa Darwina pt. „Insectivorous Plants”2. Jednak badania na poziomie molekularnym prowadzono dopiero w ciągu ostatnich kilku lat i nasza wiedza w tym zakresie jest wciąż ograniczona. Na przykład skład białkowy płynu trawiennego w dzbankach roślin z rodzaju Nepenthes nie jest jeszcze w pełni znany. Dopiero niedawno zidentyfikowano kilka białek hydrolitycznych, a także kilka odpowiadających im genów3. W pułapkach wpadkowych Nepenthes (Rysunek 1), wielokomórkowe gruczoły znajdują się w wewnętrznej części dna dzbanków. Gruczoły te odpowiadają zarówno za produkcję i wydzielanie enzymów trawiennych do płynu w dzbanku, jak i za wchłanianie rozpuszczonych substancji odżywczych z tego płynu4. Zatem te dwufunkcyjne gruczoły stanowią unikalną mikrotkankę o kluczowym znaczeniu i funkcji w procesie mięsożerności Nepenthes , co czyni je wartymi szczegółowych badań.
<img alt="Anatomia rośliny mięsożernej, szczegół dzbanka Nepenthes, studium botaniczne, mechanizm pułapki, adaptacja." src="/files/ftp_upload/50993/50993fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Dzbanek Nepenthes alata. Dolna część dzbanka zawiera płyn trawienny oraz gruczoły znajdujące się wewnątrz.
<a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50993/50993fig1highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz</a>.
W naukach o roślinach wiele podejść eksperymentalnych opiera się na „materiale zbiorczym”, ponieważ nie bada się w nich określonej tkanki, lecz całe organy. W konsekwencji ich homogenizacja i analiza mogą dostarczyć jedynie wyników, które są rozcieńczone i proporcjonalne w stosunku do poszczególnych tkanek i komórek5. Aby rozwiązać ten problem, opracowano techniki mikropreparacji, na przykład tak zwaną mikrodysekcję laserową (LCM), które z sukcesem wykorzystywano do pozyskiwania specyficznych tkanek roślinnych i analizy ich indywidualnej zawartości6. Jednakże LCM jest często ograniczona, gdy celem są niestabilne i/lub szybko degradujące składniki komórkowe, takie jak RNA. W takim przypadku wadą jest konieczność wcześniejszej fiksacji tkanki, która jest czasochłonna i często wiąże się z degradacją biomolekuł. Co więcej, ze względu na wysoką zawartość wody w wielu tkankach roślinnych oraz wytrzymałość ścian komórkowych, LCM często zawodzi przy preparowaniu bezpośrednio ze świeżej tkanki7. Każde podejście do badania składników komórkowych obecnych w gruczołach wydzielniczych — od genów, mRNA i białek po związki wtórne i ich biosyntezę — wymaga alternatywnych technik specyficznej preparatyki. Zatem niezbędne są specjalistyczne metody izolacji pojedynczych komórek lub nawet wielokomórkowych gruczołów, które pozostają nienaruszone po preparacji.
W niniejszej pracy przedstawiono metodę wykorzystującą zmechanizowaną platformę do mikropróbkowania, która umożliwia bezpośrednią wizualizację mikroskopową. Technika ta jest szybka i wydajna w przygotowywaniu pojedynczych gruczołów z dzbanów gatunków Nepenthes. Te wielokomórkowe gruczoły są dwufunkcyjne, i.e. uczestniczą zarówno w procesach wydzielania, jak i pobierania; są one osiadłe, a nieeksponowane warstwy komórek są impregnowane w celu utworzenia endodermy. Całe gruczoły mogą zostać wyizolowane bez sąsiednich tkanek i w precyzyjny sposób umieszczone w probówce PCR. Technika ta jest stosowana do badania konkretnych genów, a także ekspresji genów w tkankach gruczołów.

<table><tbody><tr><td>RNAqueous-Micro Kit</td><td>Life Technologies GmbH, Niemcy</td><td>AM1931</td><td>Izolacja całkowitego RNA, 50 próbek</td></tr><tr><td>Dynabeads mRNA DIRECT Micro Kit</td><td>Life Technologies GmbH, Niemcy</td><td>61011</td><td>5 ml magnesu Dynabeads Oligo (dT)25</td></tr><tr><td>DynaMag-2</td><td>Life Technologies GmbH, Niemcy</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript CellsBezpośredni system</td> <td>syntezy cDNALife Technologies GmbH, Niemcy</td><td>18080-200</td><td>25 reakcji</td></tr><tr><td>RNaseOUT</td><td>Life Technologies GmbH, Niemcy</td><td>10777-019</td><td>Inhibitor rnazy, 5,000 jednostek</td></tr><tr><td>Hexamery losowe (0,4 &mu; g/&mu; l)</td><td>QIAGEN GmbH, Niemcy</td><td>79236</td><td>100 &mu; l</td></tr><tr><td>10 mM dNTP Mix, klasa biologii molekularnej</td><td>Fermentas GmbH, Niemcy</td><td>R0192</td><td>1 ml</td></tr><tr><td>Taq polimeraza DNA, (rekombinowana)</td><td>Fermentas GmbH, Niemcy</td><td>EP0402</td><td>Dostarczany z 10x buforem Taq (z KCl lub (NH4)2SO4) i 25 mM MgCl2</td></tr><tr><td>TURBO DNase</td><td>Life Technologies GmbH, Niemcy</td><td>AM2238</td><td>1,000 jednostek</td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>Carl Roth GmbH Co. Niemcy</td><td>T846.3</td><td></td></tr><tr><td>GeneRuler Low Range DNA ladder, gotowa do użycia</td><td>Fermentas GmbH, Niemcy</td><td>SM1193</td><td>50 &mu; g</td></tr><tr><td>Brilliant II SYBR Green QPCR Master Mix</td><td>Agilent Technologies, Inc., USA</td><td>600828</td><td>Pojedynczy zestaw</td></tr><tr><td>RNaseZAP</td><td>Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Niemcy</td><td>R2020</td><td></td></tr><tr><td>Żyletka</td><td>Carl Roth GmbH Co., Niemcy</td><td>CK08.1</td><td></td></tr><tr><td>Pęseta</td><td>Carl Roth GmbH Co., Niemcy</td><td>2801.1 / 2855.1</td><td></td></tr><tr><td>GE Spektrofotometr NanoVue</td><td>GE Healthcare Europe GmbH, Niemcy</td><td>28-9569-62</td><td></td></tr><tr><td>Mastercycler gradient</td><td>Eppendorf AG, Hamburg, Niemcy</td><td>5331 000.010</td><td></td></tr><tr><td>Mx3000P System PCR w czasie rzeczywistym</td><td>Stratagene, USA</td><td>401403</td><td></td></tr><tr><td>Agagel Standardowa pozioma komora do elektroforezy żelowej</td><td>Biometra</td><td>Wycofane z produkcji</td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>Aura Optik GmbH</td><td>Aureka</td><td>Wyposażony w mikrokleszczyki</td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>Carl Zeiss Microscopy, Jena, Niemcy</td><td>SteREO Lumar.V12</td><td>Wyposażony w zestaw filtrów AxioCam</td></tr><tr><td>Lumar 01</td><td>Carl Zeiss, Mikroskopia, Jena, Niemcy</td><td>485001-0000-000</td><td>Filtr UV</td></tr><tr><td>Lumar Zestaw filtrów 09</td><td>Carl Zeiss, Mikroskopia, Jena, Niemcy</td><td>485009-0000-000</td><td>filtr bez UV</td></tr></tbody></table>

izolacja żywotnych gruczołów wielokomórkowych z tkanki rośliny mięsożernej, dzbanecznik

Isolation of Viable Multicellular Glands from Tissue of the Carnivorous Plant, Nepenthes

Wiele roślin posiada wyspecjalizowane struktury, które są zaangażowane w produkcję i wydzielanie specyficznych związków i białek o niskiej masie cząsteczkowej. Struktury te są prawie zawsze zlokalizowane na powierzchniach roślin. Wśród nich są nektarniki lub trichomy gruczołowe. Wydzielane związki są często wykorzystywane w interakcjach ze środowiskiem biotycznym, na przykład jako atraktanty dla zapylaczy lub środki odstraszające roślinożerców.
Gruczoły, które są unikalne pod wieloma względami, można znaleźć u roślin mięsożernych. U tak zwanych dzbaneczników z rodzaju Nepenthes, dwufunkcyjne gruczoły wewnątrz pułapki z jednej strony wydzielają płyn trawienny, w tym wszystkie enzymy niezbędne do trawienia ofiary, a z drugiej strony pobierają uwolnione składniki odżywcze. Tak więc gruczoły te reprezentują idealną, wyspecjalizowaną tkankę predestynowaną do badania leżących u podstaw molekularnych, biochemicznych i fizjologicznych mechanizmów wydzielania białek i pobierania składników odżywczych przez rośliny. Co więcej, ogólnie rzecz biorąc, biosynteza związków wtórnych wytwarzanych przez wiele roślin wyposażonych w struktury gruczołowe może być badana bezpośrednio w gruczołach.
Aby pracować nad takimi wyspecjalizowanymi strukturami, muszą one być izolowane skutecznie, szybko, metabolicznie aktywne i bez zanieczyszczenia innymi tkankami. W związku z tym opracowano technikę mechanicznego mikropreparatyki, którą zastosowano do badań nad płynem trawiącym Dzbanecznik. W niniejszej pracy przedstawiono protokół, który został wykorzystany do skutecznego przygotowania pojedynczych gruczołów dwufunkcyjnych z pułapek Nepenthes, w oparciu o zmechanizowaną platformę mikropróbkowania. Gruczoły mogą być izolowane i bezpośrednio wykorzystywane do analizy ekspresji genów za pomocą technik PCR po przygotowaniu RNA.

W celu przygotowania pojedynczych gruczołów z tkanki dzbanka Nepenthes opracowano i zastosowano zmechanizowaną technikę mikrodysekcji. Platforma do mikropreparacji musi być wyposażona w mikropincetę przymocowaną do mikromanipulatora, który z kolei jest obsługiwany za pomocą panelu sterowania. Pojedyncze gruczoły, widoczne pod mikroskopem, można było namierzyć pincetą, która chwytała tkankę gruczołową i usuwała ją mechanicznie (Rycina 4A).
Tkankę gruczołową przeniesion...

Gruczoły roślinne to wyspecjalizowane struktury odpowiedzialne za biosyntezę i wydzielanie wielu związków biorących udział w interakcjach ze środowiskiem biotycznym. Aby umożliwić badania nad ich cechami molekularnymi i biochemicznymi, opracowano technikę mechanicznego mikroprzygotowania w celu wyizolowania pojedynczych gruczołów aktywnych metabolicznie, w tym przypadku z mięsożernej rośliny Nepenthes.

Izolacja żywotnych gruczołów wielokomórkowych z tkanki rośliny mięsożernej, Dzbanecznik

Many plants possess specialized structures that are involved in the production and secretion of specific low molecular weight compounds and proteins. ...

Zakresem zaprezentowanej metody jest uzyskanie pojedynczych i czystych gruczołów z tkanki roślinnej w celu przeprowadzenia analizy molekularnej. Jest to osiągane poprzez uprzednie pobranie pułapki z rośliny z rodzaju Nepenthes. Następnie tkankę utrwala się bezpośrednio na platformie do mikropobierania w lodzie, aby zachować jej świeżość.Podczas procedury mikropróbkowania gruczoły są izolowane w precyzyjny sposób i przenoszone do probówki PCR przed przeprowadzeniem ilościowej analizy PCR pobranego materiału. Ostatecznie technologia mechanicznego mikropróbkowania jest wykorzystywana do pozyskiwania pojedynczych i czystych gruczołów z roślin mięsożernych, aby w sposób szybki i małoinwazyjny dostarczyć konkretną tkankę do dalszych analiz molekularnych. Rośliny mięsożerne są specjalistami wśród flory, ponieważ potrafią trawić białka zwierzęce.Nasza wiedza na temat tego, jak proces ten przebiega na poziomie molekularnym, jest wciąż ograniczona. Dobrym modelem do zbadania tej kwestii jest obraz mieszany wyrostka robaczkowego, ponieważ posiada on wyraźne organy, obrazy produkujące gruczoły, które przyczyniają się do tych procesów trawiennych. W wyrostku.Gruczoły te znajdują się wewnątrz ob

isolation-viable-multicellular-glands-from-tissue-carnivorous-plant

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Izolacja żywych wielokomórkowych gruczołów z tkanki rośliny mięsożernej, Nepenthes

W niniejszym materiale opisujemy wydajną strategię usuwania gruczołów jedwabniczych z odwłoka samic czarnej wdowy. Procedura ta umożliwia szybką izolację siedmiu odrębnych gruczołów jedwabniczych w sposób wysoce oczyszczony, co stanowi istotny proces dla badaczy zajmujących się produkcją jedwabiu pająków oraz montażem włókien.

Mikrodysekcja gruczołów produkujących jedwab u pająka wdowie czarne

W niniejszym materiale prezentujemy protokół izolacji komórek podstawnych oraz komórek przewodów gruczołów podśluzowych z tchawki myszy. Przedstawiamy również metodę wstrzykiwania komórek macierzystych do grzbietowej poduszki tłuszczowej myszy w celu stworzenia modelu in vivo regeneracji gruczołów podśluzowych.

Izolacja komórek podstawnych i komórek przewodów gruczołów podśluzowych z tchawki myszy

Ten film opisuje metodę izolowania komórek nabłonka żołądka od ludzkiej tkanki dna żołądka. Wyizolowane komórki nabłonkowe można wykorzystać jako model in vitro do badania ich roli regulacyjnej w fizjologii i patofizjologii żołądka.

Izolacja gruczołów dna żołądka: metoda izolowania gruczołów dna żołądka od ludzkiej tkanki żołądka

Opisujemy sekcję układu nerwowego zająca morskiego Aplysia po znieczuleniu, izolację neuronów do krótkotrwałej hodowli tkanek oraz zapisy prądów jonowych pojedynczej komórki za pomocą techniki patch clamp.

Izolacja neuronów czuciowych Aplysia californica w celu nagrań prądów glutaminergicznego za pomocą zacisków krosowych

Kultury pochodzące z komórek macierzystych kryją w sobie ogromny potencjał do modelowania chorób zakaźnych. W tym miejscu opisano hodowlę mysich i ludzkich organoidów żołądkowych pochodzących z dorosłych komórek macierzystych. Organoidy są mikrowstrzykiwane z patogenem żołądkowym Helicobacter pylori.

Organoidy jako model chorób zakaźnych: hodowla organoidów żołądka ludzkiego i mysiego oraz mikroiniekcja Helicobacter pylori

Tutaj prezentujemy protokół izolacji całych, nienaruszonych gruczołów sutkowych myszy w celu zbadania ekspresji macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) i morfologii przewodowej. Gruczoły brzuszne myszy #4 wyekstrahowano od 8-10 tygodniowych samic myszy nieródek, utrwalono w neutralnej buforowanej formalinie, pocięto i wybarwiono przy użyciu immunohistochemii białek ECM.

Izolacja nienaruszonych, całych gruczołów sutkowych myszy w celu analizy ekspresji macierzy zewnątrzkomórkowej i morfologii gruczołów

Tutaj opisujemy protokół tworzenia i hodowli trójwymiarowych (3D) organoidów żołądkowych pochodzących od ludzi i myszy oraz metodę transferu organoidów 3D do jednowarstwowej 2-wymiarowej. Opisano również zastosowanie monowarstwy nabłonka żołądka jako nowatorskiego testu na ranę drapaną do badań nad regeneracją.

Pierwotna jednowarstwowa hodowla nabłonka żołądka pochodząca od myszy i człowieka do badania regeneracji

Gruczoł łzowy (LG) ma dwa typy komórek wyrażających aktynę α mięśni gładkich (αSMA): komórki mioepitelialne (MEC) i perycyty. MEC są pochodzenia ektodermalnego, znajdują się w wielu tkankach gruczołowych, podczas gdy perycyty to komórki mięśni gładkich naczyń krwionośnych pochodzenia endodermalnego. Protokół ten izoluje MEC i perycyty od mysich LG.

Izolacja komórek mioepitelialnych z dorosłych mysich gruczołów łzowych i podżuchwowych

Prezentujemy metodę izolowania i hodowli pierwotnych komórek nabłonkowych pochodzących z ludzkich gruczołów ślinowych. Komórki te wykazują wzorce ekspresji genów zgodne z tym, że pochodzą z nabłonka śliny i mogą być hodowane jako salisfery na matrycach błony podstawnej pochodzących z komórek nowotworowych Engelbreth-Holm-Swarm lub jako monowarstwy na traktowanych szalkach hodowlanych.

Izolacja komórek nabłonka śliny z ludzkich gruczołów ślinowych do wzrostu in vitro w postaci ślikul lub monowarstw

Gruczoł sutkowy to dwuwarstwowa struktura, składająca się z zewnętrznych komórek nabłonka mięśniowego i wewnętrznego nabłonka światła. Przedstawiono protokół otrzymywania organoidów z wykorzystaniem trypsynizacji różnicowej. Ta skuteczna metoda pozwala naukowcom oddzielnie manipulować tymi dwoma typami komórek w celu zbadania pytań dotyczących ich roli w formie i funkcji gruczołu sutkowego.

Wytwarzanie organoidów mozaikowych sutków przez trypsynizację różnicową

Przedstawiono protokół dla wygodnej i wysokoprzepustowej izolacji i wzbogacania gruczołowych łodyg główkowatych i siedzących trichomów z Cannabis sativa. Protokół opiera się na suchej, niebuforowej ekstrakcji trichomów przy użyciu wyłącznie ciekłego azotu, suchego lodu i sit nylonowych i nadaje się do ekstrakcji RNA i analizy transkryptomicznej.

Niewodna izolacja i wzbogacenie gruczołowych łodyg główkowatych i włosków siedzących z Cannabis sativa

Naucz się izolować gruczoły z mięsożernej rośliny Nepenthes metodą mechaniczną mikropreparatyki. Technika umożliwia analizę molekularną i biochemiczną tych struktur odpowiedzialnych za biosyntezę związków.

Izolacja żywotnych gruczołów wielokomórkowych z tkanki rośliny mięsożernej, Dzbanecznik

Przeglądaj więcej filmów