Izolacja żywotnych gruczołów wielokomórkowych z tkanki rośliny mięsożernej, Dzbanecznik

Zakresem zaprezentowanej metody jest uzyskanie pojedynczych i czystych gruczołów z tkanki roślinnej w celu przeprowadzenia analizy molekularnej. Jest to osiągane poprzez uprzednie pobranie pułapki z rośliny z rodzaju Nepenthes. Następnie tkankę utrwala się bezpośrednio na platformie do mikropobierania w lodzie, aby zachować jej świeżość.

Podczas procedury mikropróbkowania gruczoły są izolowane w precyzyjny sposób i przenoszone do probówki PCR przed przeprowadzeniem ilościowej analizy PCR pobranego materiału. Ostatecznie technologia mechanicznego mikropróbkowania jest wykorzystywana do pozyskiwania pojedynczych i czystych gruczołów z roślin mięsożernych, aby w sposób szybki i małoinwazyjny dostarczyć konkretną tkankę do dalszych analiz molekularnych. Rośliny mięsożerne są specjalistami wśród flory, ponieważ potrafią trawić białka zwierzęce.

Nasza wiedza na temat tego, jak proces ten przebiega na poziomie molekularnym, jest wciąż ograniczona. Dobrym modelem do zbadania tej kwestii jest obraz mieszany wyrostka robaczkowego, ponieważ posiada on wyraźne organy, obrazy produkujące gruczoły, które przyczyniają się do tych procesów trawiennych. W wyrostku.

Gruczoły te znajdują się wewnątrz obiektów przedstawionych na dolnych zdjęciach. Do analizy molekularnej konieczne jest wyizolowanie tych szerokich i płaskich struktur, o średnicy około 100 do 200 µm, bezpośrednio ze świeżej tkanki. Stopień trudności zwiększa fakt, że gruczoły te są przykryte ochronnym kapturkiem.

Ze względu na strukturę przypominającą wiatę, wymagającą obserwacji trójwymiarowych podczas pobierania próbek, a także potrzebę zastosowania narzędzia zdolnego do precyzyjnego poruszania się w trzech wymiarach, stwierdzono, że obecne techniki mikrosekcji nie są dostosowane do rozwiązania tych problemów. Przykładowo, zastosowanie lasera okazało się nieskuteczne z powodu wysokiej zawartości wody w tkance roślinnej.

W związku z tym zdecydowaliśmy się zastosować nową technikę mechanicznej mikrodyssekcji o nazwie aika, przeznaczoną w szczególności do izolowania fragmentów tkanek, a nawet pojedynczych komórek struktur 3D. Składa się ona z mikroskopu stereoskopowego lub sumitralnego, w którym zintegrowano mikromanipulator 3D w taki sposób, aby mógł on z łatwością osiągać obiekty bardzo płaskie lub bardzo wysokie. Porusza się on wraz z mikroskopem jako filar do pobierania próbek; w przypadku roślin często stosujemy mikrokapilary.

Jednak w przypadku szkła do wyrostka odkryliśmy, że mikrochwytak sterowany przez PTO działa skuteczniej w naszej procedurze. W przypadku wyrostka platforma została zmodyfikowana. Mały stolik VXY podtrzymuje pojemnik z lodem, który jest wystarczająco duży, aby pomieścić zarówno próbkę tkanki z uchwytem, jak i miejsce, w którym zostanie umieszczona gruczoł.

Lód zapewnia znaczne spowolnienie procesów degradacji w obrębie tkanki, co umożliwia rozpoznanie jej pierwotnego stanu molekularnego. Z dolnej części obrazu wycięto fragment o powierzchni około jednego do dwóch centymetrów kwadratowych, a następnie go rozprostowano.

Następnie tkanka zostaje utrwalona na szkiełku przedmiotowym za pomocą dwustronnej taśmy klejącej. Próbkę tkanki pokrywa się wodą wolną od RNA i utrzymuje w stanie wilgotnym podczas procesu pobierania próbek. Następnie próbka zostaje ustawiona tak, aby gruczoły i osłony ochronne były skierowane w stronę manipulatora.

Kąt między próbką a narzędziem musi zostać dostosowany tak, aby gruczoły przylegały płasko. Dzięki zastosowaniu stołu uniwersalnego nachylenie można regulować w dwóch osiach i łatwo korygować pod mikroskopem. Metalowy stół utrzymuje próbkę w niskiej temperaturze podczas obserwacji mikroskopowych.

Gruczewale są wyraźnie widoczne. Fluorescencja ułatwia rozpoznanie konturu zarówno gruczołu, jak i osłony ochronnej. Próbkę obserwuje się przy użyciu filtra FSE w celu izolacji gruczewal.

Do ekstrakcji RNA stosuje się filtr UV. Bardzo precyzyjne pozycjonowanie mikropincety jest niezbędne do izolacji gruczołu. Zaleca się obsługę narzędzia w trybie niskiej prędkości.

Za pomocą mikrochwytaka należy zbliżyć się do gruczołu, a następnie, sterując dżojstikiem, umieścić ramiona chwytaka na jego krawędziach i delikatnie je zamknąć. Następnie gruczoł jest unoszony z otaczającej go tkanki. Po precyzyjnej izolacji widoczna jest nienaruszona jama, odsłaniająca leżącą poniżej tkankę naczyniową.

Wyizolowany gruczoł przenosi się następnie do probówki PCR i umieszcza w przygotowanym buforze. Aby zwalidować tę metodę, określono ekspresję genu białka atoma leg protein short, TAP, które jest wydzielane do cieczy wewnątrz kropelki; wykazano, że gen ten można amplifikować bezpośrednio z gruczołów bez wcześniejszej ekstrakcji DNA genomicznego. Wystarczy do tego dodać mieszaninę reakcyjną PCR do wyizolowanej tkanki.

Seria doświadczeń obejmowała gruczoły z różnie traktowanych okazów nepenthes oraz próbki z otaczającej je tkanki epidermalnej. W każdym doświadczeniu wyekstrahowano całkowite RNA. Uzyskane mRNA przekształcono w odpowiadające mu cDNA poprzez transkrypcję odwrotną, a następnie wykorzystano je w kolejnej reakcji PCR.

W celu amplifikacji interesującej sekwencji genu zastosowano reakcję PCR w czasie rzeczywistym, aby porównać poziom ekspresji TLP w gruczołach i epidermie nepenthes. Wyniki pokazują, że poziom transkryptu TLP jest wyższy w gruczołach wydzielniczych w porównaniu z tkanką epidermalną zarówno u nepenthes allotta, jak i nepenthes miis, co zobrazowano stosunkiem tkanki epidermalnej do tkanki gruczołowej mniejszym niż jeden, aby sprawdzić, czy kontakt z ofiarą może indukować ekspresję genu. Po schwytaniu ofiary porównano poziomy transkryptu TLP oraz obrazy próbek niepoddanych działaniu bodźca i obrazów próbek karmionych drosophila melan gaster.

Tkanka epidermy wykazywała tutaj wyższą ekspresję TLP. Porównano poziom transkrypcji TLP w gruczołach i tkance epidermy oraz obraz potraktowanego nepenthes miis. Podwyższenie ekspresji TLP w obu typach tkanek wskazuje, że produkcja białek płynu pułapkowego może być rzeczywiście indukowana przez ofiary.

Wyniki PCR sugerują, że karmienie skutecznie zmienia ekspresję TLP w obu typach tkanek i może przesunąć stosunek ekspresji między gruczołem a naskórkiem. Opracowaliśmy wydajną metodę pozyskiwania czystego materiału z tkanki wyrostka FA i wyizolowaliśmy wystarczającą ilość mRNA do przeprowadzenia eksperymentów nad ekspresją genów. Dzięki opracowanej przez nas nowej metodzie możliwe jest badanie nie tylko transkryptomiki w gruczołach wyrostka, ale ponadto możemy analizować również metabolomikę oraz proteomikę.I.