Ocena odpowiedzi miogennej i wazoaktywności w opornych tętnicach krezkowych za pomocą miografii ciśnieniowej

Ogólnym celem niniejszej procedury jest określenie wpływu czynnika farmakologicznego lub stanu chorobowego na indukowany ciśnieniem napięcie naczyniowe w małych tętnicach oporowych krezki. Osiąga się to poprzez najpierw wyizolowanie łuku naczyń krezkowych z modelu mysiego. Drugim krokiem jest wypreparowanie małych tętnic oporowych czwartego rzędu.

Kolejne etapy to kanulacja, nadciśnienie oraz inkubacja preparatu tętniczego. W PSS ostatnim krokiem jest ocena integralności fizjologicznej preparatu tętniczego, która przejawia się spontanicznym rozwojem napięcia naczyniowego oraz odpowiednią, odwracalną odpowiedzią na lek obkurczający naczynia i lek rozkurczający naczynia. Ostatecznie można zmierzyć skurcz wywołany ciśnieniem.

Zastosowanie tej techniki rozciąga się na terapię lub diagnostykę nadciśnienia tętniczego, niedociśnienia lub dysfunkcji naczyniowych. Wynika to z faktu, że technika ta pozwala zidentyfikować kluczowe mechanizmy leżące u podstaw zmian napięcia naczyniowego indukowanych ciśnieniem, które jest głównym determinantem oporu naczyniowego, perfuzji oraz ciśnienia krwi. Procedura ta zostanie zaprezentowana przez dr Jję, pracownika postdoktorańskiego w naszym laboratorium.

Procedurę rozpoczyna się od umieszczenia szklanej kaniuli w uchwycie do mikropipety, a następnie przymocowania uchwytu do komory perfuzyjnej w celu jej przygotowania. Należy przepłukać komorę wodą Milli Q, a następnie roztworem do sekcji, przez pięć minut w każdym przypadku. Następnie do komory należy wprowadzić dwa mililitry roztworu do sekcji.

Następnie ostrożnie wypełnij całą kaniulę oraz dołączony przewód, dbając o to, aby nie powstały pęcherzyki powietrza. Za pomocą pęsety tępym pod mikroskopem sekcyjnym przygotuj dwa szwy, z których każdy posiada półwęzeł. Używając pęsety sekcyjnej, wprowadź do obu kaniul częściowo zawiązane węzły szwów, umieszczając je w niewielkiej odległości od końcówki.

Następnie, u znieczuplonego szczura należy przeprowadzić laparotomię po linii środkowej od miednicy do mostka, wykonując najpierw nacięcie skóry, a następnie nacięcie leżącej poniżej warstwy mięśniowej. Należy zachować ostrożność, aby nie uszkodzić narządów wewnątrzbrzusznych. Oba końce należy oddzielnie powiązać, aby zapobiec wyciekowi treści pokarmowej i kału, co pozwoli uniknąć zanieczyszczenia zewnętrznego roztworu kąpieli.

Następnie odetnij proksymalny koniec jelita blisko otworów oraz koniec dystalny, blisko połączenia kątniczo-jelitowego. Po tym wykonaj nacięcie krezki u jej podstawy w pobliżu naczyń doprowadzających. Następnie przenieś całe łoże krezkowe jelita cienkiego do zlewki o pojemności 50 mililitrów zawierającej lodowaty roztwór do sekcji i inkubuj przez pięć minut.

Następnie należy przepłukać je świeżym roztworem do sekcji w celu usunięcia krwi. Teraz przytwierdź szpilką proksymalny koniec jelita po prawej stronie w naczyniu powleczonym woskiem, rozciągając pozostałą część jelita w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara. Przytwierdź segment szpilkami, aby rozprostować krezkę i odsłonić naczynia krwionośne pod stereomikroskopem.

Wydzielkuj trzeciorzędowe i czwartorzędowe małe tętnice krezkowe biegnące równolegle do jelita cienkiego, usuwając najpierw całą otaczającą tkankę tłuszczową w pobliżu odgałęzienia drugiego rzędu. Następnie wydzielkuj żyłę i wyizoluj tętnicę z V-kształtnym punktem rozgałęzienia. Należy uważać, aby nie przedziurawić wybranego segmentu.

Następnie wyizoluj odcinek tętnicy o długości od 4 do 5 mm, przebiegający równolegle do jelita cienkiego. Odetnij wszystkie gałęzie piątego rzędu wnikające do jelita cienkiego, wykonując cięcie w niewielkiej odległości od miejsca ich odgałęzienia, zachowując niewielki fragment każdej z nich. Fragmenty te posłużą jako punkty uchwytu podczas przenoszenia segmentów tętnicy do komory perfuzyjnej i ułatwią ich późniejszą kaniulację.

Następnie należy wyciąć segmenty tętnic, wykonując dwa nacięcia dystalnie względem gałęzi piątego rzędu po każdej stronie tętnicy, i przenieść je do komory perfuzyjnej. Jeden koniec naczyń należy kaniulować na szklanej mikropipecie, przytrzymując końcówkę segmentu tętniczego pęsetą anatomiczną. Następnie należy nasunąć wcześniej przygotowany, częściowo zawiązany szew na kaniulowany koniec i go zabezpieczyć.

Następnie do kurka stopowego połączonego z tą kaniulą przymocuj strzykawkę o pojemności 10 mililitrów wypełnioną roztworem do sekcji. Delikatnie unieś strzykawkę. Siła grawitacji działająca na roztwór usunie krew wewnątrznaczyniową z otwartego końca naczynia.

Po usunięciu krwi z tętnicy zamknąć kurek. Następnie przywiązać dystalny koniec naczyń do drugiej szklanej kaniuli, ostrożnie zbliżając drugą kaniulę tak blisko, jak to możliwe, do nieprzywiązanego końca segmentu tętniczego. Nasunąć wcześniej przygotowany, częściowo zawiązany szew na koniec z kaniulą i go zabezpieczyć.

Należy uważać, aby nie szarpać ani nie ciągnąć segmentów tętniczych oraz upewnić się, że kurki odcinające przymocowane do obu kaniul są zamknięte. Przenieś komorę perfuzyjną na stolik mikroskopu odwróconego wyposażonego w system nagrywania wideo na żywo. Następnie podłącz kurek odcinający kaniuli przymocowanej do proksymalnego końca segmentu tętniczego do urządzenia do regulacji ciśnienia sterowanego serwomechanizmem.

Upewnij się, że kurek znajdujący się przy drugiej kaniuli pozostaje zamknięty, aby utrzymać stabilne ciśnienie wewnątrz światła naczynia. Następnie podłącz przewód próżniowy do przewodu perfuzyjnego, a port ssawczy do portu perfuzyjnego komory. Rozpocznij perfuzję naczynia ciepłym PSS za pomocą pojedynczego przepływowego podgrzewacza roztworu z prędkością 2 ml/min.

Używając pompy perystaltycznej, włącz próżnię, gdy temperatura PSS w komorze zbliży się do 37 °C. Powoli zwiększaj ciśnienie wewnątrz światła naczynia od 20 do 100 mmHg. Sprawdź naczynie pod kątem ewentualnych nieszczelności, korzystając z automatycznego ustawienia ciśnienia w regulatorze ciśnienia.

Następnie, utrzymując ciśnienie na poziomie 100 mmHg, sprawdź, czy odcinek tętniczy nie jest zagięty. Za pomocą dźwigni śrubowej przesuń kaniulę, aby wyprostować odcinek tętniczy, dbając o to, by go nie nadmiernie rozciągnąć. Następnie obniż ciśnienie do 70 mmHg, aby odwzorować ciśnienie in vivo w łuku krezkowym, i pozwól odcinkowi tętniczemu ustabilizować się oraz wykształcić napięcie miogenne.

W tej procedurze należy obejrzeć tętnicę przy użyciu obiektywu 10 x pod mikroskopem wyposażonym w monochromatyczną kamerę wideo. Podłączyć kamerę urządzenia. Zmierzyć średnicę światła naczynia, korzystając z modułu przechwytywania obrazu wideo oraz systemu wykrywania krawędzi w czasie rzeczywistym.

Następnie należy zapisać średnicę naczynia i monitorować rozwój napięcia miogennego. Po tym czasie należy obniżyć ciśnienie do 20 mmHg i odczekać do stabilizacji średnicy. Następnie należy zwiększać ciśnienie wewnątrzświatowe w stopniach takich jak 20, 40, 60, 80 i 100 mmHg, pozwalając tętnicy na osiągnięcie stabilnej średnicy przy każdym z tych ciśnień.

W kolejnym kroku powtórzono badanie odpowiedzi na skok ciśnienia w PSS pozbawionym wapnia, zawierającym 0,39 mM EGTA i 0,1 mM nitroprusydu sodu; jak wynika z zapisu, średnica małych tętnic krezowych szczura zmniejsza się samoistnie przy ciśnieniu 70 mmHg. Dodatek 1 µM acetylocholiny zwiększył średnicę do wartości bliskiej średnicy początkowej. Dodanie 1 µM fenylefryny do kąpieli tkankowej zmniejszyło średnicę tętnicy, a rysunek ten pokazuje, że inkubacja małych tętnic krezowych w PSS pozbawionym wapnia zwiększa średnicę tętnicy. Średnica pojedynczego odcinka tętnicy pod ciśnieniem przy różnych przepływach została przedstawiona w tej tabeli.

Tutaj średnica tętnicy jest rejestrowana w sposób ciągły podczas stopniowego zwiększania ciśnienia w świetle naczynia w obecności PSS oraz PSS wolnego od wapnia. Przedstawione są krzywe średnicy tętnicy uzyskane przy każdym stopniu ciśnienia, a tutaj pokazano wykres słupkowy napięcia miogennego osiągniętego przy każdym stopniu ciśnienia Off. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak oceniać zachowanie miogenne małych tętnic oporowych.

Stosując tę technikę, można przeprowadzić dodatkowe procedury, takie jak uszkodzenie śródbłonka i przepuszczanie tętnicze. Obie te procedury pozwalają na udzielenie odpowiedzi na dalsze pytania dotyczące roli śródbłonka i wapnia w regulacji napięcia naczyniowego małych tętnic oporowych.