Charakterystyka mikrożeli glikolu polietylenowego tworzonych przez wytrącanie jest kontrolowana przez masę cząsteczkową reagentów

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wytworzenie mikrogeli z glikolu polietylenowego za pomocą fotopolimeryzacyjnej reakcji wytrącania, aby wykorzystać je jako nośniki leków oraz rusztowania w inżynierii tkankowej. Jest to osiągane poprzez najpierw przygotowanie odczynników, w tym fotoinicjatora, buforów, trietyloaminy i roztworu PEG DL, a następnie ich ogrzanie do 37 °C. W drugim kroku odczynniki umieszcza się w probówce do mikrocentryfugi i miesza w wirówce typu vortex, utrzymując temperaturę 37 °C.

Następnie dodaje się siarczan sodu, a roztwór wystawia się na działanie światła UV w celu sieciowania przez 30 sekund. Po sieciowaniu na powierzchni roztworu utworzy się mętna warstwa zawierająca mikrogele. Ostatnim krokiem jest dodanie PBS do mieszaniny i odwirowanie w celu uzyskania osadu.

Ostatecznie, do pomiaru wielkości mikrogeli wykorzystuje się mikroskopię oraz dynamiczne rozpraszanie światła, natomiast gęstość mierzy się przy użyciu gradientu gęstości dekstryny. Ponadto stopień pęcznienia oblicza się poprzez pomiar masy mokrej i suchej mikrogeli. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z innymi metodami, takimi jak techniki emulsyjne, zawiesinowe i dyspersyjne, jest fakt, że mikigele otrzymywane w reakcji precypitacji charakteryzują się niskim indeksem polidyspersyjności bez konieczności stosowania rozpuszczalników organicznych lub stabilizatorów. Łagodne warunki reakcji precypitacji, możliwość dostosowania właściwości mikrogeli oraz niska lepkość ułatwiająca iniekcje sprawiają, że są one odpowiednie do zastosowań NVivo.

Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie inżynierii tkankowej i medycyny regeneracyjnej, takie jak wytwarzanie rusztowań o jednolitym rozmiarze i niskim indeksie polidyspersyjności. Zastosowanie tej techniki może rozciągać się na terapię dostarczania leków, ponieważ czynniki wzrostu zawarte w lekach mogą być łatwo enkapsulowane. Aby rozpocząć, odważ 500 milligrams fotoinicjatora i dodaj go do 100 milliliters wody dejonizowanej, aby przygotować 0.5% roztwór.

Chronić roztwór przed światłem UV i podgrzewać go do 40 °C, stale mieszając przez około jedną godzinę, aby całkowicie rozpuścić fotoinicjator. Po pełnym rozpuszczeniu przefiltrować roztwór sterylnie, przepuszczając go przez filtr 0,22 µm, i przechowywać w temperaturze 4 °C w ciemności do momentu użycia. Następnie wstępnie podgrzać trietyloaminę do 37 °C w celu zmniejszenia jej lepkości.

Następnie należy dodać 612 µL tego roztworu wraz z 260 µL sześciomolarnego kwasu solnego do 39,4 mL PBS i w warunkach sterylnych dostosować pH do 7,8. Końcowy roztwór należy przefiltrować przez filtr 0,22 µm i przechowywać w temperaturze 37 °C do momentu użycia. Postępując zgodnie z metodami opublikowanymi przez Sony i współpracowników, należy przygotować prekursory PEG i przechowywać gotowy produkt w temperaturze -20 °C w atmosferze argonu, a następnie bezpośrednio przed użyciem przygotować 1 mL roztworu diakrylanu PEG o stężeniu 200 mg/mL, powoli dodając 0,8 mL PBS z dodatkiem trietanolaminy i kwasu solnego do 200 mg diakrylanu PEG.

Ponadto, bezpośrednio przed eksperymentem, odważ 213 mg siarczanu sodu i rozpuść go w 1 mL wody dejonizowanej. Aby przygotować roztwór 1,5 M, podgrzewaj go w temperaturze 37 °C przez 20 minut, a następnie mieszaj w wirówce vortex do całkowitego rozpuszczenia. Po rozpuszczeniu przefiltruj zarówno końcowy roztwór siarczanu sodu, jak i roztwór diakrylanu PEG w temperaturze 37 °C przez filtry 0,22 µm.

Połącz 127,5 µL PBS z trietyloaminą i kwasem solnym, 10 µL 0,5% fotoinicjatora oraz 25 µL roztworu polietylenoglikolu diakrylanu o stężeniu 200 mg/mL w probówce do mikrocentryfugi o pojemności 1,6 mL. Następnie dodaj wybrane cząsteczki przeznaczone do enkapsulacji.

Podgrzać te probówki wraz z 1,5 M roztworem siarczanu sodu do 37 °C. Następnie do pierwszej probówki z roztworem PEG dodać 87,5 µL uprzednio podgrzanego 1,5 M roztworu siarczanu sodu i wymieszać zawartość probówki, pipetując roztwór od trzech do pięciu razy. Po wymieszaniu stężenie soli rozłoży się równomiernie, a roztwór powinien stać się klarowny.

Umieść probówkę pod światłem UV i przeprowadź sieciowanie przez 30 sekund. Po sieciowaniu na powierzchni roztworu zawierającego mikrożele powinna pojawić się zmętniała warstwa. Następnie dodaj do probówki 750 µL PBS i dokładnie wymieszaj roztwór za pomocą wortexa.

Następnie odwiruj mieszaninę przy 4 000 ×g przez dwie minuty, aby uzyskać osad. Po odwirowaniu ostrożnie usuń nadsącz, uważając, aby nie naruszyć osadu, a następnie zawieś mikrogela w świeżym PBS. Przemyj mikrogela łącznie pięć razy świeżym PBS, odwirugując je po każdym etapie.

Po ostatnim przemyciu należy usunąć nadsącz i pipetować 30 µL mikrogeli z osadu do 1 mL wody dejonizowanej. Następnie roztwór mikrogeli należy poddać sonikacji w kąpieli ultradźwiękowej przez jedną godzinę przy częstotliwości od 50 do 60 Hz i mocy 1,4 A. Następnie należy nanieść 15 µL roztworu mikrogeli na czyste, trawione kwasem szkiełko przedmiotowe i przykryć je trawionym kwasem szkiełkiem nakrywnym nr 1,5.

Odwrócić preparat na chusteczkę laboratoryjną i delikatnie docisnąć szkiełko, aby usunąć nadmiar roztworu i upewnić się, że mikrogela tworzą pojedynczą warstwę. Następnie, używając mikroskopu optycznego, wykonać kilka zdjęć mikrogeli przy użyciu obiektywu olejowego 100 x z kontrastem DIC. Zmierzyć mikrogela, aby wyznaczyć reprezentatywną średnicę.

Oblicz wskaźnik polidyspersyjności, korzystając z przedstawionego tutaj równania opartego na objętości, w którym N oznacza całkowitą liczbę mikrogeli, a VI objętość mikrogela. Aby zmierzyć średnią gęstość mikrogeli, należy najpierw przygotować roztwory dekstryny o stężeniach 7, 6, 5, 4, 3 i 1% w wodzie dejonizowanej; gęstości roztworów dekstryny przedstawiono tutaj. Następnie dodaj 2 mL 7% roztworu dekstryny do probówki wirówkowej o pojemności 15 mL.

Następnie powoli pipetuj dwa mililitry 6% roztworu dekstryny, aby utworzyć wyraźną warstwę na powierzchni 7% dekstryny. Po pięciu minutach dodaj dwa mililitry kolejnej warstwy składającej się z 5% dekstryny i kontynuuj w ten sposób, aż każda koncentracja dekstryny zostanie nałożona warstwowo w kolejności malejącego stężenia dekstryny. Następnie ostrożnie nanieś mikrożele na roztwór 1% dekstryny i wiruj gradient w temperaturze pięciu stopni Celsius w 4 000 ×g przez 10 minut.

Następnie należy zwizualizować rozmieszczenie mikrogeli i obliczyć ich gęstość w zależności od położenia pomiędzy warstwami. Aby zmierzyć masę spęcznionych mikrogeli, należy najpierw zważyć pustą probówkę do mikrocentryfugi, a następnie dodać do niej 1 mL mikrogeli. Mikrogele należy przemyć pięciokrotnie wodą dejonizowaną, wykonując odpowiednie etapy płukania.

Odwiruj próbkę przez 10 minut przy 4 000 ×g, aby osadzić mikrogela po ostatnim przemyciu. Zawiesić je ponownie w wodzie dejonizowanej i pozostawić do napęcznienia na minimum 48 godzin. Po 48 godzinach odwiruj napęczniałe mikrogela przez 10 minut przy 4 000 ×g, a następnie usuń cały nadsącz.

Następnie zważ próbkę i zapisz masę mokrą. Po uzyskaniu dokładnej masy mokrej zamroź mikrogela w temperaturze -80 °C, a następnie poddaj je liofilizacji w celu usunięcia wody i uzyskania masy suchej. Po sublimacji całej wody oblicz zawartość wody i polimeru w mikrogelach, korzystając z przedstawionych tutaj równań, gdzie MS to masa mokra mikrogeli, a MD to masa sucha.

Tutaj przedstawiono średnicę mikrogeli PEG utworzonych z zastosowaniem różnych mas cząsteczkowych 20%PEG. Wydłużenie czasu naświetlania promieniami UV również miało wpływ na średnicę mikrogeli. Wraz ze wzrostem czasu naświetlania UV zwiększały się średnice trzech przedstawionych tutaj formulacji.

Gęstość mierzona za pomocą gradientów dekstryny malała wraz ze wzrostem masy cząsteczkowej cząsteczek prekursorowych peg. Potwierdzono to również na wykresie zawartości wody w procentach, gdzie stwierdzono, że peg o wyższej masie cząsteczkowej posiada większą ilość wody na gram polimeru. Na koniec, aby wykazać, że mikrogels mogą być obciążone białkiem sprzężonym fluorescencyjnie, do mieszaniny przed polimeryzacją dodano albuminę, która została uwięziona wewnątrz sfer.

Zwiększenie stężeń białka znakowanego fluorescencyjnie spowodowało wzrost wskaźnika polidyspersyjności sfer, jednak średnia wielkość pozostała stała. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o podgrzaniu wszystkich roztworów do 37 °C oraz dokładnym wymieszaniu mikrogeli w wirówce typu vortex w celu rozbicia ewentualnych agregatów podczas płukania i przygotowywania preparatów do obrazowania. Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić dodatkowe metody enkapsulacji leku, aby odpowiedzieć na kolejne pytania dotyczące efektu uwalniania leku.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tworzenia mikrogeli peg DA w łagodnych warunkach za pomocą reakcji strącania.