Izolacja mikrogleju korowego z zachowanym immunofenotypem i funkcjonalnością od mysich noworodków

Ogólnym celem niniejszej procedury jest izolacja mikrogleju korowego z noworodków myszy. Jest to realizowane poprzez wstępną mikrodysekcję tkanki kory mózgowej noworodków myszy. Drugim krokiem jest hodowla mieszanych kultur komórek glejowych przez 17 do 21 dni in vitro.

Następnie z tych mieszanych kultur glejowych izoluje się mikroglej. Ostatnim krokiem jest wysianie komórek mikrogleju na płytki hodowlane w celu przeprowadzenia dalszych eksperymentów. Ostatecznie zastosowano mikroskopię immunofluorescencyjną oraz test ELISA, aby wykazać, że protokół izolacji ten zachowuje immunofenotyp i funkcjonalność mikrogleju.

Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ kroki SEP stosowane w mikromikrodysekcji są trudne do wykonania. Pomyślna realizacja tej procedury wymaga zarówno szybkości, jak i precyzji. Zbyt wolne tempo pracy obniży wydajność uzyskiwanych komórek, natomiast niepełne usunięcie opon mózgowych zanieczyści kulturę glejową i utrudni wzrost gleju.

Rozpocznij od przygotowania pełnej pożywki dla mikrogleju, zwanej w dalszej części tekstu MCM. Przygotuj jedną kolbę na jednego szczeniaka i inkubuj je przez co najmniej jedną godzinę. Ten etap równoważenia jest niezbędny dla powodzenia procedury.

Następnie należy przygotować alikwoty i schłodzić je w lodzie. Ze wszystkich wymaganych pożywek należy odmierzyć alikwoty po 6 ml MCM dla każdego szczenięcia i ogrzać je w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przed przeprowadzeniem sekcji. Stację roboczą z poziomym przepływem powietrza oraz mikroskop sekcyjny należy przetrzeć 70% etanolem.

Następnie umieść w obszarze roboczym wysterylizowane narzędzia chirurgiczne niezbędne do przeprowadzenia procedury. Przygotuj sterylną szalkę z medium do sekcji do przechwycenia głowy oraz drugą szalkę do przeprowadzenia sekcji. Przelej medium do rozdrabniania do osobnej szalki w celu rozdrobnienia tkanki mózgowej.

Po dekapitacji i wyjęciu mózgu, umieść świeżo wyizolowany organ pod mikroskopem stereoskopowym w celu wizualizacji struktur, dbając o to, aby strona grzbietowa była skierowana do góry i pozostawała sucha. Unieruchom mózg, wkładając końcówki pincety w miejsce styku śródmózgowia i kory. Po ustabilizowaniu preparatu całkowicie usuń oponu kory od strony grzbietowej.

Następnie usuń brzuszne opony mózgowe, aby zmaksymalizować czystość i wydajność mikrogleju. Niezbędne jest całkowite usunięcie całej tkanki oponowej. Oddziel korę mózgową od pozostałej części mózgu.

Należy upewnić się, że usunięto wszelkie pozostałości opon mózgowych, które mogą znajdować się po stronie brzusznej lub przyśrodkowej kory. Po usunięciu tkanki oponowej umieścić korę w wcześniej przygotowanej miseczce do rozdrabniania. Pracując w komorze z laminarnym przepływem powietrza klasy II, rozdrobić tkankę mózgową za pomocą nożyczek.

Przenieś posiekaną tkankę do 15 mm probówki stożkowej. Przepłucz nożyczki oraz naczynie do siekania, używając do każdego z nich 1 ml pożywki do siekania, aby zmaksymalizować wydajność. Zbierz te wypłuczyny i przelej je do 15 ml probówki stożkowej zawierającej posiekaną tkankę.

Pozostaw zawiesinę tkankową w spokoju przez jedną lub dwie minuty, aby posiekana tkanka mogła osadzić się na dnie probówki. Po tym czasie ostrożnie odessaj i odrzuć 2 ml supernatantu, dbając o to, by nie poruszyć osadu z posiekanej tkanki. Do posiekanej tkanki dodaj 3 ml uprzednio ogrzanego MCM, a następnie energicznie potrząśnij tkanką.

Po zakończeniu procesu pobierania nie powinno pozostać żadnej widocznej stałej tkanki. Za pomocą tej samej końcówki pipety dodaj kolejne 3 mL MCM, aby zebrać pozostałości rozdrobnionej próbki z końcówki. Po zebraniu odwirowuj rozdrobnioną tkankę, aby uzyskać pellet komórek.

Po zakończeniu przenieś zgranulowane komórki z powrotem do komory bezpieczeństwa biologicznego. Ostrożnie odlej i usuń nadsącz. Delikatnie resus.

Resuspend pellet komórkowy w 2 ml ocieplonego MCM, a następnie dodaj zawiesinę komórek do wcześniej przygotowanej kolby. Inkubuj komórki przez 24 h. Po 24 h delikatnie opukaj kolbę o dłoń, aby rozbić resztki tkankowe.

Sprawdzić komórki przed i po opukiwaniu, aby upewnić się, że detrytus został całkowicie usunięty. Następnie wymienić medium na świeże MCM i umieścić kolbę z powrotem w inkubatorze. Monitorować komórki codziennie w celu kontroli wzrostu i ewentualnej kontaminacji.

Po około 17 do 21 dniach komórki mikrogleju będą gotowe do zbioru. Aby stwierdzić, czy komórki są gotowe, należy zbadać je pod odwróconym mikroskopem fazokontrastowym. Mikroglej jest gotowy do zbioru, gdy osiągnie około 40% konfluencji; komórki te wyglądają wówczas jak małe, jasne, sferyczne komórki rosnące w formie monowarstwy jedna na drugiej.

Aby wyizolować mikroglej, należy energicznie uderzać kolbą o blat laboratoryjny. Takie wstrząsanie pomaga oddzielić mikroglej od innych komórek glejowych ze względu na niskie właściwości adhezyjne mikrogleju. Zakrętki kolb należy uszczelnić parafilmem, a zmieszane kultury glejowe rotować przez pięć godzin za pomocą nieuwilgotnianego inkubatora rotacyjnego z kontrolą temperatury.

Po tym czasie należy wizualnie sprawdzić, czy mikroglej oddzielił się od powierzchni kolby. W mikroskopie fazokontrastowym w odwróceniu mikroglej widoczny jest jako jasne, sferyczne, swobodnie pływające komórki. Na dnie kolby pozostanie warstwa astrocytów i oligodendrocytów.

Następnie zebrać supernatant zawierający mikroglej do sterylnej stożkowej probówki wirówkowej i odwirować. Osad mikrogleju zawiesić w ogrzanym pożywce do wzrostu mikrogleju i określić stężenie komórek za pomocą komory countingowej (hemocytometru). Komórki wysiać na płytkę 24-dołkową na plastiku lub sterylnych szkiełkach podstawkowych i inkubować przez 24 godziny.

Wymień pożywkę na świeże, ciepłe MGM, aby usunąć pływające komórki i zanieczyszczenia. Krok ten jest kluczowy dla przeżycia komórek oraz utrzymania mikrogleju w stanie spoczynku; komórki mikrogleju są gotowe do eksperymentów bezpośrednio po tym etapie dokarmiania w celu oceny czystości mikrogleju. Kultury komórkowe pochodzące z mikrogleju endogennie ekspresującego GFP zabarwiono na antygen makrofagów IBA one i przeciwbarwiono dapi.

W celu wizualizacji jądra komórkowego stwierdzono, że ponad 95% komórek wykazywa kolokalizację GFP IBA one i dpi. Po stymulacji komórek LPS mikroglej przeszedł wyraźną zmianę morfologiczną z fenotypu rozgałęzionego na kształt ameboidalny. Barwienie immunohistochemiczne na P 65 wykazało, że w warunkach prawidłowych P 65 jest rozproszone w całej cytoplazmie.

Podczas gdy po dwugodzinnym wystawieniu na działanie Pam P 65 immunoreaktywność gwałtownie przesunęła się do jądra komórkowego, co potwierdziło, że wyizolowane mikrogleje zachowały swoją biochemiczną funkcjonalność immunologiczną. Wydzielanie cytokiny prozapalnej TNF alpha określono po wystawieniu na działanie PAM lub LPS. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak wyizolować mikroglej korowy z noworodków myszy, aby uzyskać najlepsze wyniki.

Ważne jest zachowanie zasad sterylności oraz dokładne usunięcie tkanki oponowej z wypreparowanego obszaru kory.