Izolacja mikrogleju korowego z zachowanym immunofenotypem i funkcjonalnością od mysich noworodków
30 stycznia 2014
Jednym z kluczy do udanego badania biologii mikrogleju jest zachowanie funkcji immunologicznej mikrogleju ex vivo podczas izolacji z tkanki OUN. Wyizolowanie mikrogleju za pomocą wytrząsania obrotowego daje wysoce czyste i immunofunkcjonalne hodowle komórek, oceniane za pomocą obrazowania fluorescencyjnego, immunocytochemii i ELISA po aktywacji mikrogleju za pomocą bodźców prozapalnych lipopolisacharydu (LPS) i Pam3CSK4 (Pam).
Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie mikrogleju korowego od mysich noworodków. Osiąga się to poprzez pierwsze mikrosekcje tkanki mózgowej kory mózgowej noworodków Muren. Drugim krokiem jest hodowla mieszanych komórek glejowych przez 17 do 21 dni in vitro.
Następnie mikroglej jest izolowany z tych mieszanych kultur glejowych. Ostatnim krokiem jest umieszczenie komórek mikrogleju na płytkach do hodowli komórkowych w celu dalszych eksperymentów. Ostatecznie mikroskopia immunofluorescencyjna i lek Eliza są wykorzystywane do wykazania, że ten protokół izolacji zachowuje fenotyp i funkcjonalność immunokomórki mikrogleju.
Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ SEP zaangażowane w mikromikrodysekcję są trudne do wykonania. Pomyślne wykonanie tej procedury wymaga zarówno szybkości, jak i dokładności. Oznacza to, że bycie zbyt wolnym zmniejszy wydajność komórek, podczas gdy niepełne usunięcie opon mózgowych zanieczyści hodowlę glejową i zahamuje wzrost gleju.
Zacznij od przygotowania kompletnych pożywek dla mikrogleju, zwanych dalej MCM. Przygotować jedną kolbę na młode i inkubować je przez co najmniej godzinę. Ten krok równowagi jest niezbędny do osiągnięcia sukcesu.
Następnie przygotuj porcję i schłodź na lodzie. Wszystkie wymagane podłoża to sześć mililitrów MCM dla każdego szczeniaka i ogrzane w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza przed preparacją. Przetrzyj stację roboczą z poziomym przepływem powietrza i mikroskop preparacyjny 70% etanolem.
Następnie umieść wysterylizowane narzędzia chirurgiczne potrzebne do zabiegu w obszarze roboczym. Przygotuj sterylne naczynie z pożywką do preparacji do uchwycenia głowy i drugie do sekcji. Dozuj pożywkę do mielenia mięsa do osobnego naczynia w celu rozdrobnienia tkanki mózgowej.
Po dekapitacji i ekstrakcji mózgu umieść świeżo odizolowany mózg pod mikroskopem preparacyjnym, aby uwidocznić uprzejmości, upewniając się, że strona grzbietowa jest sucha i podniesiona. Zabezpiecz mózg, wkładając końcówki kleszczy w skrzyżowanie śródmózgowia i kory mózgowia. Po umieszczeniu na miejscu całkowicie usuń opony mózgowo-rdzeniowe grzbietowe.
Następnie usuń opony brzuszne, aby zmaksymalizować czystość i wydajność mikrogleju. Konieczne jest całkowite usunięcie całej tkanki oponowej. Oddziel korę mózgową od pozostałej części mózgu.
Pamiętaj, aby usunąć wszelkie resztki opon korowych, które mogą być obecne po brzusznej lub przyśrodkowej stronie kory. Po usunięciu tkanki oponowej umieść korę mózgową w przygotowanym wcześniej naczyniu do mielenia mięsa. Pracując w gabinecie bezpieczeństwa biologicznego klasy drugiej, użyj nożyczek, aby zmielić tkankę mózgową.
Przenieś zmieloną tkankę do stożkowej rurki o średnicy 15 milimetrów. Opłucz zarówno nożyczki, jak i naczynie do mielenia mięsa po jednym mililitrze środka do mielenia mięsa, aby zmaksymalizować plony. Zbierz i dozuj te płukanki do stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów zawierającej zmieloną tkankę.
Pozostawić zawiesinę tkankową w spokoju przez jedną do dwóch minut, pozwalając zmielonej tkance osiąść na dnie probówki. Po tym czasie ostrożnie usunąć i wyrzucić dwa mililitry supernatantu, uważając, aby nie naruszyć osiadłej tkanki mielonej. Dodaj trzy mililitry wcześniej podgrzanego MCM do zmielonej tkanki, a następnie mocno tri tkankę.
Po zakończeniu próby nie powinna pozostać żadna dostrzegalna tkanka stała. Dodaj kolejne trzy mililitry MCM za pomocą tej samej końcówki pipety, aby zebrać pozostałą roztartą próbkę z końcówki. Po zebraniu odwiruj zmieloną tkankę, aby osadzać komórki.
Po zakończeniu należy zwrócić granulowane komórki do komory bezpieczeństwa biologicznego. Ostrożnie usunąć i wyrzucić supernatant. Delikatnie resus.
Zawiesić osad komórkowy dwoma mililitrami ciepłego MCM, a następnie dodać zawiesinę rezu komórek do przygotowanej wcześniej kolby. Inkubuj komórki przez 24 godziny. Po 24 godzinach delikatnie postukać kolbą o dłoń, aby rozbić resztki tkanki.
Sprawdź ogniwa przed i po stuknięciu, aby upewnić się, że zanieczyszczenia zostały całkowicie usunięte. Następnie zastąp pożywkę świeżym MCM i włóż kolbę z powrotem do inkubatora. Codziennie sprawdzaj komórki, aby monitorować wzrost i zanieczyszczenie.
Po około 17 do 21 dniach komórki mikrogleju będą gotowe do pobrania, aby określić, czy komórki są gotowe, zbadaj je pod mikroskopem z kontrastem z odwróconymi fazami. Mikroglej jest gotowy do zbioru. Kiedy osiągną około 40% płynności CO, pojawiają się jako małe, jasne kuliste komórki rosnące jako monowarstwa na drugiej.
Aby wyizolować, mikroglej energicznie stukaj kolbą o stół laboratoryjny. To mieszanie pomaga oddzielić mikroglej od innych komórek glejowych ze względu na niskie właściwości przylegania mikrogleju. Uszczelnić nasadki kolb paraformem i obracać mieszane kultury glejowe za pomocą wytrząsarki rotacyjnej o kontrolowanej temperaturze bez nawilżania przez pięć godzin.
Po tym czasie należy wzrokowo sprawdzić, czy mikroglej uniósł się z powierzchni kolby. Używając mikroskopu z kontrastem z odwróconą fazą, mikroglej to jasne, sferyczne, swobodnie unoszące się komórki. Do dna kolby przylega szczątkowa warstwa astrocytów i oligodendrocytów.
Następnie zebrać supernatant zawierający mikroglej do sterylnej stożkowej probówki wirówkowej i podniebienia. Resus. Zawiesić osad mikrogleju w ciepłym podłożu do wzrostu mikrogleju i określić stężenie komórek za pomocą płytki cytometru hemocytometru. Komórki na 24-dołkowej płytce na plastikowej lub sterylnej szklanej pokrywie ślizgają się 24 godziny później.
Wymień nośnik na świeży, ciepły MGM, aby usunąć pływające komórki i zanieczyszczenia. Ten etap ma kluczowe znaczenie dla przetrwania komórek i utrzymania mikrogleju w stanie spoczynku, komórki mikrogleju są gotowe do eksperymentów natychmiast po tym etapie ponownego odżywiania w celu oceny czystości mikrogleju. Kultury komórkowe pochodzące z mikrogleju wykazującego endogenną ekspresję GFP wybarwiono pod kątem antygenu makrofagowego IBA one i wybarwiono przeciw dapi.
Aby uwidocznić jądro komórkowe, ponad 95% komórek wykazywało kolokalizację GFP, IBA, one i dpi. Po rzuceniu wyzwania komórkom za pomocą LPS, mikroglej przyjął wyraźną zmianę morfologiczną z małego fenotypu bi na kształt podobny do ameboidalnego. Barwienie immunofitochemiczne dla P 65 dowodzi, że w normalnych warunkach P 65 jest rozproszony w cytoplazmie.
Natomiast po dwugodzinnej ekspozycji na Pam P 65 immunoreaktywność dramatycznie przesunęła lokalizację na jądro komórkowe, aby potwierdzić, że wyizolowany mikroglej zachował swoją biochemiczną funkcjonalność immunologiczną. Wydzielanie prozapalnej cytokiny TNF alfa określono po ekspozycji na PAM lub LPS. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wyizolować mikroglej korowy z lustrzanych noworodków, aby uzyskać najlepsze wyniki.
Ważne jest, aby zachować sterylną technikę i dokładnie usunąć tkankę oponową z wypreparowanego obszaru korowego.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten artykuł opisuje procedurę izolowywania mikroglii korowej z noworodków mysi, podkreślając znaczenie zachowania immunofunkcji mikroglii w trakcie procesu. Metoda izolacji obejmuje mikroskopową dysekcję tkanki mózgowej, hodowlę mieszanych komórek glejowych i następujące po tym odizolowanie mikroglii do eksperymentów.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Biologia komórki
- Immunologia
Tło
- Mikroglia odgrywa kluczową rolę w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN).
- Metody izolacji mogą wpływać na funkcjonalność komórek mikroglii.
- Zachowanie immunofunkcji jest niezbędne dla dokładnych wyników eksperymentów.
- Prozapalne bodźce są używane do oceny aktywacji mikroglii.
Cel badania
- Opracowanie wiarygodnego protokołu izolowania mikroglii z mysich noworodków.
- Zapewnić, że izolowany mikroglia zachowuje swój immunofenotyp i funkcjonalność.
- Ułatwienie dalszych eksperymentów na biologii mikroglii.
Zastosowane metody
- Mikroskopowa dysekcja korowej tkanki mózgowej z mysich noworodków.
- Hodowla mieszanych komórek glejowych przez 17 do 21 dni in vitro.
- Izolowanie mikroglii z mieszanych kultur komórek glejowych.
- Użycie mikroskopii immunofluorescencyjnej i ELISA do oceny funkcjonalności mikroglii.
Główne wyniki
- Protokół izolacji daje bardzo czyste kultury mikroglii.
- Mikroglia zachowuje cechy immunofunkcyjne po izolacji.
- Aktywacja LPS i Pam 3 CSK 4 wykazuje zachowaną funkcjonalność.
- Fluorescencyjne obrazy i immunocytochemia potwierdzają wyniki.
Wnioski
- Opisana metoda izolacji jest skuteczna w uzyskiwaniu funkcjonalnej mikroglii.
- Zachowanie immunofunkcji jest kluczowe dla badania biologii mikroglii.
- Ten protokół może być stosowany w różnych ustawieniach eksperymentalnych z udziałem mikroglii.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Isolation of functional microglia from murine neonates enables mechanistic de-risking in neuroimmunology target validation by preserving immunophenotype and responsiveness to inflammatory stimuli. This ex vivo model supports predictive confidence in early discovery by maintaining quiescent and activated states relevant to CNS disease pathways. The method provides a disease-relevant system for screening immunomodulatory compounds and assessing target engagement in preclinical workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of microglial activation pathways through LPS and Pam3CSK4 challenge assays.
- Operational Value: Yields highly pure cortical microglia with preserved NF-κB p65 nuclear translocation and TNF-α secretion functionality.
- Predictive Value: Supports target hypothesis testing by maintaining immunophenotypic fidelity from quiescent to proinflammatory states.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides a standardized microglial monolayer system for compound screening after 17–21 days of glial culture maturation.
- Operational Value: Allows quantification of microglial purity via IBA-1/GFP colocalization (>95%) and functional readouts like cytokine release.
- Assay Readiness: Isolated microglia exhibit morphological and functional responses to stimuli, enabling reliable dose-response profiling.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Maintains microglial functionality ex vivo, supporting continuity from discovery to preclinical validation of neuroinflammatory targets.
- Mechanistic De-risking: Preserves biochemical functionality (NF-κB signaling, TNF-α release) critical for assessing target-mediated pathway modulation.
- Disease Relevance: Models quiescent and activated microglia states applicable to neurodegenerative and neuroinflammatory disease research.
Pipeline & Workflow Integration
The isolation method fits within the discovery continuum from target validation to lead identification by providing a reproducible microglial platform for mechanism-of-action studies and phenotypic screening in neuroimmunology.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification via NF-κB translocation and cytokine secretion assays following immune challenge.
- Screening: Enables assay standardization through consistent microglial yield, purity, and functional responsiveness after rotary shaker isolation.
- Analytics: Generates quantitative dependent variables including TNF-α secretion levels and p65 nuclear localization for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects ex vivo microglial function to in vivo relevance through preserved immunophenotype and activation kinetics.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable microglial isolation workflow applicable across multiple CNS target validation campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through preserved microglial immunophenotype and stimulus-responsive functionality.
- Operational Value: Standardized isolation via mechanical agitation yields reproducible microglial cultures with >95% purity and functional integrity.
- Strategic Value: Reduces mechanistic ambiguity in neuroimmunology screening by maintaining ex vivo microglial behavior indicative of in vivo states.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of immunomodulatory targets based on validated target engagement in functional microglial assays.
Implementation Considerations
- Requires expertise in neonatal murine tissue dissection and sterile glial culture techniques.
- Dependent on temperature-controlled rotary shaker and inverted phase contrast microscopy for microglia isolation and verification.
- Necessitates standardization of meninges removal and culture duration (17–21 days) across teams to ensure microglial yield and purity.
- Adaptation to other model systems may require optimization of dissociation timing and microglial adhesion properties.
- Practical limitation: Microglial yield is contingent on complete meningeal tissue removal to prevent glial culture contamination.
