Name: Izolacja mikrogleju korowego z zachowanym immunofenotypem i funkcjonalnością od mysich noworodków (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: Poznaj metodę izolacji mikrogleju korowego od mysich noworodków z zachowaniem immunofenotypu i funkcjonalności. Protokół obejmuje mikrochirurgiczne przygotowanie tkanek mózgowych oraz hodowlę mieszanych kultur glejowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez NIEHS R01ES014470 (KMZ).

Przed rozpoczęciem tego protokołu, zbierz noworodki myszy w 1-3 dniu po urodzeniu (P1-3) w sterylnym pojemniku umieszczonym z oryginalną ściółką w klatce dla ochrony i ciepła. Ważne jest, aby pracować szybko i wydajnie za pomocą tego protokołu, aby zoptymalizować wydajność mikrogleju. Pełna lista odczynników znajduje się w Tabeli 1.
1. Przygotowanie instrumentów, pożywek hodowlanych i potraw
<ol>
	<li>Przygotować 10 ml/pupę Microglea Complete (MCM; 1x Minimal Essential Medium Earle's [MEM] uzupełnione: 1 mM L-glutaminy, 1 mM pirogronianu sodu, 0,6% v/v D-(+)-glukozy, 100 μg/ml penicyliny/streptomycyny (P/S), 4% v/v płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 6% v/v surowicy końskiej) i dodać do każdej kolby T-75 (1 kolba/pup); zakryć i umieścić poziomo w inkubatorze (37 °C, 5% CO2) w celu zrównoważenia przez 1 godzinę. Konieczne jest zrównoważenie tej pożywki w kolbie (kolbach) przed rozpoczęciem preparacji.</li>
	<li>Przygotować, porcjować i ogrzewać w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C MCM do rozbioru (6 ml/pup) oraz w oddzielnej stożkowej probówce MCM do ponownego zawieszenia komórek (2 ml/pup). Przygotować, porcjować i schłodzić na lodzie Podłoża do mielenia mięsa (MM; HBSS uzupełniony o: 100 μg/ml P/S, 0,01 M HEPES; 3 ml/pup) i pożywki sekcyjne (DM; MEM uzupełniony 100 μg/ml P/S; 2 ml/pup).</li>
	<li>Wysterylizuj następujące narzędzia chirurgiczne przez zanurzenie w 70% etanolu na 10 minut: nożyczki #1 (1; do dekapitacji), kleszcze #1 (2; do zabezpieczenia nosa i usunięcia kory), nożyczki #2 (1; bez kąta; do otwarcia skóry głowy), kleszcze #2 (1; do usunięcia skóry głowy), kleszcze #3 (1; do usunięcia czaszki), kleszcze #4 (2; do usunięcia opon mózgowych), nożyczki #3 (1; do mielenia tkanki mózgowej). Pozostawić do wyschnięcia na powietrzu na sterylnej podkładce.</li>
	<li>Przetrzyj stację roboczą z poziomym przepływem powietrza i mikroskop preparacyjny 70% etanolem.</li>
	<li>Dozować s.m. do 2 sterylnych szalek Petriego o średnicy 100 mm w celu uchwycenia głowy (3 ml; 1 szalka/3 młode) i rozbioru (1 ml; 1 szalka/szczenię; schłodzone na lodzie przed preparacją). Dozować MM do 1 sterylnej szalki Petriego o średnicy 100 mm do mielenia tkanki mózgowej (1 ml; 1 miska/pup).</li>
</ol>
2. Sekcja tkanki mózgowej
<ol>
	<li>Przed eutanazją delikatnie zdezynfekuj szyję i głowę szczeniaka 70% etanolem za pomocą chusteczki laboratoryjnej. Za pomocą nożyczek #1 szybko uśpij szczeniaka, usuwając głowę; chwytać głowę we wcześniej przygotowanej szalce Petriego. Poddaj eutanazji i zakończ sekcję jednego szczeniaka przed przejściem do następnego zwierzęcia.</li>
	<li>Przenieś głowę do schłodzonego naczynia preparacyjnego; pod mikroskopem preparacyjnym zabezpiecz głowę, szczypiąc nos za pomocą kleszcza #1 (alternatywnie, głowę można zabezpieczyć, przebijając kleszcze przez oczodół); otwórz skórę głowy za pomocą nożyczek #2, tworząc nacięcie w kształcie litery Y: zacznij od podstawy głowy i pod kątem w kierunku oczu. Użyj kleszczyka #3, aby delikatnie usunąć skórę głowy, obierając ją na boki, odsłaniając czaszkę.</li>
	<li>Za pomocą kleszczyka #3 delikatnie usuń tkankę łączną u podstawy głowy. Gdy podstawa czaszki jest odsłonięta, ostrożnie otwórz czaszkę, przewlekając jedno ramię kleszcza między mózgiem a czaszką (wzdłuż szczeliny międzypółkulowej); chwyt; Delikatnie pociągnij czaszkę do góry, aby ją rozerwać na strzępy.</li>
	<li>Zarąb tkankę łączną pod brzuszną stroną mózgu za pomocą kleszczy #1, a następnie usuń mózg za pomocą tego samego narzędzia. Podnieś mózg z czaszki, używając siły skierowanej w górę pod brzuszną stroną mózgu.</li>
	<li>Utrzymuj mózg w jego anatomicznej pozycji: strona grzbietowa skierowana do góry, aby uwidocznić korę pod mikroskopem preparacyjnym; zabezpiecz mózg na miejscu, wkładając końcówki kleszczy w przecięcie śródmózgowia i kory; całkowicie usuń opony korowe za pomocą kleszcza #4, a następnie przystąp do usuwania opon brzusznych. Gdy opony mózgowe zostaną całkowicie usunięte, oddziel korę od reszty mózgu za pomocą kleszczy #4. Konieczne jest całkowite usunięcie tkanki oponowej w celu maksymalizacji czystości i wydajności mikrogleju.</li>
</ol>
3. Mielenie tkanki mózgowej
<ol>
	<li>Przenieść korę do wcześniej przygotowanego naczynia do mielenia mięsa; kontynuować etap mielenia przy użyciu sterylnej techniki w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy II.</li>
	<li>Zmielić tkankę mózgową za pomocą nożyczek #3; przenieść zmieloną tkankę do stożkowej probówki o pojemności 15 ml; opłukać nożyczki i naczynie do mielenia mięsa po 1 ml MM, zebrać i dozować płukanki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej zmieloną tkankę. Ten etap płukania zmaksymalizuje wydajność mikrogleju, zapewniając, że cała pozostała tkanka zostanie przeniesiona do stożkowej rurki. Pozostaw zawiesinę tkankową w spokoju przez 1-2 minuty, pozwalając zmielonej tkance osiąść na dnie probówki. Nie należy przekraczać 2 minut, ponieważ MM nie zawiera niezbędnych składników odżywczych.</li>
	<li>Ostrożnie usunąć i wyrzucić 2 ml supernatantu za pomocą zwykłego mikropipetora o pojemności 1 000 μl ze standardową końcówką do pipety, upewniając się, że nie naruszyć osadzonej tkanki mielonej.</li>
	<li>Dodać 3 ml MCM do tkanki rozdrobnionej; rozcierać tkankę z pełną siłą za pomocą zwykłego mikropipetora o pojemności 1 000 μl ze standardową końcówką do pipety. Po zakończeniu rozcierania nie powinna pozostać żadna dostrzegalna tkanka stała. Dodać kolejne 3 ml MCM za pomocą tej samej końcówki pipety, zbierając pozostałą próbkę z końcówki pipety.</li>
</ol>
4. Rosnące komórki korowe
<ol>
	<li>Odwirować tkankę mieloną do postaci granulek (215 x g; 5 min; RT; wirówka kliniczna z wahliwym wirnikiem kubełkowym). Umieścić granulowane komórki z powrotem w komorze bezpieczeństwa biologicznego, usunąć i wyrzucić supernatant; Delikatnie zawiesić osad komórkowy (2 ml/probówkę; MCM); dodać zawiesinę komórek do uprzednio przygotowanej kolby T-75; Zakryj kolbę i umieść ją poziomo w wilgotnym, standardowym inkubatorze do hodowli tkankowych (37 °C, 5% CO2 ). Pozostawić komórki do inkubacji przez 24 godziny.</li>
	<li>Po 24 godzinach delikatnie postukaj kolbą o dłoń, aby rozbić resztki tkanki. Sprawdź ogniwa przed i po stuknięciu, aby upewnić się, że całkowicie usuń zanieczyszczenia. Ustawić kolbę pionowo; Usuń i wyrzuć nośniki; dodać świeży MCM na dno kolby (12 ml; 37 °C); nakryć i umieścić z powrotem w inkubatorze, poziomo.</li>
	<li>Codziennie sprawdzaj komórki pod kątem zanieczyszczenia i monitoruj wzrost.</li>
	<li>Po około 17-21 dniach in vitro (DIV) komórki mikrogleju będą gotowe do pobrania z mieszanej kultury glejowej. Aby określić, czy komórki są gotowe, zbadaj komórki pod mikroskopem z odwróconym kontrastem fazowym. Mikroglej jest gotowy do zbioru, gdy znajduje się w ~40% zbiegu. Pojawiają się jako małe, jasne, kuliste komórki, rosnące jako monowarstwa na wierzchu innych komórek glejowych.</li>
</ol>
5. Izolacja mikrogleju z mieszanej kultury glejowej
<ol>
	<li>Aby wyizolować mikroglej, energicznie postukaj kolbą o stół laboratoryjny. To pobudzenie pomaga oddzielić mikroglej od innych komórek glejowych ze względu na właściwości mikrogleju o niskiej przyczepności.</li>
	<li>Uszczelnić nasadki kolb T-75 parafilmem i obrócić mieszane kultury glejowe (200 obr./min; 37 °C; 5 godz.) za pomocą nienawilżanego wytrząsarki rotacyjnej o kontrolowanej temperaturze. Nie pozwól, aby komórki wstrząsały się dłużej niż 5 godzin. Sprawdź wzrokowo, czy mikroglej uniósł się z powierzchni kolby po 5 godzinach, używając mikroskopu z odwróconym kontrastem fazowym. Mikroglej to jasne, kuliste, swobodnie unoszące się komórki. Do dna kolby przylega szczątkowa warstwa astrocytów i oligodendrocytów.</li>
	<li>Zebrać pożywkę sklarowaną nad osadem zawierającą mikroglej do sterylnej stożkowej probówki wirówkowej; mikroglej w postaci osadu (215 x g; 5 min; obracany wirnik kubełkowy).</li>
	<li>Zawiesić osad mikrogleju w ciepłym podłożu mikrogleju (MGM; MEM uzupełniony o: 1 mM pirogronian sodu, 0,6% v/vglukoza, 1 mM L-glutamina, 100 μg/ml P/S, 5% v/v FBS; ~2 ml/kolbę), oznaczyć stężenie komórek za pomocą hemocytometru i umieścić 1 x 105 komórek/basenik w formacie płytki 24-dołkowej na szkiełkach nakrywkowych z tworzywa sztucznego lub sterylnego szkła (500 μl/basenik; MGM). Dzięki tej procedurze średnia wydajność mikrogleju wynosi 7,5 x 105 komórek/korę szczeniąt.</li>
	<li>24-godzinny post-plat, usuń wszystkie media i ponownie wprowadź komórki świeżym MGM (37 °C), aby usunąć pływające komórki i zanieczyszczenia. Ten etap ma kluczowe znaczenie dla przetrwania komórek i utrzymania mikrogleju w stanie spoczynku. Komórki mogą być wykorzystane do eksperymentów natychmiast po ponownym karmieniu.</li>
</ol>
6. Przykładowe zabiegi
<ol>
	<li>Wystawić komórki na działanie 10 ng/ml Pam3CSK4 (Pam), 10 ng/ml lipopolisacharydu (LPS) lub kontroli nośnika; inkubować przez 2 lub 24 godziny w wilgotnym inkubatorze (37 °C, 5% CO2 ).</li>
</ol>
7. Analiza mikrogleju pod kątem funkcjonalności ex vivo za pomocą obrazowania immunofluorescencyjnego i immunocytochemii
<ol>
	<li>Po poddaniu działaniu substancji należy pobrać pożywkę do hodowli komórkowych w probówkach do mikrofuge (1,5 ml) i odwirować za pomocą mikrowirówki stołowej (2 min; 900 x g) w celu oczyszczenia pożywki. Przenieść supernatant do czystej probówki do mikrofuge; natychmiast wykonać test lub przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu przygotowania do użycia. Analizuj stężenie TNF-α w supernatancie hodowli komórkowej za pomocą dostępnego na rynku mysiego zestawu ELISA TNF-α.</li>
	<li>Umyć komórki solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) i utrwalić komórki 4% (w/v) paraformaldehydem/4% (w/v) sacharozą/PBS pH 7,4 (4% PFA; 15 min; RT). Po utrwaleniu przemyć komórki PBS przez 5 minut, delikatnie wstrząsając wytrząsarką orbitalną.
	<ol>
		<li>Immunofluorescencja/immunocytochemia. Po utrwaleniu i umyciu PBS przetworzyć mikroglej do immunocytochemii. Wszystkie kroki wykonywane są z delikatnym potrząsaniem. Przepuszczalność komórek w PBS/0,1% tryton X-100; blokować komórki w PBS/10% normalnej surowicy koziej przez jedną godzinę. Inkubować komórki O/N w temperaturze 4 °C z króliczym przeciwciałem anty-NF-κB (podjednostka p65; 1/1,250) lub króliczym przeciwciałem anty-Iba-1 (1/750) w buforze blokującym. Wizualizacja kompleksu antygen:przeciwciało po inkubacji z fluorescencyjnie sprzężonym kozim przeciwciałem drugorzędowym anty-króliczym IgG (1 godzina; 1/1,000). Usunąć niezwiązane przeciwciało drugorzędowe przez przemycie PBS/0,1% trytonem X-100 (3 x 5 min).</li>
		<li>Przeciwdziałaj barwieniu komórek za pomocą 4',6-Diamidino-2-Fenyloindol/PBS (DAPI; 0,1 μg / ml) w celu wizualizacji jądra komórkowego. Wszystkie mikroglej pochodzące od myszy CX3CR1-GFP+/- wykazują ekspresję GFP. Wykorzystaj filtr długości fali 350 nm do wizualizacji DAPI; filtr długości fali 488 nm do wizualizacji GFP; oraz filtr o długości fali 594 nm do wizualizacji immunokompleksów p65 i Iba-1.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zamontuj szkiełka nakrywkowe za pomocą wodnego roztworu montażowego i uwidocznij mikroglej za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.</li>
</ol>

<ol><li>Ranshoff, R. M. P. V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+Physiology%3A+Unique+Stimuli%2C+Specialized+Responses%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Microglia Physiology: Unique Stimuli, Specialized Responses.</a> Annu. Rev. Immunol. 27, 119-145 (2009).</li>
<li>Lawson, L. J., Perry, V. H., Dri, P., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+in+the+distribution+and+morphology+of+microglia+in+the+normal+adult+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity in the distribution and morphology of microglia in the normal adult mouse brain.</a> Neuroscience. 39, 151-170 (1990).</li>
<li>Gomez Perdiguero, E., Schulz, C., Geissmann, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+homeostasis+of+%26%2334%3Bresident%26%2334%3B+myeloid+cells%3A+The+case+of+the+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Development and homeostasis of &#34;resident&#34; myeloid cells: The case of the microglia.</a> Glia. 61, 112-120 (2013).</li>
<li>Kierdorf, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+emerge+from+erythromyeloid+precursors+via+Pu.1-+and+Irf8-dependent+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Microglia emerge from erythromyeloid precursors via Pu.1- and Irf8-dependent pathways.</a> Nat. Neurosci. 16, 273-280 (2013).</li>
<li>Saijo, K., Glass, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+cell+origin+and+phenotypes+in+health+and+disease.+Nature+reviews%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Microglial cell origin and phenotypes in health and disease. Nature reviews.</a> Immunology. , 11-775 (2011).</li>
<li>Davalos, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP+mediates+rapid+microglial+response+to+local+brain+injury+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo.</a> Nat. Neurosci. 8, 752-758 (2005).</li>
<li>Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resting+microglial+cells+are+highly+dynamic+surveillants+of+brain+parenchyma+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo.</a> Science. 308, 1314-1318 (2005).</li>
<li>Hu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokine+and+free+radical+production+by+porcine+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Immunol.+Immunopathol%22%5BJournal%5D)">Cytokine and free radical production by porcine microglia.</a> Clin. Immunol. Immunopathol. 78, 93-96 (1996).</li>
<li>Muzio, M., Polentarutti, N., Bosisio, D., Prahladan, M. K., Mantovani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-like+receptors%3A+a+growing+family+of+immune+receptors+that+are+differentially+expressed+and+regulated+by+different+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Leukocyte+Biol%22%5BJournal%5D)">Toll-like receptors: a growing family of immune receptors that are differentially expressed and regulated by different leukocytes.</a> J. Leukocyte Biol. 67, 450-456 (2000).</li>
<li>Lee, S. J., Lee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-like+receptors+and+inflammation+in+the+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Drug+Targets.+Inflamm.+Allergy%22%5BJournal%5D)">Toll-like receptors and inflammation in the CNS.</a> Curr. Drug Targets. Inflamm. Allergy. 1, 181-191 (2002).</li>
<li>Block, M. L., Zecca, L., Hong, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia-mediated+neurotoxicity%3A+uncovering+the+molecular+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Microglia-mediated neurotoxicity: uncovering the molecular mechanisms.</a> Nat. Rev. Neurosci. 8, 57-69 (2007).</li>
<li>Halle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+NALP3+inflammasome+is+involved+in+the+innate+immune+response+to+amyloid-beta%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The NALP3 inflammasome is involved in the innate immune response to amyloid-beta.</a> Nat. Immunol. 9, 857-865 (2008).</li>
<li>Chen, G. Y., Nunez, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sterile+inflammation%3A+sensing+and+reacting+to+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Sterile inflammation: sensing and reacting to damage.</a> Nat. Rev. Immunol. 10, 826-837 (2010).</li>
<li>Duewell, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NLRP3+inflammasomes+are+required+for+atherogenesis+and+activated+by+cholesterol+crystals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">NLRP3 inflammasomes are required for atherogenesis and activated by cholesterol crystals.</a> Nature. 464, 1357-1361 (2010).</li>
<li>Stewart, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD36+ligands+promote+sterile+inflammation+through+assembly+of+a+Toll-like+receptor+4%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">CD36 ligands promote sterile inflammation through assembly of a Toll-like receptor 4.</a> 11, 155-161 (2010).</li>
<li>Beraud, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((alpha-Synuclein+Alters+Toll-Like+Receptor+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">alpha-Synuclein Alters Toll-Like Receptor Expression.</a> Front. Neurosci. 5, 80 (2011).</li>
<li>Banati, R. B., Gehrmann, J., Schubert, P., Kreutzberg, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxicity+of+microglia.%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Cytotoxicity of microglia.</a> Glia. 7, 111-118 (1993).</li>
<li>Combs, C. K., Karlo, J. C., Kao, S. C., Landreth, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((beta-Amyloid+stimulation+of+microglia+and+monocytes+results+in+TNF+alpha-dependent+expression+of+induciblenitric+oxide+synthase+and+neuronal+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">beta-Amyloid stimulation of microglia and monocytes results in TNF alpha-dependent expression of induciblenitric oxide synthase and neuronal apoptosis.</a> J. Neurosci. 21, 1179-1188 (2001).</li>
<li>Kim, Y. S., Joh, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia%2C+major+player+in+the+brain+inflammation%3A+their+roles+in+the+pathogenesis+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Microglia, major player in the brain inflammation: their roles in the pathogenesis of Parkinson's disease.</a> Exp. Mol. Med. 38, 333-347 (2006).</li>
<li>Colton, C., Wilcock, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+activation+states+in+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22CNS+Neurol.+Disord.+Drug+Targets%22%5BJournal%5D)">Assessing activation states in microglia.</a> CNS Neurol. Disord. Drug Targets. 9, 174-191 (2010).</li>
<li>Nakajima, K., Tohyama, Y., Kohsaka, S., Kurihara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ceramide+activates+microglia+to+enhance+the+production%2Fsecretion+of+brain-derived+neurotrophic+factor+%28BDNF%29+without+induction+of+deleterious+factors+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Ceramide activates microglia to enhance the production/secretion of brain-derived neurotrophic factor (BDNF) without induction of deleterious factors in vitro.</a> J. Neurochem. 80, 697-705 (2002).</li>
<li>Uesugi, M., Nakajima, K., Tohyama, Y., Kohsaka, S., Kurihara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonparticipation+of+nuclear+factor+kappa+B+%28NFkappaB%29+in+the+signaling+cascade+of+c-JunN-terminal+kinase+%28JNK%29-+and+p38+mitogen-activated+protein+kinase+%28p38MAPK%29-dependent+tumor+necrosis+factor+alpha+%28TNFalpha%29+induction+in+lipopolysaccharide+%28LPS%29-stimulated+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Nonparticipation of nuclear factor kappa B (NFkappaB) in the signaling cascade of c-JunN-terminal kinase (JNK)- and p38 mitogen-activated protein kinase (p38MAPK)-dependent tumor necrosis factor alpha (TNFalpha) induction in lipopolysaccharide (LPS)-stimulated microglia.</a> Brain Res. , 1073-1074 (2006).</li>
<li>Beraud, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+Activation+and+Antioxidant+Responses+Induced+by+the+Parkinson%27s+Disease+Protein+alpha-Synuclein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroimmun.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Microglial Activation and Antioxidant Responses Induced by the Parkinson's Disease Protein alpha-Synuclein.</a> J. Neuroimmun. Pharmacol. 8, 94-117 (2013).</li>
<li>Su, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synuclein+activates+microglia+in+a+model+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol.+Aging%22%5BJournal%5D)">Synuclein activates microglia in a model of Parkinson's disease.</a> Neurobiol. Aging. 29, 1690-1701 (2008).</li>
<li>Minghetti, L., Levi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+as+effector+cells+in+brain+damage+and+repair%3A+focus+on+prostanoids+and+nitric+oxide%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Microglia as effector cells in brain damage and repair: focus on prostanoids and nitric oxide.</a> Prog. Neurobiol. 54, 99-125 (1998).</li>
<li>Hirsch, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+cells+and+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurol.%22%5BJournal%5D)">Glial cells and Parkinson's disease.</a> J. Neurol.. 247 (2), 58-62 (2000).</li>
<li>Liu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+nitric+oxide+in+inflammation-mediated+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+NY+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Role of nitric oxide in inflammation-mediated neurodegeneration.</a> Ann. NY Acad. Sci. 962, 318-331 (2002).</li>
<li>Shie, F. S., Nivison, M., Hsu, P. C., Montine, T. J. Modulation of microglialinnate immunity in Alzheimer's disease by activation of peroxisome proliferator-activated receptor gamma. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aShie%2C+FS+%22Curr.+Med.+Chem%22">Curr. Med. Chem</a>. 16, 643-651 (2009).</li>
<li>Rogers, J., Mastroeni, D., Leonard, B., Joyce, J., Grover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroinflammation+in+Alzheimer%27s+disease+and+Parkinson%27s+disease%3A+are+microglia+pathogenic+in+either+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+Rev.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Neuroinflammation in Alzheimer's disease and Parkinson's disease: are microglia pathogenic in either disorder.</a> Int. Rev. Neurobiol. 82, 235-246 (2007).</li>
<li>Cardona, A. E., Huang, D., Sasse, M. E., Ransohoff, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+murinemicroglial+cells+for+RNA+analysis+or+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation of murinemicroglial cells for RNA analysis or flow cytometry.</a> Nat. Protoc. 1, 1947-1951 (2006).</li>
<li>Ford, A. L., Goodsall, A. L., Hickey, W. F., Sedgwick, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+adult+ramified+microglia+separated+from+other+central+nervous+system+macrophages+by+flow+cytometric+sorting.+Phenotypic+differences+defined+and+direct+ex+vivo+antigenpresentation+to+myelin+basic+protein-reactive+CD4%2B+T+cells+compared%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Normal adult ramified microglia separated from other central nervous system macrophages by flow cytometric sorting. Phenotypic differences defined and direct ex vivo antigenpresentation to myelin basic protein-reactive CD4+ T cells compared.</a> J. Immunol. 154, 4309-4321 (1995).</li>
<li>Ford, A. L., Foulcher, E., Goodsall, A. L., Sedgwick, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+digestion+with+dispase+substantially+reduces+lymphocyte+and+macrophage+cell-surface+antigen+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Tissue digestion with dispase substantially reduces lymphocyte and macrophage cell-surface antigen expression.</a> J. Immunol. Methods. 194, 71-75 (1996).</li>
<li>Pino, P. A., Cardona, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+brain+and+spinal+cord+mononuclear+cells+using+percoll+gradients%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of brain and spinal cord mononuclear cells using percoll gradients.</a> J. Vis. Exp. , (2011).</li>
<li>Veremeyko, T., Starossom, S. C., Weiner, H. L., Ponomarev, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+microRNAs+in+microglia+by+real-time+PCR+in+normal+CNS+and+during+neuroinflammation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Detection of microRNAs in microglia by real-time PCR in normal CNS and during neuroinflammation.</a> J. Vis. Exp. , (2012).</li>
<li>Su, X., Federoff, H. J., Maguire-Zeiss, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutant+alpha-synuclein+overexpression+mediates+early+proinflammatory+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotox.+Res%22%5BJournal%5D)">Mutant alpha-synuclein overexpression mediates early proinflammatory activity.</a> Neurotox. Res. 16, 238-254 (2009).</li>
<li>Jung, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+fractalkine+receptorCX%283%29CR1+function+by+targeted+deletion+and+green+fluorescent+protein+reporter+gene+insertion%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of fractalkine receptorCX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion.</a> Mol. Cell. Biol. 20, 4106-4114 (2000).</li>
<li>Imai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+molecular+characterization+of+fractalkine+receptor+CX3CR1%2C+which+mediates+both+leukocyte+migration+and+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Identification and molecular characterization of fractalkine receptor CX3CR1, which mediates both leukocyte migration and adhesion.</a> Cell. 91, 521-530 (1997).</li>
<li>Cardona, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+microglial+neurotoxicity+by+the+fractalkine+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Control of microglial neurotoxicity by the fractalkine receptor.</a> Nat. Neurosci. 9, 917-924 (2006).</li>
<li>Streit, W. J., Walter, S. A., Pennell, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+microgliosis%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Reactive microgliosis.</a> Prog. Neurobiol. 57, 563-581 (1999).</li>
<li>Frank, M. G., Wieseler-Frank, J. L., Watkins, L. R., Maier, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+isolation+of+highly+enriched+and+quiescent+microglia+from+adult+rat+hippocampus%3Aimmunophenotypic+and+functional+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid isolation of highly enriched and quiescent microglia from adult rat hippocampus:immunophenotypic and functional characteristics.</a> J. Neurosci. Methods. 151, 121-130 (2006).</li>
</ol>

Autorzy deklarują, że badanie zostało przeprowadzone przy braku jakichkolwiek powiązań handlowych lub finansowych, które mogłyby być interpretowane jako potencjalny konflikt interesów.

Obecna procedura oferuje skuteczną metodę izolacji mikrogleju korowego od nowonarodzonych myszy. Procedura ta ma dwojaką korzyść: 1) zachowanie immunofenotypu i funkcjonalności mikrogleju, określonych za pomocą obrazowania fluorescencyjnego, immunocytochemii i testu ELISA; oraz 2) umożliwienie mikrogleju dojrzewania w obecności innych komórek glejowych (astrocytów i oligodentrocytów) przed izolacją, co może ułatwić ważne interakcje komórka-komórka w okresie dojrzewania hodowli glejowej. Co ważne, wyizolowane komórki wyka...

Komórki mikrogleju, makrofagi nadzorujące miąższ OUN, stanowią około 12% całkowitej populacji komórek mózgu dorosłego ssaka. Mikroglej pochodzi z komórek prekursorowych szpiku woreczka żółtkowego i różni się gęstością i morfologią komórek w różnych regionach cytoarchitektonicznych w obrębie dorosłego OUN1-5. W zdrowym dorosłym mózgu mikroglej to małe, rozgałęzione lub polarne komórki z drobnymi, dynamicznymi procesami. W przeciwieństwie do morfologii makrofagów obwodowych, mikroglej wykazuje spokojny, niskoprofilowy fenotyp w zdrowych mózgach, który może objawiać się brakiem aktywności komórkowej; Jednak badania obrazowe in vivo pokazują, że procesy mikrogleju dynamicznie rozszerzają się i cofają, aby monitorować swoje mikrośrodowisko w sposób przypominający "pobieranie próbek i badanie"6,7.
Mikroglej bardzo i różnie reaguje na zmiany środowiskowe i patofizjologiczne w mózgu, przechodząc ze stanu inwigilacji do stanu efektorowego - powszechnie uważanego odpowiednio za ich stan spoczynku i aktywacji. Ta zmiana aktywacji może być pośredniczona przez zaangażowanie receptorów rozpoznawania wzorców związanych z błoną (PRR), takich jak receptory toll-podobne (TLR), które reagują na wzorce molekularne związane z patogenami (PAMP), a mianowicie lipoproteiny pochodzące z bakterii i wirusów, kwasy nukleinowe i węglowodany8-11. Oprócz PAMP, wykazano również, że PRR indukują aktywację mikrogleju przeciwko sterylnym, niepatogennym cząsteczkom znanym jako wzorce molekularne związane z niebezpieczeństwem/uszkodzeniem (DAMP), które reprezentują zaburzenie homeostazy OUN, takie jak uszkodzenie komórek12-16. Po zaangażowaniu PRR inicjują wewnątrzkomórkową kaskadę sygnalizacyjną, która powoduje zmiany w morfologii komórek mikrogleju i ekspresji genów; w szczególności aktywowany mikroglej adaptuje fenotyp podobny do ameboidu, translokuje podjednostkę p65 NF-κB (p65) do jądra komórkowego i zwiększa produkcję i wydzielanie cytokin prozapalnych, takich jak czynnik martwicy nowotworu-α (TNF-α), β interleukina-1 (IL-1β) wraz z reaktywnymi formami tlenu (ROS)16-24. Chociaż są integralną częścią wrodzonej odpowiedzi immunologicznej OUN, stwierdzono również, że wydzielane cząsteczki zwiększają stres oksydacyjny neuronów, wywołując i nasilając w ten sposób neurodegenerację w stanach chorobowych, takich jak choroba Parkinsona i Alzheimera25-29.
Jednak mechanizmy aktywacji mikrogleju w stanach patologicznych nie są w pełni zrozumiałe. W związku z tym izolacja mikrogleju jest potężnym narzędziem badawczym w zakresie tych procesów biologicznych, ponieważ wiele cech aktywacji mikrogleju in vivo można podsumować w hodowli. Dostępnych jest kilka metod izolowania mikrogleju, w tym izolacja za pomocą gradientu Percoll po enzymatycznym trawieniu tkanki OUN30,31. Jednak trawienie enzymatyczne może zmienić immunofenotyp komórek poprzez zmniejszenie ekspresji antygenu na powierzchni komórki32 i skutkuje niższą wydajnością komórek na zwierzę niż metoda opisana w niniejszym dokumencie. W szczególności podajemy średnią wydajność mikrogleju na korę szczeniąt wynoszącą 7,5 x 105 komórek, podczas gdy wcześniej zgłaszano metody izolacji z całego OUN za pomocą gradientu Percoll wydajność 3-5 x 105 komórek30,33,34. Obecna procedura pozwala obejść stosowanie enzymów trawiennych poprzez izolację mikrogleju na podstawie ich właściwości o niskiej przyczepności, zachowując w ten sposób immunofenotyp i funkcjonalność mikrogleju.
W niniejszym badaniu opisujemy izolację komórek mikrogleju z mieszanych kultur glejowych pochodzących z heterozygotycznych kory mysich CX3CR1-GFP (CX3CR1-GFP+/-) i C57BL/6 poprzez mechaniczne mieszanie na wytrząsarce obrotowej, co jest rozszerzeniem wcześniej opublikowanej metody24,35. Wykorzystujemy poprzedni szczep myszy do łatwej wizualizacji mikrogleju, ponieważ myszy te wyrażają GFP pod kontrolą endogennego locus Cx3Cr1 - promotora specyficznego dla monocytów36-38. Metoda ta pozwala na uzyskanie wysoce czystych kultur mikrogleju z zachowanym immunofenotypem ex vivo, o czym świadczą zmiany morfologiczne, translokacja jądrowa p65 i wydzielanie TNF-α po prowokacji lipopolisacharydem bakteryjnym (LPS) lub agonistami odpowiednio Pam3CSK4, TLR4 i TLR1/2.

<table><tbody><tr><td>Glukoza</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td>Przygotuj 20% roztwór podstawowy z wodą MilliQ; sterylizować filtr; przechowywać w temperaturze 4 & stopni; C; Okres przydatności do spożycia: 3-6 miesięcy. Używany do produkcji MCM i MGM.</td></tr><tr><td>Pirogronian sodu 100 mM (100x)</td><td>Hyclon</td><td>SH30239.01</td><td>Przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Używany do produkcji MCM i MGM.</td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna 10 000 jednostek/ml (100x)</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>Przechowywać w temperaturze -20 & st. C. Używany do produkcji MCM, MGM, MM i DM.</td></tr><tr><td>L-Glutamina 200 mM (100x)</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td>Przechowywać w temperaturze -20 & st. C. Służy do produkcji MCM i MGM.</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (zdefiniowana)</td><td>Hyklon</td><td>SH30070.03</td><td>Filtr sterylizować; przechowywać w temperaturze -20 stopni C. Używany do produkcji MCM i MGM.</td></tr><tr><td>Minimum Essential Medium Earle's (MEM)</td><td>Cellgro</td><td>15-010-CV</td><td>Bez L-glutaminy. Zawiera sole Earle'a. Używany do tworzenia MCM, MGM i DM.</td></tr><tr><td>Serum dla koni</td><td>Gibco</td><td>16050</td><td>Filtr sterylizować; przechowywać w temperaturze -20 stopni C. Używany do produkcji MCM i MGM.</td></tr><tr><td>Zrównoważony roztwór soli Hanksa (HBSS)</td><td>Cellgro</td><td>21-021-CV</td><td>Bez wapnia i magnezu. Przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Służy do produkcji MM.</td></tr><tr><td>HEPES 1 M</td><td>Gibco</td><td>15630-031</td><td>Przechowywać w 4 & st. C. Używany do produkcji MM.</td></tr><tr><td>T-75 Kolba</td><td>Corning</td><td>430641</td><td></td></tr><tr><td>4',6-diamidyn-2-fenyloindol, dilactate (DAPI)</td><td>Invitrogen</td><td>D3571</td><td>Służy do barwienia jądra komórkowego.</td></tr><tr><td>Królik anty-Iba1</td><td>Wako</td><td>019-19741</td><td>Stosowany w rozcieńczeniu 1/750 do barwienia ICC Iba1.&nbsp;</td></tr><tr><td>Królik anty-NF&kappa; B (p65)</td><td>Abcam</td><td>7970</td><td>Stosowany w rozcieńczeniu 1/1,250 do barwienia ICC dla p65.</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Kozioł anty-królik IgG (H + L)</td><td>Invitrogen</td><td>A11012</td><td>Stosowany w rozcieńczeniu 1/1,000 do wizualizacji kompleksu antygen:przeciwciało w ICC.</td></tr><tr><td>10 ml Jednorazowa pipeta serologiczna</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-11E</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Jednorazowa probówka wirówkowa</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-539-8</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Jednorazowa probówka wirówkowa</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-539-12</td><td></td></tr><tr><td>Sterylna polistyrenowa szalka Petriego</td><td>Fisher Scientific</td><td>875713</td><td>100 mm x 15 mm</td></tr><tr><td>Nożyczki: Proste Metzembaum (nożyczki #1)</td><td>Roboz Surgical</td><td>RS-6010</td><td>1; 5 cali; służy do usuwania głowy</td></tr><tr><td>Nożyczki: Vannas (nożyczki #2)</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-08</td><td>1; bez kąta; krawędź tnąca 2,5 mm; służy do otwierania skóry głowy</td></tr><tr><td>Nożyczki: Student Vannas (nożyczki #3)</td><td>Narzędzia do nauki o sztuce</td><td>91501-09</td><td>1; zakrzywiony; używany do mielenia tkanki mózgowej</td></tr><tr><td>Kleszcz: Dumont #7 (kleszcz #1)</td><td>Narzędzia do nauki pięknej</td><td>91197-00</td><td>2; służy do zabezpieczania nosa i usuwania kory&nbsp;</td></tr><tr><td>Kleszcz: Dumont #2 (kleszcz #2)</td><td>Narzędzia do nauki pięknej</td><td>11223-20</td><td>1; służy do usuwania skóry głowy</td></tr><tr><td>Kleszcz: Dumont #3 (kleszcz #3)</td><td>Narzędzia do nauki pięknej</td><td>11231-30</td><td>1; służy do usuwania czaszki</td></tr><tr><td>Kleszcz: Dumont #5a (kleszcz #4)</td><td>Narzędzia do nauki pięknej</td><td>11253-21</td><td>1; służy do usuwania opon mózgowych</td></tr><tr><td>Tabela wyposażenia specjalnego</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stereoskopowy mikroskop prosektoryjny z zoomem&nbsp;</td><td>Mikroskop Olympus</td><td>SZ4060</td><td>jest umieszczony w komorze z przepływem poziomym z przepływem laminarnym</td></tr><tr><td>Komora z przepływem poziomym</td><td>Nuaire</td><td>NU-201-330</td><td></td></tr><tr><td>Komora bezpieczeństwa biologicznego</td><td>Labconco</td><td>3440001</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator CO2 z płaszczem wodnym</td><td>VWR</td><td>97025-836</td><td>Ustawiony na 37 & stopni; C, 5% CO2</td></tr><tr><td>Wiadra wychylne</td><td>Fisher Scientific 75006441</td><td></td><td>Do stosowania z rotorem wychylnym</td></tr><tr><td>Rotor wychylny</td><td>Fisher Scientific</td><td>75006445</td><td>Maksymalny promień: 19,2 (cm)</td></tr><tr><td>Wirówka Sorvall Legend RT+ (wirówka kliniczna)</td><td>Fisher Scientific</td><td>75-004-377</td><td>Z wirnikiem wychylnym</td></tr><tr><td>Mikrowirówka AccuSpin Micro 17 ( mikrowirówka stołowa)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S98645</td><td>Z wirnikiem mikrolitrowym (24 x 1,5/2,0 ml; Kot #: 75003524)&nbsp; &nbsp;</td></tr></tbody></table>

izolacja mikrogleju korowego z zachowanym immunofenotypem i funkcjonalnością od mysich noworodków

Isolation of Cortical Microglia with Preserved Immunophenotype and Functionality From Murine Neonates

Izolacja mikrogleju z tkanki OUN jest potężnym narzędziem badawczym używanym do badania biologii mikrogleju ex vivo. Niniejsza metoda szczegółowo opisuje procedurę izolacji mikrogleju z kory mysiej noworodka poprzez mechaniczne mieszanie za pomocą wytrząsarki obrotowej. Ta metoda izolacji mikrogleju daje wysoce czysty mikroglej korowy, który wykazuje cechy morfologiczne i funkcjonalne wskazujące na spoczynkowy mikroglej w normalnych, niepatologicznych warunkach in vivo. Procedura ta zachowuje również immunofenotyp mikrogleju i funkcjonalność biochemiczną, o czym świadczy indukcja zmian morfologicznych, translokacja jądrowa podjednostki p65 NF-κB (p65) i wydzielanie charakterystycznej cytokiny prozapalnej, czynnika martwicy nowotworu-α (TNF-α), po lipopolisacharydzie (LPS) i Pam3CSK4 (Pam) wyzwania. W związku z tym obecna procedura izolacji zachowuje immunofenotyp zarówno mikrogleju w stanie spoczynku, jak i aktywowanego, zapewniając eksperymentalną metodę badania biologii mikrogleju w warunkach ex vivo.

Zachowanie immunofenotypu i funkcjonalności mikrogleju ex vivo podczas izolacji jest kluczowe, aby móc wykorzystać te komórki jako model badawczy w biologii mikrogleju. W celu wykazania skutecznego zachowania immunofunkcjonalności mikrogleju przy użyciu opisanej metody, wyizolowaliśmy mikroglej korowy z noworodków P3 (CX3CR1-GFP+/- oraz C57BL/6) i poddaliśmy kultury działaniu LPS lub Pam.
Jak pokazano na Rysunku 1A, izolacja mikrogleju poprzez agitację za p...

Jednym z kluczy do udanego badania biologii mikrogleju jest zachowanie funkcji immunologicznej mikrogleju ex vivo podczas izolacji z tkanki OUN. Wyizolowanie mikrogleju za pomocą wytrząsania obrotowego daje wysoce czyste i immunofunkcjonalne hodowle komórek, oceniane za pomocą obrazowania fluorescencyjnego, immunocytochemii i ELISA po aktywacji mikrogleju za pomocą bodźców prozapalnych lipopolisacharydu (LPS) i Pam3CSK4 (Pam).

Izolacja mikrogleju korowego z zachowanym immunofenotypem i funkcjonalnością od mysich noworodków

Isolation of microglia from CNS tissue is a powerful investigative tool used to study microglial biology ex vivo. The present method details a procedure ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest izolacja mikrogleju korowego z noworodków myszy. Jest to realizowane poprzez wstępną mikrodysekcję tkanki kory mózgowej noworodków myszy. Drugim krokiem jest hodowla mieszanych kultur komórek glejowych przez 17 do 21 dni in vitro.Następnie z tych mieszanych kultur glejowych izoluje się mikroglej. Ostatnim krokiem jest wysianie komórek mikrogleju na płytki hodowlane w celu przeprowadzenia dalszych eksperymentów. Ostatecznie zastosowano mikroskopię immunofluorescencyjną oraz test ELISA, aby wykazać, że protokół izolacji ten zachowuje immunofenotyp i funkcjonalność mikrogleju.Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ kroki SEP stosowane w mikromikrodysekcji są trudne do wykonania. Pomyślna realizacja tej procedury wymaga zarówno szybkości, jak i precyzji. Zbyt wolne tempo pracy obniży wydajność uzyskiwanych komórek, natomiast niepełne usunięcie opon mózgowych zanieczyści kulturę glejową i utrudni wzrost gleju.Rozpocznij od przygotowania pełnej pożywki dla mikrogleju, zwanej w dalszej części tekstu MCM. Przygotuj jedną kolbę na jednego szczeniaka i inkubuj je przez co najmniej jedną godzinę. Ten etap równoważenia jest niezbędny dla powodzenia procedury.Następnie należy przygotować alikwoty i schłodzić je w lodzie. Ze wszystkich wymaganych pożywek należy odmierzyć alikwoty po 6 ml MCM dla każdego szczenięcia i ogrzać je w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przed przeprowadzeniem sekcji. Stację roboczą z poziomym przepływem powietrza oraz mikroskop sekcyjny należy przetrzeć 70% etanolem.Następnie umieść w obszarze roboczym wysterylizowane narzędzia chirurgiczne niezbędne do przeprowadzenia procedury. Przygotuj sterylną szalkę z medium do sekcji do przechwycenia głowy oraz drugą szalkę do przeprowadzenia sekcji. Przelej medium do rozdrabniania do osobnej szalki w celu rozdrobnienia tkanki mózgowej.Po dekapitacji i wyjęciu mózgu, umieść świeżo wyizolowany organ pod mikroskopem stereoskopowym w celu wizualizacji struktur, dbając o to, aby strona grzbietowa była skierowana do góry i pozostawała sucha. Unieruchom mózg, wkładając końcówki pincety w miejsce styku śródmózgowia i kory. Po ustabilizowaniu preparatu całkowicie usuń oponu kory od strony grzbietowej.Następnie usuń brzuszne opony mózgowe, aby zmaksymalizować czystość i wydajność mikrogleju. Niezbędne jest całkowite usunięcie całej tkanki oponowej. Oddziel korę mózgową od pozostałej części mózgu.Należy upewnić się, że usunięto wszelkie pozostałości opon mózgowych, które mogą znajdować się po stronie brzusznej lub przyśrodkowej kory. Po usunięciu tkanki oponowej umieścić korę w wcześniej przygotowanej miseczce do rozdrabniania. Pracując w komorze z laminarnym przepływem powietrza klasy II, rozdrobić tkankę mózgową za pomocą nożyczek.Przenieś posiekaną tkankę do 15 mm probówki stożkowej. Przepłucz nożyczki oraz naczynie do siekania, używając do każdego z nich 1 ml pożywki do siekania, aby zmaksymalizować wydajność. Zbierz te wypłuczyny i przelej je do 15 ml probówki stożkowej zawierającej posiekaną tkankę.Pozostaw zawiesinę tkankową w spokoju przez jedną lub dwie minuty, aby posiekana tkanka mogła osadzić się na dnie probówki. Po tym czasie ostrożnie odessaj i odrzuć 2 ml supernatantu, dbając o to, by nie poruszyć osadu z posiekanej tkanki. Do posiekanej tkanki dodaj 3 ml uprzednio ogrzanego MCM, a następnie energicznie potrząśnij tkanką.Po zakończeniu procesu pobierania nie powinno pozostać żadnej widocznej stałej tkanki. Za pomocą tej samej końcówki pipety dodaj kolejne 3 mL MCM, aby zebrać pozostałości rozdrobnionej próbki z końcówki. Po zebraniu odwirowuj rozdrobnioną tkankę, aby uzyskać pellet komórek.Po zakończeniu przenieś zgranulowane komórki z powrotem do komory bezpieczeństwa biologicznego. Ostrożnie odlej i usuń nadsącz. Delikatnie resus.Resuspend pellet komórkowy w 2 ml ocieplonego MCM, a następnie dodaj zawiesinę komórek do wcześniej przygotowanej kolby. Inkubuj komórki przez 24 h. Po 24 h delikatnie opukaj kolbę o dłoń, aby rozbić resztki tkankowe.Sprawdzić komórki przed i po opukiwaniu, aby upewnić się, że detrytus został całkowicie usunięty. Następnie wymienić medium na świeże MCM i umieścić kolbę z powrotem w inkubatorze. Monitorować komórki codziennie w celu kontroli wzrostu i ewentualnej kontaminacji.Po około 17 do 21 dniach komórki mikrogleju będą gotowe do zbioru. Aby stwierdzić, czy komórki są gotowe, należy zbadać je pod odwróconym mikroskopem fazokontrastowym. Mikroglej jest gotowy do zbioru, gdy osiągnie około 40% konfluencji; komórki te wyglądają wówczas jak małe, jasne, sferyczne komórki rosnące w formie monowarstwy jedna na drugiej.Aby wyizolować mikroglej, należy energicznie uderzać kolbą o blat laboratoryjny. Takie wstrząsanie pomaga oddzielić mikroglej od innych komórek glejowych ze względu na niskie właściwości adhezyjne mikrogleju. Zakrętki kolb należy uszczelnić parafilmem, a zmieszane kultury glejowe rotować przez pięć godzin za pomocą nieuwilgotnianego inkubatora rotacyjnego z kontrolą temperatury.Po tym czasie należy wizualnie sprawdzić, czy mikroglej oddzielił się od powierzchni kolby. W mikroskopie fazokontrastowym w odwróceniu mikroglej widoczny jest jako jasne, sferyczne, swobodnie pływające komórki. Na dnie kolby pozostanie warstwa astrocytów i oligodendrocytów.Następnie zebrać supernatant zawierający mikroglej do sterylnej stożkowej probówki wirówkowej i odwirować. Osad mikrogleju zawiesić w ogrzanym pożywce do wzrostu mikrogleju i określić stężenie komórek za pomocą komory countingowej (hemocytometru). Komórki wysiać na płytkę 24-dołkową na plastiku lub sterylnych szkiełkach podstawkowych i inkubować przez 24 godziny.Wymień pożywkę na świeże, ciepłe MGM, aby usunąć pływające komórki i zanieczyszczenia. Krok ten jest kluczowy dla przeżycia komórek oraz utrzymania mikrogleju w stanie spoczynku; komórki mikrogleju są gotowe do eksperymentów bezpośrednio po tym etapie dokarmiania w celu oceny czystości mikrogleju. Kultury komórkowe pochodzące z mikrogleju endogennie ekspresującego GFP zabarwiono na antygen makrofagów IBA one i przeciwbarwiono dapi.W celu wizualizacji jądra komórkowego stwierdzono, że ponad 95% komórek wykazywa kolokalizację GFP IBA one i dpi. Po stymulacji komórek LPS mikroglej przeszedł wyraźną zmianę morfologiczną z fenotypu rozgałęzionego na kształt ameboidalny. Barwienie immunohistochemiczne na P 65 wykazało, że w warunkach prawidłowych P 65 jest rozproszone w całej cytoplazmie.Podczas gdy po dwugodzinnym wystawieniu na działanie Pam P 65 immunoreaktywność gwałtownie przesunęła się do jądra komórkowego, co potwierdziło, że wyizolowane mikrogleje zachowały swoją biochemiczną funkcjonalność immunologiczną. Wydzielanie cytokiny prozapalnej TNF alpha określono po wystawieniu na działanie PAM lub LPS. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak wyizolować mikroglej korowy z noworodków myszy, aby uzyskać najlepsze wyniki.Ważne jest zachowanie zasad sterylności oraz dokładne usunięcie tkanki oponowej z wypreparowanego obszaru kory.

isolation-cortical-microglia-with-preserved-immunophenotype

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Izolacja kortykalnych mikrogleju o zachowanym fenotypie immunologicznym i funkcjonalności od noworodków mysich

Izolowanie pierwotnych mikroglejów z heterogenicznej populacji komórek mózgu jest niezbędne do zbadania ich roli w warunkach fizjologicznych i patologicznych. Niniejszy protokół opisuje technikę mechanicznej izolacji i mieszanej hodowli komórkowej, która zapewnia wysoką wydajność oraz wysoką czystość żywych, pierwotnych komórek mikrogleju do badań in vitro i dalszych zastosowań.

Izolacja pierwotnych mikroglejów z mieszanych kultur komórek glejowych tkanki mózgu noworodka szczura

W tym filmie opisujemy protokół izolacji komórek CD11b, w tym mikrogleju, z mózgów młodych myszy za pomocą sortowania komórek aktywowanego magnetycznie. Tkanki mózgowe są homogenizowane w celu uzyskania zawiesin pojedynczych komórek, które są inkubowane z mikrokulkami pokrytymi przeciwciałem anty-CD11b, a następnie rozdzielane na podstawie kolumny magnetycznej w celu oczyszczenia populacji komórek CD11b +.

Izolacja magnetyczna mikrogleju z mózgów młodych myszy

Film demonstruje technikę izolowania mikrogleju z kory mózgowej dorosłej myszy. Po pierwsze, kora przechodzi segmentację i homogenizację w celu usunięcia neuronów i innych komórek glejowych, zachowując mikroglej. Następnie zawiesina komórkowa jest poddawana działaniu mikrokulek magnetycznych antymieliny i pola magnetycznego, skutecznie oddzielając komórki mikrogleju i szpiku od resztek mieliny i komórek zawierających mielinę.

Izolacja mikrogleju z kory mózgowej dorosłej myszy

Film demonstrował metodę izolowania i hodowli komórek z mózgu noworodka myszy. Polegało to na enzymatycznej i mechanicznej dysocjacji mózgu, a następnie hodowli w pożywkach wzrostowych pozbawionych neuronalnego czynnika wzrostu w celu uzyskania mieszanej populacji glejowej.

Uzyskiwanie mieszanej hodowli komórek glejowych z mózgu noworodka myszy

Przedstawiamy metody efektywnej i szybkiej izolacji/hodowli żywotnego mikrogleju z kory mózgowej noworodka i dorosłego rdzenia kręgowego.  Sekcja i posiew mikrogleju korowego może być przeprowadzona w ciągu 90 minut, a późniejsze zbieranie mikrogleju odbywa się ~ 10 dni po początkowym rozbiorze.

Hodowla mikrogleju z ośrodkowego układu nerwowego noworodków i dorosłych

Tutaj prezentujemy protokół izolacji mikrogleju od pourodzeniowych szczeniąt myszy (dzień 1) do eksperymentów in vitro. Ta improwizowana metoda izolacji zapewnia zarówno wysoką wydajność, jak i czystość, co stanowi znaczną przewagę nad alternatywnymi metodami, która pozwala na szeroki zakres eksperymentów w celu wyjaśnienia biologii mikrogleju.

Szybka i udoskonalona izolacja magnetyczna CD11b pierwotnego mikrogleju o zwiększonej czystości i wszechstronności

Wysiłki zmierzające do szczegółowego zrozumienia funkcji mikrogleju zostały utrudnione przez brak modeli hodowli mikrogleju, które podsumowują właściwości dojrzałego mikrogleju in vivo. Protokół ten opisuje podejście oparte na izolacji i hodowli, mające na celu utrzymanie solidnego przetrwania wysoce rozgałęzionego dojrzałego mikrogleju szczurów w warunkach o zdefiniowanej pożywce.

Izolacja i hodowla mikrogleju gryzoni w celu promowania dynamicznej, rozgałęzionej morfologii w pożywce wolnej od surowicy

Tutaj prezentujemy protokół izolacji in vitro wielu populacji komórek glejowych z ośrodkowego układu nerwowego myszy. Metoda ta pozwala na segregację regionalnego mikrogleju, komórek prekursorowych oligodendrocytów i astrocytów w celu zbadania fenotypów każdego z nich w różnych systemach hodowli.

Rozwarstwienie i izolacja mysiego gleju z wielu regionów ośrodkowego układu nerwowego

Pierwotne kultury mikrogleju są powszechnie używane do oceny nowych cząsteczek przeciwzapalnych. Niniejszy protokół opisuje powtarzalną i odpowiednią metodę magnetycznego izolowania mikrogleju od nowonarodzonych młodych.

Izolacja magnetyczna komórek mikrogleju od noworodków myszy do pierwotnych hodowli komórkowych

To badanie opisuje skuteczną technikę izolowania i przetwarzania tkanek dziąseł z jamy ustnej myszy w celu wytworzenia hodowli jednokomórkowej. Uzyskane w ten sposób komórki mogą być dalej wykorzystywane do analizy cytometrii przepływowej i badań molekularnych.

Izolacja, przetwarzanie i analiza mysich komórek dziąseł

Poznaj metodę izolacji mikrogleju korowego od mysich noworodków z zachowaniem immunofenotypu i funkcjonalności. Protokół obejmuje mikrochirurgiczne przygotowanie tkanek mózgowych oraz hodowlę mieszanych kultur glejowych.

Izolacja mikrogleju korowego z zachowanym immunofenotypem i funkcjonalnością od mysich noworodków

Przeglądaj więcej filmów