Monitorowanie zmian polarności błony, integralności błony i stężeń jonów wewnątrzkomórkowych w Streptococcus pneumoniae przy użyciu barwników fluorescencyjnych

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest wykorzystanie barwników fluorescencyjnych do monitorowania zmian w dynamice błon oraz wewnątrzkomórkowych stężeniach jonów w układzie bakteryjnym. Osiąga się to poprzez wstępną inkubację bakterii w fazie wzrostu z wybranym fluoforem, aż do momentu osiągnięcia stanu równowagi w obrębie ich błon. Następnie bakterie są poddawane działaniu wybranego czynnika, a ich fluorescencja jest monitorowana.

Wyniki mogą wykazać zmiany w depolaryzacji błony, integralności błony oraz wewnątrzkomórkowych stężeniach jonów na podstawie obserwowanych zmian fluorescencji barwników wskaźnikowych. Główną zaletą tej techniki w stosunku do konwencjonalnych metod elektrofizjologicznych, takich jak patch-clamping stosowany w systemach eukariotycznych, jest możliwość monitorowania dynamiki błony i wewnątrzkomórkowych stężeń jonów w bakteriach przy użyciu znaczników fluorescencyjnych. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą napotkać trudności, ponieważ optymalizacja stężeń barwników wymaga pewnego nakładu pracy.

Warunki ładowania i ustawienia detekcji. Rozpocząć od komórek bakteryjnych. Po ich zcentrygowaniu w roztworze płuczącym, w pierwszej kolejności resuspendować osad w co najmniej 1 ml PBS do stężenia 100 milionów CFU na ml, co jest ilością wystarczającą na pięć próbek. Przenieść 1 ml wypłukanych komórek do probówki do mikrocentryfugi i dodać 25 µL 1 M filtra.

Sterylny roztwór zapasu glukozy, a następnie inkubować komórki w bloku grzewczym w temperaturze 37 °C przez 15 minut. Ilość dodanej glukozy może się różnić w zależności od eksperymentu. Po 15 minutach dodać 5 µL 50 µM dieback oraz 10 µL roztworu PI.

Dokładnie wymieszaj komórki, pipetując je kilkakrotnie w górę i w dół. Następnie podziel tę zawiesinę komórkową na pięć dołków próbnych w przezroczystej płytce 96-dołkowej. Umieść płytkę w podgrzanym czytniku płytek ustawionym do detekcji NP dieback.

Następnie monitoruj równoważenie zaniku sygnału przez błony komórkowe, wykonując pomiary raz w minucie przez 30 do 40 minut, aż do momentu stabilizacji odczytów na poziomie wartości sprzed traktowania. Następnie wyjmij płytkę i dodaj wybrany czynnik eksperymentalny. Bezzwłocznie umieść płytkę z powrotem w czytniku i kontynuuj monitorowanie zaniku sygnału oraz fluorescencji PI przez wymagany czas.

Przygotowując bufor do ładowania do tej procedury, należy go krótko wymieszać w wstrząsarze Vortex przed dodaniem PBS i probenekcidu. Po dodaniu tych roztworów ponownie wymieszać w wstrząsarce Vortex i zawinąć w folię jeden mililitr dwukrotnej zawiesiny komórkowej. Dodać jeden mililitr dwukrotnego buforu do ładowania.

Jest to ilość wystarczająca dla 10 próbek. Inkubować mieszaninę w kąpieli wodnej o temperaturze 37°C przez 75 minut, chroniąc przed światłem podczas wszystkich tych analiz. Stężenie barwnika oraz czas inkubacji mogą wymagać korekty w celu optymalizacji analizy i poziomu detekcji fluorescencji bazowej, w zależności od konkretnego gatunku bakterii oraz innych zmiennych systemu eksperymentalnego.

Po inkubacji przemyj komórki trzykrotnie, wykonując każde płukanie w oddzielnym kroku. Odwiruj komórki przy 2 400 Gs przez 10 minut i resuspenduj je w dwóch mililitrach PBS zawierającego 1x pronic. Po trzech przemyciach inkubuj komórki w temperaturze 37°C przez kolejne 30 minut.

Umożliwia to estro wewnątrz bakterii hydrolizę grup estrowych barwnika, co aktywuje barwnik wewnątrz komórki. Następnie odwirować komórki, usunąć supernatant i ponownie zawiesić je w dwóch mililitrach PBS zawierającego 1x Probenecid. W razie potrzeby można teraz dodać ponownie glukozę, aby dostarczyć energii bakteriom. Należy nanieść 200 µL komórek do jednej studzienki płytki 96-dołkowej dla każdej próbki, a następnie włożyć płytkę do podgrzanego czytnika w celu pomiaru jednej próbki.

W pierwszej kolejności należy ustalić odczyt bazowy przy odpowiednich długościach fal, wykonując jeden pomiar na sekundę przez jedną minutę. Następnie należy wyjąć płytkę i dodać około 5 µL wybranej substancji do traktowania.

Szybko pipetuj roztwór w górę i w dół kilka razy, aby wymieszać odczynnik, a następnie niezwłocznie włóż płytkę z powrotem do czytnika. Kontynuuj pomiary przez wybrany czas. Aby przeanalizować dane, oblicz stosunek wartości fluorescencji dla każdego punktu czasowego, dzieląc wartość pierwszą przez wartość drugą, a następnie nanieś otrzymane wartości stosunku na wykres.

W ramach przygotowań należy sporządzić serię pięciu lub sześciu buforów o wysokim stężeniu potasu o wartościach pH od 6,5 do 8,0. Podobnie jak w poprzedniej procedurze, użyć vortexa do przygotowania dwukrotnego buforu do ładowania z zawiesiny komórkowej w średniej fazie logarytmicznej po przemyciu i skoncentrowaniu komórek. Następnie zastąpić SNAT dwiema mililitrami BS, aby uzyskać czterokrotnytą zawiesinę komórkową.

Połącz 1 mL czterokrotnej zawiesiny komórek z 1 mL dwukrotnego buforu do ładowania. Następnie inkubuj komórki w kąpieli wodnej o temperaturze 30 °C przez 40 minut. Chronić przed światłem.

Następnie przemyj komórki trzy razy. Odwiruj komórki w formie granulatu, zgodnie z wcześniej opisananą procedurą. Po trzech przemyciach dodaj z powrotem 4 mL PBS zawierającego 2x prop Benin oraz 1 mM glukozy i powtórz wirowanie.

Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez kolejne pięć minut. Aby wyznaczyć tło fluorescencji filtra, wysterylizować około 500 µL pobudzonej zawiesiny bakteryjnej w celu usunięcia bakterii. Następnie przenieść 200 µL filtratu do płytki 96-dołkowej i mierzyć absorbancję w tym dołku przez jedną minutę.

Aby uzyskać krzywą kalibracyjną in vivo, odwiruj 500 µL aliquotów załadowanych i pobudzonych komórek i resuspenduj je w serii buforów z wysoką zawartością potasu o różnych wartościach pH. Do każdej próbki dodaj 20 µM risin. Pozwala to na wyrównanie wewnątrzkomórkowego pH komórek do pH otaczającego buforu.

Następnie inkubuj próbki w temperaturze 37 °C przez pięć minut. Po inkubacji przenieś próbki do płytki 96-dołkowej w czytniku płytek. Mierz fluorescencję każdej próbki przez kilka minut, aby uzyskać odczyt pomiarowy dla każdego dołka.

Aby przeanalizować te dane, należy odjąć wartości fluorescencji tła, a następnie obliczyć stosunek wartości fluorescencji, dzieląc wartość pierwszą przez wartość drugą. Należy nanieść wartości stosunku dla każdego buforu pH na wykres, aby stworzyć krzywą kalibracyjną służącą do pomiaru zmian wewnątrzkomórkowego pH. Do płytki należy nanieść próbki 200 µL pobudzonych komórek i mierzyć fluorescencję co pięć sekund przez pięć minut.

Jednocześnie do jednej próbki należy dodać 10 µM CCCP, a do pozostałych próbek badane substancje. CCCP służy jako zsynchronizowana w czasie kontrola pozytywna dla obniżenia pH wewnątrzkomórkowego. Następnie należy bezzwłocznie umieścić płytkę z powrotem w czytniku i kontynuować pomiar fluorescencji co pięć sekund przez 10 minut.

Jako dodatkową kontrolę, dodaj 20 µM NI garrison do wszystkich próbek, aby wyrównać pH bakterii do pH buforu przez kolejne pięć minut. Podczas badania polarności błony, bakterie muszą być inkubowane z barwnikiem przez około 40 minut, aby umożliwić równowagę barwnika przez błonę. Wskazuje na to stały spadek fluorescencji, który następnie stabilizuje się na stałym poziomie.

PI nie wymaga równoważenia, ale wraz z dieback pomaga w monitorowaniu pękania błony. Równocześnie z polaryzacją, depolaryzacja i pękanie bakterii są sygnalizowane przez wzrost intensywności fluorescencji obu barwników przez mniej niż 2:00 AM, po czym obliczany jest stosunek dwóch sygnałów fluorescencyjnych, a wzrost lub spadek tego stosunku odpowiada wewnątrzkomórkowemu poziomowi wapnia. W przypadku PBFI za pomocą stosunków fluorescencji mierzy się wewnątrzkomórkowy poziom potasu.

Wewnątrzkomórkowy poziom wodoru mierzy się za pomocą stosunków fluorescencji B-C-E-C-F am. Po dodaniu jonoforu wapniowego jonomycyny wapń przepływa do wnętrza komórki, co powoduje wzrost stosunku fluorescencji. Dodanie walmynomycyny wywołuje odwrotny efekt, powodując wypływ potasu z komórki, co objawia się spadkiem stosunku fluorescencji.

Metoda B-C-E-C-F umożliwia pomiar pH wewnątrzkomórkowego; w pierwszej kolejności sporządza się krzywe kalibracyjne w różnych buforach o znanym pH. Spadek stosunku fluorescencji barwnika odpowiada spadkowi pH. Jest to widoczne po dodaniu protonoforu CCCP (linia czarna) oraz po dodaniu dyssypatora siły protonomotorycznej (linia niebieska).

Druga strzałka pokazuje dodanie nissiny, która wyrównuje wewnątrz- i zewnątrzkomórkowe stężenia wodoru. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat pomiaru depolaryzacji błony, integralności błony oraz wewnątrzkomórkowych stężeń jonów w komórkach bakteryjnych. Powinni Państwo również być w stanie wykorzystać ten protokół jako punkt wyjścia do badania innych właściwości i komórek bakteryjnych.