Monitorowanie zmian polarności błony, integralności błony i stężeń jonów wewnątrzkomórkowych w Streptococcus pneumoniae przy użyciu barwników fluorescencyjnych

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest wykorzystanie barwników fluorescencyjnych do monitorowania zmian w dynamice błony i stężeniach jonów wewnątrzkomórkowych w systemie bakteryjnym. Osiąga się to poprzez pierwszą inkubację bakterii w fazie wzrostu z interesującym ich fluorem, aż do zrównoważenia przez ich błony. Następnie bakterie są traktowane wybranym środkiem i monitorowana jest ich fluorescencja.

Wyniki mogą pokazać zmiany w depolaryzacji błony, integralności błony i stężeniach jonów wewnątrzkomórkowych w oparciu o obserwowane zmiany fluorescencji barwników wskaźnikowych. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z konwencjonalnymi technikami elektrofizjologii, takimi jak zaciskanie łat, które są stosowane w systemach eukariotycznych, jest to, że zmiany w dynamice błony i stężeniach jonów wewnątrzkomórkowych można teraz monitorować u bakterii za pomocą fluorescencji. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w tej metodzie, będą miały trudności, ponieważ optymalizacja stężeń barwnika wymaga pewnego wysiłku.

Warunki ładowania i ustawienia wykrywania Zacznij od komórek bakteryjnych. Wystarczy granulować w roztworze do mycia, najpierw ponownie zawiesić osad w co najmniej jednym mililitrze PBS na 100 milionów CFU na mililitr, co wystarcza na pięć próbek. Przenieś jeden mililitr umytych komórek do mikroprobówki wirówkowej i dodaj 25 mikrolitrów jednego filtra molowego.

Wysterylizowany roztwór podstawowy glukozy, a następnie inkubować komórki w bloku grzewczym o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut. Dodana glukoza może się różnić w zależności od eksperymentu. Po 15 minutach dodaj pięć mikrolitrów zamierania 50 mikromolów i 10 mikrolitrów roztworu PI.

Dokładnie wymieszaj komórki, pipetując je kilka razy w górę i w dół. Następnie podzielić tę zawiesinę komórek na pięć dołków na próbki z przezroczystą 96-dołkową płytką. Załaduj płytkę do czytnika płyt wstępnie rozgrzanych do wykrywania zamierania NP.

Teraz monitoruj równowagę zamierania nad błonami komórkowymi, wykonując pomiary raz na minutę przez 30 do 40 minut, aż odczyt ustabilizuje się do wartości sprzed obróbki. Następnie wysuń płytkę i dodaj wybrany czynnik doświadczalny. Natychmiast zwróć płytkę do czytnika i kontynuuj monitorowanie zamierania i fluorescencji PI przez żądany okres czasu.

Przygotowując bufor ładujący do tej procedury, należy go krótko przemieszać przed dodaniem PBS i Probenecydu. Po dodaniu tych roztworów ponownie zwiruj i zawiń w folię do jednego mililitra zawiesiny dwukomórkowej. Dodaj jeden mililitr dwóch x bufora ładującego.

To wystarczy na 10 próbek. Inkubuj mieszaninę w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 75 minut, chroniąc przed światłem Podczas wszystkich tych testów. Może być konieczne dostosowanie stężenia barwnika i czasu inkubacji w celu optymalizacji testu i wyjściowego poziomu wykrywania fluorescencji, w zależności od konkretnych gatunków bakterii i innych eksperymentalnych zmiennych systemowych.

Po inkubacji umyj komórki trzy razy na każde płukanie. Granuluj komórki w temperaturze 2 400 G przez 10 minut i ponownie zawieś je w dwóch mililitrach PBS zawierających jeden x pronic. Po trzech płukaniach inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez kolejne 30 minut.

Dzięki temu estro wewnątrz bakterii może hydrolizować grupy estrowe barwnika, dzięki czemu barwnik jest aktywny w komórce. Następnie osad komórki usuwają snat i resus zawieszają je w dwóch mililitrach PBS zawierających jeden x Probenecyd. W razie potrzeby glukozę można teraz dodać z powrotem, aby ponownie naładować bakterie, załadować 200 mikrolitrów komórek do jednego dołka z 96-dołkową płytką dla każdej próbki i załadować płytkę do podgrzewanego czytnika w jednej próbce.

Cóż, najpierw ustal odczyt linii bazowej na odpowiednich długościach fal i z szybkością jednego odczytu na sekundę przez jedną minutę. Następnie zdejmij płytkę i dodaj około pięciu mikrolitrów wybranego zabiegu. Do tego.

Cóż, szybko pipetuj kilka razy w górę i w dół, aby wymieszać z preparatem i natychmiast zwróć płytkę do czytnika. Kontynuuj wykonywanie pomiarów przez żądany czas. Aby przeanalizować dane, oblicz stosunek wartości fluorescencyjnych dla każdego punktu czasowego, dzieląc wartość, jeden przez wartość dwa, a następnie wykreśl wartości współczynnika na wykresie.

W ramach przygotowań należy utworzyć zakres pięciu lub sześciu o wysokiej zawartości potasu o wartościach pH od 6,5 do 8,0. Podobnie jak w poprzedniej procedurze, użyj wiru, aby przygotować bufor ładujący dwa x z hodowli w środkowej fazie logarytmicznej, przepłukać i zagęścić komórki. Następnie zastąp SNAT dwoma mililitrami BS Aby uzyskać zawiesinę czterokomórkową x.

Połącz jeden mililitr zawiesiny czterech x komórek z jednym mililitrem dwóch x bufora ładującego. Teraz inkubuj komórki w łaźni wodnej o temperaturze 30 stopni Celsjusza przez 40 minut. Chroń go przed światłem.

Teraz umyj komórki trzy razy. Ułóż ogniwa, jak pokazano wcześniej. Dodać z powrotem cztery mililitry PBS zawierające dwa x prop Benin i jeden milimolowy roztwór glukozy i powtórzyć wirowanie po trzech płukaniach.

Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez kolejne pięć minut. Aby określić tło filtra fluorescencyjnego, wysterylizuj około 500 mikrolitrów naenergetyzowanej zawiesiny bakteryjnej w celu usunięcia bakterii. Następnie przenieś 200 mikrolitrów filtratu na płytkę 96-dołkową i mierz absorpcję z tej studzienki przez minutę.

Aby uzyskać krzywą kalibracyjną in vivo, odkręć 500 mikrolitrów WATÓW ALI załadowanych i zasilanych ogniw i resus. Zawiesić je w szeregu o wysokiej zawartości potasu o różnym pH do każdej próbki, dodać 20 mikromoli risyny. To równoważy wewnątrzkomórkowe pH komórek z pH otaczającego buforu.

Następnie inkubować próbki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut. Po inkubacji przenieść próbki na płytkę 96-dołkową w czytniku płytek. Mierz fluorescencję każdej próbki przez kilka minut, aby ustalić odczyt badania dla każdej z nich. Studnia.

Aby przeanalizować te dane, odejmij wartości fluorescencji tła, a następnie oblicz stosunek wartości fluorescencji przez dzielenie wartości. Jeden po wartości dwa, wykreśl wartości stosunków dla każdego buforu pH, aby utworzyć krzywą kalibracyjną do pomiaru zmian wewnątrzkomórkowego pH. Załaduj 200 mikrolitrów próbek komórek pod napięciem na płytkę i mierz fluorescencję co pięć sekund przez pięć minut.

Jednocześnie dodać 10 mikromolowych CCCP do jednej próbki, dodając interesujące czynniki do pozostałych próbek. CCCP to wyrównana w czasie kontrola pozytywna w celu obniżenia wewnątrzkomórkowego pH. Natychmiast włóż płytkę z powrotem do czytnika i kontynuuj pomiar fluorescencji co pięć sekund przez 10 minut.

Jako dodatkową kontrolę, dodaj 20 mikrotrzonowców NI garnizonu do wszystkich próbek, aby zrównoważyć pH bakterii z pH buforu przez kolejne pięć minut. Podczas badania polaryzacji błony bakterie muszą być inkubowane z zagęszczeniem przez około 40 minut, aby barwnik mógł zrównoważyć się nad membraną. Wskazuje na to stały spadek fluorescencji, który się wyrównuje.

PI nie wymaga równowagi, ale wraz z zamieraniem jest pomocny w monitorowaniu pęknięcia błony. Równocześnie z polaryzacją, depolaryzacją i pękaniem bakterii wskazuje wzrost intensywności fluorescencji obu barwników przez mniej 2:00 w nocy, obliczany jest stosunek dwóch sygnałów fluorescencyjnych, a wzrost lub spadek tego stosunku odpowiada wewnątrzkomórkowemu wapniowi. W przypadku PBFI am wewnątrzkomórkowy potas mierzy się za pomocą współczynników fluorescencji.

Wodór wewnątrzkomórkowy mierzy się za pomocą współczynników fluorescencji B-C-E-C-F am. Po dodaniu jonojonu wapnia cztery jony mycyny wapń wpływa do komórki, powodując wzrost współczynnika fluorescencji. Dodanie valmy ma odwrotny skutek, powodując wypływ potasu z komórki, na co wskazuje spadek współczynnika fluorescencji.

B-C-E-C-F pozwala na pomiar wewnątrzkomórkowego pH, pierwsze krzywe kalibracyjne wykonuje się w różnych o znanym pH. Spadek współczynnika fluorescencji barwnika odpowiada spadkowi pH. Jest to widoczne z dodaniem protonu siły CCCP, czarnej linii, a po dodaniu rozpraszacza siły napędowej protonu niebieskiej linii.

Druga strzałka pokazuje dodatek nissyny, która równoważy wewnątrzkomórkowe i zewnątrzkomórkowe stężenia wodoru. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak mierzyć depolaryzację błony, integralność błony i wewnątrzkomórkowe stężenia jonów w komórkach bakteryjnych. Powinieneś być również w stanie wykorzystać ten protokół jako punkt wyjścia do badania innych właściwości i komórek bakteryjnych.