Inżynieria konstruktów tkankowych na bazie fibryny z miofibroblastów oraz zastosowanie ograniczeń i szczepów do indukowania reorganizacji komórek i kolagenu

Ogólnym celem tej procedury jest stworzenie konstruktów na bazie fibryny, które można wykorzystać do badania reorganizacji komórek i kolagenu. Osiąga się to poprzez najpierw wyizolowanie ludzkich żylnych komórek odpiszczelowych z tkanki dawcy i namnażanie ich w hodowli. Drugim krokiem jest przyklejenie pasków na rzepy do elastycznych membran.

Na dole sześciu dołków płytki, aby utworzyć kwadratową przestrzeń pośrodku, która utrzyma konstrukcję. Następnie mieszaninę komórek trombiny fibrynogenu i fluorescencyjnie znakowanych kulek dodaje się do przestrzeni między paskami na rzepy i pozostawia się do polimeryzacji w celu utworzenia żelu. Ostatnim krokiem jest kondycjonowanie komórek i indukowanie zorientowanego tworzenia matrycy poprzez zastosowanie jednoosiowego cyklicznego odkształcenia do konstruktu lub poprzez uwolnienie odkształcenia statycznego.

Poprzez przycinanie żelu fibrynowego ze słupków na rzepy w jednym kierunku. Ostatecznie można uzyskać wyniki, które opisują zmiany w reorganizacji komórek i kolagenu, monitorując konstrukty w czasie za pomocą mikroskopii konfokalnej. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie przebudowy kolagenu związane z szybkością tworzenia i reorientacji kolagenu przez różne typy komórek.

Na początek należy pozyskać ludzką tkankę dawcy z żylnej saana magna zgodnie z wytycznymi dotyczącymi wtórnego wykorzystania materiału. Następnie wyizoluj ludzkie żylne komórki odpiszczelowe lub H VSC z tkanki, postępując zgodnie z protokołem Schnella i wsp., i przechowuj je w ciekłym azocie. W razie potrzeby rozpręż komórki, umieszczając jedną fiolkę zawierającą 250 000 szybko rozmrożonych H VSC w kolbie T 75 z 15 mililitrami wstępnie podgrzanego wzrostu.

Pożywka składająca się z 440 mililitrów zaawansowanego DMEM, 50 mililitrów płodowej surowicy bydlęcej. Pięć mililitrów paciorkowca 100 X pen i pięć mililitrów 200 milimolowych L glut max. Zmieniaj pożywkę wzrostową co dwa do trzech dni przez około dwa tygodnie, aż komórki zaczną się zlewać.

Po zlaniu się zbierz i podziel komórki aż do przejścia. Dziewięć. Stosowanie trypsyny do momentu, gdy będzie odpowiednia liczba komórek do planowanego eksperymentu. Do każdego konstruktu potrzeba około 1,5 miliona komórek.

Po wyhodowaniu odpowiedniej liczby komórek zbierz je z płynnością 90% CO, a następnie zawieś komórki w pożywce wzrostowej na poziomie 15 milionów komórek na mililitr. Umieść je na lodzie, aż będą potrzebne. Przygotuj klej silikonowy, mieszając elastomer i utwardzacz w stosunku 10 do jednego.

Użyj tego kleju, aby przymocować paski o wymiarach siedem milimetrów na trzy milimetry złapane od miękkiej strony rzepu do elastycznej membrany elastycznych płytek komórkowych. Aby uformować kształt krzyża z otwartym środkiem, wysusz klej silikonowy przez noc w piekarniku w temperaturze 60 stopni Celsjusza, aby zapewnić stwardnienie kleju. Następnie wysterylizuj płytkę, dodając pięć mililitrów 70% etanolu do każdej studzienki i inkubując przez 30 minut w temperaturze pokojowej.

Przepłukać studzienki trzykrotnie sterylnym PBS. Następnie wyjmij PBS z dołków i pasków na rzepy. Umieść odkrytą płytkę pod lampą UV okapu do hodowli tkankowych na 30 minut, aby wysterylizować powierzchnie.

Po zakończeniu przykryj płytkę i utrzymuj ją w sterylnej pozycji do czasu użycia. Następnie przygotuj pożywkę do inżynierii tkankowej, dodając 130 miligramów kwasu allinowego, dwóch fosforanów do 500 mililitrów pożywki wzrostowej w ciągu pierwszych siedmiu dni hodowli. Dodaj również jeden miligram na mililitr kwasu aminokapronowego epsilon, aby zapobiec degradacji fibryny, rozpuść fibrynogen do stężenia 10 miligramów rzeczywistego białka na mililitr pożywki inżynierii tkankowej uzupełnionej kwasem aminokapronowym przez delikatne mieszanie.

Następnie sterylne. Przefiltruj roztwór fibrynogenu przez filtr strzykawkowy o średnicy 0,22 mikrona i przechowuj go na lodzie do czasu użycia. Następnie należy przygotować roztwór trombiny, rozcieńczając podstawową trombinę do końcowego stężenia 10 jednostek międzynarodowych na mililitr w pożywce inżynierii tkankowej uzupełnionej kwasem aminokapronowym i przechowywać go na lodzie do czasu użycia.

Następnie 100 mikrolitrów przygotowanej wcześniej zawiesiny komórkowej do mikroprobówki wirówkowej dla każdego konstruktu tkankowego, który zostanie wykonany. Odwirować komórki w temperaturze 350 razy G przez siedem minut, a następnie wyrzucić supernatant, ponownie zawiesić komórki w 50 mikrolitrach roztworu trombiny i dodać cztery mikrolitry, niebieskie fluorescencyjne mikrosfery polistyrenu, które mają być użyte jako wewnętrzne markery odniesienia. Następnie pobrać 50 mikrolitrów roztworu fibrynogenu do końcówki pipety.

Zwiększ objętość pipety do 100 mikrolitrów, a następnie odpipetuj 50 mikrolitrów roztworu fibrynogenu do probówki wirówkowej. Za pomocą mieszaniny trombiny i komórek delikatnie wymieszaj trombinę i fibrynogen ze sobą, pobierając mieszaninę o objętości 100 mikrolitrów, aby zapobiec tworzeniu się pęcherzyków. Po dokładnym wymieszaniu roztworu, odpipetuj mieszaninę żelu do i pomiędzy paskami na rzepy, szybko kończymy typowy czas żelowy dla żeli fibrynowych, po wymieszaniu jest rzędu 20 sekund, inkubuj konstrukcje przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza w nawilżonym inkubatorze buforowanym 5% dwutlenkiem węgla, aby umożliwić im żelowanie.

Następnie dodaj sześć mililitrów pożywki do inżynierii tkankowej z kwasem aminokapronowym do każdej studzienki i umieść płytkę z powrotem w inkubatorze. Wymieniaj nośnik co dwa do trzech dni przez pierwsze siedem dni. Po tygodniu usuń suplement kwasu aminokapronowego z pożywki i kontynuuj hodowlę żeli za pomocą pożywki do inżynierii tkankowej.

Nadal wymieniając go co dwa do trzech dni przez pierwsze pięć dni w hodowli, pozwala konstruktom zagęścić i zreorganizować się pod obciążeniem statycznym, tworząc włókna kolagenowe, dwuosiowo ze względu na ograniczenia włókien, aby wywołać reorganizację kolagenu w jednym kierunku w warunkach statycznych. Najpierw hoduj komórki przez dodatkowy tydzień w 12 dniu, odetnij konstrukcję tkanki z dwóch pasków na rzepy w jednym kierunku. Spowoduje to naprężenie w przeciwnym kierunku, gdy fibryna zagęści się.

Alternatywnie, w przypadku obciążenia cyklicznego, umieść płyty na zestawie słupków załadowczych w płycie podstawy z elastycznymi ogniwami, wyposażonej w uszczelkę w szóstym dniu, słupki załadowcze będą podtrzymywać elastyczną membranę studni i umożliwiać ściągnięcie podstawy słupków w dół, aby wytworzyć naprężenie w jednym kierunku. Następnie skonfiguruj protokół oprogramowania, aby zastosować cykliczne odkształcenie do konstrukcji. Pokazany tutaj program jest przeznaczony do przerywanego odkształcenia przypominającego falę sinusoidalną, naprężającego konstrukcję od zera do 5% naprężenia w jednym hercu przez trzy godziny, na przemian z trzema godzinami odpoczynku.

Po przygotowaniu programu włącz pompę próżniową i uruchom program. Sterownik będzie regulował siłę podciśnienia w systemie, który ściąga w dół membrany wokół słupków wsporczych, aby zastosować cykliczne naprężenia do konstrukcji zgodnie z programem. Uruchom program przez tydzień, uważając, aby wymieniać media co dwa do trzech dni po tygodniu kondycjonowania, wywołaj reorganizację kolagenu, obracając prostokątny słupek o 90 stopni, aby zmienić kierunek obciążenia przez trzy dni.

Aby zobrazować aktywną przebudowę kolagenu w czasie rzeczywistym, dodaj pomarańczowy tracker komórek. Dodaj stężenie czterech mikromolowców, aby zabarwić cytoplazmę i CNA 35 OG 4 88. Dodaj stężenie jednego mikromola, aby uwidocznić włókna kolagenowe.

Sondy te nie będą ingerować w żywotność komórek ani tworzenie kolagenu. Następnie inkubuj komórki przez godzinę w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po inkubacji wyjmij płytkę hodowlaną z inkubatora i przetransportuj ją do konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego w celu wizualizacji komórek i kolagenu.

Zrób zdjęcia żeli na powierzchni i do około 60 mikronów w rusztowaniu, aby zobaczyć zmiany w organizacji na tych poziomach w czasie. Następnie umieść płytkę z powrotem w urządzeniu do kondycjonowania mechanicznego wewnątrz inkubatora. Powtarzaj tę procedurę co kilka dni, aby śledzić postęp reorganizacji komórkowej w odpowiedzi na bodźce.

Mikrosfery fluorescencyjne dodane do mieszaniny fibrynogenu przed polimeryzacją zostają uwięzione w sieci fibryny i działają dobrze jako markery referencyjne, zapewniając wizualizację tego samego obszaru w różnych punktach czasowych podczas hodowli w warunkach statycznych i przyczepiają się do wszystkich czterech słupków. Trzy dni po przycięciu dwóch połączeń światłowodowych nie widać prawdziwej orientacji światłowodowej ani komórkowej. Jednoosiowe naprężenie spowodowane skurczem wyrównało włókna kolagenowe pokazane na zielono.

Ludzkie żylne komórki odpiszczelowe, które były cyklicznie odkształcane w jednym kierunku przez tydzień, są pokazane tutaj na powierzchni konstruktu i 60 mikronów w żelu. Gdy kierunek odkształcenia został obrócony o 90 stopni, okazało się, że odpowiedź komórkowa po trzech dniach była szybsza na powierzchni niż w rdzeniu tkanki. Po opanowaniu inżynierii, te konstrukty tkankowe oparte na FI można wykonać w ciągu około dwóch godzin.