Name: Inżynieria konstruktów tkankowych na bazie fibryny z miofibroblastów oraz zastosowanie ograniczeń i szczepów do indukowania reorganizacji komórek i kolagenu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-28T21:45:00.000+00:00
Duration: 12 min 13 s
Description: Poznaj metodę tworzenia żelowych konstruktów fibrynowych z miofibroblastami do badania reorganizacji kolagenu w czasie rzeczywistym. Technika umożliwia obserwację dynamiki komórkowej przy użyciu mikroskopii konfokalnej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie zostało przeprowadzone w ramach programu badawczego Instytutu Materiałów Biomedycznych (BMM). BMM jest współfinansowany przez holenderskie Ministerstwo Gospodarki, Rolnictwa i Innowacji. Z wdzięcznością wyrażamy wkład finansowy Nederlandse Hartstichting.

1. Hodowla komórek ludzkiej żyły sapheny
<ol>
	<li>Wyizolować komórki z żyły głębokiej saphena magna, pobrane od dawcy zgodnie z wytycznymi dotyczącymi materiału wtórnego użytku, zgodnie z protokołem Schnella i wsp.9 i przechowywać je w ciekłym azocie. Z części żyły saphena magna od jednego dawcy wyciąć kawałki 2 x 2 mm do hodowli na sześciodołkowej płytce. Użyj 2 sztuk na dołek. Ogólnie rzecz biorąc, można uzyskać wystarczającą ilość komórek, aby napełnić około 3 fiolek 0,25 x 106 komórek w ciekłym azocie. HVSC są charakteryzowane jako miofibroblasty, wykazując ekspresję wimentyny, brak ekspresji desminy i subpopulację wyrażającą aktynę mięśni gładkichα 10. Następnie uruchom protokół, aby rozmrozić komórki z ciekłego azotu, aby zwiększyć liczbę komórek.</li>
	<li>Umieścić komórki z jednej fiolki w kolbie do hodowli tkankowej T75 i dodać pożywkę wzrostową (GM), składającą się z Advanced DMEM, 50 ml płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 5 ml penicyliny/streptomycyny i 5 ml L-glutamaxu. Zmieniaj podłoże co 2-3 dni.</li>
	<li>Komórki zlewają się po około 14 dniach. Przechowywać 0,5 x 106 komórek w jednej fiolce w ciekłym azocie, określanym jako pasaż 1.</li>
</ol>
Uwaga: Zamrażanie komórek nie jest konieczne podczas zbierania HVSC, ale służy wyłącznie do przechowywania.
<ol start="4">
	<li>Umieścić HVSC z jednej fiolki w kolbie do hodowli tkankowej T175 i dodać GM. Zmieniaj pożywkę co 2-3 dni. Komórki zlewają się po około 7 dniach. Przechowywać 3 x 106 komórek w jednej fiolce w ciekłym azocie, zwanym pasażem 2.</li>
	<li>Umieść komórki z jednej fiolki w butelce rolkowej i dodaj GM. Zmieniaj podłoże co 2-3 dni. Komórki zlewają się ze sobą po około 8 dniach. Jedna butelka rolkowa zawiera około 20-30 x 106 komórek. Hodowla komórek do pasażu 6. Nie należy używać komórek o pasażu wyższym niż pasaż 9, ponieważ fenotyp komórki może ulec zmianie.</li>
</ol>
2. Inżynieria konstruktów tkankowych na bazie fibryny
<ol>
	<li>Przygotuj klej silikonowy, mieszając elastomer z utwardzaczem (10:1). Wytnij 7 x 3 mm prostokątne segmenty na rzepy. Przyklej rzep do 6-dołkowej płytki hodowlanej z elastycznymi membranami, aby utworzyć krzyż i pozostawić kwadratową przestrzeń 3 mm między paskami rzepów.</li>
</ol>
Uwagi: Używaj tylko miękkiej strony rzepu i skieruj tę stronę do góry. Podczas klejenia rzepu przykryj rzep tylko klejem silikonowym, nie rozprowadzaj kleju po całej studni. Ponieważ płytki hodowlane mają dno z membraną silikonową, użyj czegoś pod płytką studzienki, aby wzmocnić elastyczne membrany, aby zapewnić łatwe przyklejenie do płytki.
<ol start="2">
	<li>Klej silikonowy wysuszyć przez noc w piekarniku w temperaturze 60 °C, aby zapewnić utwardzenie kleju. Sterylizować, dodając 70% EtOH do studzienek i inkubować przez 30 minut. Przepłucz 3x PBS i usuń cały PBS z dołków i rzepów. Umieść pod wpływem promieniowania UV na 30 minut i utrzymuj sterylność do momentu użycia.</li>
	<li>Przygotowanie pożywki do inżynierii tkankowej (TM), składającej się z GMO i 130 mg 2-fosforanu L-askorbinowego.</li>
	<li>Dodać 1 mg/ml kwasu ε-aminokapronowego (ACA) do TM. ACA stosuje się przez pierwsze 7 dni posiewu, aby zapobiec degradacji fibryny11. Alternatywnie można zastosować aprotyninę.</li>
	<li>Aby zapobiec tworzeniu się grudek, przed otwarciem pozwól fibrynogenowi osiągnąć temperaturę pokojową. Bez grudek fibrynogen łatwiej się rozpuści. Rozpuść fibrynogen do stężenia 10 mg rzeczywistego białka/ml TM7 uzupełnionego ACA. Sterylny filtr roztwór fibrynogenu, może być potrzebnych wiele filtrów. Przechowywać na lodzie do czasu użycia.</li>
</ol>
Uwaga: Aby delikatnie rozpuścić fibrynogen, aby zapobiec tworzeniu się zbyt dużej ilości piany.
<ol start="6">
	<li>Rozpuścić trombinę do stężenia 10 j.m./ml TM7 uzupełnioną ACA. Przechowywać na lodzie do czasu użycia.</li>
</ol>
Uwaga: Przechowywanie na lodzie jest konieczne, aby zapobiec wczesnemu żelowaniu trombiny i fibrynogenu.
<ol start="7">
	<li>Trypsynizuj komórki, ponownie zamieszaj w GM i policz.</li>
	<li>Użyj 15 x 106 komórek/ml do wysiewu konstruktów tkankowych na bazie fibryny (stężenie oparte na metodach inżynierii tkankowej zastawek serca7). Pojedynczy żel składa się ze 100 μl żelu, a więc z 1,5 x 106 komórek. Umieść 1,5 x 106 komórek w jednej probówce wirówkowej, co daje tyle probówek wirówkowych, ile żeli zostanie wyprodukowanych.</li>
	<li>Odwirować komórki przy 350 x g przez 7 minut i odrzucić supernatant. Zawiesić komórki w 50 μl trombiny. Do tej zawiesiny dodać 4 μl niebieskich fluorescencyjnych mikrosfer polistyrenowych. Umieść 50 μl fibrynogenu w fiolce. Za pomocą pipety pobrać 50 μl trombiny wraz z komórkami. Zwiększyć objętość pipety do 100 μl. Odpipetować 50 μl roztworu trombiny z komórkami do fiolki z fibrynogenem w celu wymieszania trombiny i fibrynogenu, a następnie pobrać mieszaninę 100 μl.</li>
</ol>
Uwaga: Fluorescencyjne mikrosfery polistyrenowe są używane jako wewnętrzne znaczniki referencyjne do analizy obrazu. Podczas mieszania trombiny i fibrynogenu należy zapobiegać tworzeniu się pęcherzyków powietrza, ostrożnie pipetując mieszaninę. Pęcherzyki powietrza spowodują w żelu fibryny.
<ol start="10">
	<li>Odpipetować mieszaninę żelu do pasków na rzepy i pomiędzy nimi. Typowy czas żelowania żeli fibrynowych, po wymieszaniu składników, wynosi około 20 sekund.</li>
</ol>
Uwagi: Zrób to tak szybko, jak to możliwe, aby zapobiec żelowaniu zanim mieszanina zostanie odpipetowana do płytki studzienki. Poćwicz przed użyciem komórek i koralików.
<ol start="11">
	<li>Inkubować zawiesiny przez 30 minut w temperaturze 37 °C w nawilżonym inkubatorze o stężeniu 95% powietrza/5% CO2 , aby umożliwić żelowanie przed dodaniem kultury TM z ACA.</li>
	<li>Wymieniaj TM na ACA co 2-3 dni przez pierwsze 7 dni. Żele są na tyle stabilne po tygodniu, że można je hodować bez ACA. Po pierwszym tygodniu wymieniaj TM co 2-3 dni. Dodać 6 ml TM na studzienkę. W 12 dniu komórki wyprodukowały wystarczającą ilość kolagenu do wizualizacji.</li>
</ol>
3. Stosowanie szczepu i wywoływanie zmian w obciążeniu i ograniczeniach
<ol>
	<li>Odkształcenie statyczne jest wywierane bezpośrednio przez komórki, ze względu na ciągnięcie i zagęszczenie komórek12. Aby wywołać reorganizację kolagenu, odetnij konstrukcję tkanki luźno z dwóch pasków rzepów w jednym kierunku. Powoduje to powstania wiązań jednokierunkowych (rysunek 1A). Wykonaj to w 12 dniu, ponieważ konstrukt jest wtedy wystarczająco stabilny, a kolagen został zdeponowany.</li>
	<li>Zastosować cykliczne odkształcanie poprzez zastosowanie próżni na dnie płytek hodowlanych z elastycznymi membranami, za pomocą systemu FX4000T Flexcell. Umieść tabliczki na płycie podstawy, na słupkach załadowczych (które są częścią cyklicznego urządzenia załadowczego). Pompa wywiera podciśnienie na membranę i w ten sposób przeciąga membranę nad prostokątnym słupkiem leżącym pod spodem. Ze względu na krzyżowe mocowania konstruktów tkankowych do membrany (za pomocą rzepu) i prostokątnego słupka, zastosowane cykliczne odkształcenie jest jednoosiowe (ryc. 1B).</li>
	<li>Początkowo należy stosować hodowlę statyczną przez 5 dni, aby osiągnąć początkową integralność mechaniczną, przed zastosowaniem cyklicznego szczepu rozpoczynającego się w 6 dniu. Zaprogramuj protokół cyklicznego barwienia w sterowniku pompy próżniowej. Na przykład należy użyć wcześniej ustalonego protokołu przerywanego cyklicznego odkształcania z jednoosiowym kierunkiem13. Składa się z przerywanego odkształcenia fali sinusoidalnej o częstotliwości 1 Hz, naprężającej się od 0 do 5% odkształcenia, przez okresy 3 godzin, na przemian z 3-godzinnymi okresami spoczynku. Wykonuj ten cykliczny protokół szczepu przez 7 dni, indukując wyrównaną organizację kolagenu.</li>
	<li>Zazwyczaj po 12 dniach HVSC wytwarzają wyrównaną organizację kolagenu. Po osiągnięciu wyrównanej organizacji kolagenu zmień jednoosiowy kierunek cyklicznego odkształcenia, aby był prostopadły do pierwotnego kierunku odkształcenia. W tym celu należy obrócić prostokątne słupki o 90°.</li>
</ol>
4. Wizualizacja komórek i kolagenu
<ol>
	<li>Aby zobrazować aktywną przebudowę kolagenu w czasie rzeczywistym, oznacz próbki sondami, które nie zakłócają żywotności komórek ani tworzenia kolagenu. Użyj sond do fluorescencyjnego barwienia cytoplazmy komórki i kolagenu.</li>
	<li>Alternatywnie można zastosować generowanie drugiej harmonicznej za pomocą konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej do wizualizacji struktur kolagenowych za pomocą autofluorescencji14, ze wzbudzeniem przy 780 nm i detekcją w zakresie 500-550 nm.</li>
	<li>Wyjmij płytki hodowlane z zestawu i inkubatora dla cyklicznie napiętych próbek podczas 3-godzinnego okresu odpoczynku i przetransportuj je do konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego w celu wizualizacji komórek i kolagenu.</li>
</ol>

<ol><li>Beamish, J. A., He, P., Kottke-Marchant, K., Marchant, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+regulation+of+contractile+smooth+muscle+cell+phenotype%3A+implications+for+vascular+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+B+Rev%22%5BJournal%5D)">Molecular regulation of contractile smooth muscle cell phenotype: implications for vascular tissue engineering.</a> Tissue Eng. Part B Rev. 16, 467-491 (2010).</li>
<li>Isenberg, B. C., Tranquillo, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+cyclic+distention+enhances+the+mechanical+properties+of+collagen-based+media-equivalents%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Long-term cyclic distention enhances the mechanical properties of collagen-based media-equivalents.</a> Ann. Biomed. Eng. 31, 937-949 (2003).</li>
<li>Nichol, J. W., Khan, A. R., Birbach, M., Gaynor, J. W., Gooch, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemodynamics+and+axial+strain+additively+increase+matrix+remodeling+and+MMP-9%2C+but+not+MMP-2%2C+expression+in+arteries+engineered+by+directed+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Hemodynamics and axial strain additively increase matrix remodeling and MMP-9, but not MMP-2, expression in arteries engineered by directed remodeling.</a> Tissue Eng. Part A. 15, 1281-1290 (2009).</li>
<li>Sander, E. A., Stylianopoulos, T., Tranquillo, R. T., Barocas, V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image-based+multiscale+modeling+predicts+tissue-level+and+network-level+fiber+reorganization+in+stretched+cell-compacted+collagen+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Image-based multiscale modeling predicts tissue-level and network-level fiber reorganization in stretched cell-compacted collagen gels.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 17675-17680 (2009).</li>
<li>Hu, J. J., Humphrey, J. D., Yeh, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+engineered+tissue+development+under+biaxial+stretch+using+nonlinear+optical+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Characterization of engineered tissue development under biaxial stretch using nonlinear optical microscopy.</a> Tissue Eng. Part A. 15, 1553-1564 (2009).</li>
<li>Lee, E. J., Holmes, J. W., Costa, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remodeling+of+engineered+tissue+anisotropy+in+response+to+altered+loading+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Remodeling of engineered tissue anisotropy in response to altered loading conditions.</a> Ann. Biomed. Eng. 36, 1322-1334 (2008).</li>
<li>Mol, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrin+as+a+cell+carrier+in+cardiovascular+tissue+engineering+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Fibrin as a cell carrier in cardiovascular tissue engineering applications.</a> Biomaterials. 26, 3113-3121 (2005).</li>
<li>de Jonge, N., Kanters, F. M., Baaijens, F. P., Bouten, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strain-induced+Collagen+Organization+at+the+Micro-level+in+Fibrin-based+Engineered+Tissue+Constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Strain-induced Collagen Organization at the Micro-level in Fibrin-based Engineered Tissue Constructs.</a> Ann. Biomed. Eng. 41 (4), 763-774 (2012).</li>
<li>Schnell, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+cell+source+for+cardiovascular+tissue+engineering%3A+venous+vs.+aortic+human+myofibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Thorac.+Cardiovasc.+Surg%22%5BJournal%5D)">Optimal cell source for cardiovascular tissue engineering: venous vs. aortic human myofibroblasts.</a> Thorac. Cardiovasc. Surg. 49, 221-225 (2001).</li>
<li>Mol, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+human+tissue-engineered+heart+valves%3A+prospects+for+systemic+application%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Autologous human tissue-engineered heart valves: prospects for systemic application.</a> Circulation. , I152-I158 (2006).</li>
<li>Ahmann, K. A., Weinbaum, J. S., Johnson, S. L., Tranquillo, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrin+degradation+enhances+vascular+smooth+muscle+cell+proliferation+and+matrix+deposition+in+fibrin-based+tissue+constructs+fabricated+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Fibrin degradation enhances vascular smooth muscle cell proliferation and matrix deposition in fibrin-based tissue constructs fabricated in vitro.</a> Tissue Eng. Part A. 16, 3261-3270 (2010).</li>
<li>John, J., Quinlan, A. T., Silvestri, C., Billiar, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Boundary+stiffness+regulates+fibroblast+behavior+in+collagen+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Boundary stiffness regulates fibroblast behavior in collagen gels.</a> Ann. Biomed. Eng. 38, 658-673 (2010).</li>
<li>Rubbens, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intermittent+straining+accelerates+the+development+of+tissue+properties+in+engineered+heart+valve+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Intermittent straining accelerates the development of tissue properties in engineered heart valve tissue.</a> Tissue Eng. Part A. 15, 999-1008 (2009).</li>
<li>Chen, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiphoton+imaging+and+quantitative+analysis+of+collagen+production+by+chondrogenic+human+mesenchymal+stem+cells+cultured+in+chitosan+scaffold%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+C+Methods%22%5BJournal%5D)">Multiphoton imaging and quantitative analysis of collagen production by chondrogenic human mesenchymal stem cells cultured in chitosan scaffold.</a> Tissue Eng. Part C Methods. 16, 913-920 (2010).</li>
<li>de Jonge, N., Kanters, F. M., Baaijens, F. P., Bouten, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strain-induced+Collagen+Organization+at+the+Micro-level+in+Fibrin-based+Engineered+Tissue+Constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Strain-induced Collagen Organization at the Micro-level in Fibrin-based Engineered Tissue Constructs.</a> Ann. Biomed. Eng. 41, 763-774 (2013).</li>
<li>Merryman, W. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+between+heart+valve+interstitial+cell+stiffness+and+transvalvular+pressure%3A+implications+for+collagen+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Correlation between heart valve interstitial cell stiffness and transvalvular pressure: implications for collagen synthesis.</a> Am. J. Physiol. 290, (2006).</li>
<li>Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+cellular+mechanotransduction+to+biologically+inspired+engineering%3A+2009+Pritzker+Award+Lecture%2C+BMES+Annual+Meeting+October+10%2C+2009%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">From cellular mechanotransduction to biologically inspired engineering: 2009 Pritzker Award Lecture, BMES Annual Meeting October 10, 2009.</a> Ann. Biomed. Eng. 38, 1148-1161 (2009).</li>
<li>Sander, E. A., Barocas, V. H., Tranquillo, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+fiber+alignment+pattern+alters+extracellular+matrix+synthesis+in+fibroblast-populated+fibrin+gel+cruciforms+and+correlates+with+predicted+tension%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Initial fiber alignment pattern alters extracellular matrix synthesis in fibroblast-populated fibrin gel cruciforms and correlates with predicted tension.</a> Ann. Biomed. Eng. 39, 714-729 (2010).</li>
<li>van der Schaft, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+Skeletal+Muscle+Tissues+from+Murine+Myoblast+Progenitor+Cells+and+Application+of+Electrical+Stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Engineering Skeletal Muscle Tissues from Murine Myoblast Progenitor Cells and Application of Electrical Stimulation.</a> J. Vis. Exp. (73), e4267(2013).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Opisany system modelowy konstruktów fibrynowych wypełnionych komórkami ma ogromny potencjał do badania (re)organizacji komórek i kolagenu (de Jonge i wsp.15), np. do wykorzystania do celów inżynierii tkankowej. Używając fibryny jako początkowego nośnika komórkowego, po degradacji fibryny powstaje tkanka składająca się tylko z komórek i macierzy endogennej. W ten sposób komórki są stymulowane do reagowania na odkształcenie, o charakterze statycznym lub cyklicznym, poprzez zastosowanie sił kurc...

Tkanki sercowo-naczyniowe pełnią znaczącą funkcję nośną. W szczególności zawartość i organizacja włókien kolagenowych w macierzy zewnątrzkomórkowej przyczynia się do właściwości nośnych i dominuje w ogólnej wytrzymałości tkanek1. W inżynierii tkankowej stosuje się mechaniczne kondycjonowanie konstruktu - zwykle składające się z (cyklicznych) schematów naprężania - w celu poprawy organizacji tkanek i właściwości mechanicznych2,3. Nie osiągnięto jeszcze pełnego zrozumienia indukowanej przez szczep organizacji kolagenu w złożonych geometriach tkanek w celu stworzenia tkanek o predefiniowanej architekturze kolagenu. Wynika to głównie z naszej ograniczonej wiedzy na temat przebudowy kolagenu w rozwijających się tkankach. Istniejące modele dostarczają głównie informacji o końcowym wyniku netto przebudowy kolagenu przy użyciu szczepu statycznego4-6. W tym przypadku dostarczamy wysoce przestrajalny system modelowy, który pozwala na badanie (re)organizacji kolagenu w czasie rzeczywistym, w 3D, pod wpływem naprężeń statycznych lub cyklicznych. Konstrukty tkankowe są oparte na fibrynie, dzięki czemu cały kolagen w konstrukcie jest endogenny. Organizacja komórek i kolagenu w konstruktach jest wizualizowana, a wewnętrzny system odniesienia pozwala nam na przemieszczanie komórek i struktur kolagenowych w celu analizy poklatkowej. W tym protokole opiszemy zastosowanie systemu modelowego dla ludzkich komórek Vena Saphena (HVSC), ponieważ komórki te są znane ze zwiększonej produkcji macierzy zewnątrzkomórkowej i zdolności do przebudowy macierzy oraz naszego ustalonego zastosowania w zmodyfikowanych tkankach sercowo-naczyniowych7, w oparciu o pracę de Jonge i wsp.8

<table><tbody><tr><td>Plastik hodowlany</td><td>Greiner</td><td></td><td>Zawiera kolby hodowlane i pipety</td></tr><tr><td>Zaawansowany DMEM</td><td>Gibco</td><td>12491</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Greiner</td><td>758075</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/streptomycyna</td><td>Gibco</td><td>10378016</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax</td><td>Gibco</td><td>35050-079</td><td></td></tr><tr><td>Elastomer i utwardzacz</td><td>Dow Corning Corporation</td><td>3097358-1004</td><td>Silastic MDX 4-4210#</td></tr><tr><td>Velcro</td><td>Regularny sklep</td><td></td><td>Możesz to kupić w zwykłym sklepie, używaj tylko miękkiej strony</td></tr><tr><td>Płytki hodowlane Bioflex</td><td>Flexcell Int</td><td>BF-3001U</td><td>Nieleczony</td></tr><tr><td>kwas L-askorbinowy 2-fosfataza</td><td>Sigma</td><td>A8960</td><td></td></tr><tr><td>&epsilon;-Kwas aminokapronowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D7754</td><td></td></tr><tr><td>Trombina bydlęca</td><td>Sigma</td><td>T4648</td><td></td></tr><tr><td>Fibrynogen bydlęcy</td><td>Sigma</td><td>F8630</td><td></td></tr><tr><td>0,45 filtr strzykawkowy</td><td>Whatmann (Schleicher i Scheul)</td><td>10462100</td><td></td></tr><tr><td>Mikrosfery polistyrenowe</td><td>Invitrogen</td><td>F-8829</td><td>Niebieska fluorescencyjna, 10 &mu; m średnica</td></tr><tr><td>Flexcell FX-4000T</td><td>Flexcell Int</td><td></td><td>Zawiera prostokątne słupki załadowcze</td></tr><tr><td>Cell Tracker Orange</td><td>Invitrogen Sondy molekularne</td><td>C2927</td><td></td></tr><tr><td>CNA35-OG488</td><td></td><td></td><td>Serdecznie dostarczane przez Laboratorium Chemii Makromolekularnej i Organicznej, Wydział Inżynierii Biomedycznej, Uniwersytet Techniczny w Eindhoven</td></tr><tr><td>Konfokalny laserowy mikroskop skaningowy</td><td>Laserowy mikroskop skaningowy Carl Zeiss</td><td></td><td>LSM 510 Meta i tryb Two-Photon-LSM</td></tr><tr><td>Amfoterycyna</td><td>Gibco</td><td>15290-018</td><td>Potrzebny do izolacji komórek</td></tr></tbody></table>

inżynieria konstruktów tkankowych na bazie fibryny z miofibroblastów oraz zastosowanie ograniczeń i szczepów do indukowania reorganizacji komórek i kolagenu

Engineering Fibrin-based Tissue Constructs from Myofibroblasts and Application of Constraints and Strain to Induce Cell and Collagen Reorganization

Na zawartość kolagenu i organizację w rozwoju tkanek kolagenowych mogą mieć wpływ lokalne szczepy tkanek i ograniczenia tkankowe. Inżynierowie tkankowi dążą do wykorzystania tych zasad do tworzenia tkanek o predefiniowanych architekturach kolagenu. Brakuje jednak pełnego zrozumienia dokładnych procesów leżących u podstaw przebudowy kolagenu w celu kontrolowania końcowej architektury tkanki. W szczególności niewiele wiadomo na temat (re)orientacji włókien kolagenowych w odpowiedzi na zmiany warunków obciążenia mechanicznego tkanek. Opracowaliśmy system modelowy in vitro, składający się z dwuosiowo ograniczonych konstruktów fibrynowych z nasionami miofibroblastów, aby dokładniej wyjaśnić (re)orientację kolagenu w odpowiedzi na i) powrót dwuosiowych do jednoosiowych warunków obciążenia statycznego oraz ii) cykliczne jednoosiowe obciążenie konstrukcji ograniczonych dwuosiowo przed i po zmianie kierunku obciążenia, za pomocą urządzenia ładującego Flexcell FX4000T. Poklatkowe obrazowanie konfokalne służy do wizualizacji (re)orientacji kolagenu w sposób nieniszczący.
Organizacja komórek i kolagenu w konstruktach może być wizualizowana w czasie rzeczywistym, a wewnętrzny system odniesienia pozwala nam na przenoszenie komórek i struktur kolagenowych do analizy poklatkowej. Można dostosować różne aspekty systemu modelowego, takie jak źródło komórek lub wykorzystanie komórek zdrowych i chorych. Dodatki mogą być stosowane do dalszego wyjaśniania mechanizmów leżących u podstaw przebudowy kolagenu, na przykład poprzez dodawanie MMP lub blokowanie integryn. Kształt i rozmiar konstruktu można łatwo dostosować do konkretnych potrzeb, co skutkuje wysoce przestrajalnym systemem modelowym do badania (re)organizacji komórek i kolagenu.

Ten system modelowy umożliwia hodowlę żeli fibrynowych zasianych myofibroblastami. Rysunek 1A przedstawia tkankę hodowaną początkowo w warunkach statycznego ograniczenia dwuosiowego. Ograniczenia tkanki są zwalniane poprzez odcięcie żelu fibrynowego od dwóch punktów mocowania, co tworzy statyczne ograniczenie jednowymiarowe, po czym następuje kompakcja i przebudowa tkanki (Rysunek 1A). W przypadku odkształcenia cyklicznego tkanka jest również hodowana w warunkach statycznego ograniczenia...

Ten system modelowy zaczyna się od wypełnionego miofibroblastami żelu fibrynowego, który może być używany do badania endogennej kolagenu (re)organizacji w czasie rzeczywistym w sposób nieniszczący. System modelowy jest bardzo przestrajalny, ponieważ może być używany z różnymi źródłami komórek, dodatkami do pożywek i może być łatwo dostosowany do konkretnych potrzeb.

Inżynieria konstruktów tkankowych na bazie fibryny z miofibroblastów oraz zastosowanie ograniczeń i szczepów do indukowania reorganizacji komórek i kolagenu

Collagen content and organization in developing collagenous tissues can be influenced by local tissue strains and tissue constraint. Tissue engineers aim ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest stworzenie konstruktów opartych na fibrynie, które mogą być wykorzystane do badania reorganizacji komórek i kolagenu. Jest to realizowane poprzez wstępną izolację ludzkich komórek żylnych z żyły odpiszczelnej z tkanki dawcy oraz ich namnażanie w hodowli. Drugim krokiem jest przyklejenie pasków rzepów do elastycznych membran.Na dnie płytek sześciodołkowych tworzy się kwadratową przestrzeń w centrum, w której zostanie umieszczony konstrukt. Następnie w przestrzeń między paskami rzepów dodaje się mieszaninę fibrynogenu, trombiny, komórek i znakowanych fluorescencyjnie kulek, po czym pozwala się jej spolimeryzować w celu utworzenia żelu. Ostatnim krokiem jest kondycjonowanie komórek i indukowanie zorientowanego tworzenia macierzy poprzez przyłożenie do konstruktu jednowymiarowego odkształcenia cyklicznego lub poprzez zwolnienie odkształcenia statycznego.Poprzez przycinanie żelu fibrynowego z wypustek rzepowych w jednym kierunku można w efekcie uzyskać wyniki opisujące zmiany w reorganizacji komórkowej i kolagenowej poprzez monitorowanie konstruktów w czasie za pomocą mikroskopii konfokalnej. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie przebudowy kolagenu, odnoszące się do szybkości tworzenia i reorientacji kolagenu przez różne typy komórek.Na początek należy pozyskać tkankę od dawcy ludzkiego z żyły saphena magna zgodnie z wytycznymi dotyczącymi wtórnego wykorzystania materiału. Następnie należy wyizolować ludzkie komórki żylnej żyły saphne lub H VSCs z tkanki, postępując zgodnie z protokołem opracowanym przez Schnell i wsp., a następnie przechowywać je w ciekłym azocie. W razie potrzeby należy namnożyć komórki, przenosząc jedną fiolkę zawierającą 250 000 szybko rozmrożonych H VSCs do kolby T 75 z 15 mililitrami podgrzanego medium wzrostowego.Pożywka składająca się z 440 mililitrów advanced DMEM, 50 mililitrów płodowej surowicy bydlęcej, 5 mililitrów 100 X pen strep oraz 5 mililitrów 200 milimolar L glut max. Wymieniać pożywkę wzrostową co dwa do trzech dni przez około dwa tygodnie, aż do uzyskania konfluencji komórek.Po osiągnięciu konfluencji zebrać i przesiać komórki do dziewiątego pasażu, wykorzystując trypsynę aż do uzyskania odpowiedniej liczby komórek dla planowanego eksperymentu. Dla każdego konstruktu wymagane jest około 1,5 miliona komórek.Po wyhodowaniu odpowiedniej liczby komórek, należy je zebrać przy 90% konfluencji, a następnie zawiesić w pożywce wzrostowej w stężeniu 15 milionów komórek na mililitr. Przechowywać je na lodzie do momentu użycia. Przygotować klej silikonowy, mieszając elastomer i utwardzacz w stosunku 10:1.Użyj tego kleju, aby przymocować paski o wymiarach 7 mm na 3 mm, wycięte z miękkiej strony rzepa, do elastycznej membrany płytek flex cell. Aby utworzyć kształt krzyża z otwartym środkiem, wysusz klej silikonowy przez noc w piecu w temperaturze 60°C, aby zapewnić jego utwardzenie. Następnie wysterylizuj płytkę, dodając 5 mL 70% etanolu do każdego dołka i inkubując przez 30 minut w temperaturze pokojowej.Przepłucz dołki trzy razy sterylnym PBS. Następnie usuń PBS z dołków oraz z pasków rzepowych. Umieść nieprzykrytą płytkę pod lampą UV w komorze do hodowli tkanek na 30 minut w celu sterylizacji powierzchni.Po zakończeniu przykryj płytkę i przechowuj ją w warunkach sterylnych do momentu użycia. Następnie przygotuj pożywkę do inżynierii tkankowej, dodając 130 mg kwasu allikowego oraz dwa fosforany do 500 mL pożywki wzrostowej podczas pierwszych siedmiu dni hodowli. Dodaj również 1 mg/mL kwasu epsilon-aminokapronowego, aby zapobiec degradacji fibryny, a następnie poprzez delikatne mieszanie rozpuść fibrynogen do stężenia 10 mg białka w 1 mL pożywki do inżynierii tkankowej uzupełnionej kwasem aminokapronowym.Następnie przefiltruj sterylnie roztwór fibrynogenu przez filtr strzykawkowy o rozmiarze 0,22 mikrona i przechowuj go w lodzie do momentu użycia. Następnie przygotuj roztwór trombiny, rozcieńczając roztwór zapasowy trombiny do końcowego stężenia 10 jednostek międzynarodowych na mililitr w medium do inżynierii tkankowej z dodatkiem kwasu aminokapronowego i przechowuj go w lodzie do momentu użycia.Następnie przenieś 100 µL wcześniej przygotowanej zawiesiny komórkowej do probówki do mikrocentryfugi dla każdego konstruktu tkankowego, który zostanie wykonany. Odwiruj komórki przy 350 ×g przez siedem minut, a następnie odlej naddatek, resuspenduj komórki w 50 µL roztworu trombiny i dodaj 4 µL niebieskich fluorescencyjnych mikroküreczek polistyrenowych, które będą służyć jako wewnętrzne markery referencyjne. Następnie pobierz 50 µL roztworu fibrynogenu do końcówki pipety.Zwiększ objętość pipety do 100 µL, a następnie przeniesienie 50 µL roztworu fibrinogenu do probówki wirówkowej. W przypadku mieszaniny trombiny i komórek, delikatnie wymieszaj trombinę z fibrinogenem, pobierając 100 µL mieszaniny, aby zapobiec powstawaniu pęcherzyków powietrza. Po dokładnym wymieszaniu roztworu, szybko nanieś mieszaninę żelową na paski rzepowe i pomiędzy nie, ponieważ typowy czas żelowania żeli fibrynowych po wymieszaniu wynosi około 20 sekund. Inkubuj konstrukty przez 30 minut w temperaturze 37 °C w inkubatorze z nawilżeniem i buforowaną atmosferą 5% CO2, aby umożliwić ich żelowanie.Następnie do każdej studzienki dodaj sześć mililitrów pożywki do inżynierii tkankowej z kwasem aminokapronowym i umieść płytkę z powrotem w inkubatorze. Wymieniaj pożywkę co dwa lub trzy dni przez pierwsze siedem dni. Po tygodniu usuń dodatek kwasu aminokapronowego z pożywki i kontynuuj hodowlę żeli w pożywce do inżynierii tkankowej.Kontynuując wymianę pożywki co dwa do trzech dni przez pierwsze pięć dni hodowli, należy pozwolić konstruktom na zagęszczenie i reorganizację pod wpływem statycznego naprężenia, co prowadzi do formowania włókien kolagenowych w dwóch osiach ze względu na ograniczenia włókien; ma to na celu indukcję reorganizacji kolagenu w jednym kierunku w warunkach statycznych. Najpierw hodować komórki przez dodatkowy tydzień; w 12. dniu odciąć konstrukt tkankowy od dwóch pasków rzepów w jednym kierunku. Spowoduje to powstanie naprężenia w przeciwnym kierunku w miarę zagęszczania się fibryny.Alternatywnie, w przypadku obciążania cyklicznego, w szóstym dniu należy umieścić płytki na zestawie słupków obciążających w podstawie komory fleksyjnej wyposażonej w uszczelkę; słupki obciążające będą podtrzymywać elastyczną membranę studni i pozwolą na pociągnięcie podstawy słupków w dół, aby wywołać odkształcenie w jednym kierunku. Następnie należy skonfigurować protokół oprogramowania w celu zastosowania cyklicznego odkształcenia do konstruktu. Przedstawiony tutaj program służy do przerywanego odkształcania przypominającego falę sinusoidalną, polegającego na odkształceniu konstruktu od 0 do 5% strain z częstotliwością 1 Hz przez okresy trzech godzin, przeplatane trzema godzinami odpoczynku.Po przygotowaniu programu włącz pompę próżniową i uruchom program. Sterownik będzie regulować siłę próżni w systemie, co spowoduje dociśnięcie membran wokół słupków wsporczych, aby przyłożyć cykliczne odkształcenie do konstruktów zgodnie z programem. Uruchom program na jeden tydzień, pamiętając o wymianie pożywki co dwa do trzech dni; po tygodniu kondycjonowania zindukuj reorganizację kolagenu, obracając prostokątny słupek o 90 stopni, aby zmienić kierunek odkształcenia na trzy dni.Aby zwizualizować aktywny remodeling kolagenu w czasie rzeczywistym, należy dodać barwnik CellTracker Orange. Dodaj go w stężeniu 4 µM w celu zabarwienia cytoplazmy oraz CNA 35 OG 4 88. Dodaj go w stężeniu 1 µM, aby zwizualizować włókna kolagenowe.Sondy te nie będą wpływać na żywotność komórek ani tworzenie kolagenu. Następnie inkubować komórki przez jedną godzinę w inkubatorze w temperaturze 37 °C. Po inkubacji wyjąć płytkę hodowlaną z inkubatora i przenieść ją do konfokalnego skaningowego mikroskopu laserowego w celu wizualizacji komórek i kolagenu.Wykonaj obrazy żeli na powierzchni oraz do głębokości około 60 mikronów wewnątrz rusztowania, aby zaobserwować zmiany w organizacji na tych poziomach w czasie. Następnie umieść płytkę z powrotem w układzie do kondycjonowania mechanicznego wewnątrz inkubatora. Powtarzaj tę procedurę co kilka dni, aby monitorować postępy reorganizacji komórkowej w odpowiedzi na bodźce.Fluorescencyjne mikrosfery dodane do mieszaniny fibrynogenu przed polimeryzacją zostają uwięzione w sieci fibrynowej i służą jako markery referencyjne, zapewniając wizualizację tego samego obszaru w różnych punktach czasowych podczas hodowli w warunkach statycznych i przylegania do wszystkich czterech słupków. Po trzech dniach od przycięcia dwóch połączeń słupków z włóknami nie można zaobserwować rzeczywistej orientacji włókien ani komórek. Jednowymiarowe odkształcenie spowodowane skurczem doprowadziło do wyrównania włókien kolagenowych zaznaczonych na zielono.Przedstawiono ludzkie komórki żyłyy sapyrennej, które były poddawane cyklicznemu rozciąganiu w jednym kierunku przez tydzień, ukazane na powierzchni konstruktu oraz w głębokości 60 µm w żelu. Po obróceniu kierunku rozciągania o 90 stopni stwierdzono, że odpowiedź komórkowa po trzech dniach była szybsza na powierzchni niż w rdzeniu tkanki. Po opanowaniu techniki, przygotowanie tych konstruktów tkankowych opartych na FI zajmuje około dwóch godzin.

engineering-fibrin-based-tissue-constructs-from-myofibroblasts

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Inżynieria konstrukcji tkankowych opartych na fibrynie z myofibroblastów oraz zastosowanie ograniczeń i odkształceń w celu wywołania reorganizacji komórek i kolagenu

W niniejszej pracy przedstawiamy sposób wytwarzania konstruktów tkankowych na bazie kolagenu zawierających mioblasty szkieletowe. Te trójwymiarowe konstrukty inżynieryjne mogą być wykorzystywane do zastępowania lub naprawy tkanek in vivo. Na potrzeby naszych badań zaprojektowaliśmy je jako przekaźnik elektryczny przedsionkowo-komorowy do leczenia całkowitego bloku serca[1].

Wytwarzanie inżynieryjnych konstruktów tkanki mięśniowej

Opisujemy izolację kardiomiocytów noworodkowych oraz przygotowanie komórek do enkapsulacji w konstrukcjach z hydrożelu fibrynowego na potrzeby inżynierii tkankowej. Przedstawiamy metody analizy zmodyfikowanego w sposób tkankowo-inżynieryjny mięśnia sercowego po okresie hodowli, w tym pomiar aktywnej siły generowanej podczas stymulacji elektrycznej, ocenę żywotności komórek oraz barwienie immunohistologiczne.

Enkapsulacja kardiomiocytów w hydrożelu fibrynowym w inżynierii tkanki serca

Niniejszy protokół koncentruje się na wykorzystaniu naturalnej zdolności komórek macierzystych do reagowania na sygnały z otaczającej je macierzy zewnątrzkomórkowej i indukowania ich różnicowania w wiele fenotypów. Niniejszy artykuł metodologiczny rozszerza nasz opis i charakterystykę modelu wykorzystującego dwuwarstwowy hydrożel, składający się z PEG-fibryny i kolagenu, do jednoczesnego współróżnicowania mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej1.

Projektowanie dwuwarstwowego hydrożelu w celu kontrolowania różnicowania ASC

Techniki mikroskopii poklatkowej i przetwarzania obrazów zostały użyte do obserwacji i analizy zagęszczenia żelu za pośrednictwem fibroblastów i wyrównania włókien fibryny w bioreaktorze kontrolowanym przez środowisko przez okres 48 godzin.

Obserwacja i ilościowe określanie zagęszczenia fibryny w żelu za pośrednictwem fibroblastów

W tej pracy prezentujemy technikę szybkiego wytwarzania żywych tkanek naczyniowych poprzez bezpośrednią hodowlę kolagenu, komórek mięśni gładkich i komórek śródbłonka. Ponadto opisano nowy protokół charakterystyki mechanicznej zmodyfikowanych tkanek naczyniowych.

Inżynieria 3D cellularnych żeli kolagenowych do regeneracji tkanki naczyniowej

Prezentujemy model tkanki więzadła, w którym trójwymiarowe konstrukty są traktowane ludzką surowicą kondycjonowaną wysilaniem i analizowane pod kątem zawartości kolagenu, funkcji i biochemii komórkowej.

Leczenie konstruktów więzadeł surowicą kondycjonowaną wysiłkowo: translacyjny model inżynierii tkankowej

Celem tego protokołu jest przeprowadzenie dynamicznej ko-hodowli ludzkich makrofagów i miofibroblastów w rurowych rusztowaniach elektroprzędzonych w celu zbadania regeneracji tkanek sterowanej materiałem, przy użyciu bioreaktora, który umożliwia oddzielenie naprężeń ścinających od cyklicznego rozciągania.

Bioreaktor z wieloma wskazówkami do oceny zdolności zapalnej i regeneracyjnej biomateriałów poddanych przepływowi i rozciąganiu

Ten artykuł przedstawia strategię budowania modeli elementów skończonych z włóknistych materiałów przewodzących wystawionych na działanie pola elektrycznego (EF). Modele te można wykorzystać do oszacowania wkładu elektrycznego, jaki otrzymują komórki zasiane w takich materiałach, oraz do oceny wpływu zmiany właściwości, struktury lub orientacji materiału składowego rusztowania.

Modelowanie metodą elementów skończonych w komórkowym mikrośrodowisku elektrycznym

Prezentowany tutaj jest protokół generowania zmodyfikowanych tkanek łącznych do równoległej hodowli 48 tkanek na wielodołkowej płytce z podwójnymi biegunami, odpowiedni do badań mechanistycznych, modelowania chorób i badań przesiewowych. Protokół jest zgodny z fibroblastami z różnych narządów i gatunków, a jego przykładem są tutaj pierwotne fibroblasty serca ludzkiego.

Tkanka łączna pochodząca z fibroblastów pochodząca od człowieka do zastosowań przesiewowych

Poniższy protokół przedstawia metodę wytłaczania opartą na ścinaniu do produkcji hydrożeli kolagenowych z nanoskalowymi wzorzystymi włókienkami, które mogą być stosowane w szerokim zakresie zastosowań inżynierii tkankowej.

Produkcja kolagenu o wzorzystym kształcie nanofibrylarnym dla inżynierii tkankowej

Przedstawiono powtarzalną metodę generowania 3D tkanek mięśnia sercowego, łączących rusztowania polikaprolaktonu (PCL) i hydrożele fibrynowe pochodzące z hiPSC. Technika ta zapewnia precyzyjną kontrolę nad architekturą rusztowania i może być stosowana w przedklinicznych testach leków i modelowaniu chorób serca.

Generowanie 3D ludzkiej tkanki mięśnia sercowego przy użyciu elektroprzędzenia stopionego zapisu rusztowań polikaprolaktonowych i komórek serca pochodzących z hiPSC

Poznaj metodę tworzenia żelowych konstruktów fibrynowych z miofibroblastami do badania reorganizacji kolagenu w czasie rzeczywistym. Technika umożliwia obserwację dynamiki komórkowej przy użyciu mikroskopii konfokalnej.

Inżynieria konstruktów tkankowych na bazie fibryny z miofibroblastów oraz zastosowanie ograniczeń i szczepów do indukowania reorganizacji komórek i kolagenu (Wideo) | JoVE Journal

Inżynieria konstruktów tkankowych na bazie fibryny z miofibroblastów oraz zastosowanie ograniczeń i szczepów do indukowania reorganizacji komórek i kolagenu

Przeglądaj więcej filmów