Przygotowanie hydrożeli hydroksy-PAAm do rozprzęgania efektów sygnałów mechanotransdukcji

Ogólnym celem niniejszej procedury jest opracowanie prostej i wydajnej strategii immobilizacji dowolnego białka docelowego na hydrożelach poliakrylamidowych, aby umożliwić niezależną kontrolę różnych parametrów mikrośrodowiska komórkowego. Osiąga się to poprzez wstępne rozprowadzenie roztworu białka na powierzchni stempla z PDMS. Drugim krokiem jest ostrożne osuszenie ustrukturyzowanej powierzchni stempla z PDMS za pomocą stałego strumienia wysokiej czystości azotu.

Następnie stempel pokryty białkiem przykłada się ustrukturyzowaną powierzchnią do wysuszonej powierzchni hydrożelu, a na górną część stempla PDMS wywiera się krótkotrwały nacisk, aby zapewnić dobry kontakt między mikrostrukturami stempla a powierzchnią hydrożelu; ostatnim krokiem jest delikatne usunięcie stempla PDMS z powierzchni hydrożelu oraz oczyszczenie stempla w strefach niedrukowanych. Dzięki BSA komórki mogą zostać osadzone na mikrowzorowanej powierzchni hydrożelu. Ostatecznie do obserwacji mikrostruktur białkowych wykorzystuje się odwrócony mikroskop fluorescencyjny.

Ta metoda może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie mechanotransdukcji, takie jak względny wkład właściwości macierzy zewnątrzkomórkowej, na przykład sztywności, gęstości ligandów komórkowych lub natury białek. W procesie anotransdukcji zaleca się, aby procedurę tę przeprowadzać w dygestorium chemicznym. Należy rozpocząć od umieszczenia szkiełek podstawkowych o średnicy 25 mm w szalce Petriego i pokrycia ich 0,1 M roztworem wodorotlenku sodu na pięć minut.

Usunąć roztwór wodorotlenku sodu i całkowicie zanurzyć szkiełka nakrywkowe w sterylnej wodzie DD H2O, a następnie delikatnie kołysać przez 20 minut na platformie kołyszącej; odlać sterylną wodę DD H2O, dolać nowej sterylnej wody DD H2O, aby całkowicie zanurzyć szkiełka nakrywkowe i ponownie delikatnie kołysać przez kolejne 20 minut. Wyjąć szkiełka nakrywkowe sterylną pęsetą i umieścić je w nowej szalce Petriego. Ustawiając stronę aktywowaną do góry, osuszyć szkiełka nakrywkowe stałym strumieniem wysoko czystego azotu gazowego.

Po wyschnięciu szkiełek podstawkowych należy przenieść je z powrotem do sterylnej komory z laminarnym przepływem powietrza i nanieść cienką warstwę 3-trimetylopropylakrylanu na aktywowaną stronę każdego szkiełka. Pozostawić na jedną godzinę. Po upływie godziny szkiełka podstawkowe dokładnie wypłukać sterylną wodą DD H2O.

Następnie zanurz szkiełka podstawowe w sterylnej wodzie DD H2O w nowej szalce Petriego. Uszczelnij szalkę Petriego folią parafilm i umieść ją na platformie kołyszącej pod łagodnym wytrząsaniem przez 10 minut. Na koniec, używając sterylnej pęsety z cienkimi końcówkami, przenieś szkiełka podstawowe z DD H2O do nowej szalki Petriego.

Ustawioną stroną aktywną do góry. Przykryć szalkę folią aluminiową, aby zapobiec osadzaniu się kurzu na szkiełkach nakrywkowych, i przechowywać w temperaturze pokojowej w suchym miejscu. Aby rozpocząć tę procedurę, przygotować 5 mL sterylnego roztworu hydrożelu hydroksylowej poliakryloamidu oraz 100 µL świeżego 10% roztworu wodorosiarczanu amonu.

Zgodnie z opisem w tekście protokołu, do roztworu hydrożelu z hydroksylowanej poliakrylamidu należy dodać 2,5 µL tetrametyleno-diaminy oraz 25 µL roztworu nadtlenianu amonu. Aby zainicjować polimeryzację, należy wymieszać roztwór poprzez trzykrotne pipetowanie w warunkach sterylnych pod dygestorium, dbając o to, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza. Następnie należy nanieść kroplę 25 µL roztworu hydrożelu z hydroksylowanej poliakrylamidu na kolisty szkiełko podstawowe o średnicy 25 mm i natychmiast przykryć ją kolistym szkiełkiem nakrywkowym o średnicy 22 mm, aby rozgnieść roztwór hydrożelu z hydroksylowanej poliakrylamidu. Szkiełko nakrywkowe o średnicy 22 mm zostało wcześniej aktywowane poprzez siedmiominutową ekspozycję w czyszczarce UV-ozonowej.

Wycentruj szkiełko podstawowe za pomocą sterylnej pęsety i wygładź wszelkie pęcherzyki powietrza. Pozostaw hydrożel z hydroksylo poliakryloamidu do polimeryzacji w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Ręcznie odwróć probówkę z pozostałym roztworem hydrożelu z hydroksylo poliakryloamidu.

Aby monitorować zakończenie procesu polimeryzacji, całkowicie zanurz szkiełka podstawowe w sterylnym D DH two o. Ostrożnie oddziel 22 milimetrowe szkiełko podstawowe, wsuwając krawędź żyletki pomiędzy 22 milimetrowe szkiełko podstawowe a warstwę hydrożelu hydroksypoliakryloamidowego. Przemyj hydrożel hydroksypoliakryloamidowy trzykrotnie sterylnym PBS i pozostaw żel całkowicie zanurzony w sterylnym PBS w celu utrzymania nawodnienia.

Mikrostempli z polidimetylosiloksanu (PDMS) użyte w tej procedurze wykonano zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Umieść mikrostemple PDMS w roztworze etanolu i wody w stosunku 50:50 i poddaj sonikacji przez 15 minut. Osusz stemple strumieniem azotu i umieść je wzorem do góry w oczyszczaczu UV-ozonowym na siedem minut.

Pod wyciągiem sterylnym nanieś kroplę 150 µL wybranego roztworu białka na mikrostrukturyzowaną powierzchnię A-P-D-M-S. W tym pokazie wykorzystano stempel FI nin. Rozprowadź roztwór białka po powierzchni stempla, przesuwając go sterylną końcówką pipety w stronę każdego z narożników stempla.

Pozostaw roztwór białka do absorpcji na stemplu PDMS przez 60 minut. Wewnątrz tego jałowego dygestorium wyłącz lampy, aby uniknąć uszkodzenia białek. Następnie przenieś szkiełka podstawowe pokryte hydrożelem z poliakryloamidu hydroksylowego do nowej szalki Petriego.

Usunąć nadmiar PBS z powierzchni podłoży z hydrożelu poliakrylamidowego z grupami hydroksylowymi za pomocą strumienia azotu w warunkach sterylnych. Przerwać procedurę, gdy tylko na powierzchni żelu nie będzie już widocznych kropli wody.

Żel nie powinien zostać całkowicie wysuszony na tym etapie. Ostrożnie osusz ustrukturyzowaną powierzchnię stempla PDMS za pomocą stałego strumienia gazu azotowego o wysokiej czystości. Chwyć stempel pokryty białkiem pęsetą opatrunkową i dociśnij jego ustrukturyzowaną powierzchnię do wysuszonej powierzchni hydrożelu.

Krótkotrwale dociśnij końcówką pęsety górną powierzchnię stempla PDMS, aby zapewnić dobry kontakt między mikrostrukturami stempla a powierzchnią hydrożelu, a następnie pozostaw stempel PDMS na powierzchni hydrożelu na jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Ostrożnie usuń stempel PDMS z hydrożelu poliakryloamidowego za pomocą pęsety chirurgicznej i oczyść stempel, mocząc go w roztworze etanolu i wody przez 15 minut. Hydrożel poliakryloamidowy po stemplowaniu przemyj dokładnie za pomocą trzech wymian PBS w warunkach sterylnych, poświęcając 10 minut na każdą wymianę.

Po ostatnim przemyciu w PBS, dodać sterylny roztwór BSA i inkubować przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza przy łagodnym mieszaniu na platformie kołyszącej. Pozwoli to na zablokowanie stref nieodtrukowanych następnego dnia. Odtrukowany hydrożel z poliakryloamidu hydroksylowanego przemyć dokładnie, stosując trzykrotną wymianę PBS w warunkach sterylnych przez 10 minut na każdą wymianę.

Stemplowane hydrożele z hydroksy-poliakryloamidu można przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsius za okres do jednego tygodnia. Wyniki wykazują liniową korelację między ewolucją sztywności hydrożeli z hydroksy-poliakryloamidu a ilością sieciowania bis-akryloamidu. Obrazy epi-fluorescencyjne laminowanych prostokątnych mikro-wzorów naniesionych na hydrożele z hydroksy-poliakryloamidu o trzech różnych sztywnościach demonstrują niezależne dostrajanie geometrii mikro-wzorów i sztywności macierzy. Gęstość ligandów komórkowych może być modulowana poprzez zmianę stężenia roztworu białka użytego do inkubacji stempli z PDMS.

Przedstawiono tutaj dwa obrazy fluorescencyjne z sekwencyjnego mikrodruku kontaktowego. Pasy fibronektyny w kolorze czerwonym i lamininy w kolorze zielonym, przecinające się pod kątem 90 stopni, oraz pasy fibryny, lamininy i kolagenu nadrukowane sekwencyjnie na podłożu z hydrożelu hydroksylowego poliakryloamidu o module 25 kilo pascal. Po wysianiu komórek pierwotnych na homogenicznie pokryte i mikrowzorowane powierzchnie hydrożelu hydroksylowego poliakryloamidu, żywotność komórek wynosiła co najmniej 80% do trzech dni po wysianiu.

Zaobserwowano również, że komórki proliferują intensywniej na podłożach sztywnych w porównaniu do podłoży miękkich. Po wysianiu na prostokątne mikro-wzory powlekane fibronektyną, naniesione na hydrożele z hydroksy-poliakryloamidu o trzech różnych stopniach sztywności, pierwotne komórki śródbłonka wykazują niską gęstość włókien aktynowych oraz zaokrąglone jądro na podłożu miękkim.

Na sztywniejszych podłożach włókna aktynowe są prostsze i grubsze, a jądro komórkowe ulega deformacji po jego rozwoju. Technika ta utorowała drogę badaczom z dziedziny transdukcji mechanicznej do zbadania indywidualnej roli parametrów mikrośrodowiska komórkowego w szerokim zakresie systemów komórkowych, takich jak komórki pierwotne lub macierzyste, poziom tkankowy, organizmy modelowe, formy, demografia lub układy narządowe.