Przygotowanie hydrożeli hydroksy-PAAm do rozprzęgania efektów sygnałów mechanotransdukcji

Ogólnym celem tej procedury jest opracowanie prostej i skutecznej strategii immobilizacji dowolnego białka będącego przedmiotem zainteresowania na hydrożelach poliakrylamidowych w celu niezależnej kontroli różnych parametrów mikrośrodowiska komórki. Osiąga się to poprzez uprzednie rozprowadzenie roztworu białkowego na powierzchni stempla PDMS. Drugim krokiem jest dokładne osuszenie strukturalnej powierzchni stempla PDMS przy stałym przepływie azotu o wysokiej czystości.

Następnie stempel pokryty białkiem umieszcza się ze strukturalną powierzchnią stykającą się z wysuszoną powierzchnią hydrożelu, a na wierzchu stempla PDMS nakładane są krótkie punkty nacisku, aby zapewnić dobry kontakt między mikrocechami stempla a powierzchnią hydrożelu, ostatnim krokiem jest delikatne usunięcie stempla PDMS z powierzchni hydrożelu i oczyszczenie stempla po usunięciu stref niedrukowanych. Dzięki BSA komórki mogą być osadzone na powierzchni hydrożelu o mikrowzorze. Ostatecznie do obserwacji mikrocech białek stosuje się odwrócony mikroskop fluorescencyjny.

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie transdukcji mechano, takie jak względny udział właściwości macierzy zewnątrzkomórkowej, na przykład sztywności, gęstości ligonów komórkowych lub charakteru białek. W procesie transakcji ano zaleca się, aby procedura ta była wykonywana w dygestoriach chemicznych. Zacznij od umieszczenia okrągłych szkiełek nakrywkowych o średnicy 25 milimetrów na szalce Petriego i rozsmarowania na nich 0,1 molowego roztworu wodorotlenku sodu przez pięć minut.

Usuń roztwór wodorotlenku sodu i całkowicie zanurz szkiełka nakrywkowe w sterylnym DD H2O, delikatnie kołysz przez 20 minut na kołyszącej się płycie, odcedź sterylny DDH dwa O dodaj więcej sterylnego DDH dwa O, aby całkowicie zanurzyć szkiełka nakrywkowe i delikatnie kołysz przez kolejne 20 minut. Usuń szkiełka nakrywkowe sterylną pęsetą i umieść je na nowej szalce Petriego. Gdy aktywowaną stroną skierowaną do góry wysusza się pokrywa szkiełkuje ze stałym przepływem azotu o wysokiej czystości.

Gdy szkiełka nakrywkowe wyschną, zabierz je z powrotem do sterylnego kaptura hodowlanego i rozsmaruj cienką warstwę trzech trimetylopropylowych akrl po aktywowanej stronie każdej okładki. Poślizgnij się na godzinę po jednej godzinie. Dokładnie umyj szkiełka szklanej pokrywy sterylnym DD H2O.

Następnie zanurz szkiełka nakrywkowe w sterylnym DD H2O na nowej szalce Petriego. Uszczelnij szalkę Petriego folią par i umieść ją na kołyszącej się płycie pod delikatnym mieszaniem na 10 minut. Na koniec użyj sterylnej pęsety z cienkimi końcówkami, aby przenieść szkiełka nakrywkowe z DDH 2 O na nową szalkę Petriego.

Z aktywowaną stroną zadrukowaną do góry. Przykryj naczynie folią aluminiową, aby uniknąć przywierania kurzu do szkiełek nakrywkowych i przechowuj w temperaturze pokojowej w suchym miejscu. Aby rozpocząć tę procedurę, przygotuj pięć mililitrów sterylnego roztworu hydrożelu hydroksylowego z poliakryloamidu i 100 mikrolitrów świeżego 10% roztworu amonu na siarczan.

Zgodnie z opisem w tekście protokołu, do roztworu hydrożelu hydroksylowego poliakryloamidu dodać 2,5 mikrolitra tetrametylenodiaminy i 25 mikrolitrów roztworu amonu na siarczan. Aby rozpocząć polimeryzację, wymieszać roztwór przez trzy kolejne pipetowania bez wprowadzania pęcherzyków w sterylnych warunkach pod sterylnym kapturem, umieścić 25 mikrolitrów kropli roztworu hydrożelu z hydrożelu z hydroksylu poliakryloamidu na 25-milimetrowym okrągłym szkiełku nakrywkowym i natychmiast umieścić 22-milimetrowe okrągłe szklane szkiełko nakrywkowe na wierzchu kropli, aby wycisnąć roztwór hydrożelu hydroksylowego z poliakryloamidu. Szkiełko nakrywkowe o grubości 22 mm zostało wcześniej aktywowane przez siedmiominutową ekspozycję w środku czyszczącym UV ozone.

Wyśrodkuj szklane szkiełko nakrywkowe sterylną pęsetą i wygładź wszelkie pęcherzyki. Pozostawić hydrożel hydroksylowy z poliakryloamidu do polimeryzacji w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Odwróć ręcznie pozostały roztwór hydrożelu z poliakryloamidu w probówce.

Aby po zakończeniu procesu polimeryzacji całkowicie zanurzyć szkiełka nakrywkowe w sterylnym D DH dwa o. Ostrożnie oddziel 22-milimetrowe szklane szkiełko nakrywkowe, wkładając krawędź żyletki między 22-milimetrowe szklane szkiełko nakrywkowe a warstwę hydrożelu z hydroksylu poliakrylamidowego. Umyj hydrożel hydroksylowo-poliakrylamidowy trzykrotnie sterylnym PBS i pozostaw żel całkowicie zanurzony w sterylnym PBS, aby utrzymać nawilżenie.

Mikrostemple polidimetylosoanu lub PDMS użyte w tej procedurze zostały wyprodukowane zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Umieść mikro stemple PDMS w roztworze wodnym o stężeniu od 50 do 50 etanolu i sonikuj przez 15 minut. Wysuszyć stemple parą strumienia azotu i umieścić je w urządzeniu do czyszczenia ozonem UV na siedem minut.

Pod sterylnym kapturem umieść 150 mikrolitrową kroplę pożądanego roztworu białkowego na mikrostrukturalnej powierzchni A-P-D-M-S. W tej demonstracji użyto pieczęci FI nin. Rozprowadź roztwór białka na powierzchni stempla, przesuwając go sterylną końcówką pipety w kierunku każdego rogu stempla.

Pozostaw roztwór białkowy do wchłonięcia na stemplu PDMS na 60 minut. Pod tym sterylnym kapturem wyłącz lampy, aby uniknąć uszkodzenia białka. Następnie przenieś pokrywę pokrytą hydrożelem z hydroksylanu poliakryloamidu do nowej szalki Petriego.

Usunąć nadmiar PBS z powierzchni substratów hydrożelowych z hydroksylu poliakryloamidu za pomocą strumienia o niskiej zawartości azotu w sterylnych warunkach. Zatrzymaj procedurę. Gdy tylko nie zaobserwuje się śladów stojącej wody na powierzchni żelu.

Na tym etapie żelu nie należy dokładnie suszyć. Ostrożnie osusz strukturalną powierzchnię stempla PDMS stałym strumieniem azotu o wysokiej czystości. Chwyć stempel pokryty białkiem za pomocą kleszczyków do tkanek opatrunkowych i umieść strukturalną powierzchnię w kontakcie z wysuszoną powierzchnią hydrożelu.

Zastosuj krótkie punkty nacisku końcówką pęsety na górze stempla PDMS, aby zapewnić dobry kontakt między mikroelementami stempla a powierzchnią hydrożelu, po godzinie pozostaw stempel PDMS na powierzchni hydrożelu na godzinę w temperaturze pokojowej. Delikatnie usuń stempel PDMS z hydrożelu hydroksylowego z poliakryloamidu za pomocą kleszczyków do opatrunków i wyczyść stempel, cudzołóc w roztworze wodnym etanolu przez 15 minut. Umyć tłoczony hydrożel hydroksylowo-poliakrylamidowy dokładnie przez trzy wymiany PBS w sterylnych warunkach przez 10 minut na wymianę.

Po ostatnim płukaniu PBS dodać sterylny roztwór BSA i inkubować przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza pod delikatnym mieszaniem na kołyszącej się płycie. To zje strefy niezadrukowane następnego dnia. Umyć tłoczony hydrożel hydroksylowo-poliakrylamidowy dokładnie przez trzy wymiany PBS w sterylnych warunkach przez 10 minut na wymianę.

Tłoczone hydrożele hydroksylowo-poliakrylamidowe można przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez okres do jednego tygodnia. Wyniki wskazują na liniową korelację między ewolucją sztywności hydrożeli z poliakryloamidu a ilością fluorescencyjnych obrazów epi z usieciowaniem bis akryloamidu prostokątnych mikrowzorów osadzonych na hydroksylowym poliakrylamidze Hydrożele o trzech różnych sztywnościach wykazują niezależne dostrojenie geometrii mikrowzoru i sztywności matrycy. Gęstość ligandów komórkowych można modulować poprzez zmianę stężenia roztworu białkowego używanego do inkubacji znaczników PDMS.

Pokazane są tutaj dwa obrazy fluorescencyjne z sekwencyjnych odcisków mikrokontaktowych. Paski fibronektyny w kolorze czerwonym i lamininy w kolorze zielonym, skrzyżowane pod kątem 90 stopni, a paski fibryny i kolagenu mikro drukowane sekwencyjnie na podłożu hydrożelowym o maskale 25 kg paskalowo-hydroksylowym poliakrylamidowym. Gdy komórki pierwotne zostały posiane na jednorodnie pokrytych powierzchniach hydrożelowych z poliakryloamidu o mikrowzorze, żywotność komórek wynosiła co najmniej 80% do trzech dni po posiewaniu.

Zaobserwowano również, że komórki namnażają się bardziej na sztywnych podłożach w porównaniu z miękkimi podłożami. Po posianiu na prostokątnych mikrowzorach pokrytych fibronektyną osadzonych na hydrożelach hydroksylowych z poliakryloamidu o trzech różnych sztywnościach. Pierwotne komórki śródbłonka wykazują niską gęstość włókien aktynowych i zaokrąglone jądro na miękko.

Podłoża na sztywniejszych podłożach, włókna aktyny są prostsze i grubsze, a jądro ulega deformacji po jego rozwinięciu. Technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się transdukcją mechaniczną do zbadania indywidualnej roli parametrów mikrośrodowisk komórkowych w szerokim zakresie systemów komórkowych, takich jak komórki pierwotne lub macierzyste, poziom tkanki, organizm modelowy, moda, systemy demograficzne lub narządy.