Name: Przygotowanie hydrożeli hydroksy-PAAm do rozprzęgania efektów sygnałów mechanotransdukcji (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: Poznaj metodę przygotowania hydrożeli hydroksy-PAAm do badania mechanotransdukcji komórkowej. Technika umożliwia precyzyjną kontrolę mikrośrodowiska i niezależne sterowanie sztywnością matrycy oraz gęstością ligandów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była wspierana przez Belgijską Narodową Fundację Badań Naukowych (F.R.S.-FNRS) poprzez granty "MIS Confocal Microscopy", "Crédit aux Chercheurs" oraz "Nanomotorility FRFC project" (nr 2.4622.11). Stypendium doktoranckie T.G. jest wspierane przez Foundation for Training in Industrial and Agricultural Research (FRIA). Autorzy dziękują Sylvainowi Desprezowi za charakterystykę mechaniczną i Géraldine Circelli za obrazowanie konfokalne.

1. Aktywacja powierzchni szklanych szkiełek nakrywkowych
<ol>
	<li>Umieścić szklane okrągłe szkiełka nakrywkowe (o średnicy 25 mm) na szalce Petriego i rozsmarować na niej 0,1 M roztwór NaOH przez 5 minut (zalecany wyciąg chemiczny).</li>
	<li>Usuń roztwór NaOH i całkowicie zanurz szkiełka nakrywkowe w sterylnym ddH2O na 20 minut, delikatnie kołysząc na kołyszącej się płytce w sterylnym kapturze hodowlanym.</li>
	<li>Odcedzić sterylny ddH2O i powtórzyć krok 1.2.</li>
	<li>Usuń szkiełka nakrywkowe sterylną pęsetą i umieść je na nowej szalce Petriego aktywowaną stroną zadrukowaną do góry.</li>
	<li>Suche szkiełka nakrywkowe przy stałym przepływie azotu o wysokiej czystości.</li>
	<li>W sterylnym kapturze hodowlanym rozsmarować cienką warstwę akrylanu 3-(trimetoksysililo)propylu (92%) po aktywowanej stronie szkiełka nakrywkowego przez 1 godzinę.</li>
	<li>Szkiełka nakrywkowe należy dokładnie umyć 3 popłuczynami sterylnego ddH2O i zanurzyć je w sterylnym ddH2O na nowej szalce Petriego.</li>
	<li>Postukaj w szalkę Petriego Parafilmem i umieść ją na talerzu kołyskowym pod delikatnym mieszaniem przez 10 minut.</li>
	<li>Usunąć szkiełka nakrywkowe z ddH2O za pomocą sterylnej pęsety z cienkimi końcówkami i umieścić je na nowej szalce Petriego aktywowaną stroną zadrukowaną do góry.</li>
	<li>Przechowywać w RT w suchym miejscu z folią aluminiową, aby uniknąć przywierania kurzu do szkiełek nakrywkowych.</li>
</ol>
2. Przygotowanie hydrożeli Hydroxy-PAAm
<ol>
	<li>Przygotować 65 mg N-hydroksyetyloakryloamidu (HEA) w 1,5 ml probówki Eppendorfa. Ważne jest, aby przygotować świeży roztwór HEA.</li>
	<li>Dodać 1 ml 50 mM buforu HEPES do HEA i mieszać za pomocą wirownika aż do całkowitego rozpuszczenia HEA.</li>
	<li>Dodać 400 μl 40% w/w w roztworze akryloamidu HEPES i wymaganą objętość 2% w/w w roztworze bis-akrylamidu HEPES (patrz Tabela 1), aby osiągnąć pożądaną sztywność hydrożelu. Za pomocą 50 mM HEPES doprowadzić do końcowej objętości 5 ml.</li>
	<li>Wymieszać roztwór za pomocą wirownika i odgazować go w komorze próżniowej przez 20 minut w celu zmniejszenia stężenia tlenu w roztworze, co zapobiega polimeryzacji hydroksy-PAAm.</li>
	<li>Pod sterylnym kapturem przefiltruj odgazowany roztwór za pomocą filtra o wielkości porów 0,2 μm w celu jego sterylizacji.</li>
	<li>Aktywuj okrągłe szklane szkiełka nakrywkowe (o średnicy 22 mm) w środku czyszczącym UV/ozonem przez 7 minut.</li>
	<li>Przygotować 100 μl 10% roztworu nadsiarczanu amonu (APS), czyli 10 mg APS w 100 μl ddH2O. Ważne jest, aby przygotować świeży roztwór APS.</li>
	<li>Dodać 2,5 μl tetrametylenodiaminy (TEMED) i 25 μl roztworu APS do wysterylizowanego roztworu hydroksy-PAAm (krok 2.5), aby rozpocząć polimeryzację. Wymieszać roztwór przez 3 kolejne pipetowanie bez wprowadzania pęcherzyków, w sterylnych warunkach.</li>
	<li>Pod sterylnym kapturem umieścić 25 μl kropli roztworu hydroksy-PAAm na szkiełku nakrywkowym o średnicy 25 mm (dostępne od kroku 1.9) i natychmiast umieścić szklane szkiełko nakrywkowe o średnicy 22 mm (przygotowane w kroku 2.5) na wierzchu kropli, aby wycisnąć roztwór hydroksy-PAAm. Wyśrodkuj szklane szkiełko nakrywkowe o średnicy 22 mm sterylną pęsetą i wygładź wszelkie pęcherzyki.</li>
	<li>Pozostawić hydrożele hydroksy-PAAm do polimeryzacji w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Odwrócić ręcznie pozostały roztwór hydroksy-PAAm w probówce Eppendorfa, aby zakończyć proces polimeryzacji.</li>
	<li>Całkowicie zanurz szkiełka nakrywkowe w sterylnym ddH2O i ostrożnie oddziel szkiełka nakrywkowe o średnicy 22 mm, wprowadzając krawędź żyletki między szkiełka nakrywkowe ze szkła o średnicy 22 mm a warstwę hydrożelu hydroksy-PAAm.</li>
	<li>Umyj hydrożele hydroksy-PAAm sterylnym PBS (3 wymiany PBS) i pozostaw żele całkowicie zanurzone w sterylnym PBS, aby utrzymać nawilżenie.</li>
	<li>Hydrożele hydroksy-PAAm należy przechowywać w sterylnym PBS w temperaturze 4 °C przez okres do 3 dni.</li>
</ol>
3. Wytwarzanie mikroznaczków z polidimetylosiloksanu (PDMS)
UWAGA: Przed rozpoczęciem produkcji mikrostempla PDMS wymagane jest wyprodukowanie wzorca krzemowego. To mikrowytwarzanie wzorca krzemowego można wykonać technikami litograficznymi, co wymaga specjalistycznego sprzętu i szkolenia. Zachęca się do współpracy z zakładem zajmującym się nanofabrykacją w celu wytworzenia wzorca krzemowego. Możesz też skontaktować się z firmą, która na żądanie wytwarza na żądanie mikrostrukturalne wzorce krzemowe. Ważne jest, aby pamiętać, że produkcja wzorca krzemowego musi być wykonana tylko raz. Rzeczywiście, mikrostrukturalne wzorce krzemowe mogą być używane w nieskończoność do produkcji stempli elastomerowych.
<ol>
	<li>Wymieszaj PDMS i utwardzacz w proporcji 10:1 w plastikowej zlewce i dokładnie mieszaj za pomocą pipety przez 10 minut.</li>
	<li>Odgazować mieszaninę PDMS w próżni w celu usunięcia pęcherzyków powietrza, które powstały podczas kroku 3.1.</li>
	<li>Umieść mikrostrukturalny wzorzec krzemowy na szalce Petriego i rzuć na niego warstwę odgazowanej mieszaniny PDMS o grubości 10 mm, nie tworząc pęcherzyków.</li>
	<li>Pozostaw PDMS do utwardzenia przez 2 godziny w temperaturze 60 °C w piekarniku.</li>
	<li>W środowisku wolnym od kurzu należy odkleić warstwę PDMS i wyciąć skalpelem 1 cm2 mikrostemple</li>.
	<li>Za pomocą kleszczy umieść mikrostemple PDMS na szalce Petriego.</li>
</ol>
4. Hydrożele hydrożelowe Hydroxy-PAAm do mikromodelowania
<ol>
	<li>Umieść mikrostemple PDMS w roztworze etanolu/wody (50/50) i poddaj sonikacji przez 15 minut.</li>
	<li>Wysuszyć stemple strumieniem strumienia azotu i umieścić je w urządzeniu do czyszczenia UV/Ozone (λ < 200 nm) na 7 minut.</li>
	<li>Pod sterylnym kapturem umieść 150 μl kropli pożądanego roztworu białkowego (np. 100 μg/ml lamininy w PBS lub 25 μg/ml fibronektyny w PBS) na mikrostrukturalnej powierzchni 1-cm2 stempla PDMS.</li>
	<li>Opcjonalnie: Zmodyfikuj stężenie roztworu białkowego, aby modulować gęstość liganda komórkowego.</li>
	<li>Rozprowadź roztwór białka na powierzchni stempla, przesuwając go sterylną końcówką pipety w kierunku każdego rogu stempla.</li>
	<li>Pozostaw roztwór białkowy do adsorpcji na stemplu PDMS na 60 minut pod sterylnym kapturem. Wyłącz lampy, aby uniknąć uszkodzenia białka.</li>
	<li>Pod sterylnym kapturem przenieś szkiełka nakrywkowe pokryte hydroksy-PAAm (dostępne od kroku 2.13) na szalkę Petriego.</li>
	<li>Usunąć nadmiar PBS z powierzchni substratów hydroksy-PAAm za pomocą strumienia o niskiej zawartości azotu w sterylnych warunkach. Przerwij procedurę, gdy tylko nie zauważysz śladów stojącej wody na powierzchni żelu. Na tym etapie żelu nie należy dokładnie suszyć.</li>
	<li>Dokładnie osusz strukturalną powierzchnię stempla PDMS stałym strumieniem azotu o wysokiej czystości.</li>
	<li>Chwyć stempel pokryty białkiem za pomocą kleszczyków do tkanek opatrunkowych i umieść strukturalną powierzchnię w kontakcie z wysuszoną powierzchnią hydrożelu. Nakładaj krótkie punkty nacisku końcówką pęsety na górze stempla PDMS, aby zapewnić dobry kontakt między mikroelementami stempla a powierzchnią hydrożelu.</li>
	<li>Pozostaw stempel PDMS na powierzchni hydrożelu na 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Delikatnie usuń stempele PDMS z hydrożeli hydroksy-PAAm za pomocą kleszczyków do tkanek opatrunkowych i postępuj zgodnie z krokiem 4.1, aby wyczyścić stempel.</li>
	<li>Tłoczone hydrożele hydroksy-PAAm należy dokładnie przemyć przez 3 wymiany PBS (pH = 7,4) w sterylnych warunkach przez 10 minut na wymianę.</li>
	<li>Opcjonalnie: Dodatkowe mikrowzorce innych białek ECM można dodać do powierzchni hydroksy-PAAm, wykonując kroki od 4.5 do 4.11.</li>
	<li>Pasywować niezadrukowane strefy sterylnym roztworem BSA w dawce 5 mg/ml w PBS przez jedną noc w temperaturze 4 °C pod delikatnym mieszaniem na kołyszącej się płycie.</li>
	<li>Intensywnie myć przez 3 wymiany PBS (pH = 7,4) w sterylnych warunkach przez 10 minut na wymianę. Na tym etapie tłoczone hydrożele hydroksy-PAAm można przechowywać w temperaturze 4 °C do jednego tygodnia.</li>
</ol>
5. Osadzanie komórek na mikrowzorcowych hydrożelach hydroksy-PAAm
<ol>
	<li>Inkubować szkiełka nakrywkowe w pożywce komórkowej przez 30-45 minut przed posiewem komórek.</li>
	<li>Przemyć przylegające komórki hodowane w kolbie hodowlanej o długości 75cm2 sterylnym PBS w temperaturze 37 °C i odłączyć je 3 ml trypsyny-EDTA lub akutazy na 10 minut.</li>
	<li>Przenieść żądaną ilość wstępnie podgrzanej, kompletnej pożywki wzrostowej odpowiedniej dla danej linii komórkowej do kolby zawierającej oderwane komórki i odwirować zawiesinę komórek przez 3 minuty przy 650 x g.</li>
	<li>Usunąć supernatant za pomocą mikropipety i ponownie zawiesić komórki w kompletnej pożywce hodowlanej w stężeniu 15-20 000 komórek/ml.</li>
	<li>Dodać 4 ml roztworu komórkowego do szkiełka nakrywkowego z mikrowzorem (otrzymanego z kroku 5.1) i umieścić szkiełko nakrywkowe pokryte komórkami w inkubatorze do hodowli w temperaturze 37 °C i wilgotności 5% na 1-2 godziny.</li>
	<li>Odessać delikatnie odczepione komórki i wymienić pożywkę hodowlaną. Umieść przyczepione komórki z powrotem w inkubatorze i pozwól im się całkowicie rozprzestrzenić (3-6 godzin, w zależności od typu komórki).</li>
</ol>

<ol><li>Grevesse, T., Versaevel, M., Circelli, G., Desprez, S., Gabriele, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+route+to+functionalize+polyacrylamide+gels+for+the+independent+tuning+of+mechanotransduction+cues%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A simple route to functionalize polyacrylamide gels for the independent tuning of mechanotransduction cues.</a> Lab Chip. 13 (5), 777-780 (2013).</li>
<li>Gabriele, S., Benoliel, A. M., Bongrand, P., Théodoly, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+investigation+reveals+distinct+roles+for+actin+cytoskeleton+and+myosin+II+activity+in+capillary+leukocyte+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Microfluidic investigation reveals distinct roles for actin cytoskeleton and myosin II activity in capillary leukocyte trafficking.</a> Biophys. J. 96 (10), 4308-4318 (2009).</li>
<li>Atmanli, A., Domian, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+aligned+functional+myocardial+tissue+through+microcontact+printing%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Generation of aligned functional myocardial tissue through microcontact printing.</a> J. Vis. Exp. (73), e50288(2013).</li>
<li>Gabriele, S., Versaevel, M., Preira, P., Théodoly, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+microfluidic+method+to+select%2C+isolate%2C+and+manipulate+single-cells+in+mechanical+and+biochemical+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A simple microfluidic method to select, isolate, and manipulate single-cells in mechanical and biochemical assays.</a> Lab Chip. 10 (11), 1459-1467 (2010).</li>
<li>Le Berre, M., Aubertin, J., Piel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fine+control+of+nuclear+confinement+identifies+a+threshold+deformation+leading+to+lamina+rupture+and+induction+of+specific+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Integr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Fine control of nuclear confinement identifies a threshold deformation leading to lamina rupture and induction of specific genes.</a> Integr. Biol. 4 (11), 1406-1414 (2012).</li>
<li>Rundqvist, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+fidelity+functional+patterns+of+an+extracellular+matrix+protein+by+electron+beam-based+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">High fidelity functional patterns of an extracellular matrix protein by electron beam-based inactivation.</a> J. Am. Chem. Soc. 129 (59), 59-67 (2006).</li>
<li>Sorribas, H., Padeste, C., Tiefenauer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photolithographic+generation+of+proteins+micropatterns+for+neuron+culture+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Photolithographic generation of proteins micropatterns for neuron culture applications.</a> Biomaterials. 23 (3), 893-900 (2002).</li>
<li>Holden, M. A., Cremer, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+activated+patterning+of+dye-labeled+molecules+on+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Light activated patterning of dye-labeled molecules on surfaces.</a> J. Am. Chem. Soc. 125 (27), 8074-8075 (2003).</li>
<li>Cheng, Q., Li, S., Komvopoulos, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma-assisted+surface+chemical+patterning+for+single-cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Plasma-assisted surface chemical patterning for single-cell culture.</a> Biomaterials. 30 (25), 4203-4210 (2009).</li>
<li>Kumar, A., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Features+of+gold+having+micrometer+to+centimeter+dimensions+can+be+formed+through+a+combination+of+stamping+with+an+elastomeric+stamp+and+an+alkanethiol+%22ink%22+followed+by+chemical+etching%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Phys.+Lett%22%5BJournal%5D)">Features of gold having micrometer to centimeter dimensions can be formed through a combination of stamping with an elastomeric stamp and an alkanethiol "ink" followed by chemical etching.</a> Appl. Phys. Lett. 63 (14), 2002-2004 (1993).</li>
<li>Tseng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+micropatterning+method+of+soft+substrates+reveals+that+different+tumorigenic+signals+can+promote+or+reduce+cell+contraction+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">New micropatterning method of soft substrates reveals that different tumorigenic signals can promote or reduce cell contraction levels.</a> Lab Chip. 11, 2231-2240 (2011).</li>
<li>Palchesko, R. N., Zhang, L., Sun, Y., Feinberg, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+Polydimethylsiloxane+Substrates+with+Tunable+Elastic+Modulus+to+Study+Cell+Mechanobiology+in+Muscle+and+Nerve%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Development of Polydimethylsiloxane Substrates with Tunable Elastic Modulus to Study Cell Mechanobiology in Muscle and Nerve.</a> PLoS ONE. 7, e51499(2012).</li>
<li>Herrick, W. G., Nguyen, T. V., Sleiman, M., McRae, S., Emrick, T. S., Peyton, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PEG-Phosphorylcholine+hydrogels+as+tunable+and+versatile+platforms+for+mechanobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">PEG-Phosphorylcholine hydrogels as tunable and versatile platforms for mechanobiology.</a> Biomacromolecules. 14, 2294-2304 (2013).</li>
<li>Versaevel, M., Grevesse, T., Riaz, M., Lantoine, J., Gabriele, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micropatterning+hydroxy-PAAm+hydrogels+and+sylgard+184+silicone+elastomers+with+tunable+elastic+moduli%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Micropatterning hydroxy-PAAm hydrogels and sylgard 184 silicone elastomers with tunable elastic moduli.</a> Methods in Cell Biology. 121, 33-48 (2014).</li>
<li>Kandow, C. E., Georges, P. C., Janmey, P. A., Beningo, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyacrylamide+hydrogels+for+cell+mechanics%3A+steps+towards+optimization+and+alternative+uses%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Polyacrylamide hydrogels for cell mechanics: steps towards optimization and alternative uses.</a> Methods Cell Biol. 83, 29-46 (2007).</li>
<li>Hemphill, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+possible+role+for+integrin+signaling+in+diffuse+axonal+injury%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">A possible role for integrin signaling in diffuse axonal injury.</a> PLoS ONE. 6 (7), e22899(2011).</li>
<li>Damljanovic, V., Lagerholm, B. C., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bulk+and+micropatterned+conjugation+of+extracellular+matrix+proteins+to+characterized+polyacrylamide+substrates+for+cell+mechanotransduction+assays%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Bulk and micropatterned conjugation of extracellular matrix proteins to characterized polyacrylamide substrates for cell mechanotransduction assays.</a> BioTechniques. 39 (6), 847-851 (2005).</li>
<li>Hynd, M. R., Frampton, J. P., Dowell-Mesfin, N., Turner, J. N., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+cell+growth+on+protein-functionalized+hydrogel+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Directed cell growth on protein-functionalized hydrogel surfaces.</a> Journal of Neuroscience Methods. 162, 255-263 (2007).</li>
<li>Tseng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((new+micropatterning+method+of+soft+substrates+reveals+that+different+tumorigenic+signals+can+promote+or+reduce+cell+contraction+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">new micropatterning method of soft substrates reveals that different tumorigenic signals can promote or reduce cell contraction levels.</a> Lab Chip. 11 (13), 2231-2240 (2011).</li>
<li>Versaevel, M., Grevesse, T., Gabriele, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+coordination+between+cell+and+nuclear+shape+within+micropatterned+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Spatial coordination between cell and nuclear shape within micropatterned endothelial cells.</a> Nat. Commun. 3, 671(2012).</li>
<li>Versaevel, M., Grevesse, T., Riaz, M., Gabriele, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Confinement%3A+Putting+the+squeeze+on+the+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Cell Confinement: Putting the squeeze on the nucleus.</a> Soft Matter. 9, 6665-6676 (2013).</li>
<li>Trappman, B., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+cells+sense+extracellular+matrix+stiffness%3A+a+material%27s+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">How cells sense extracellular matrix stiffness: a material's perspective.</a> Current Opinion in Biotechnology. 24, 1-6 (2013).</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Wiele obserwacji in vitro we współczesnej biologii komórki przeprowadzono na szkiełkach nakrywkowych ze szkiełka nakrywkowego, często pokrytych cienką warstwą białek ECM lub syntetycznych peptydów zawierających sekwencję RGD. Jednak takie podstawowe substraty hodowlane nie podsumowują całej złożoności fizykochemicznej ECM, a tym samym nie zapewniają dokładnego modelu do badania komórkowych procesów mechanotransdukcji. Aby rozwiązać ten problem, proponujemy prostą alternatywę dla funkcjonalizacji dwuwymiarowych h...

Wiele aspektów lokalnego mikrośrodowiska komórkowego (np. sztywność, wielkość porów, natura białek czy gęstość komórek i ligandów) dostarcza zestawu współrzędnych sygnałów regulacyjnych, które kontrolują procesy komórkowe, takie jak ruchliwość, proliferacja komórek, różnicowanie i ekspresja genów. Modyfikacje właściwości fizykochemicznych środowiska zewnątrzkomórkowego mogą być odbierane przez komórki i powodować różne konsekwencje fizjologiczne, w tym deformację polaryzacji komórkowej, migracji i różnicowania. Nie jest jednak jasne, w jaki sposób komórki tłumaczą modyfikacje ECM na komórkowe sygnały biochemiczne. Dlatego tak ważne jest opracowanie kontrolowanych mikrośrodowisk in vitro, które mogą odtwarzać interakcje między komórkami i ich mikrośrodowiskiem w celu badania szlaków mechanotransdukcji. Aby rozwiązać ten problem, niedawno wprowadziliśmy nową metodę1, zwaną hydrożelami hydroksy-PAAm, do łatwego generowania dwuwymiarowych miękkich matryc, które pozwalają na niezależne kontrolowanie ważnych sygnałów mechanotransdukcji: sztywności matrycy, geometrii i uwięzienia komórki, charakteru białka i gęstości liganda komórki.
ECM kieruje procesami komórkowymi poprzez gradienty morfogenów (chemotaksja), białek adhezyjnych (haptotaksja) i sztywności (durotaxis). W ciągu ostatnich kilku dekad opracowano zaawansowane platformy in vitro w celu wyizolowania tych sygnałów zewnątrzkomórkowych w celu ustalenia, w jaki sposób komórki są w stanie tłumaczyć cechy biochemiczne i biofizyczne na procesy fizjologiczne2-5. Wiązkaelektronów6, fotolitografia7, immobilizacja fotochemiczna8 lub techniki wspomaganeplazmą9 zostały opracowane w celu kierowania wzrostem żywych komórek na podłożach mikrowzorcowych. Chociaż techniki te przyniosły ważne wyniki, większość z nich nie pozwala na rozróżnienie między indywidualnym wpływem różnych sygnałów na zachowanie komórek i wymagają zaplecza technicznego, na które niewiele laboratoriów może sobie pozwolić. Wśród tych technik druk mikrokontaktowy (μCP) okazał się solidną i dostępną metodą tworzenia mikrowysp adhezyjnych10. Ostatnio podjęto szeroko zakrojone wysiłki11-14 w celu opracowania μCP na hydrożelach o regulowanej sztywności w celu odtworzenia szerokiego zakresu sztywności obserwowanych w żywych tkankach. Wśród tych prac popularny stał się poliakrylamid (PAAm)15 i jest już jedną z najczęściej stosowanych matryc na bazie polimerów do testów biomechaniki komórki.
PAAm powierzchnie są powszechnie funkcjonalizowane za pomocą heterobifunkcyjnego sieciera N-sulfosukcynimidylo-6-[4'-azydo-2'-nitrofenyloamido] (sulfo-SANPAH), a białka ECM są połączone z powierzchnią przez aktywację UV grup azydekowych nitrofenylu SANPAH16. Inna technika polega na sprzęganiu hydrazyny z białkami, które zostały silnie utlenione periodianem17. Hynd i współpracownicy wprowadzili technikę modelowania powierzchni biomimetycznego hydrożelu za pomocą białka i peptydów, która wymaga fotopolimeryzacji w obecności monomeru akroylowo-streptawidyny18. Niedawno Tseng i in. opisali nową metodę mikromodelowania19 opartą na głębokiej ekspozycji PAAm na promieniowanie UV przez optyczną maskę kwarcową, która wymaga inkubacji aktywowanych żeli PA z roztworami wodnymi chlorowodorku 1-etylo-3-[3-dimetyloaminopropylo] karbodimidu (EDC) i N-hydroksysukcynimidu (NHS) przed dodaniem białka. Pomimo zdolności tych technik do tworzenia jednorodnych i powtarzalnych mikrowzorów białek, większość z nich ma poważne ograniczenia: długie procesy syntezy (np. dializa, liofilizacja itp.), drogie związki chemiczne (np. kwas hialuronowy, sulfo-SANPAH) czy głębokie naświetlanie promieniowaniem UV. Ponadto techniki te nie pozwalają na niezależną modulację sztywności podłoża, geometrii mikrowzoru, charakteru białka ECM i gęstości komórka-ligand.
Biorąc pod uwagę te ograniczenia, opracowaliśmy nowatorskie i proste podejście oparte na akrylamidzie, które pozwala na immobilizację różnych białek i biomolekuł na miękkich hydrożelach i pozwala na niezależne dostrajanie sygnałów mechanotransdukcji w celu rozszyfrowania ich roli w funkcjach komórkowych. Zamiast traktować hydrożele PAAm ostrymi związkami chemicznymi, wprowadzamy komercyjny monomer akryloamidu z grupami hydroksylowymi podczas polimeryzacji PAAm. Ta prosta operacja pozwala przezwyciężyć wewnętrzne właściwości antyadhezyjne hydrożeli PAAm bez żadnych innych wymagań technicznych.
Obecność grup hydroksylowych prowadzi do wysokiego powinowactwa hydrożeli hydroksy-PAAm do białek i biomolekuł, które tworzą oddziaływania wiążące wodór. W połączeniu z μCP, hydrożele hydroksy-PAAm umożliwiają szybkie generowanie dwuwymiarowej platformy hodowlanej z niezależną kontrolą sztywności matrycy, rodzaju białek ECM, gęstości komórka-ligand i ograniczonej adhezji, które mają być potężną platformą do badania mechanotransdukcji.
Celem tego protokołu jest dostarczenie niezbędnych informacji do łatwego wytwarzania hydrożeli hydroksy-PAAm bez żadnej wiedzy z zakresu materiałoznawstwa. Ostatecznym celem jest zapewnienie naukowcom środków do zadawania fizjologicznie istotnych pytań na poziomie komórkowym i tkankowym, które mogą prowadzić do lepszego zrozumienia szlaków mechanotransdukcji zaangażowanych w mechanizmy patofizjologiczne.

<table><tbody><tr><td>Fotoreaktor UV/</td><td>ozon Produkty ultrafioletowe</td><td>Model PR-100</td><td></td></tr><tr><td>Płyta kołysząca</td><td>IKAcWerke</td><td>Model KS 130 Podstawowy</td><td></td></tr><tr><td>wirownik</td><td>Przemysł naukowy</td><td>Model Vortex Genie2</td><td></td></tr><tr><td>Komora odgazowywania próżniowego</td><td>Stosowana inżynieria próżniowa</td><td>DP-8-KIT</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7793-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Kleszczyki ze stali nierdzewnej z cienką końcówką</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z225304-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Kleszczyki do opatrunków</td><td>tkankowych Sigma-Aldrich</td><td>F4392-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Szalki Petriego z polistyrenu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5731-500EA</td><td></td></tr><tr><td>Folia aluminiowa, grubość 0,5&nbsp; mm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>266574-3.4G</td><td></td></tr><tr><td>Filtr membranowy izoporowy (0,2 &mikro; m wielkość porów)</td><td>Millipore</td><td>GTTP Kod</td><td></td>filtra</tr><tr><td>Okrągłe szklane szkiełko nakrywkowe (średnica 22 mm)</td><td>Neuvitro</td><td>GG-22</td><td></td></tr><tr><td>Okrągłe szklane szkiełko nakrywkowe (średnica 25 mm)</td><td>Neuvitro</td><td>GG-25</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipeta o zmiennej objętości</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z114820</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek białkowych</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z666505-100EA</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyty do skalpeli</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2896-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Ostrza skalpela</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2771-100EA</td><td></td></tr><tr><td>Kolby do hodowli komórkowych (75 cm2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430641</td><td></td></tr><tr><td>Ultradźwiękowa brodzik do kąpieli, lita (stal nierdzewna)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z613983-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Polidimetylosiloksan&nbsp;</td><td>Zestaw</td><td></td><td>elastomerów silikonowych Dow Corning Sylgard 184</td></tr><tr><td>Akrylamid (proszek)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3553</td><td></td></tr><tr><td>N,N'-Metylenobis(Akrylamid)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>146072</td><td></td></tr><tr><td>N-hydroksyetyloakryloamid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>697931</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N',N'-Tetrametyloetylenodiamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>Persiarczan amonu (APS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>Akrylan 3-(trimetoksysililo)propylu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1805</td><td></td></tr><tr><td>Fibronektyna z ludzkiego osocza</td><td>Millipore</td><td>FC010</td><td></td></tr><tr><td>Laminina z EHS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>Hydroksyd sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221465-25G</td><td></td></tr><tr><td>Woda podwójnie destylowana (ddH2O)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pożywka do wzrostu komórek śródbłonka</td><td>Zastosowania komórek</td><td>211K-500</td><td></td></tr><tr><td>Ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC)</td><td>Invitrogen</td><td>C-003-5C</td><td></td></tr><tr><td>Laboratoria Accutase</td><td>PAA</td><td>L11-007</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór buforowy HEPES 1 M w H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>83264-500ML-F</td><td></td></tr><tr><td>Antybiotyki-leki przeciwgrzybicze</td><td>Laboratoria PAA</td><td>P11-002</td><td></td></tr><tr><td>Bufor fosforanowy Roztwór soli fizjologicznej</td><td>Laboratoria PAA</td><td>H15-002</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488</td><td>Sondy molekularne</td> Phaloidin <td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-winkulinowe wytwarzane u myszy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V9131</td><td></td></tr><tr><td>Koza anty-mysz przeciwciało-tetrametylodamina</td><td>Sondy molekularne</td><td>T-2762</td><td></td></tr><tr><td>Anty-Fibronektyna (królik)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3648</td><td></td></tr><tr><td>Streptawidyna&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>41469</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-Laminin (królik)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9393</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciw królikowi IgG-FITC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7512</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór trypsyny-EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3924-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Etanol absolutny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>459844-2.5L</td><td></td></tr></tbody></table>

przygotowanie hydrożeli hydroksy-paam do rozprzęgania efektów sygnałów mechanotransdukcji

Preparation of Hydroxy-PAAm Hydrogels for Decoupling the Effects of Mechanotransduction Cues

Teraz dobrze wiadomo, że wiele funkcji komórkowych jest regulowanych przez interakcje komórek z fizykochemicznymi i mechanicznymi sygnałami środowiska ich macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM). Komórki eukariotyczne stale wyczuwają swoje lokalne mikrośrodowisko za pomocą mechanoczujników powierzchniowych, aby przekształcić fizyczne zmiany ECM w sygnały biochemiczne i zintegrować te sygnały w celu osiągnięcia określonych zmian w ekspresji genów. Co ciekawe, parametry fizykochemiczne i mechaniczne ECM mogą łączyć się ze sobą w celu regulowania losu komórki. Dlatego kluczem do zrozumienia mechanotransdukcji jest rozdzielenie względnego wpływu sygnałów ECM na funkcje komórkowe.
Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół eksperymentalny do szybkiego i łatwego generowania biologicznie istotnych hydrożeli do niezależnego dostrajania sygnałów mechanotransdukcji in vitro. Chemicznie zmodyfikowaliśmy hydrożele poliakrylamidowe (PAAm), aby przezwyciężyć ich wewnętrznie nieadhezyjne właściwości poprzez włączenie hydroksylowych monomerów akryloamidu podczas polimeryzacji. Otrzymaliśmy nowy hydrożel PAAm, zwany hydroksy-PAAm, który pozwala na immobilizację dowolnej pożądanej natury białek ECM. Połączenie hydrożeli hydroksy-PAAm z drukowaniem mikrokontaktowym pozwala na niezależną kontrolę morfologii pojedynczych komórek, sztywności matrycy, charakteru i gęstości białek ECM. Oferujemy prostą i szybką metodę, którą można zastosować w każdym laboratorium biologicznym do badania procesów mechanotransdukcji komórek in vitro. Weryfikujemy tę nowatorską dwuwymiarową platformę, przeprowadzając eksperymenty na komórkach śródbłonka, które wykazują mechaniczne sprzężenie między sztywnością ECM a jądrem.

Rycina 1A przedstawia kopolimeryzację akryloamidu (AAm) i bisakryloamidu (bis-AAm) z monomerami N-hydroksyetyloakryloamidu (HEA) zawierającymi grupę hydroksylową pierwszorzędową, w wyniku której poprzez losową polimeryzację rodnikową powstaje hydrofilowa sieć poliakryloamidu z wbudowanymi grupami hydroksylowymi (hydroksy-PAAm). W niniejszym protokole 65 mg HEA należy rozpuścić w 1 ml HEPES. Przyjmując, że gęstość HEA jest w przybliżeniu równa jedności, zakładamy uzyskanie objętości roboczej 1,065 µl (HEA...

Prezentujemy nowy hydrożel poliakrylamidowy, zwany hydroksy-PAAm, który umożliwia bezpośrednie wiązanie białek ECM przy minimalnych kosztach i specjalistycznej wiedzy. Połączenie hydrożeli hydroksy-PAAm z nadrukiem mikrokontaktowym ułatwia niezależną kontrolę wielu sygnałów naturalnego mikrośrodowiska komórkowego w celu badania mechanostransdukcji komórkowej.

Przygotowanie hydrożeli hydroksy-PAAm do rozprzęgania efektów sygnałów mechanotransdukcji

It is now well established that many cellular functions are regulated by interactions of cells with physicochemical and mechanical cues of their ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest opracowanie prostej i wydajnej strategii immobilizacji dowolnego białka docelowego na hydrożelach poliakrylamidowych, aby umożliwić niezależną kontrolę różnych parametrów mikrośrodowiska komórkowego. Osiąga się to poprzez wstępne rozprowadzenie roztworu białka na powierzchni stempla z PDMS. Drugim krokiem jest ostrożne osuszenie ustrukturyzowanej powierzchni stempla z PDMS za pomocą stałego strumienia wysokiej czystości azotu.Następnie stempel pokryty białkiem przykłada się ustrukturyzowaną powierzchnią do wysuszonej powierzchni hydrożelu, a na górną część stempla PDMS wywiera się krótkotrwały nacisk, aby zapewnić dobry kontakt między mikrostrukturami stempla a powierzchnią hydrożelu; ostatnim krokiem jest delikatne usunięcie stempla PDMS z powierzchni hydrożelu oraz oczyszczenie stempla w strefach niedrukowanych. Dzięki BSA komórki mogą zostać osadzone na mikrowzorowanej powierzchni hydrożelu. Ostatecznie do obserwacji mikrostruktur białkowych wykorzystuje się odwrócony mikroskop fluorescencyjny.Ta metoda może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie mechanotransdukcji, takie jak względny wkład właściwości macierzy zewnątrzkomórko

preparation-hydroxy-paam-hydrogels-for-decoupling-effects

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Przygotowanie hydrożeli Hydroxy-PAAm do oddzielenia efektów sygnałów mechanotransdukcji

Wpływ sztywności podłoża na funkcje komórkowe można modelować in vitro, wykorzystując hydrożele poliakryloamidowe o różnym stopniu podatności.

Badanie wpływu sztywności macierzy na funkcje komórkowe z wykorzystaniem hydrożeli na bazie akrylamidu

Ten film prezentuje ilościową mikroskopię poklatkową do oceny zależnej od sztywności macierzy zewnątrzkomórkowej rozprzestrzeniania się Listeria monocytogenes przez komórki śródbłonka. Bardziej miękki hydrożel ułatwia szybsze rozprzestrzenianie się bakterii przez komórki śródbłonka w porównaniu ze sztywniejszymi odpowiednikami, co podkreśla wpływ sztywności matrycy na rozprzestrzenianie się bakterii.

Ilościowa mikroskopia poklatkowa do oceny rozsiewu bakterii zależnego od sztywności macierzy zewnątrzkomórkowej

Tutaj opisana jest metoda, która umożliwia szybkie, efektywne i niedrogie przygotowanie żeli poliakrylamidowych w formacie wielodołkowej płytki. Metoda nie wymaga specjalistycznego sprzętu i może być z łatwością zaadoptowana przez każde laboratorium badawcze. Byłoby to szczególnie przydatne w badaniach skoncentrowanych na zrozumieniu odpowiedzi komórek zależnych od sztywności.

Prosty test sztywności wielodołkowej na bazie poliakrylamidu do badania odpowiedzi komórek zależnych od sztywności

W tej metodzie, używamy technik fotopolimeryzacji i chemii kliknięć do tworzenia wzorów białkowych lub peptydowych na powierzchni hydrożeli glikolu polietylenowego (PEG), dostarczając unieruchomionych sygnałów bioaktywnych do badania odpowiedzi komórkowych in vitro.

Wzorowanie bioaktywnych białek lub peptydów na hydrożelu przy użyciu fotochemii do zastosowań biologicznych

Opracowaliśmy wielodołkowy test na bazie poliakrylamidu do badania wpływu sztywności macierzy zewnątrzkomórkowej na infekcję bakteryjną przylegających komórek. Test ten jest kompatybilny z cytometrią przepływową, barwieniem immunologicznym i mikroskopią sił trakcyjnych, umożliwiając ilościowe pomiary interakcji biomechanicznych między komórkami, ich macierzą zewnątrzkomórkową i bakteriami chorobotwórczymi.

Wielodołkowy test na bazie poliakrylamidu do badania wpływu sztywności macierzy zewnątrzkomórkowej na infekcję bakteryjną przylegających komórek

Tutaj przedstawiono protokół hermetyzacji i hodowli komórek w hydrożelach z poli(glikolu etylenowego) (PEG) funkcjonalizowanych peptydem degradowalnym przez metaloproteinazę o matrycy fluorogennej (MMP). Komórkowy MMP i aktywność metaboliczną mierzy się bezpośrednio z kultur hydrożelowych za pomocą standardowego czytnika mikropłytek.

Pomiar globalnej metaloproteinazy macierzy komórkowej i aktywności metabolicznej w hydrożelach 3D

Tutaj prezentujemy protokół oparty na mechanice, który ma na celu zakłócenie połączenia szczelinowego 43 i zmierzenie późniejszego wpływu, jaki ma to na biomechanikę śródbłonka poprzez obserwację trakcji i naprężeń międzykomórkowych.

Zaburzanie biomechaniki śródbłonka poprzez zakłócenie strukturalne Connexin 43

Szczegółowe protokoły krok po kroku są opisane tutaj do badania sygnałów mechanicznych in vitro przy użyciu multipotencjalnych komórek grzebienia nerwowego O9-1 i hydrożeli poliakrylamidowych o różnej sztywności.

Zoptymalizowany system O9-1/Hydrogel do badania sygnałów mechanicznych w komórkach grzebienia nerwowego

Litografia w bliskim UV i mikroskopia siły trakcyjnej są połączone w celu pomiaru sił komórkowych na mikrowzorzystych hydrożelach. Ukierunkowane uwalnianie pojedynczych komórek pod wpływem światła umożliwia dużą liczbę pomiarów na tej samej próbce.

Kontrola adhezji komórek za pomocą technik modelowania hydrożelu do zastosowań w mikroskopii sił trakcyjnych

W tym miejscu przedstawiamy protokół wytwarzania unikalnego dwuwarstwowego urządzenia mikroprzepływowego do badania elektromechanicznej regulacji homeostazy tkanek nabłonkowych. Urządzenie aplikuje statyczne fizjologiczne prądy elektryczne prostopadłe do płaszczyzny tkanki, wpływając na adhezję, proliferację i wytłaczanie komórki. Obrazowanie żywych komórek i pomiary naprężeń mechanicznych ujawniają mechanizmy tych procesów.

Ujawnienie elektromechanicznej kontroli homeostazy tkanek za pomocą dwuwarstwowego urządzenia mikroprzepływowego

Poznaj metodę przygotowania hydrożeli hydroksy-PAAm do badania mechanotransdukcji komórkowej. Technika umożliwia precyzyjną kontrolę mikrośrodowiska i niezależne sterowanie sztywnością matrycy oraz gęstością ligandów.

Przygotowanie hydrożeli hydroksy-PAAm do rozprzęgania efektów sygnałów mechanotransdukcji

Przeglądaj więcej filmów