Zoptymalizowany protokół przygotowania całej siatkówki do obrazowania i immunohistochemii
December 13th, 2013
Opisany tutaj protokół służy do oceny strukturalnej preparatu całego siatkówki. Obejmuje to opisy rozwarstwiania tkanek, montażu na hydrofilizowanej wkładce membranowej z politetrafluoroetylenu (PTFE), ładowania bolusa markerami fluorescencyjnymi oraz porównanie utrwalania z karbodiimidem i paraformaldehydem do analizy immunohistochemicznej składników komórkowych i synaptycznych.
W tej procedurze wykorzystuje się tkankę siatkówki myszy, aby zademonstrować, jak ustabilizować delikatną tkankę nerwową w celu zachowania integralności strukturalnej. Podczas kilku etapów barwienia immunohistochemicznego najpierw zarodkować oko, usunąć rogówkę i oddzielić siatkówkę od twardówki. Wykonaj nacięcia w muszli ocznej siatkówki, aby spłaszczyć tkankę.
Następnie przymocuj siatkówkę do membrany wzmocnionej pierścieniem za pomocą transferu ssącego bez bezpośredniej manipulacji, aby zachować integralność tkanki. Teraz przenieś pierścień na płytkę wielodołkową w celu barwienia. Nasze wyniki pokazują, że technika ta może być skutecznie stosowana w żywych tkankach i zapewnia lepszy substrat do obrazowania białek synaptycznych w porównaniu z istniejącymi metalami do obsługi wypreparowanej siatkówki.
Techniki te pozwalają na transfer delikatnej tkanki przy minimalnej manipulacji fizycznej. Zmniejszy to ryzyko zniekształceń i uszkodzeń. Po raz pierwszy wpadliśmy na ten pomysł, gdy musieliśmy zarejestrować z płasko zamontowanej tkanki w RD jedną mysz, model zwyrodnienia siatkówki, a ta siatkówka myszy jest niezwykle cienka i delikatna z powodu rozległej utraty komórek spowodowanej mutacją Chief.
Postdoc w naszym laboratorium dołączy do mnie, aby zademonstrować procedurę. Najpierw zarodkuje oczy znieczulonej myszy i przenieś je do natlenionego roztworu dzwonka. Aby usunąć rogówkę, przytrzymaj oko na rąbku kleszczykami, a następnie wytnij okrężną ścieżkę wzdłuż ora serrata.
Wyciągnij soczewkę z kleszczami do wstrzyknięć w bolusie i zapisów elektrofizjologicznych. Użyj kleszczyków z mieszanymi krawędziami, aby usunąć jak najwięcej ciała szklistego. Teraz ustabilizuj muszlę oczną, mocno przytrzymując twardówkę kleszczami.
Umieść drugi zestaw kleszczyków między siatkówką a muszlą oczną. Powoli przesuwaj kleszcze po obwodzie. Przetnij nerw wzrokowy między siatkówką a muszlą oczną i zdejmij muszlę oczną nożyczkami.
Wykonaj nacięcia od obwodu siatkówki aż do nerwu wzrokowego. Alternatywnie, aby wykorzystać całą siatkówkę, wykonaj nacięcia od obrzeża do połowy nerwu wzrokowego, aby skrócić uchwyt. Usuń nadmierną część za pomocą tokarki.
Następnie wypoleruj szorstkie powierzchnie drobnym papierem ściernym. Zdejmij nóżki spod pierścienia. Odetnij wąską końcówkę plastikowej pipety.
Następnie przenieś tkankę z odrobiną roztworu do membrany. Stopniowo usuwaj roztwór, jednocześnie rozprowadzając siatkówkę i rozwijając tkankę. Teraz przymocuj siatkówkę do błony komórkami zwojowymi skierowanymi do góry.
Odetnij końcówkę trzymającą jednomililitrowej strzykawki i umieść ją bezpośrednio pod tkanką. Pociągnij tłok do objętości około 0,3 mililitra, aby fizycznie oplątać tkankę w membranie. Wyciągnij kilka pipet kapilarnych z krzemianem boro, używając oporu około jednej mega.
Następnie delikatnie złamij końcówkę każdej pipety z plastrem. Następnie dodaj 0,3 mikrolitra selektywnego roztworu bejca do 10 mikrolitrów roztworu dzwonka buforowanego w stosach. Teraz umieść membranę w komorze nagrywającej wypełnioną ciepłym, natlenionym, buforowanym roztworem dzwonka.
Przyłożyć pipetę zawierającą barwnik do wewnętrznej membrany ograniczającej za pomocą manipulatora mikrom. Dalej przesuwaj pipetę, aby przeniknąć przez wewnętrzną membranę ograniczającą. Następnie wstrzyknąć roztwór barwiący w jedno lub wiele docelowych miejsc.
Teraz odczekaj 10 minut, aż tkanka zregeneruje się po wstrzyknięciu, oglądając ją w świetle fluorescencyjnym epi. W razie potrzeby przenieś wkładkę do naczynia hodowlanego ze szklanym dnem, umieszczając ją siatkówką do dołu. Dodaj jedną kroplę roztworu na czubkę, aby próbka była wilgotna.
Umieść również trzy plamy smaru próżniowego na obwodzie plastikowego pierścienia, aby mocno przymocować wkładkę do naczynia hodowlanego. Po utrwaleniu przenieś naczynie na scenę mikroskopu, zanurz membranę w roztworach gradientu sacharozy. Wyciąć membranę z plastikowego pierścienia wkładki.
Usuń jak najwięcej roztworu za pomocą chusteczek Kim i umieść go na param siatkówką skierowaną do góry. Przenieś paraformę wraz z tkanką do komory kriostatu i dodaj kroplę pożywki OCT. Użyj urządzenia do szybkiego zamrażania, aby przyspieszyć zamrażanie.
Odłącz zamrożoną próbkę i odwróć ją na drugą stronę. Teraz odetnij nadmiar zamrożonego OCT. Pozostaw około dwóch milimetrów wokół próbki z trzech stron i milimetrów od strony, która zostanie przymocowana do uchwytu.
Przykryj odsłoniętą stronę siatkówki kroplą OCT, pozostawiając przyczepiony obszar wolny. Zamrozić błonę zawierającą tkankę siatkówki. Umieść kroplę OCT na zimnym pierścieniu utrwalającym.
Natychmiast włóż zamrożoną próbkę do kropli. Wytnij odcinki o grubości od 10 do 20 mikronów w temperaturze minus 19 stopni Celsjusza i umieść je na ciepłych szkiełkach adhezyjnych z polilizyny. Umieść szkiełka z dołączonymi sekcjami na platformie grzewczej o temperaturze 41 stopni Celsjusza na dwie do trzech minut w ciemności.
Następnie przechowuj próbki w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Eksperyment ten ilustruje szybką i prostą charakterystykę unaczynienia siatkówki jako skomplikowanej sieci naczyń krwionośnych, które rozciągają się na wiele warstw siatkówki. Łącząc ładowanie bolusem selektyny iso z znakowaniem zanurzeniowym w żwaczu sulfonamidowym, żywa tkanka może być wizualizowana i skanowana niemal natychmiast w siatkówce, naczynia krwionośne mogą być znakowane od warstwy powierzchownej do głębokiej.
W przeciwieństwie do stosunkowo dobrze dyfuzyjnej, selektyna SRH nie przenika dobrze przez wewnętrzną błonę ograniczającą. Istnieje kilka zalet utrwalania karbimidem w porównaniu z konwencjonalnym utrwalaniem za pomocą paraformaldehydu podczas znakowania białek synaptycznych, na przykład po krótkim okresie utrwalania za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego karbimidem dla markera synaptycznego. PSD 95 w IPL miał jasny, punktowy wygląd zgodny z rozróżnieniem poszczególnych synaps.
W przeciwieństwie do tego, przy użyciu konwencjonalnego utrwalacza aldehydu paraformowego, identyfikacja składników synaptycznych jest mniej wyraźna. Podobne wyniki uzyskano w skrępach kriostatu siatkówkowego. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak zamontować delikatną tkankę na tej membranie i jak nałożyć chemiczne barwienie cyto na preparat jeden mistrz.
Przymocowanie siatkówki do filtra zajmie Ci 15 minut.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten protokół opisuje metodę oceny strukturalnej preparatów siatkówki u myszy za pomocą tkanki siatkówki myszy. Szczegółowo opisuje procesy rozcięcia, montażu i barwienia w celu zachowania integralności tkanki do obrazowania białek synaptycznych.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Neuronauki
- Imunohistochemia
- Biologia siatkówki
Tło
- Integralność strukturalna tkanki nerwowej jest kluczowa dla dokładnego obrazowania.
- Istniejące metody mogą kompromitację jakości tkanki podczas rozcięcia.
- Markery fluorescencyjne poprawiają wizualizacje komponentów komórkowych.
- Porównanie metod fiksacji jest istotne dla optymalnych wyników.
Cel badania
- Opracować niezawodny protokół przygotowania tkanki siatkówki.
- Ocenić skuteczność różnych metod fiksacji.
- Poprawić techniki obrazowania białek synaptycznych.
Stosowane metody
- Nukleacji oka i usunięcia rogówki.
- Oddzielenia siatkówki od twardówki i spłaszczenia tkanki.
- Przymocowania siatkówki do membrany za pomocą transferu za pomocą ssania.
- Barwienia i obrazowania białek synaptycznych.
Główne wyniki
- Protokół skutecznie zachowuje integralność tkanki.
- Markery fluorescencyjne zapewniają lepszą wizualizacje.
- Porównanie metod fiksacji dostarcza istotnych informacji.
- Ta technika może być stosowana do obrazowania tkanki żywej.
Wnioski
- Opisana metoda poprawia strukturalną ocenę tkanki siatkówki.
- Oferuje niezawodny podłoże do obrazowania białek synaptycznych.
- Przyszłe zastosowania mogą obejmować inne tkanki nerwowe.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This protocol addresses a critical challenge in neuroscience drug discovery: preserving the structural integrity of fragile neural tissue during immunohistochemical processing. By enabling reliable visualization of synaptic proteins and vascular networks in retinal wholemounts, it supports target validation and mechanistic de-risking in neurodegenerative disease models. The method enhances predictive confidence in preclinical assays by minimizing tissue distortion artifacts that could confound target engagement readouts.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of synaptic protein localization and retinal vasculature architecture in disease models.
- Operational Value: Provides a stabilized platform for consistent antibody staining and fluorescent marker delivery.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, spatially resolved readouts of synaptic marker puncta and vascular networks.
- Operational Value: Compatible with multi-well plate formats for standardized immunostaining and imaging workflows.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports continuity from live tissue imaging to fixed tissue analysis for target engagement and pathway modulation studies.
- Operational Value: Reduces variability in histological preparations, improving reproducibility across preclinical efficacy and safety assessments.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing in neural tissue to preclinical validation of modulator effects on synaptic integrity and vascular function.
- Discovery Biology: Facilitates mechanistic de-risking by enabling clear visualization of synaptic protein distribution and neurovascular unit integrity.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative immunofluorescence outputs suitable for high-content analysis of compound effects on retinal structure.
- Analytics: Generates puncta density and vascular network metrics that support comparative analysis across experimental conditions.
- Translational Research: Enables alignment of retinal synaptic and vascular biomarkers with preclinical disease progression and treatment response.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable tissue stabilization platform applicable to multiple neural tissue types and staining protocols.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances target validation confidence through unambiguous synaptic and vascular visualization in fragile neural tissue.
- Operational Value: Improves assay reproducibility and reduces failure rates in immunohistochemical processing of delicate preparations.
- Strategic Value: Supports better go/no-go decisions by reducing false negatives from tissue damage during preparation.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of neuroprotective compounds based on reliable structural and functional readouts.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microsurgical dissection and tissue handling techniques.
- Depends on access to ring-supported hydrophilized PTFE membranes and suction transfer apparatus.
- Necessitates standardization of fixation, staining, and imaging protocols across research teams.
- Involves adaptation considerations for varying tissue thickness and fragility across neural models.
- Practical limitations include the need for specialized equipment to prepare and maintain the supporting membrane system.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
2:50
Mounting onto Hydrophilized PTFE Membrane Insert
3:43
Bolus Injection of Isolectin Alexa 488
5:05
Vertical Sectioning of Membrane-mounted Tissue
6:45
Results: Hydrophilized PTFE Membrane for Wholemount Retina
1:38
Dissection of Wholemount Retina
8:04
Conclusion
