Name: Zoptymalizowany protokół przygotowania całej siatkówki do obrazowania i immunohistochemii (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-13T14:15:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: Poznaj zoptymalizowany protokół przygotowania całej siatkówki do obrazowania i immunohistochemii przy użyciu tkanki siatkówki myszy. Ta metoda zachowuje integralność strukturalną delikatnej tkanki nerwowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez NIH grant R01-EY020535 (B.T.S), International Retinal Research Foundation i Karl Kirchgessner Foundation (B.T.S).

We wszystkich procedurach eksperymentalnych, zwierzęta były traktowane zgodnie z przepisami zawartymi w Oświadczeniu ARVO dotyczącym wykorzystania zwierząt w badaniach okulistycznych i wzrokowych oraz zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Weill Cornell Medical College. Zwierzęta zostały poddane eutanazji przez dwutlenek węgla, a następnie zwichnięcie szyjki macicy.
1. Rozwarstwienie całej siatkówki
<ol>
	<li>Po eutanazji myszy należy wyłuszczyć jej oczy i umieścić je w natlenionym, buforowanym przez HEPES roztworze Ringera (Tabela 1).</li>
	<li>Usuń rogówkę, przecinając okrągłą ścieżkę wzdłuż ora serrata małymi nożyczkami, przytrzymując oko na rąbku kleszczami. Wyciągnij obiektyw za pomocą kleszczy.</li>
	<li>Usuń jak najwięcej ciała szklistego za pomocą kleszczy o stępionych krawędziach. Ten etap jest ważny w przypadku wstrzyknięć w bolusie i zapisów elektrofizjologicznych; Nie jest to konieczne w przypadku wykonywania samej immunohistochemii.</li>
	<li>Odłącz siatkówkę od muszli ocznej, umieszczając kleszcze między siatkówką a muszlą oczną, powoli przesuwając kleszcze po obwodzie. Ustabilizuj muszlę oczną, mocno przytrzymując twardówkę drugim zestawem kleszczyków. Przetnij nerw wzrokowy w miejscu między siatkówką a muszlą oczną, aby ułatwić oddzielenie siatkówki od muszli ocznej.</li>
	<li>Siatkówka może być rozebrana na kawałki (np. ćwiartki) lub używana jako całość. Aby pokroić na kawałki, użyj nożyczek, aby wykonać nacięcia od obwodu siatkówki aż do nerwu wzrokowego. Alternatywnie, aby wykorzystać całą siatkówkę, wykonaj nacięcia od obwodu w połowie drogi do nerwu wzrokowego. Nacięcia pomogą w wykonaniu płaskiego preparatu.</li>
</ol>
2. Montaż na hydrofilizowanej membranie PTFE
<ol>
	<li>Przygotuj membranę zgodnie z poniższym opisem. Podczas wykonywania zapisów fizjologicznych lub eksperymentów z wstrzykiwaniem barwnika należy skrócić uchwyt za pomocą tokarki lub piły ręcznej tak, aby pozostały pierścień miał wysokość 1 mm. 
	Uwaga: Wkładki do płytek hodowlanych mogą być niezmodyfikowane lub zmodyfikowane (rysunek 1A). Wybór konfiguracji jest podyktowany celem eksperymentu. Do barwienia immunologicznego odpowiednia jest niezmodyfikowana wkładka.</li>
	<li>Wypoleruj szorstkie powierzchnie drobnym papierem ściernym (o ziarnistości 300 lub wyższej).</li>
	<li>(Opcjonalnie) Zdejmij nóżki pod pierścieniem za pomocą nożyczek.</li>
	<li>Aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia, przepłucz lub poddaj sonikację membrany w wodzie destylowanej przez 2-3 minuty.</li>
	<li>Zamontuj tkankę na membranie (ryc. 1A). Umieść tkankę z odrobiną roztworu na błonie za pomocą plastikowej pipety do przenoszenia. W razie potrzeby odciąć wąską końcówkę pipety, aby uniknąć przywierania próbki tkanki do pipety podczas przenoszenia.</li>
	<li>Przymocuj siatkówkę za pomocą komórek zwojowych (GC) do góry: na membranie stopniowo usuwaj roztwór, jednocześnie rozprowadzając siatkówkę i rozkładając fałdy za pomocą kleszczy.</li>
	<li>Po przeciwnej stronie membrany umieścić pustą strzykawkę (1 ml) bezpośrednio pod tkanką. Zastosować ssanie, odciągając tłok do objętości 0,2-0,3 ml. Zwiększyć powierzchnię ssania, przecinając końcówkę przytrzymującą strzykawkę przed użyciem. Tkanka nie wymaga dalszego leczenia adhezji, ponieważ jest fizycznie zaplątana w błonę.</li>
</ol>
3. Wstrzyknięcie bolusa izolektyny Alexa 488
<ol>
	<li>Przygotuj pipety do plastrów i roztwór barwiący. Wyciągnij pipety z plastrem z borokrzemianowego szkła kapilarnego za pomocą ściągacza Flaming/Brown, o rezystancji ~1 MΩ. Delikatnie odłam końcówkę pipety.</li>
	<li>Przygotować roztwór barwiący, dodając 0,3 μl roztworu podstawowego izolektyny Alexa 488 do 10 μl roztworu Ringera buforowanego przez HEPES opisanego w kroku 1.2.</li>
	<li>Przenieść próbkę do zestawu patch-clamp w celu wstrzyknięcia (rysunek 1C). Umieścić membranę z dołączoną tkanką w komorze rejestracyjnej wypełnionej podgrzanym (37 °C) i natlenionym, buforowanym przez HEPES roztworem Ringera.</li>
	<li>Umieść pipetę zawierającą barwnik na wewnętrznej membranie ograniczającej (ILM, rysunek 2A). Za pomocą mikromanipulatora dosuń pipetę do ILM, aż dotrze do niej. Wstrzyknąć roztwór barwiący pod ciśnieniem 10-20 psi przez 1 sekundę za pomocą pikospritzera. Jedno lub wiele miejsc może być przeznaczonych do wstrzyknięcia (ryc. 2B). Jeśli pikospritzer nie jest dostępny, można użyć strzykawki o pojemności 10 ml w celu dostarczenia dodatniego ciśnienia powietrza do wstrzykiwań.</li>
	<li>Inkubować wstrzykniętą tkankę przez 10 minut. Podczas inkubacji wstrzykniętą tkankę można oglądać w świetle epifluorescencyjnym.</li>
	<li>Po znakowaniu preparat można zabrać do mikroskopu w celu wykonania badań obrazowych. Przenieś wkładkę do naczynia hodowlanego ze szklanym dnem, kładąc siatkówkę stroną do dołu (Rysunek 1C).</li>
	<li>Dodaj kroplę roztworu HEPES, aby próbka była wilgotna.</li>
	<li>Umieść 2-3 plamy smaru próżniowego na obwodzie plastikowego pierścienia, aby mocno przymocować wkładkę do dna naczynia hodowlanego.</li>
	<li>Przenieś naczynie do stolika mikroskopowego.</li>
</ol>
4. Wiązanie paraformaldehydu i karbodimidu
<ol>
	<li>Utrwalić próbkę, przenosząc wkładkę do utrwalacza na 15 minut. Można zastosować dłuższe lub krótsze czasy utrwalania, w zależności od zastosowania. Oba utrwalacze mogą być skutecznie stosowane do utrwalania GFP, izololektyny lub fluorescencyjnych hydrazydów Alexa (np. używanych do wypełniania komórek w nagraniach patch-clamp). 
	Uwaga: Do utrwalenia można użyć 4% roztworów karmodiimidu lub 4% roztworów paraformaldehydu. Aby utrzymać przyczepność, utrwalenie należy wykonać po tym, jak tkanka została już przymocowana do membrany. Tkanka może być unieruchomiona natychmiast po zamontowaniu lub po zapisie fizjologicznym i/lub wstrzyknięciu bolusa.</li>
	<li>Płukać tkankę w buforze fosforanowym (PB) przez 30 minut. Następnie tkanka może być przetworzona jako całość (krok 5) lub pocięta na pionowe sekcje, a następnie przetworzona (kroki 6 i 7).</li>
</ol>
5. Barwienie immunologiczne całych wierzchowców siatkówki
<ol>
	<li>W 24-dołkowym naczyniu (ryc. 1D) zablokuj kawałki siatkówki na membranie na 1 godzinę w roztworze barwiącym.</li>
	<li>Rozcieńczyć mysie przeciwciała pierwszorzędowe anty-PSD-95 w stosunku 1:300 w roztworze barwiącym i stosować przez 48 godzin w temperaturze pokojowej w ciemności. Dodaj ~ 100-150 μl roztworu przeciwciał do każdej studzienki z tkanką. Aby zapobiec wysychaniu, napełnij nieużywane studnie wodą destylowaną.</li>
	<li>Płukać przez 20 min w PB, 3x.</li>
	<li>Inkubować przez 24 godziny w przeciwciałie wtórnym anty-mysim Alexa 568 rozpuszczonym w stosunku 1:500 w roztworze barwiącym.</li>
	<li>Płukać przez 20 min w PB, 3x.</li>
	<li>Umieść wkładkę z zabarwioną chusteczką na standardowej szalce Petriego o średnicy 3 cm wypełnionej roztworem PB. Małymi nożyczkami wytnij z pierścienia część błony zawierającą siatkówkę.</li>
	<li>Przenieś siatkówkę na membranę na siatkówkę przesuwaną do góry. Usuń PB, dodaj podłoże montażowe. Umieść małe kawałki potłuczonego szkła nakrywkowego między szkiełkiem podstawowym a szkiełkiem nakrywkowym, aby uniknąć nadmiernego ściskania i uszkodzenia siatkówki. Umieść szkiełko nakrywkowe.</li>
	<li>Uszczelnij szkiełko nakrywkowe lakierem do paznokci. Przechowuj slajdy w ciemności, w lodówce.</li>
</ol>
6. Pionowe cięcie tkanki zamontowanej na błonie
<ol>
	<li>Po utrwaleniu zanurz tkankę na membranie w roztworach gradientu sacharozy 10%, 20% i 30% sacharozy odpowiednio na 30 minut, 1 godzinę i noc. Etap nocny wykonuje się w temperaturze 4 °C w lodówce, wszystkie inne etapy w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Za pomocą nożyczek usuń membranę z tkanką z plastikowego pierścienia wkładającego.</li>
	<li>Umieść odciętą membranę na Parafilm siatkówką do góry i usuń jak najwięcej roztworu za pomocą Kimwipes.</li>
	<li>Umieść Parafilm z tkanką w komorze kriostatu i dodaj kroplę pożywki OCT. Użyj urządzenia do szybkiego zamrażania, aby przyspieszyć zamrażanie.</li>
	<li>Odłącz zamrożoną próbkę i odwróć ją na drugą stronę.</li>
	<li>Wyciąć nadmiar zamrożonego OCT. Pozostawić około 2 mm wokół próbki z trzech stron i pozostawić 5-6 mm od strony, która będzie przymocowana do uchwytu.</li>
	<li>Przykryj odsłoniętą stronę siatkówki (stronę błony) kroplą OCT. Pozostaw obszar mocowania wolny.</li>
	<li>Zamrozić błonę z tkanką siatkówki. Teraz próbka jest gotowa do umieszczenia na uchwycie do cięcia.</li>
	<li>Umieść kroplę OCT na zimnym pierścieniu utrwalającym. Natychmiast włóż zamrożoną próbkę do kropli.</li>
	<li>Wyciąć odcinki o grubości 10-20 μm, ustawiając temperaturę kriostatu na -19 °C. Użyć ciepłych (temperatura pokojowa) szkiełek o przyczepności polisynowej (temperatura pokojowa). Pozostaw szkiełka z dołączonymi sekcjami na platformie grzewczej na ~2-3 minuty (41 °C) w ciemności, aby zapewnić mocne przyleganie sekcji.</li>
	<li>Włóż szkiełka do pudełka do przechowywania i przechowuj w temperaturze -20 °C do czasu użycia.</li>
</ol>
7. Barwienie immunologiczne odcinków siatkówki
<ol>
	<li>Wyjmij szkiełka z sekcjami z zamrażarki. Pozostaw je w temperaturze pokojowej przez 1 minutę, aby usunąć kondensat.</li>
	<li>Otocz sekcje blokerem cieczy, aby stworzyć barierę dla dalszej inkubacji.</li>
	<li>Umieść szkiełka w pudełku inkubacyjnym. Przykryj dno pudełka wodą, aby zapobiec parowaniu roztworu przeciwciała.</li>
	<li>Płukać PB przez 5 min.</li>
	<li>Przygotuj te same roztwory barwiące i postępuj zgodnie z krokami jak w kroku 5. Inkubacja z przeciwciałem pierwszorzędowym trwa noc, a z przeciwciałem wtórnym 1 godzina. Nie należy używać potłuczonego szkła między szkiełkiem nakrywkowym a szkiełkiem.</li>
</ol>

<ol><li>Csaba, G., Kovacs, P., Pallinger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EDAC+fixation+increases+the+demonstrability+of+biogenic+amines+in+the+unicellular+Tetrahymena%3A+a+flow+cytometric+and+confocal+microscopic+comparative+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol.+Int%22%5BJournal%5D)">EDAC fixation increases the demonstrability of biogenic amines in the unicellular Tetrahymena: a flow cytometric and confocal microscopic comparative analysis.</a> Cell Biol. Int. 30, 345-348 (2006).</li>
<li>Fletcher, E. L., Hack, I., Brandstatter, J. H., Wassle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+localization+of+NMDA+receptor+subunits+in+the+rat+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Synaptic localization of NMDA receptor subunits in the rat retina.</a> J. Comp. Neurol. 420, 98-112 (2000).</li>
<li>Gastinger, M. J., O'Brien, J. J., Larsen, N. B., Marshak, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histamine+immunoreactive+axons+in+the+macaque+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Histamine immunoreactive axons in the macaque retina.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 40, 487-495 (1999).</li>
<li>Haverkamp, S., Wassle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunocytochemical+analysis+of+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Immunocytochemical analysis of the mouse retina.</a> J. Comp. Neurol. 424, 1-23 (2000).</li>
<li>Koulen, P., Fletcher, E. L., Craven, S. E., Bredt, D. S., Wassle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunocytochemical+localization+of+the+postsynaptic+density+protein+PSD-95+in+the+mammalian+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Immunocytochemical localization of the postsynaptic density protein PSD-95 in the mammalian retina.</a> J. Neurosci. 18, 10136-10149 (1998).</li>
<li>Pena, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miRNA+in+situ+hybridization+in+formaldehyde+and+EDC-fixed+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">miRNA in situ hybridization in formaldehyde and EDC-fixed tissues.</a> Nat. Methods. 6, 139-141 (2009).</li>
<li>Tymianski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+use+for+a+carbodiimide+compound+for+the+fixation+of+fluorescent+and+non-fluorescent+calcium+indicators+in+situ+following+physiological+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">A novel use for a carbodiimide compound for the fixation of fluorescent and non-fluorescent calcium indicators in situ following physiological experiments.</a> Cell Calcium. 21, 175-183 (1997).</li>
<li>Sagdullaev, B. T., Eggers, E. D., Purgert, R., Lukasiewicz, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonlinear+interactions+between+excitatory+and+inhibitory+retinal+synapses+control+visual+output%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Nonlinear interactions between excitatory and inhibitory retinal synapses control visual output.</a> J. Neurosci. 31, 15102-15112 (2011).</li>
<li>Toychiev, A. H., Sagdullaev, B., Yee, C. W., Ivanova, E., Sagdullaev, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+time+and+cost+efficient+approach+to+functional+and+structural+assessment+of+living+neuronal+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">A time and cost efficient approach to functional and structural assessment of living neuronal tissue.</a> J. Neurosci. Methods. 214, 105-112 (2013).</li>
<li>Yee, C. W., Toychiev, A. H., Sagdullaev, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Network+deficiency+exacerbates+impairment+in+a+mouse+model+of+retinal+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Syst.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Network deficiency exacerbates impairment in a mouse model of retinal degeneration.</a> Front Syst. Neurosci. 6, 8(2012).</li>
<li>Ivanova, E., Muller, U., Wassle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+glycinergic+input+to+bipolar+cells+of+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Characterization of the glycinergic input to bipolar cells of the mouse retina.</a> Eur. J. Neurosci. 23, 350-364 (2006).</li>
<li>Dmitrieva, N. A., Strang, C. E., Keyser, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+alpha+7+nicotinic+acetylcholine+receptors+by+bipolar%2C+amacrine%2C+and+ganglion+cells+of+the+rabbit+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Expression of alpha 7 nicotinic acetylcholine receptors by bipolar, amacrine, and ganglion cells of the rabbit retina.</a> J. Histochem. Cytochem. 55, 461-476 (2007).</li>
</ol>

Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Wysoka biokompatybilność i przezroczystość hydrofilizowanej membrany PTFE w roztworach jest korzystna podczas pracy z żywą tkanką. Preparat ten był z powodzeniem stosowany we wcześniejszych pracach do nagrań patch-clamp odpowiedzi świetlnych8-10. W tym miejscu pokazujemy, w jaki sposób można zastosować to podejście do analizy statyczno-wytrzymałościowej siatkówki całokształtowej.
Technika ładowania bolusem może być skutecznie stosowana do znakowania żywej tkanki. Technika ta jest ws...

Przeprowadzanie immunohistochemii w delikatnych, nienaruszonych tkankach wiąże się z ryzykiem uszkodzenia podczas przenoszenia i przenoszenia. Może to wystąpić zarówno w wycinkach mózgu, jak i innych cienkich tkankach, takich jak zdegenerowana siatkówka. Ponadto istnieją pewne metody utrwalania tkanek, które mogą być korzystne dla barwienia immunologicznego struktur neuronalnych, ale powodują upośledzenie stabilności strukturalnej, co wyklucza ich stosowanie. Szczególnym tego przykładem jest utrwalanie na bazie karbodiamidu, które jest lepsze w barwieniu receptorów i hormonów1-7, ale zwykle unika się go ze względu na niestabilność utrwalonej tkanki.
Tutaj opisujemy procedurę, która wykorzystuje hydrofilizowaną membranę PTFE do strukturalnego podtrzymywania delikatnej tkanki, zarówno stałej, jak i nieutrwalonej, dla różnych technik barwienia. Membrana nośna pozwala na manipulację delikatną tkanką przed i po utrwaleniu, co pozwala na kilka etapów przetwarzania przy jednoczesnym zminimalizowaniu ryzyka uszkodzenia tkanki. Ogólnie rzecz biorąc, ta prosta metoda zachowania integralności tkanek daje możliwość zastosowania technik, których w przeciwnym razie można by uniknąć. W związku z tym podejście to może być również z powodzeniem stosowane do przygotowywania szerokiej gamy tkanek, takich jak wycinki mózgu, które stają się kruche po procedurach krojenia.

<table><tbody><tr><td>Wkładka do hodowli komórkowych Millicell, 12 mm, hydrofilowy PTFE (Biopore), 0,4 &mu; m</td><td>Millipore</td><td>PICM01250</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka insulinowa, 1 ml</td><td>Beckton Dickinson</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki</td><td>Fine Science Tools</td><td>15003-08</td> kleszcze <td>preparacyjne</td></tr>, <tr><td>Dumont #55, inox</td><td>Fine Science Tools</td><td>11255-20</td><td>preparacja</td></tr><tr><td>Kriostat,</td><td>Leica</td>, <td>różne</td><td></td></tr><tr><td>systemy mikroskopu konfokalnego</td>, <td>Nikon</td><td>różne</td><td></td></tr><tr><td>Szkło kapilarne</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B150F-4</td><td></td></tr><tr><td>P-97 Flaming/Brown Ściągacz do mikropipet</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Picospritzer III</td><td>Parker Hannifin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Naczynia do hodowli ze szklanym dnem</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-0-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Szalka Petriego</td><td>Falcon</td><td>1008</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowe pipety z podziałką</td><td>VWR</td><td>16001-180</td><td></td></tr><tr><td>Płytki wielodołkowe, 24-dołkowe</td><td>Beckton Dickinson</td><td>351147</td><td></td></tr><tr><td>Szkło nakrywkowe, #1</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>72200-30</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka adhezyjne polisynowe</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>63412-01</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe</td><td>Globe</td><td>1301</td><td></td></tr><tr><td>Liquid Blocker</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>71312</td><td></td></tr><tr><td>Podłoże montażowe VECTASHIELD</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>OCT średnia</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm film laboratoryjny</td><td>Fisher</td><td>13-374-10</td><td></td></tr><tr><td>Dow Corning smar wysokopróżniowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z273554</td><td></td></tr><tr><td>Mouse przeciwciało anty-PSD95</td><td>Millipore</td><td>MABN68</td><td></td></tr><tr><td>Osioł anty-mysz Alexa 568</td><td>Invitrogen</td><td>A10037</td><td></td></tr> przeciwciało <tr><td>Izolektyna Alexa 488</td><td>Invitrogen</td><td>I21411</td><td></td></tr><tr><td>Chemiblocker</td><td>Chemicon</td><td>2170S</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Sulforodamina</td><td>Sigma-Aldrich 341738</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Karbodimid</td><td>Thermo Scientific</td><td>22980</td><td>EDC</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr></tbody></table>

zoptymalizowany protokół przygotowania całej siatkówki do obrazowania i immunohistochemii

Optimized Protocol for Retinal Wholemount Preparation for Imaging and Immunohistochemistry

Praca z delikatną tkanką może być czynnikiem komplikującym podczas przeprowadzania oceny immunohistochemicznej. W tym miejscu przedstawiamy metodę, która wykorzystuje hydrofilizowaną membranę PTFE opartą na pierścieniu, aby zapewnić wsparcie strukturalne zarówno żywej, jak i utrwalonej tkance podczas przetwarzania immunohistochemicznego, co pozwala na zastosowanie różnych protokołów, które w przeciwnym razie spowodowałyby uszkodzenie tkanki. Po pierwsze, demonstruje się to za pomocą ładowania markerów fluorescencyjnych w bolusie do żywej tkanki siatkówki. Metoda ta pozwala na szybką wizualizację docelowych struktur, natomiast podparcie błonowe utrzymuje integralność tkanek podczas iniekcji i pozwala na łatwe przeniesienie preparatu do dalszego obrazowania lub obróbki.
Po drugie, opisana jest procedura barwienia przeciwciał w tkance utrwalonej karbodimidem. Chociaż wiązanie paraformaldehydu jest bardziej powszechne, wiązanie karbodimidu zapewnia doskonały substrat do wizualizacji białek synaptycznych. Ograniczeniem karbodimidu jest to, że powstała w ten sposób utrwalona tkanka jest stosunkowo delikatna; Jest to jednak przezwyciężane za pomocą membrany nośnej. Do zademonstrowania tych technik wykorzystuje się tkankę siatkówki, ale można je zastosować do dowolnej delikatnej tkanki.

Przedstawiono tutaj dwa reprezentatywne eksperymenty, w których zastosowanie hydrofilizowanej membrany PTFE do podtrzymywania całej siatkówki podczas procedur barwienia przynosi korzyści. Pierwszy eksperyment ilustruje metodę szybkiej i prostej charakterystyki naczyń krwionośnych siatkówki, czyli rozbudowanej sieci naczyń krwionośnych rozciągających się przez wiele warstw siatkówki (Rysunek 2). Podejście to łączy dawkowe wprowadzanie izolektyny z barwieniem imersyjnym przy użyciu SRH. Jest to wydajna met...

Opisany tutaj protokół służy do oceny strukturalnej preparatu całego siatkówki. Obejmuje to opisy rozwarstwiania tkanek, montażu na hydrofilizowanej wkładce membranowej z politetrafluoroetylenu (PTFE), ładowania bolusa markerami fluorescencyjnymi oraz porównanie utrwalania z karbodiimidem i paraformaldehydem do analizy immunohistochemicznej składników komórkowych i synaptycznych.

Zoptymalizowany protokół przygotowania całej siatkówki do obrazowania i immunohistochemii

Working with delicate tissue can be a complicating factor when performing immunohistochemical assessment. Here, we present a method that utilizes a ...

Niniejsza procedura wykorzystuje tkankę siatkówki mysiej do zaprezentowania sposobu stabilizacji delikatnej tkanki nerwowej w celu zachowania jej integralności strukturalnej. W trakcie kilku etapów barwienia immunohistochemicznego należy najpierw przeprowadzić enukleację oka, usunąć rogówkę i oddzielić siatkówkę od twardówki. Następnie należy wykonać nacięcia w kielichu siatkówkowym, aby spłaszczyć tkankę.Następnie przymocuj siatkówkę do membrany wzmocnionej pierścieniem, używając przeniesienia metodą ssącą bez bezpośredniej manipulacji, aby zachować integralność tkanki. Teraz przenieś pierścień na płytkę wielodołkową w celu przeprowadzenia barwienia. Nasze wyniki pokazują, że technika ta może być skutecznie stosowana w żywej tkance i zapewnia lepsze podłoże do obrazowania białek synaptycznych w porównaniu do istniejących metod postępowania z wypreparowaną siatkówką.Techniki te umożliwiają przeniesienie delikatnej tkanki przy minimalnej manipulacji fizycznej. Dzięki temu zmniejsza się ryzyko zniekształcenia i uszkodzenia preparatu. Pomysł ten pojawił się, gdy zaistniała potrzeba rejestracji sygnałów z tkanki zamontowanej płasko u myszy RD one, modelu degeneracji siatkówki; siatkówka tych myszy jest niezwykle cienka i krucha ze względu na rozległą utratę komórek spowodowaną mutacją Chief.W demonstracji procedury pomógł mi postdoc z naszego laboratorium. Najpierw należy przeprowadzić enuklację oczu zanarkizowanej myszy i przenieść je do natlenionego roztworu Heapsa-Ringer. Aby usunąć rogówkę, należy uchwycić oko pęsetą w obrębie limbusa, a następnie wykonać cięcie okrężne wzdłuż ora serrata.Za pomocą pęsety wyciągnij soczewkę w celu wykonania wstrzyknięć bolusowych oraz pomiarów elektrofizjologicznych. Użyj pęsety z zaokrąglonymi końcówkami, aby usunąć jak najwięcej ciała szklistego. Następnie ustabilizuj oczodoł, mocno trzymając twardówkę pęsetą.Umieść drugą pęsetę pomiędzy siatkówką a kielichowatą częścią gałki ocznej. Powoli przesuwaj pęsetę wzdłuż obwodu. Przetnij nerw wzrokowy pomiędzy siatkówką a kielichowatą częścią gałki ocznej, a następnie usuń tę część za pomocą nożyczek.Wykonaj nacięcia od obwodu siatkówki aż do nerwu wzrokowego. Alternatywnie, aby wykorzystać całą siatkówkę, wykonaj nacięcia od obwodu do połowy drogi do nerwu wzrokowego w celu skrócenia uchwytu. Usuń nadmiar materiału za pomocą tokarki.Następnie wygładzić szorstkie powierzchnie za pomocą drobnoziarnistego papieru ściernego. Zdjąć nóżki znajdujące się pod pierścieniem. Odciąć wąski czubek plastikowej pipety.Następnie przenieś tkankę wraz z niewielką ilością roztworu na membranę. Stopniowo usuwaj roztwór, rozprostowując siatkówkę i rozkładając tkankę. Teraz przymocuj siatkówkę do membrany tak, aby komórki zwojowe były skierowane ku górze.Odetnij końcówkę strzykawki o pojemności 1 ml i umieść ją bezpośrednio pod tkanką. Cofnij tłok do objętości około 0,3 ml, aby fizycznie uwięzić tkankę wewnątrz błony. Wytraw pipety kapilarne z borokrzemianu, stosując opór wynoszący około 1 MΩ.Następnie delikatnie odłam końcówkę każdej pipety patch. Dalej, dodaj 0,3 µL roztworu barwiącego selectynę z roztworu zapasowego do 10 µL roztworu HEAPS buffered ringer. Teraz umieść membranę w komorze rejestracyjnej przepływanej ciepłym, natlenionym roztworem HEAPS buffered ringer.Używając mikromanipulatora, ustaw pipetę z barwnikiem przy błonie ograniczającej wewnętrznej. Przesuń pipetę dalej, aby przebić błonę ograniczającą wewnętrzną. Następnie wstrzyknij roztwór barwiący w jedno lub kilka wybranych miejsc.Następnie odczekać 10 minut, aby tkanka mogła dojść do siebie po iniekcji, obserwując ją w oświetleniu fluorescencyjnym epi. W razie potrzeby przenieść wkład do szalki hodowlanej z szklanym dnem, umieszczając go stroną siatkówki do dołu. Dodać jedną kroplę roztworu HEP, aby utrzymać próbkę w stanie wilgotnym.Należy również nanieść trzy kropelki smaru próżniowego wokół obwodu plastikowego pierścienia, aby mocno przymocować wkładkę do szalki hodowlanej. Po utrwaleniu przenieść szalkę na stolik mikroskopu, a następnie zanurzyć membranę w roztworach gradientu sacharozy. Wyciąć membranę z plastikowego pierścienia wkładki.Usuń jak najwięcej roztworu za pomocą chusteczek Kimwipe i umieść próbkę na parafilmie siatkówką do góry. Przenieś parafilm z tkanką do komory kriotoma i dodaj kroplę medium OCT. Użyj urządzenia do szybkiego mrożenia, aby przyspieszyć proces zamrażania.Odseparuj zamrożoną próbkę i odwróć ją. Następnie odetnij nadmiar zamrożonego OCT. Pozostaw około dwóch milimetrów wokół próbki z trzech stron oraz milimetr od strony, która zostanie przymocowana do uchwytu.Przykryj odsłoniętą stronę siatkówki kroplą OCT, pozostawiając wolny obszar przyczepienia. Zamroź membranę zawierającą tkankę siatkówki. Nanieś kroplę OCT na zimny pierścień uchwytu.Natychmiast przenieś zamrożoną próbkę do kriosztatu. Wykonaj skrawki o grubości 10 do 20 µm w temperaturze -19 °C i umieść je na podgrzanych szkiełkach z powłoką z polilizyny. Szkiełka z przytwierdzonymi skrawkami umieść na platformie grzewczej o temperaturze 41 °C na dwie do trzech minut w ciemności.Następnie próbki należy przechowywać w temperaturze -20 °C. Eksperyment ten ilustruje szybką i prostą charakterystykę unaczynienia siatkówki jako rozbudowanej sieci naczyń krwionośnych rozciągających się przez wiele warstw siatkówki. Dzięki połączeniu bolusowego podania iso-selektyny z immersyjnym znakowaniem sulforodaminą, możliwe jest niemal natychmiastowe obrazowanie i skanowanie żywej tkanki siatkówki, co pozwala na znakowanie naczyń krwionośnych od warstw powierzchownych do głębokich.W przeciwieństwie do substancji relatywnie dobrze dyfundujących, SRH nie przenika skutecznie przez wewnętrzną błonę ograniczającą. Istnieje kilka zalet fiksacji karbimidem w porównaniu z konwencjonalną fiksacją paraformaldehydem podczas znakowania białek synaptycznych; na przykład po krótkim okresie fiksacji karbimidem barwienie immunofluorescencyjne markera synaptycznego PSD 95 w IPL wykazało jasny, punktowy obraz, co pozwoliło na rozróżnienie poszczególnych synaps.W przeciwieństwie do tego, przy użyciu konwencjonalnego utrwalacza na bazie paraformaldehydu, identyfikacja komponentów synaptycznych jest mniej wyraźna. Podobne wyniki uzyskano w mrożonych przekrojach siatkówki. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dokładną wiedzę na temat tego, jak przymocować delikatną tkankę do tej membrany oraz jak przeprowadzić barwienie cytochemiczne preparatu.Mocowanie siatkówki do filtra zajmie 15 minut.

optimized-protocol-for-retinal-wholemount-preparation-for-imaging

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Zoptymalizowany protokół przygotowania całopokładowego siatkówki do obrazowania i immunohistologii

Mysia siatkówka noworodka dostarcza dobrze scharakteryzowanego fizjologicznego modelu angiogenezy, który pozwala na badanie ról różnych genów lub leków modulujących angiogenezę w kontekście in vivo. Barwienie immunofluorescencyjne w celu dokładnej wizualizacji splotu naczyniowego ma kluczowe znaczenie dla powodzenia tego typu badań.

Barwienie immunofluorescencyjne siatkówki noworodka myszy w celu zbadania angiogenezy in vivo

Protokoły immunohistochemiczne są używane do badania lokalizacji określonego białka w siatkówce. Techniki obrazowania wapnia są wykorzystywane do badania dynamiki wapnia w komórkach zwojowych siatkówki i ich aksonach.

Metody obrazowania immunohistochemicznego i wapniowego w siatkówce szczura

Pokazujemy trzy różne techniki przygotowania tkanek do immunohistochemicznej wizualizacji mikrokrążeń siatkówki szczura, tj. kriosekcje, całe wierzchowania i hipotoniczne izolowanie sieci naczyniowej.

Kriowycinki siatkówki, całe wierzchowania i hipotoniczne izolowane preparaty naczyniowe do immunohistochemicznej wizualizacji perycytów mikronaczyniowych

Ten raport opisuje kompleksowe metody przygotowania zamrożonych wycinków siatkówki myszy do immunohistochemii (IHC).  Opisane metody obejmują rozwarstwienie tylnej części gałki ocznej, utrwalanie paraformaldehydu, osadzanie w pożywkach o optymalnej temperaturze cięcia (OCT) i orientację tkanki, cięcie i barwienie immunologiczne.

Przygotowanie kriosekcji siatkówki myszy do immunohistochemii

Tutaj prezentujemy protokół adaptacji metody CLARITY tkanek mózgowych do całych siatkówek, aby poprawić jakość standardowego barwienia immunohistochemicznego i obrazowania w wysokiej rozdzielczości neuronów siatkówki i ich struktur subkomórkowych.

Barwienie immunologiczne całych siatkówek metodą CLARITY Tissue Clearing

Metanol może być używany jako pomocnicze stałe podłoże do przygotowania całej siatkówki i długoterminowego przechowywania, co jest przydatne do badania komórek zwojowych siatkówki.

Preparat na bazie metanolu do badania komórek zwojowych siatkówki

Ten protokół opisuje szczegółowe etapy wstępnego wdrażania mikroskopii immunoelektronowej, skupiając się na badaniu obwodów synaptycznych i lokalizacji białek w siatkówce.

Badanie obwodów siatkówki i lokalizacji molekularnej poprzez wstępne osadzenie mikroskopii immunoelektronowej

Ten protokół opisuje szczegółowe kroki przygotowania próbek siatkówki do objętościowej mikroskopii elektronowej, skupiając się na cechach strukturalnych końcówek fotoreceptorów siatkówki.

Przygotowanie próbek siatkówki do objętościowej mikroskopii elektronowej

Ten protokół zapewnia zoptymalizowaną i skomplikowaną procedurę przygotowania próbek organoidów siatkówki do transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Nadaje się do zastosowań, które obejmują analizę synaps w dojrzałych organoidach siatkówki.

Przygotowanie próbek organoidów siatkówki do transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Ten protokół opisuje procedurę izolowania całej siatkówki myszy i przeprowadzania barwienia immunologicznego w celu oznaczenia wszystkich komórek zwojowych siatkówki (RGC). Po procesie następuje obrazowanie i automatyczne zliczanie RGC za pomocą oprogramowania opartego na sztucznej inteligencji, co zapewnia prostą, szybką i dokładną metodę ilościowego określania RGC w całej siatkówce myszy.

Barwienie immunologiczne w całości i automatyczne zliczanie komórek zwojowych siatkówki myszy

Protokół ten łączy w sobie oczyszczanie optyczne i znakowanie immunologiczne w celu obrazowania konfokalnego całej objętości organoidów siatkówki z pełnym mocowaniem. Zachowuje strukturę 3D, umożliwiając szczegółową wizualizację kluczowych ścieżek neuronalnych, usprawniając badanie dojrzewania siatkówki, organizacji przestrzennej i jej potencjalnych zastosowań w modelowaniu chorób i medycynie spersonalizowanej.

Wizualizacja organoidów siatkówki w całości z rozdzielczością komórkową

Poznaj zoptymalizowany protokół przygotowania całej siatkówki do obrazowania i immunohistochemii przy użyciu tkanki siatkówki myszy. Ta metoda zachowuje integralność strukturalną delikatnej tkanki nerwowej.

Zoptymalizowany protokół przygotowania całej siatkówki do obrazowania i immunohistochemii

Przeglądaj więcej filmów