Name: Izolacja i hodowla komórek śródbłonka z zarodka przodomózgowia (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 2 s
Description: Poznaj izolację i hodowlę komórek śródbłonka z zarodka przodomózgowia. Ta metoda umożliwia badanie angiogenezy mózgowej i interakcji nerwowo-naczyniowych w kontrolowanych warunkach laboratoryjnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez National Alliance for Research on Schizofrenia and Depression (NARSAD) Young Investigator Award oraz grant National Institutes of Health R01NS073635 dla AV.

1. Przygotowanie odczynników i roztworów
<ol>
	<li>Powłoka naczynia hodowlanego o średnicy 35 mm: Roztwór kolagenu typu 1 jest dostarczany w postaci roztworu wodnego w 20 mM kwasie octowym (~100 mg białka/fiolkę). Rozcieńczyć odpowiednią objętość roztworu kolagenu do stężenia roboczego 0,01% przy użyciu sterylnej wody do hodowli tkankowych. Naczynia należy pokryć 1 ml roztworu kolagenu przez 3-4 godziny w temperaturze pokojowej (RT) lub 37 °C lub przez noc w temperaturze 2-8 °C. Usunąć nadmiar roztworu z powlekanego naczynia i pozostawić do wyschnięcia na noc. Opłucz naczynie wodą z kultur tkankowych lub PBS przed dodaniem pożywki. Naczynia powlekane można przechowywać w temperaturze 4 °C przez jeden miesiąc.</li>
	<li>Przygotuj kompletne podłoże Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM). Uzupełnij DMEM (500 ml) w 10% FBS i roztwór antybiotykowo-przeciwgrzybiczy (1x stężenie; 1 ml/100 ml). Kompletny DMEM może być przechowywany w temperaturze 4 °C przez dwa miesiące.</li>
	<li>Przygotować podwielokrotność (50 ml) DMEM z DNazą I (0,001 mg/ml) (określaną jako DMEM-DNaza I).</li>
	<li>Przygotować kolejną porcję (10 ml) DMEM z kolagenazą i dypazą (1 mg/ml) (określaną jako DMEM-kolagenaza/dispaza).</li>
	<li>Przygotować pożywkę do hodowli komórek śródbłonka (ECCM, 500 ml), uzupełnioną EGF (5 μg), EKG (100 mg) i 5 μl roztworu antybiotykowo-przeciwgrzybiczego. ECCM można przechowywać w temperaturze 4 °C przez dwa miesiące.</li>
	<li>Podgrzej wszystkie media przed użyciem.</li>
	<li>Przygotować bufor oczyszczający: PBS, pH 7,2 z 0,5% BSA i 2 mM EDTA. Przechowywać bufor w niskiej temperaturze (2-8 °C).</li>
</ol>
2. Usuwanie zarodków i rozwarstwianie kresomózgowia
Wszystkie eksperymenty z użyciem zwierząt laboratoryjnych są zatwierdzane przez komitety ds. opieki nad zwierzętami i ich użytkowania w McLean Hospital i są zgodne z wytycznymi NIH dotyczącymi opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych.
<ol>
	<li>Użyj ciężarnych myszy CD1 w czasie (15 dzień embrionalny). Dzień odkrycia czopa dopochwowego jest uważany za dzień embrionalny 0 (E0). Matki CD1 na ogół produkują duże mioty, więc od ciężarnej matki oczekuje się 10-12 zarodków.</li>
	<li>W przypadku histerotomii należy znieczulić ciężarne myszy wstrzyknięciem dootrzewnowym ketaminy (100 mg / kg) / ksylazyny (5 mg / kg). W przypadku myszy o wadze około 20-30 g należy dostarczyć 0,3 ml roztworu znieczulającego o stężeniu 10 ml/kg ketaminy/ksylazyny i upewnić się, że ból i niepokój są minimalne podczas dootrzewnowych wstrzyknięć środka znieczulającego. Do wstrzykiwań należy stosować środki przytrzymujące ręce.</li>
	<li>Sprawdź głębokie znieczulenie przez uszczypnięcie palca u nogi. Usuń zarodki od głęboko znieczulonych myszy. Odetnij głowę każdemu zarodkowi natychmiast po usunięciu go od matki. Umieść głowy zarodków na sterylnych szalkach Petriego w lodowatym PBS.</li>
	<li>Po histerektomii należy dokonać natychmiastowej eutanazji z przedawkowaniem środka znieczulającego (130 mg/kg pentobarbitalu, i.p.), metody eutanazji, która jest zgodna z wytycznymi AVMA dotyczącymi eutanazji zwierząt: wydanie z 2013 r.</li>
	<li>Pod mikroskopem stereoskopowym usuń mózg z głowy za pomocą cienkich nożyczek z mikrokońcówkami i cienkich kleszczy. Uwaga: Wysokiej jakości sekcja jest niezbędna do skutecznego usunięcia błony jajowej z mózgu embrionalnego. Osiąga się to poprzez praktykę. Cienkie kleszcze i nożyczki z mikrokońcówkami są również kluczowymi narzędziami do uzyskania dobrej sekcji.</li>
	<li>Użyj kleszczy, aby mocno chwycić mózg i nożyczek z mikrokońcówkami, aby odkleić błonę włosową. Usuń śródmózgowie i śródmózgowie i odizoluj kresomózgowie. Przenieść kresomózgowie wolne od pialu ze wszystkich zarodków do naczynia hodowlanego o średnicy 35 mm z 2 ml PBS w lodzie.</li>
</ol>
3. Izolacja komórek
<ol>
	<li>Zmielić kresomózgowie na fragmenty o średnicy 1-2 mm za pomocą ostrza skalpela i zebrać tkankę w 15 ml probówce Falcon zawierającej 2 ml kompletnego DMEM.</li>
	<li>Delikatnie, ale dokładnie rozdzielić tkankę za pomocą pipety o pojemności 1 ml, aż do zniknięcia grudek i uzyskania mlecznej zawiesiny.</li>
	<li>Odwirować zdysocjowane komórki przy 800-1 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Ostrożnie usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w DMEM-DNaza I. Delikatnie ponownie rozdzielić komórki za pomocą pipety 1 ml i odwirować przy 800-1,000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Ponownie zawiesić osad w ciepłym, kompletnym DMEM. Przefiltruj komórki przez sterylną siatkę nylonową o grubości 70 μm. Zbierz przefiltrowane komórki i trzymaj w lodzie.</li>
	<li>Zebrać części komórek zatrzymane na siatce i dalej trawić za pomocą kolagenazy DMEM/dypazy (2 ml) przez 1-2 minuty w temperaturze pokojowej. Przemyć komórki 3x w DMEM-DNazie I przez wirowanie w temperaturze 800-1000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Połączyć te komórki z przefiltrowanymi komórkami zebranymi w kroku 3.5. Umyj wszystkie komórki raz za pomocą kompletnego DMEM. Kontynuuj określanie numeru komórki i etapów etykietowania magnetycznego. Uwaga: Ważne jest, aby uzyskać zawiesinę jednokomórkową przed etykietowaniem magnetycznym.</li>
</ol>
4. Etykietowanie magnetyczne
<ol>
	<li>Ten protokół pokazuje magnetyczne znakowanie 107 komórek. W przypadku komórek o numerach mniejszych niż 107 należy użyć tej samej objętości odczynnika, a w przypadku liczby komórek większej niż 107 należy odpowiednio zwiększyć wszystkie objętości odczynników i objętości całkowite (np. w przypadku komórek o wymiarach 2 x 107 należy użyć podwójnej objętości wszystkich wskazanych odczynników). Trzymaj wszystkie odczynniki i komórki w lodzie.</li>
	<li>Określ numer komórki za pomocą hemocytometru.</li>
	<li>Odwirować zawiesinę komórek przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Całkowicie odessać supernatant.</li>
	<li>Dodać 90 μl/107 komórek buforu oczyszczającego do osadu komórkowego, a następnie 10 μl mikrokulek CD31. Mikrogranulki dostarczone przez producenta są sprzężone z monoklonalnym przeciwciałem anty-mysim CD31.</li>
	<li>Dobrze wymieszaj i inkubuj przez 15 minut w lodówce. Uwaga: Wyższe temperatury i/lub dłuższy czas inkubacji podczas etykietowania magnetycznego mogą skutkować niespecyficznym wiązaniem.</li>
	<li>Przemyć komórki, dodając 1-2 ml/107 komórek buforu oczyszczającego i odwirować przy 300 x g przez 10 min. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w 500 μl buforu oczyszczającego. Przejdź do etapu separacji magnetycznej lub oczyszczania.</li>
</ol>
5. Oczyszczanie
<ol>
	<li>Umieść kolumnę MS w polu magnetycznym separatora MACS.</li>
	<li>Przepłukać kolumnę 500 μl buforu oczyszczającego.</li>
	<li>Nałóż zawieszenie komórek na kolumnę. Załaduj odpowiednią liczbę komórek do kolumny MS, ponieważ większa liczba komórek może zatkać kolumnę. Uwaga: Każda kolumna MS może pomieścić maksymalną liczbę komórek 2 x 107, aby uzyskać większą liczbę komórek, użyj większej liczby kolumn.</li>
	<li>Zbierz i wyrzuć przepływowe komórki zawierające nieoznakowane komórki.</li>
	<li>Przepłukać kolumnę trzykrotnie 500 μl buforu oczyszczającego. Podczas etapów mycia należy upewnić się, że zbiornik kolumny jest pusty przed dodaniem kolejnych podwielokrotności bufora oczyszczającego.</li>
	<li>Wyjmij kolumnę z separatora MACS i umieść ją na probówce Falcon o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Tłok jest dostarczany wraz z kolumną MS. Odpipetować 1 ml buforu oczyszczającego na kolumnę MS i natychmiast wypłukać magnetycznie znakowane komórki, mocno wciskając tłok do kolumny.</li>
	<li>Płytki na szalce hodowlanej o średnicy 35 mm wstępnie pokrytej kolagenem typu 1 i hodować komórki w ECCM w inkubatorze ustawionym na 37 °C z 95%O2 i 5% CO2 .</li>
	<li>Zmieniaj podłoże co cztery dni. Użyj PVEC do eksperymentów lub subkultury po 10-12 dniach, gdy danie jest zlewne.</li>
</ol>
6. Subkultura PV ECS
<ol>
	<li>Wyjąć ECCM i przepłukać monowarstwę PVECS 1-2 ml sterylnego PBS.</li>
	<li>Delikatnie dodaj 1,5 ml 0,25% roztworu trypsyny-EDTA, aby pokryć monowarstwę komórki.</li>
	<li>Włóż naczynie z powrotem do inkubatora. W ciągu 5-7 minut komórki oderwą się od powierzchni naczynia.</li>
	<li>Po odłączeniu komórek natychmiast dodaj równą objętość inhibitora trypsyny i kilkakrotnie rozcieraj.</li>
	<li>Przenieść komórki do sterylnej probówki Falcon o pojemności 15 ml. Odwirować probówkę o sile 500 x g przez 5 minut.</li>
	<li>Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 ml podgrzanego ECCM.</li>
	<li>Zasiej komórki w celu namnażania hodowli, obrazowania lub innych testów.</li>
</ol>

<ol><li>Shen, Q., S, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cells+stimulate+self-renewal+and+expand+neurogenesis+of+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Endothelial cells stimulate self-renewal and expand neurogenesis of neural stem cells.</a> Science. 304, 1338-1340 (2004).</li>
<li>Milner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+three-dimensional+system+to+study+interactions+between+endothelial+cells+and+neural+cells+of+the+developing+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A novel three-dimensional system to study interactions between endothelial cells and neural cells of the developing central nervous system.</a> BMC Neurosci. 8, 3 (2007).</li>
<li>Rauch, M. F., Michaud, M., Xu, H., Madri, J. A., Lavik, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-culture+of+primary+neural+progenitor+and+endothelial+cells+in+a+macroporous+gel+promotes+stable+vascular+networks+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Co-culture of primary neural progenitor and endothelial cells in a macroporous gel promotes stable vascular networks in vivo.</a> 19, 1469-1485 (2008).</li>
<li>Vasudevan, A., Long, J. E., Crandall, J. E., Rubenstein, J. L., Bhide, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartment-specific+transcription+factors+orchestrate+angiogenesis+gradients+in+the+embryonic+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Compartment-specific transcription factors orchestrate angiogenesis gradients in the embryonic brain.</a> Nat. Neurosci. 11, 429-439 (2008).</li>
<li>Vasudevan, A., Bhide, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenesis+in+the+embryonic+CNS%3A+a+new+twist+on+an+old+tale%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Adh.+Migr%22%5BJournal%5D)">Angiogenesis in the embryonic CNS: a new twist on an old tale.</a> Cell Adh. Migr. 2, 167-169 (2008).</li>
<li>Won, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autonomous+vascular+networks+synchronize+GABA+neuron+migration+in+the+embryonic+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Autonomous vascular networks synchronize GABA neuron migration in the embryonic forebrain.</a> Nat. Commun. 4, 2149-2162 (2013).</li>
<li>Dong, Q. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+strategy+for+isolation+of+endothelial+cells+from+murine+tissues.+Characterization+of+two+endothelial+cell+lines+from+the+murine+lung+and+subcutaneous+sponge+implants%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler.+Thromb.+Vasc.+Biol%22%5BJournal%5D)">A general strategy for isolation of endothelial cells from murine tissues. Characterization of two endothelial cell lines from the murine lung and subcutaneous sponge implants.</a> Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 17, 1599-1604 (1997).</li>
<li>Erblich, B., Zhu, L., Etgen, A. M., Dobrenis, K., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absence+of+colony+stimulation+factor-1+receptor+results+in+loss+of+microglia%2C+disrupted+brain+development+and+olfactory+deficits%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Absence of colony stimulation factor-1 receptor results in loss of microglia, disrupted brain development and olfactory deficits.</a> PLoS One. 6, (2011).</li>
<li>Wichterle, H., Garcia-Verdugo, J. M., Herrera, D. G., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Young+neurons+from+medial+ganglionic+eminence+disperse+in+adult+and+embryonic+brain%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Young neurons from medial ganglionic eminence disperse in adult and embryonic brain.</a> 2, 461-466 (1999).</li>
<li>Snapyan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vasculature+guides+migrating+neuronal+precursors+in+the+adult+mammalian+forebrain+via+brain-derived+neurotrophic+factor+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Vasculature guides migrating neuronal precursors in the adult mammalian forebrain via brain-derived neurotrophic factor signaling.</a> J. Neurosci. 29, 4172-4188 (2009).</li>
<li>Whitman, M. C., Fan, W., Rela, L., Rodriguez-Gil, D. J., Greer, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+vessels+form+a+migratory+scaffold+in+the+rostral+migratory+stream%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Blood vessels form a migratory scaffold in the rostral migratory stream.</a> J. Comp. Neurol. 516, 94-104 (2009).</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

PVEC są bardziej istotne fizjologicznie niż dorosłe komórki śródbłonka mózgu i EC z innych źródeł tkankowych dla badań koncentrujących się na interakcjach nerwowo-naczyniowych, a także mają potencjał terapeutyczny. W przypadku przygotowania PVEC bardzo ważne jest, aby rozpocząć od sekcji, aby pracować szybko, aby osiągnąć dobrą żywotność, ponieważ martwe komórki mogą wiązać się niespecyficznie z mikrokulkami CD31. Ponadto, jeśli zawieszenie pojedynczej komórki nie zostanie osiągnięte przed etapem etykietowania magnetyczn...

Angiogeneza, neurogeneza i migracja neuronów są krytycznymi wydarzeniami w rozwoju, naprawie i regeneracji ośrodkowego układu nerwowego (OUN). Kilka eleganckich badań wykazało, że komórki śródbłonka stymulują proliferację neuronów i odwrotnie poprzez uwalnianie rozpuszczalnych czynników i bezpośredni kontakt. Za ciekawe uznałyśmy fakt, że w większości tych badań1-3, podczas gdy neuronalne komórki progenitorowe/nerwowe komórki macierzyste są izolowane z mózgu embrionalnego, są one współhodowane z komórkami śródbłonka z dorosłego mózgu, innymi źródłami tkanek dorosłych lub liniami komórkowymi śródbłonka. Może to być częściowo spowodowane trudnościami technicznymi związanymi z izolacją i hodowlą czystych populacji komórek śródbłonka z mózgu embrionalnego. Jednak angiogeneza, neurogeneza i migracja neuronów są równoczesnymi zdarzeniami zachodzącymi o rzędy wielkości silniej w mózgu embrionalnym niż w normalnym mózgu dorosłego. Okołokomorowa sieć naczyniowa zarodkowego przodomózgowia (kresomózgowie) pochodzi z naczynia znajdującego się w obrębie zawiązka zwojów podstawy i rozwija się w postaci uporządkowanego gradientu od brzusznej do grzbietowej kresomózgowia do 11. dnia embrionalnego (E11)4,5. Ten splot naczyń sieci naczyniowej okołokomorowej różni się od naczyń pialnych na podstawie pochodzenia, położenia anatomicznego, wzorców wzrostu i regulacji rozwoju4,5. Kierunek propagacji gradientu angiogenezy okołokomorowej jest zgodny z poprzecznym gradientem neurogenetycznym kresomózgowia. W obrębie kresomózgowia gradient angiogenezy okołokomorowej i gradient neuronów GABA migrujących stycznie nakładają się również przestrzennie6. Jeśli chodzi o czas, gradient angiogenezy wyprzedza gradient neurogenetyczny i gradient neuronów GABA o około jeden dzień. W związku z tym komórki śródbłonka okołokomorowego są dobrze usytuowane przestrzennie i czasowo, aby dostarczyć krytycznych wskazówek wspierających neurogenezę kresomózgowia i migrację neuronów4,6. W związku z tym wykorzystanie embrionalnych komórek śródbłonka okołokomorowego w eksperymentach kokulturowych z neuronalnymi progenitorami i / lub neuronami zapewniłoby bardziej korzystny model do badania interakcji nerwowo-naczyniowych i opracowywania nowych dróg leczenia chorób neurodegeneracyjnych lub niedokrwiennego/urazowego uszkodzenia mózgu.
Podkreślamy znaczenie usunięcia błony nabłonkowej, nie tylko w celu ograniczenia zanieczyszczenia komórek nabłonkowych, ale także w celu oddzielenia komórek śródbłonka, które są molekularnie i funkcjonalnie różne od komórek śródbłonka sieci naczyniowej okołokomorowej4,6 (określanych jako PVEC dla odróżnienia od EC nabłonka). W tym miejscu opisujemy metodę, którą rutynowo stosujemy w naszym laboratorium, aby uzyskać bogatą i czystą wydajność PVEC. Te komórki śródbłonka są przygotowywane z embrionalnej przodomózgowia wyizolowanej od pojedynczej myszy w ciąży. Można je rozszerzać, subkulturować i z powodzeniem zamrażać do wykorzystania w przyszłości.

<table><tbody><tr><td>DNase I</td><td>Sigma</td><td>D-4527</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Kolagen, roztwór typu 1 z ogona szczura&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>C3867</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Jakość Biologiczne</td><td>114057-131</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>M4055</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A2058</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Kolumna MS</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-201</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Mikrogranulki CD31</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-097-418</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Separator MACS</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-102</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Wielofunkcyjne stanowisko MACS</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-303</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Sitko do komórek 70 i mikro; m</td><td>BD Bioscience</td><td>352350</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Roztwór antybiotykowy i przeciwgrzybiczy</td><td>Sigma</td><td>A5955</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma</td><td>F4135</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Kolagenaza/Rozkład</td><td>Roche</td><td>10269638001</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>DMEM&nbsp;</td><td>Lonza</td><td>12-604F</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>35 mm Naczynie hodowlane</td><td>BD Bioscience</td><td>353001</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>15 ml tubka Falcon&nbsp;</td><td>BD Bioscience</td><td>352097</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>50 ml probówka Falcon</td><td>BD Bioscience</td><td>352098</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Zestaw ECCM</td><td>Zestaw 355054 BD Bioscience</td><td></td><td>Zawiera suplement na wzrost komórek śródbłonka, EGF i inhibitor trypsyny sojowej</td></tr><tr><td>Suplement na wzrost komórek śródbłonka (EKGS)</td><td>BD Bioscience</td><td>354006</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Zastosowania ogniw</td> <td>RBECGM</td><td>R819-500</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>DMEM F12&nbsp;</td><td>Technologie życiowe</td><td>10565-018</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Life Technologies</td><td>305050-061</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Woda klasy kulturowej</td><td>Technologie życia</td><td>15230162</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>0,25% Trypsyna</td><td>Technologie Życia</td><td>15050</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Inhibitor trypsyny sojowej</td><td>BD Bioscience</td><td>5425</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Bioscience</td><td>354234</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Qtracker 655 Zestaw do etykietowania komórek Life Technologies</td><td></td><td>Q25021</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>CellLight Plasma Membrane-RFP, BacMam 2.0</td><td>Life Technologies</td><td>C10608</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Biotynylowane przeciwciało izolektyny B4</td><td>Sigma</td><td>L2140</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Czynnik anty-von Willebranda</td><td>Sigma</td><td>F3520</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Anty-CD31/PECAM-1</td><td>BD Pharmingen</td><td>550274</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>VECTASHIELD Hardset Media montażowe z DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1500</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Ketamina</td><td>Butler Schein Zaopatrzenie Zdrowia Zwierząt</td><td>44028</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Ksylazyna</td><td>Lloyd Laboratories</td><td>1009</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>Motic</td><td>SMZ-168</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Hemocytometr</td><td>Fisher Scientific</td><td>267110</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony</td><td>Olympus CK-40</td><td>CK-40</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny</td><td>Olympus FSX-100</td><td>FSX-100</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Kleszcze cienkie</td><td>Roboz Instrument Chirurgiczny</td><td>7 inox</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Cienkie nożyczki z mikrokońcówkami</td><td>Roboz Instrument chirurgiczny</td><td>RS5611</td><td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

izolacja i hodowla komórek śródbłonka z zarodka przodomózgowia

Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

Embrionalne komórki śródbłonka mózgu mogą służyć jako ważne narzędzie w badaniach nad angiogenezą oraz rozwojem i interakcjami nerwowo-naczyniowymi. Dwie sieci naczyniowe embrionalnej przodomózgowia, pialna i okołokomorowa, są przestrzenne i mają różne pochodzenie i wzorce wzrostu. Komórki śródbłonka z sieci naczyniowej i okołokomorowej mają unikalne profile ekspresji genów i funkcje. W tym miejscu przedstawiamy krok po kroku protokół izolacji, hodowli i weryfikacji czystych populacji komórek śródbłonka z okołokomorowej sieci naczyniowej (PVEC) zarodkowego przodomózgowia (kresomózgowie). W tym podejściu kresomózgowie pozbawione błony płucnej uzyskane od myszy w 15. dniu embrionalnym jest mielone, trawione kolagenazą/dyspazą i rozpraszane mechanicznie do zawiesiny pojedynczej komórki. PVEC są oczyszczane z zawiesiny komórkowej przy użyciu pozytywnej selekcji przeciwciałem anty-CD-31/PECAM-1 sprzężonym z mikrokulkami przy użyciu metody silnej separacji magnetycznej. Oczyszczone komórki hoduje się na szalkach hodowlanych pokrytych kolagenem 1 w pożywce do hodowli komórek śródbłonka, aż staną się zlewające się i dalej subhodowane. PVEC uzyskane za pomocą tego protokołu wykazują fenotypy w kształcie kostki brukowej i wrzeciona, co zostało uwidocznione za pomocą mikroskopii światła z kontrastem fazowym i mikroskopii fluorescencyjnej. Czystość kultur PVEC ustalono za pomocą markerów komórek śródbłonka. W naszych rękach metoda ta niezawodnie i konsekwentnie daje czyste populacje PVEC. Protokół ten przyniesie korzyści badaniom mającym na celu uzyskanie mechanistycznego wglądu w angiogenezę przodomózgowia, zrozumienie interakcji PVEC i wzajemnych oddziaływań z typami komórek neuronalnych i ma ogromny potencjał terapeutyczny w angiogenezie.

Charakterystyka fenotypowa PVEC od 1. do 12. dnia przedstawiona jest za pomocą mikroskopii świetlnej w kontraście fazowym (Rysunek 2). Komórki przytwierdzone do naczynia w 1. dniu wykazują morfologię charakterystyczną dla podziału komórkowego (Rysunek 2A). Między 5. a 8. dniem PVEC przechodzą z morfologii brukowanej w wrzecionowatą, typową dla komórek śródbłonka i bardziej zbliżoną do ich stanu in vivo (Rysunki 2B i 2C). Do 12. dnia kultura PVEC...

Ten film demonstruje łatwą i niezawodną strategię przygotowania czystych kultur komórek śródbłonka z embrionalnej przodomózgowia w ciągu 10-12 dni i będzie przydatny do badań skoncentrowanych na wielu aspektach angiogenezy mózgowej.

Izolacja i hodowla komórek śródbłonka z zarodka przodomózgowia

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przygotowanie czystych kultur komórek śródbłonka z mózgów embrionów czwartego stadium w celu badania angiogenezy mózgowej oraz oddziaływań naczyniowo-nerwowych. Osiąga się to najpierw poprzez usunięcie błony zewnętrznej i wyizolowanie głowogłowia z mózgów embrionalnych. Drugim krokiem procedury jest wytworzenie zawiesiny pojedynczych komórek poprzez dysocjację, filtrację i trawienie pobranej tkanki.Trzecim krokiem jest magnetyczne znakowanie komórek przy użyciu mikrokulek CD 31. Końcowe etapy polegają na oczyszczaniu komórek znakowanych CD 31 poprzez separację magnetyczną, a następnie ich hodowli. W rezultacie uzyskuje się czyste populacje komórek śródbłonka przykomorowego do dalszych badań z wykorzystaniem mikroskopii immunofluorescencyjnej oraz testów angiogenezy.Niniejsza metoda okaże się pomocna w badaniach koncentrujących się na mechanizmach komórkowych i molekularnych. W przypadku analizy mózgu może służyć jako narzędzie do wyjaśniania interakcji komórek śródbłonka komór przedkomorowych oraz ich wzajemnego oddziaływania z typami komórek neuronalnych. Wykazuje ona również ogromny potencjał w zastosowaniach terapeutycznych.Demonstracja tej metody jest kluczowa dla wyeliminowania niektórych trudności technicznych związanych z izolacją i hodowlą czystych populacji komórek śródbłonka z zarodkowego mózgu. W ramach tego protokołu, głowy embrionów w 15. dniu rozwoju (E 15) z matek CD1 należy umieścić w lodowatym PBS pod stereomikroskopem. Mózgi należy usunąć za pomocą precyzyjnych nożyczek z mikrokońcówką oraz delikatnych pęset.Prawidłowe przeprowadzenie sekcji jest kluczowe i wymaga wprawy oraz narzędzi w doskonałym stanie. Następnie, używając pęsety, pewnie chwyć mózg, a nożyczkami z mikrokońcówką usuń błony otaczające. Ten etap jest najtrudniejszym krokiem procedury, jednak niezbędne umiejętności zostaną nabyte wraz z praktyką.Następnie usuń mesencefalon i metencefalon. Wyizoluj cephalon. Następnie przenieś go, usuwając błonę otoczkową, do 35 milimetrowej szalki hodowlanej zawierającej 2 mililitry PBS w warunkach chłodzenia na lodzie.Zbierz wszystkie pazury do jednej szalki. Rozpocznij od posiekania pazurów na fragmenty o wielkości jednego lub dwóch milimetrów za pomocą ostrza skalpela. Zbierz tkankę do probówki o pojemności 15 ml zawierającej 2 ml pełnej pożywki DMEM.Delikatnie, lecz dokładnie rozbij tkankę za pomocą pipety o pojemności 1 ml, aż do całkowitego rozpadu grudek i uzyskania mlecznej zawiesiny. Wirować zawiesinę przy 800 do 1000 G przez pięć minut. W temperaturze pokojowej ostrożnie usunąć nadosad z pomocą aspiratora i resuspendować.Zawiesić osad w DMEM z DS one. Następnie ponownie zdysocjować komórki, stosując delikatną trytonizację, i powtórzyć etap wirowania. Potem ponownie zawiesić osad w ogrzanym, pełnym DMEM.Przefiltruj zawiesinę komórek przez nylonowe sito o oczkach 70 µm, zbierz frakcje komórek zatrzymane na sicie i poddaj je dalszemu trawieniu w dwóch mililitrach DMEM z kolagenazą i dispaizą. Odczekaj kilka minut, a następnie przemyj tkankę. Po trzecie, wykorzystując wirowanie i resuspensję osadu w DMEM z DPS1, połącz przemyty materiał z filtratem i przechowuj na lodzie.Następnie przemyj kombinację kompletnego DMEM za pomocą wirowania i resuspenduj. Teraz określ liczbę komórek za pomocą hemocytometru i przystąp do znakowania magnetycznego. Objętości podane w tym protokole są odpowiednie dla maksymalnie 10 milionów komórek. W przypadku większej liczby komórek należy proporcjonalnie zwiększyć objętości.Zacznij od odwirowania zawiesiny komórkowej przy 300 G przez 10 minut w temperaturze pokojowej, całkowicie odessaj supernatant i dodaj 90 µL schłodzonego buforu do oczyszczania do osadu komórkowego, a następnie 10 µL mikrokulek sprzężonych z CD 31. Dobrze wymieszaj komórki za pomocą pipety 200 µL i inkubuj zawiesinę przez 15 minut w lodówce, nie dłużej, aby zachować specyficzność znakowania. Przemyj komórki, dodając od jednego do dwóch mililitrów schłodzonego buforu do oczyszczania i wirując przy 300 G przez 10 minut.Usunąć supernatant i resuspendować komórki w 500 µL schłodzonego buforu do oczyszczania. Następnie załadować kolumnę MS do pola magnetycznego separatora max. Potem przepłukać kolumnę 500 µL buforu do oczyszczania w temperaturze pokojowej.Następnie naniesie zawiesinę komórkową na kolumnę. Jest ona odpowiednia dla maksymalnie 20 milionów komórek. Zbierz i odrzuć cały przesącz zawierający nieoznakowane komórki.Przemyj kolumnę 500 µL buforu do oczyszczania trzykrotnie. Zawsze upewnij się, że zbiornik kolumny jest pusty przed dodaniem kolejnych alikwotów buforu do oczyszczania. Następnie wyjmij kolumnę z wirówki i umieść ją nad probówką o pojemności 15 mL.Dodaj jeden mililitr buforu do oczyszczania do kolumny i natychmiast wypłucz komórki znakowane magnetycznie, mocno wciszając dołączony tłok do płytki kolumny. Wypłukane komórki przenieś na 35 milimetrową płytkę hodowlaną uprzednio pokrytą kolagenem typu I.Następnie hoduj komórki w pożywce ECCM w inkubatorze ustawionym na 37 °C, przy 95% tlenu i 5% dwutlenku węgla. Wymieniaj pożywkę co cztery dni. Codziennie obserwuj wzrost komórek w naczyniu hodowlanym przy użyciu mikroskopu.Charakterystyka fenotypowa komórek śródbłonka okołokomorowego lub PVE CS zmienia się od pierwszego do dwunastego dnia, co obrazuje mikroskopia świetlna w kontraście fazowym. Komórki przywierające do naczynia w pierwszym dniu wykazują morfologię charakterystyczną dla podziału komórkowego między piątym a ósmym dniem. PVE CS przechodzą z morfologii brukowanej w kształt wrzecionowaty, typowy dla komórek śródbłonka i bardziej zbliżony do ich stanu in vivo.Do 12. dnia hodowla PVEC osiąga pełną konfluencję. Komórki PVEC można łatwo pasażować w celu powiększenia kolonii po subkultywacji.Czystość kultur komórek śródbłonka określono na 100%, wykorzystując następujące markery komórek śródbłonka: ISO lectin, czynnik von Willebranda, CD 31 PE, cam one oraz VE-kadherynę. Zdjęcia przy dużym powiększeniu PVE CS przygotowanych z embrionów CD 1, a także embrionów tie 2 GFP, których komórki śródbłonka ekspresowały GFP, zostały znakowane ISO lectiną; wykazano w nich typową morfologię brukową i wrzecionowatą, a także morfologię wieloboczna z cienkimi wypustkami w niektórych naczyniach hodowlanych powlekanych kolagenem. W przypadku braku matrigelu PVE CS tworzyły wzory sieciowe przypominające unikalną charakterystykę sieci naczyniowej okołokomorowej in vivo.Odzwierciedla to wysoki potencjał angiogenny pve. Cs. Przeprowadzono test angiogenezy, w którym 20 000 PVE CS dodano do naczyń hodowlanych pokrytych matryką żelową matrix gel. Komórki PV Cs wykazały intensywne tworzenie cewek w ciągu 18 godzin.Długoterminowe badanie pve CS, obejmujące migrację, morfologię ruchliwości, testy funkcji komórkowych oraz eksperymenty in vivo, jest możliwe dzięki znakowaniu PV vs. embrionów wyizolowanych z CD one za pomocą nanokryształów Q dot. Nanokryształy te zapewniają intensywną i stabilną fluorescencję w cytoplazmie żywych komórek.Komórki Pve EECS można transfekować markerami komórkowymi, takimi jak cell light plasma membrane RFP back MAM 2.0, w celu wyraźnej wizualizacji morfologii komórek w eksperymentach obrazowania żywych komórek. Komórki Pve CS hodowano w kilku rodzajach pożywek, a ich morfologię porównywano za pomocą mikroskopii fazokontrastowej i ISO selectin przed barwieniem.Podczas gdy komórki PV CS hodowane w ECCM wykazywały morfologię wrzecionowatą i osiągały konfluencję do 12. dnia, komórki pve CS hodowane w pożywce do wzrostu endotelialnych komórek mózgu szczura wykazywały morfologię bardzo wydłużoną i osiągały konfluencję do 20. dnia. Z kolei komórki PV CS hodowane w pożywce D-M-E-M-F 12 wykazywały jedynie morfologię płaską i polygonalną, bez tworzenia wrzecion, charakteryzowały się bardzo szybkim wzrostem i osiągały konfluencję do czwartego dnia.Komórki PVEC były hodowane w pośrodku ECCM do trzech pasaży bez utraty fenotypu i funkcji. W związku z tym ECCM jest pośrodkiem preferowanym do hodowli PVEC. Po opanowaniu techniki, proces ten można przeprowadzić w trzy godziny, pod warunkiem właściwego wykonania.Współuprawa komórek śródbłonka okołokomorowego z prekursorami neuronalnymi prawdopodobnie stymuluje neurogenezę i migrację neuronów znacznie skuteczniej niż komórki śródbłonka pochodzące z dorosłego mózgu lub innych źródeł. Mogą one zatem być cenne w wspomaganiu powrotu funkcji neurologicznych w wielu różnych scenariuszach.

isolation-culture-endothelial-cells-from-embryonic

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Izolacja i hodowlania komórek śródbłonkowych z przedniego mózgu embrionalnego

W niniejszej pracy opisujemy protokół izolacji i hodowli mysich komórek śródbłonka płuc. Metoda ta obejmuje mechaniczną i enzymatyczną dysocjację tkanki płucnej oraz dwuetapowy proces oczyszczania z wykorzystaniem przeciwciał anty-PECAM-1 oraz anty-ICAM-2 sprzężonych z kuleczkami magnetycznymi, co pozwala na uzyskanie czystej populacji komórek śródbłonka pochodzenia głównie naczyniowego mikroskopowego.

Izolacja i hodowla komórek śródbłonka płuc noworodków myszy

Niniejsza metoda opisuje sposób izolacji i unieśmiertelniania mikro naczyniowych komórek śródbłonka z mózgu myszy. Przedstawiamy szczegółowy protokół, obejmujący kolejno homogenizację tkanki mózgowej, etapy trawienia, wysiew oraz unieśmiertelnianie komórek. Uzyskanie homogennej, unieśmiertelnionej linii mikro naczyniowych komórek śródbłonka zajmuje zazwyczaj około pięciu tygodni.

Generowanie unieśmiertelnionej linii komórek śródbłonka mikrokrążenia mózgu myszy jako modelu bariery krew-mózg in vitro

Ten film przedstawia izolację mikronaczyń z mózgu szczura za pomocą kombinacji wirowania gradientu gęstości i enzymatycznego trawienia. Wyizolowane mikronaczynia można hodować w kolbie hodowlanej wstępnie pokrytej matrycą kolagenu i fibronektyny w celu uzyskania kolonii komórek śródbłonka.

Hodowla komórek śródbłonka z mikronaczyń mózgu szczura: procedura izolacji i hodowli komórek śródbłonka z mikronaczyń mózgu szczura

Ten film demonstruje protokół indukowania różnicowania indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych w komórki śródbłonka mózgu.

Generowanie komórek śródbłonka mózgu z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

Pierwotna hodowla komórkowa jest użyteczną techniką do analizy określonych populacji komórek, szczególnie z transgenicznych zarodków myszy w określonych stadiach rozwoju. W tym przypadku komory embrionalne są preparowane i dysocjowane, a kulki sprzężone z przeciwciałami rozpoznają i oddzielają komórki śródbłonka do dalszej analizy.

Izolacja embrionalnych komórek śródbłonka komór

Komórki śródbłonka mikronaczyniowego mózgu (BMEC) są połączone specyficznymi białkami połączeniowymi, tworząc wysoce regulowaną barierę oddzielającą krew od ośrodkowego układu nerwowego (OUN), tak zwaną barierę krew-mózg (BBB). Izolacja pierwotnych mysich komórek śródbłonka mikronaczyniowego mózgu, jak omówiono w tym protokole, umożliwia szczegółowe badania in vitro bariery krew-mózg.

Izolacja pierwotnych mysich komórek śródbłonka mikronaczyniowego mózgu

Komórki śródbłonka naczyniowego odgrywają znaczącą rolę w wielu ważnych zaburzeniach sercowo-naczyniowych. W tym artykule opisano prostą metodę izolowania i rozszerzania komórek śródbłonka z aorty myszy bez użycia specjalnego sprzętu. Nasz protokół zapewnia skuteczny sposób identyfikacji mechanizmów w fizjopatologii komórek śródbłonka.

Izolacja i pierwotna hodowla komórek śródbłonka aorty myszy

Zgłaszamy wiarygodną metodę izolowania i hodowli pierwotnych komórek śródbłonka specyficznych dla nowotworu z genetycznie modyfikowanych modeli mysich.

Izolacja i ekspansja hodowli komórek śródbłonka specyficznych dla nowotworu

Hematopoetyczne komórki macierzyste i progenitorowe (HSPC) pochodzą z wyspecjalizowanych (hemogennych) komórek śródbłonka podczas rozwoju, jednak niewiele wiadomo o procesie, w którym niektóre komórki śródbłonka decydują się na ukrwienie. Przedstawiono metodę opartą na cytometrii przepływowej, pozwalającą na jednoczesną izolację hemogennych komórek śródbłonka i HSPC z mysich tkanek embrionalnych.

Izolacja mysich embrionalnych hemogennych komórek śródbłonka

Celem tego protokołu jest odizolowanie komórek progenitorowych śródbłonka od krwi pępowinowej. Niektóre z zastosowań obejmują wykorzystanie tych komórek jako biomarkera do identyfikacji pacjentów z ryzykiem sercowo-naczyniowym, leczenia chorób niedokrwiennych oraz tworzenia konstruktów naczyń krwionośnych i zastawek serca za pomocą inżynierii tkankowej.

Izolacja śródbłonkowych komórek progenitorowych z ludzkiej krwi pępowinowej

Poznaj izolację i hodowlę komórek śródbłonka z zarodka przodomózgowia. Ta metoda umożliwia badanie angiogenezy mózgowej i interakcji nerwowo-naczyniowych w kontrolowanych warunkach laboratoryjnych.

Izolacja i hodowla komórek śródbłonka z zarodka przodomózgowia

Przeglądaj więcej filmów