Izolacja i hodowla komórek śródbłonka z zarodka przodomózgowia

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przygotowanie czystych kultur komórek śródbłonka z mózgów embrionów czwartego stadium w celu badania angiogenezy mózgowej oraz oddziaływań naczyniowo-nerwowych. Osiąga się to najpierw poprzez usunięcie błony zewnętrznej i wyizolowanie głowogłowia z mózgów embrionalnych. Drugim krokiem procedury jest wytworzenie zawiesiny pojedynczych komórek poprzez dysocjację, filtrację i trawienie pobranej tkanki.

Trzecim krokiem jest magnetyczne znakowanie komórek przy użyciu mikrokulek CD 31. Końcowe etapy polegają na oczyszczaniu komórek znakowanych CD 31 poprzez separację magnetyczną, a następnie ich hodowli. W rezultacie uzyskuje się czyste populacje komórek śródbłonka przykomorowego do dalszych badań z wykorzystaniem mikroskopii immunofluorescencyjnej oraz testów angiogenezy.

Niniejsza metoda okaże się pomocna w badaniach koncentrujących się na mechanizmach komórkowych i molekularnych. W przypadku analizy mózgu może służyć jako narzędzie do wyjaśniania interakcji komórek śródbłonka komór przedkomorowych oraz ich wzajemnego oddziaływania z typami komórek neuronalnych. Wykazuje ona również ogromny potencjał w zastosowaniach terapeutycznych.

Demonstracja tej metody jest kluczowa dla wyeliminowania niektórych trudności technicznych związanych z izolacją i hodowlą czystych populacji komórek śródbłonka z zarodkowego mózgu. W ramach tego protokołu, głowy embrionów w 15. dniu rozwoju (E 15) z matek CD1 należy umieścić w lodowatym PBS pod stereomikroskopem. Mózgi należy usunąć za pomocą precyzyjnych nożyczek z mikrokońcówką oraz delikatnych pęset.

Prawidłowe przeprowadzenie sekcji jest kluczowe i wymaga wprawy oraz narzędzi w doskonałym stanie. Następnie, używając pęsety, pewnie chwyć mózg, a nożyczkami z mikrokońcówką usuń błony otaczające. Ten etap jest najtrudniejszym krokiem procedury, jednak niezbędne umiejętności zostaną nabyte wraz z praktyką.

Następnie usuń mesencefalon i metencefalon. Wyizoluj cephalon. Następnie przenieś go, usuwając błonę otoczkową, do 35 milimetrowej szalki hodowlanej zawierającej 2 mililitry PBS w warunkach chłodzenia na lodzie.

Zbierz wszystkie pazury do jednej szalki. Rozpocznij od posiekania pazurów na fragmenty o wielkości jednego lub dwóch milimetrów za pomocą ostrza skalpela. Zbierz tkankę do probówki o pojemności 15 ml zawierającej 2 ml pełnej pożywki DMEM.

Delikatnie, lecz dokładnie rozbij tkankę za pomocą pipety o pojemności 1 ml, aż do całkowitego rozpadu grudek i uzyskania mlecznej zawiesiny. Wirować zawiesinę przy 800 do 1000 G przez pięć minut. W temperaturze pokojowej ostrożnie usunąć nadosad z pomocą aspiratora i resuspendować.

Zawiesić osad w DMEM z DS one. Następnie ponownie zdysocjować komórki, stosując delikatną trytonizację, i powtórzyć etap wirowania. Potem ponownie zawiesić osad w ogrzanym, pełnym DMEM.

Przefiltruj zawiesinę komórek przez nylonowe sito o oczkach 70 µm, zbierz frakcje komórek zatrzymane na sicie i poddaj je dalszemu trawieniu w dwóch mililitrach DMEM z kolagenazą i dispaizą. Odczekaj kilka minut, a następnie przemyj tkankę. Po trzecie, wykorzystując wirowanie i resuspensję osadu w DMEM z DPS1, połącz przemyty materiał z filtratem i przechowuj na lodzie.

Następnie przemyj kombinację kompletnego DMEM za pomocą wirowania i resuspenduj. Teraz określ liczbę komórek za pomocą hemocytometru i przystąp do znakowania magnetycznego. Objętości podane w tym protokole są odpowiednie dla maksymalnie 10 milionów komórek. W przypadku większej liczby komórek należy proporcjonalnie zwiększyć objętości.

Zacznij od odwirowania zawiesiny komórkowej przy 300 G przez 10 minut w temperaturze pokojowej, całkowicie odessaj supernatant i dodaj 90 µL schłodzonego buforu do oczyszczania do osadu komórkowego, a następnie 10 µL mikrokulek sprzężonych z CD 31. Dobrze wymieszaj komórki za pomocą pipety 200 µL i inkubuj zawiesinę przez 15 minut w lodówce, nie dłużej, aby zachować specyficzność znakowania. Przemyj komórki, dodając od jednego do dwóch mililitrów schłodzonego buforu do oczyszczania i wirując przy 300 G przez 10 minut.

Usunąć supernatant i resuspendować komórki w 500 µL schłodzonego buforu do oczyszczania. Następnie załadować kolumnę MS do pola magnetycznego separatora max. Potem przepłukać kolumnę 500 µL buforu do oczyszczania w temperaturze pokojowej.

Następnie naniesie zawiesinę komórkową na kolumnę. Jest ona odpowiednia dla maksymalnie 20 milionów komórek. Zbierz i odrzuć cały przesącz zawierający nieoznakowane komórki.

Przemyj kolumnę 500 µL buforu do oczyszczania trzykrotnie. Zawsze upewnij się, że zbiornik kolumny jest pusty przed dodaniem kolejnych alikwotów buforu do oczyszczania. Następnie wyjmij kolumnę z wirówki i umieść ją nad probówką o pojemności 15 mL.

Dodaj jeden mililitr buforu do oczyszczania do kolumny i natychmiast wypłucz komórki znakowane magnetycznie, mocno wciszając dołączony tłok do płytki kolumny. Wypłukane komórki przenieś na 35 milimetrową płytkę hodowlaną uprzednio pokrytą kolagenem typu I.

Następnie hoduj komórki w pożywce ECCM w inkubatorze ustawionym na 37 °C, przy 95% tlenu i 5% dwutlenku węgla. Wymieniaj pożywkę co cztery dni. Codziennie obserwuj wzrost komórek w naczyniu hodowlanym przy użyciu mikroskopu.

Charakterystyka fenotypowa komórek śródbłonka okołokomorowego lub PVE CS zmienia się od pierwszego do dwunastego dnia, co obrazuje mikroskopia świetlna w kontraście fazowym. Komórki przywierające do naczynia w pierwszym dniu wykazują morfologię charakterystyczną dla podziału komórkowego między piątym a ósmym dniem. PVE CS przechodzą z morfologii brukowanej w kształt wrzecionowaty, typowy dla komórek śródbłonka i bardziej zbliżony do ich stanu in vivo.

Do 12. dnia hodowla PVEC osiąga pełną konfluencję. Komórki PVEC można łatwo pasażować w celu powiększenia kolonii po subkultywacji.

Czystość kultur komórek śródbłonka określono na 100%, wykorzystując następujące markery komórek śródbłonka: ISO lectin, czynnik von Willebranda, CD 31 PE, cam one oraz VE-kadherynę. Zdjęcia przy dużym powiększeniu PVE CS przygotowanych z embrionów CD 1, a także embrionów tie 2 GFP, których komórki śródbłonka ekspresowały GFP, zostały znakowane ISO lectiną; wykazano w nich typową morfologię brukową i wrzecionowatą, a także morfologię wieloboczna z cienkimi wypustkami w niektórych naczyniach hodowlanych powlekanych kolagenem. W przypadku braku matrigelu PVE CS tworzyły wzory sieciowe przypominające unikalną charakterystykę sieci naczyniowej okołokomorowej in vivo.

Odzwierciedla to wysoki potencjał angiogenny pve. Cs. Przeprowadzono test angiogenezy, w którym 20 000 PVE CS dodano do naczyń hodowlanych pokrytych matryką żelową matrix gel. Komórki PV Cs wykazały intensywne tworzenie cewek w ciągu 18 godzin.

Długoterminowe badanie pve CS, obejmujące migrację, morfologię ruchliwości, testy funkcji komórkowych oraz eksperymenty in vivo, jest możliwe dzięki znakowaniu PV vs. embrionów wyizolowanych z CD one za pomocą nanokryształów Q dot. Nanokryształy te zapewniają intensywną i stabilną fluorescencję w cytoplazmie żywych komórek.

Komórki Pve EECS można transfekować markerami komórkowymi, takimi jak cell light plasma membrane RFP back MAM 2.0, w celu wyraźnej wizualizacji morfologii komórek w eksperymentach obrazowania żywych komórek. Komórki Pve CS hodowano w kilku rodzajach pożywek, a ich morfologię porównywano za pomocą mikroskopii fazokontrastowej i ISO selectin przed barwieniem.

Podczas gdy komórki PV CS hodowane w ECCM wykazywały morfologię wrzecionowatą i osiągały konfluencję do 12. dnia, komórki pve CS hodowane w pożywce do wzrostu endotelialnych komórek mózgu szczura wykazywały morfologię bardzo wydłużoną i osiągały konfluencję do 20. dnia. Z kolei komórki PV CS hodowane w pożywce D-M-E-M-F 12 wykazywały jedynie morfologię płaską i polygonalną, bez tworzenia wrzecion, charakteryzowały się bardzo szybkim wzrostem i osiągały konfluencję do czwartego dnia.

Komórki PVEC były hodowane w pośrodku ECCM do trzech pasaży bez utraty fenotypu i funkcji. W związku z tym ECCM jest pośrodkiem preferowanym do hodowli PVEC. Po opanowaniu techniki, proces ten można przeprowadzić w trzy godziny, pod warunkiem właściwego wykonania.

Współuprawa komórek śródbłonka okołokomorowego z prekursorami neuronalnymi prawdopodobnie stymuluje neurogenezę i migrację neuronów znacznie skuteczniej niż komórki śródbłonka pochodzące z dorosłego mózgu lub innych źródeł. Mogą one zatem być cenne w wspomaganiu powrotu funkcji neurologicznych w wielu różnych scenariuszach.