Name: Generowanie mapy przyczepności przy ścinaniu przy użyciu syntetycznych sieci mikronaczyniowych SynVivo (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: Poznaj generowanie map przyczepności przy ścinaniu w syntetycznych sieciach mikronaczyniowych SynVivo. Ta metoda obliczeniowa pozwala uzyskać pełną mapę z jednego eksperymentu, oszczędzając czas i odczynniki w porównaniu do tradycyjnych komór przepływowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Technologia SynVivo została opracowana w ramach grantu #2R44HL076034 z NHLBI.

1. Przygotowanie urządzenia mikroprzepływowego SynVivo-SMN do pracy
<ol>
	<li>Każdy port (wlot/wylot) urządzenia składa się z dwóch równoległych portów – jeden służy do wprowadzania składników powłoki powierzchniowej (cząsteczek adhezyjnych, macierzy wzrostowych itp.) i/lub komórek do wysiewu, a drugi do przeprowadzania analizy (Rycina 1A).</li>
	<li>Całkowicie zanurz mikroprzepływowe urządzenie SynVivo-SMN (Rycina 1B) w płytce Petri zawierającej sterylną wodę dejonizowaną (DI) i umieść płytkę w suszarce próżniowej. Pozostaw suszarkę włączoną do momentu usunięcia całego powietrza z kanałów urządzenia. Powinno to zająć około 15 min.</li>
	<li>Przed wyjęciem urządzenia z wody, za pomocą pęsety z cienkimi końcami wprowadź do każdego portu urządzenia dren Tygon (średnica zewnętrzna 0,06" i średnica wewnętrzna 0,02") uprzednio przepłukany wodą. Dren powinien mieć długość około 1 cala. Teraz urządzenie można wyjąć z wody. Rycina 1C przedstawia obraz urządzenia z zamocowanymi drenami.</li>
</ol>
2. Powlekanie urządzenia mikroprzepływowego pożądanym białkiem (np. awidyną)
<ol>
	<li>Za pomocą pipety nanieś kroplę wody (około 100 µl) wokół podstawy rurki jednego z portów wlotowych. Ostrożnie usuń rurkę używaną do przygotowania urządzenia. Kropla wody zapobiegnie przedostawaniu się powietrza do wnętrza urządzenia.</li>
	<li>Przygotuj strzykawkę o pojemności 1 ml z awidyną o stężeniu 20 µg/ml. Połącz strzykawkę ze stalową igłą 24 G i rurką. Wprowadź rurkę do jednego z portów wlotowych urządzenia. Nieużywany port wlotowy zacisnąć za pomocą zacisku szczękowego.</li>
	<li>Wprowadź awidynę z prędkością przepływu 1 µl/min przez 10 min, aby zapewnić całkowitą perfuzję urządzenia. Po upływie czasu przepływu zacisnąć rurkę zaciskiem szczękowym i pozostawić urządzenie w temperaturze 4 °C przez noc.</li>
</ol>
3. Przepływ biotynylowanych cząsteczek w eksperymentach adhezyjnych
<ol>
	<li>Pozostawić urządzenie do czasu osiągnięcia temperatury pokojowej. Umieścić urządzenie na odwróconym mikroskopie fluorescencyjnym wyposażonym w zmotoryzowany stolik i wysokowydajną kamerę.</li>
	<li>Przygotować roztwór cząstek biotynylowanych o rozmiarze 2 µm w stężeniu 5 x 106 cząstek/ml w buforze fosforanowym z solą (PBS). Napełnić strzykawkę 1 ml cząstkami. Przygotować drugą strzykawkę 1 ml zawierającą tylko PBS. Umieścić każdą strzykawkę w pompie strzykawkowej i podłączyć do igły oraz cewki.</li>
	<li>Za pomocą pipety nanieść kroplę wody (około 100 µl) wokół podstawy cewki portu wlotowego. Ostrożnie usunąć cewkę używaną do powlekania urządzenia. Kropla wody zapobiegnie przedostaniu się powietrza do urządzenia.</li>
	<li>Ostrożnie wprowadzić cewki dla cząstek biotynylowanych i PBS z kroku 3.2 do każdego z portów wlotowych. Rysunek 2A przedstawia schemat konfiguracji.</li>
	<li>Rozpocząć wstrzykiwanie cząstek biotynylowanych z prędkością przepływu 2,5 µl/min. Monitorować port wlotowy pod mikroskopem. W momencie pojawienia się pierwszych cząstek uruchomić stoper i kontynuować przepływ przez 3 min.</li>
	<li>Po upływie 3 min zatrzymać przepływ cząstek biotynylowanych, jednocześnie rozpoczynając przepływ PBS z prędkością 2,5 µl/min. Pozostawić PBS w urządzeniu przez 3 min, aby wypłukać niezwiązane cząstki.</li>
</ol>
4. Pozyskiwanie obrazów i wykonywanie pomiarów obszarów zainteresowania (AOI) przy użyciu oprogramowania do obrazowania (NIKON Elements)
<ol>
	<li>Użyj funkcji „scan large image” w oprogramowaniu do obrazowania, aby uzyskać obraz całego urządzenia.</li>
	<li>Ponumeruj sekwencyjnie rozgałęzienia w urządzeniu i utwórz okrągły obszar zainteresowania (AOI) o średnicy dwukrotnie większej od średnicy kanałów. W tym przypadku ustaw średnicę AOI na 200 µm, ponieważ średnica kanału wynosi 100 µm.</li>
	<li>Użyj funkcji automatycznego zliczania w oprogramowaniu do obrazowania, aby wyeksportować liczbę cząsteczek w każdym AOI do arkusza MS Excel.</li>
	<li>W analogiczny sposób użyj funkcji automatycznego zliczania, aby wyeksportować liczbę cząsteczek w całym urządzeniu.</li>
</ol>
5. Analiza strumienia cząstek z wykorzystaniem modeli obliczeniowej dynamiki płynów (CFD)
<ol>
	<li>Symulacje CFD są przeprowadzane przy użyciu komercyjnego oprogramowania (CFD-ACE+, ESI Inc.) dla topologii urządzenia SynVivo-SMN. Wyniki są przechowywane w bazie danych w celu analizy obserwacji eksperymentalnych. Wyniki symulacji zawierają informacje o szybkościach ścinania przy ściankach, prędkości, strumieniu cząstek oraz adhezji w urządzeniu.</li>
	<li>Wyniki symulacji są wykorzystywane do określenia liczby cząstek wnikających do każdego AOI na podstawie danej koncentracji cząstek na wlocie.</li>
</ol>
6. Generowanie mapy adhezji ścinającej
<ol>
	<li>Oblicz % adhezji, dzieląc liczbę cząsteczek przylegających w rozwidleniu przez liczbę cząsteczek przepływających przez rozwidlenie, zgodnie z równaniem 6.1. 
	<img alt="Wzór na procent adhezji, % Adhezja=(Cząsteczki Przylegające/Cząsteczki Przepływające), równanie naukowe." fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/51025/51025eq1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Equation 1"> gdzie liczba cząsteczek przylegających oraz przepływających jest odpowiednio uzyskana z kroków protokołu 4.3 i 5.2.</li>
	<li>Narysuj mapę adhezji ścinającej, wykorzystując szybkość ścinania w każdym rozwidleniu sieci uzyskaną z bazy danych w kroku (5.1) oraz wartości % adhezji otrzymane z równania 6.1.</li>
</ol>

<ol><li>Weitz-Schmidt, G., Chreng, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+adhesion+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell adhesion assays.</a> Methods Mol Biol. 757, 15-30 (2012).</li>
<li>Parsons, S. A., Jurzinsky, C., Cuvelier, S. L., Patel, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+leukocyte+recruitment+under+flow+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Studying leukocyte recruitment under flow conditions.</a> Methods Mol Biol. 946, 285-300 (2013).</li>
<li>Luscinskas, F. W., Gimbrone, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Jr+Endothelial-dependent+mechanisms+in+chronic+inflammatory+leukocyte+recruitment%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Med%22%5BJournal%5D)">Jr Endothelial-dependent mechanisms in chronic inflammatory leukocyte recruitment.</a> Annu Rev Med. 47, 413-421 (1996).</li>
<li>Adriani, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+preferential+targeting+of+the+diseased+microvasculature+by+disk-like+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The preferential targeting of the diseased microvasculature by disk-like particles.</a> Biomaterials. 33, 5504-5513 (2012).</li>
<li>Decuzzi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+chamber+analysis+of+size+effects+in+the+adhesion+of+spherical+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Flow chamber analysis of size effects in the adhesion of spherical particles.</a> Int J Nanomedicine. 2, 689-696 (2007).</li>
<li>Zou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PSGL-1+derived+from+human+neutrophils+is+a+high-efficiency+ligand+for+endothelium-expressed+E-selectin+under+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">PSGL-1 derived from human neutrophils is a high-efficiency ligand for endothelium-expressed E-selectin under flow.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 289, 415-424 (2005).</li>
<li>Sakhalkar, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte-inspired+biodegradable+particles+that+selectively+and+avidly+adhere+to+inflamed+endothelium+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Leukocyte-inspired biodegradable particles that selectively and avidly adhere to inflamed endothelium in vitro and in vivo.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 15895-15900 (2003).</li>
<li>Van Kruchten, R., Cosemans, J. M., Heemskerk, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+whole+blood+thrombus+formation+using+parallel-plate+flow+chambers+-+a+practical+guide%5BTitle%5D)+AND+%22Platelets%22%5BJournal%5D)">Measurement of whole blood thrombus formation using parallel-plate flow chambers - a practical guide.</a> Platelets. 23, 229-242 (2012).</li>
<li>Ganguly, A., Zhang, H., Sharma, R., Parsons, S., Patel, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+human+umbilical+vein+endothelial+cells+and+their+use+in+the+study+of+neutrophil+transmigration+under+flow+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of human umbilical vein endothelial cells and their use in the study of neutrophil transmigration under flow conditions.</a> J Vis Exp. 66 (66), (2012).</li>
<li>Shirure, V. S., Reynolds, N. M., Burdick, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mac-2+binding+protein+is+a+novel+E-selectin+ligand+expressed+by+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Mac-2 binding protein is a novel E-selectin ligand expressed by breast cancer cells.</a> PLoS One. 7, (2012).</li>
<li>Ploppa, A., Schmidt, V., Hientz, A., Reutershan, J., Haeberle, H. A., Nohé, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+leukocyte+distribution+during+sepsis%3A+an+experimental+study+on+the+interdependence+of+cell+activation%2C+shear+stress+and+endothelial+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Care%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of leukocyte distribution during sepsis: an experimental study on the interdependence of cell activation, shear stress and endothelial injury.</a> Crit Care. 14, 201(2010).</li>
<li>Oh, H., Diamond, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethanol+enhances+neutrophil+membrane+tether+growth+and+slows+rolling+on+P-selectin+but+reduces+capture+from+flow+and+firm+arrest+on+IL-1-treated+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Ethanol enhances neutrophil membrane tether growth and slows rolling on P-selectin but reduces capture from flow and firm arrest on IL-1-treated endothelium.</a> J Immunol. 181, 2472-2482 (2008).</li>
<li>Resto, V. A., Burdick, M. M., Dagia, N. M., McCammon, S. D., Fennewald, S. M., Sackstein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L-selectin-mediated+lymphocyte-cancer+cell+interactions+under+low+fluid+shear+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">L-selectin-mediated lymphocyte-cancer cell interactions under low fluid shear conditions.</a> J Biol Chem. 283, 15816-15824 (2008).</li>
<li>Enders, S., Bernhard, G., Zakrzewicz, A., Tauber, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+L-selectin+binding+by+polyacrylamide-based+conjugates+under+defined+flow+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Inhibition of L-selectin binding by polyacrylamide-based conjugates under defined flow conditions.</a> Biochim Biophys Acta. 1770, 1441-1449 (2007).</li>
<li>Prabhakarpandian, B., Goetz, D. J., Swerlick, R. A., Chen, X., Kiani, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+functional+significance+of+adhesion+molecules+on+cultured+endothelial+cells+in+response+to+ionizing+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Expression and functional significance of adhesion molecules on cultured endothelial cells in response to ionizing radiation.</a> Microcirculation. 8, 355-364 (2001).</li>
<li>Brown, D. C., Larson, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvements+to+parallel+plate+flow+chambers+to+reduce+reagent+and+cellular+requirements%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Immunology%22%5BJournal%5D)">Improvements to parallel plate flow chambers to reduce reagent and cellular requirements.</a> BMC Immunology. 2, 9(2001).</li>
<li>Zheng, W., Zhang, W., Jiang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+control+of+cell+adhesion+by+combination+of+surface+chemistry+and+soft+lithography%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Healthc+Mater%22%5BJournal%5D)">Precise control of cell adhesion by combination of surface chemistry and soft lithography.</a> Adv Healthc Mater. 2, 95-108 (2013).</li>
<li>Qian, T., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro%2Fnano-fabrication+technologies+for+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Biol+Eng+Comput%22%5BJournal%5D)">Micro/nano-fabrication technologies for cell biology.</a> Med Biol Eng Comput. 48, 1023-1032 (2010).</li>
<li>Biswas, A., Bayer, I. S., Biris, A. S., Wang, T., Dervishi, E., Faupel, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+top-down+and+bottom-up+surface+nanofabrication%3A+techniques%2C+applications+%26+future+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Colloid+Interface+Sci%22%5BJournal%5D)">Advances in top-down and bottom-up surface nanofabrication: techniques, applications & future prospects.</a> Adv Colloid Interface Sci. 170, 2-27 (2012).</li>
<li>Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+lithography+in+biology+and+biochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Soft lithography in biology and biochemistry.</a> Annu Rev Biomed Eng. 3, 335-373 (2001).</li>
<li>McDonald, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+microfluidic+systems+in+poly%28dimethylsiloxane%29%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Fabrication of microfluidic systems in poly(dimethylsiloxane).</a> Electrophoresis. 21, 27-40 (2000).</li>
<li>Prabhakarpandian, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+microvascular+networks+for+quantitative+analysis+of+particle+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Microdevices%22%5BJournal%5D)">Synthetic microvascular networks for quantitative analysis of particle adhesion.</a> Biomed Microdevices. 10, 585-595 (2008).</li>
<li>Rosano, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+physiologically+realistic+in+vitro+model+of+microvascular+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Microdevices%22%5BJournal%5D)">A physiologically realistic in vitro model of microvascular networks.</a> Biomed Microdevices. 11, 1051-1057 (2009).</li>
<li>Tousi, N., Wang, B., Pant, K., Kiani, M. F., Prabhakarpandian, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferential+adhesion+of+leukocytes+near+bifurcations+is+endothelium+independent%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc+Res%22%5BJournal%5D)">Preferential adhesion of leukocytes near bifurcations is endothelium independent.</a> Microvasc Res. 80, 384-388 (2010).</li>
<li>Prabhakarpandian, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bifurcations%3A+focal+points+of+particle+adhesion+in+microvascular+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Bifurcations: focal points of particle adhesion in microvascular networks.</a> Microcirculation. 18, 380-389 (2011).</li>
</ol>

Opłata za publikację tego artykułu sponsorowana przez CFD Research Corporation.

Równoległe komory przepływowe płytkowe, choć zapewniają istotny wgląd w interakcje komórka-komórka i komórka-cząstka, mają kilka ograniczeń, takich jak wysokie zużycie odczynników i konieczność przeprowadzenia wielu serii eksperymentalnych w celu wygenerowania mapy przyczepności przy ścinaniu. Zastosowanie SynVivo-Syntetycznych Sieci Mikronaczyniowych (SynVivo-SMNs) umożliwia wygenerowanie mapy adhezji przy ścinaniu na podstawie pojedynczego eksperymentu w warunkach naśladujących warunki in vivo . Ponadto uzysku...

Obecne testy do badania interakcji komórka-komórka i cząstka-komórka zazwyczaj obejmują statyczny format płytki, w której cząstki lub komórki są inkubowane na matrycach białkowych lub przylegających komórkach. Pod koniec określonego czasu inkubacji liczbę przylegających cząstek lub komórek określa się ilościowo za pomocą mikroskopii1. Mimo że testy te dostarczają istotnych informacji na temat procesów biochemicznych stojących za tymi interakcjami, kluczowym ograniczeniem jest brak fizjologicznego przepływu płynu (typowy dla mikrokrążenia) i jego wpływ na adhezję cząstek.
Aby przezwyciężyć to ograniczenie, w ostatnich latach opracowano komory przepływowe in vitro. Wspólnym elementem tych komór przepływowych jest przezroczysty aparat perfundowany przy niskich liczbach Reynoldsa, aby dopasować się do szybkości ścinania ścian obserwowanych w naczyniach krwionośnych in vivo2. Ściana naczynia jest modelowana przez powlekanie biomolekuł lub wzrost komórek na jednej powierzchni komory przepływowej3. Cząstki4-7 lub komórki8-16 są następnie wprowadzane w pożądanym zakresie natężeń przepływu w celu ilościowego określenia liczby przylegających cząstek przy różnych szybkościach ścinania.
Jednak użycie równoległych komór przepływowych do badania i walidacji zjawisk biochemicznych jest dość kosztowne i czasochłonne. Wynika to głównie z faktu, że należy przeprowadzić wiele eksperymentów w celu wygenerowania mapy ścinania płynu w stosunku do liczby przylegających cząstek/komórek. Ponadto komory przepływowe płytkowe wymagają dużych ilości odczynników ze względu na ich duży rozmiar (wysokość > 250 μm i szerokość > 1 mm). Wreszcie, urządzenia te nie modelują dokładnie cech geometrycznych (np. bifurkacji) i warunków przepływu (np. przepływów zbieżnych i rozbieżnych), które występują in vivo.
Ostatnie postępy w mikroprodukcji opartej na litografii17-19 przyspieszyły rozwój urządzeń typu lab-on-a-chip20-21. Urządzenia te odegrały zasadniczą rolę w opracowaniu zminiaturyzowanej wersji równoległej komory przepływowej z płytką o wymiarach w reżimie mikrometrycznym. Zmniejszenie wymiarów przynosi również znaczące korzyści pod względem ilości odczynników, komórek lub cząstek wymaganych do eksperymentów. Jednak kluczowym ograniczeniem obecnie dostępnych urządzeń jest wykorzystanie kanałów liniowych do modelowania mikronaczyń, co nie naśladuje złożonego mikrokrążenia obserwowanego in vivo.
Niedawno opracowaliśmy nowatorską metodologię odtwarzania sieci mikronaczyniowych na jednorazowych podłożach z tworzywa sztucznego, co daje syntetyczne odwzorowanie warunków in vivo. Urządzenia te, zwane SynVivo-Syntetycznymi Sieciami Mikronaczyniowymi (SMN), są opracowywane przy użyciu procesu miękkiej litografii opartego na PDMS. Urządzenia SynVivo-SMN mogą być używane do uzyskiwania mapy adhezji przy ścinaniu adhezji komórek/cząstek22, badania ukierunkowanego dostarczania leków23 i zostały zweryfikowane na podstawie danych in vivo 24-25. W artykule przedstawiono protokół, który umożliwia wygenerowanie mapy przyczepności przy ścinaniu na podstawie pojedynczego eksperymentu w objętościach tak małych jak 1-5 μl, co skutkuje znaczną oszczędnością zasobów i czasu.

<table><tbody><tr><td>SynVivo-SMN</td><td>CFD Research</td><td>SMN-001</td><td>wyłącznie w CFDRC</td></tr><tr><td>CFD-ACE+</td><td>ESI Inc.</td><td>Nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>Avidin</td><td>Invitrogen</td><td>43-4401</td><td>Każde źródło awidyny będzie działać w tym teście</td></tr><tr><td>Biotynylowane cząstki</td><td>Polysciences</td><td>24173-1</td><td>Każde źródło biotynylowanych cząstek będzie działać w teście</td></tr><tr><td>Tygon Rurka</td><td>VWR</td><td>63018-044</td><td>Rozmiar jest typowy do użytku z SynVivo-SMN</td></tr><tr><td>Elementy NIKON</td><td>Instrumenty NIKON</td><td>Nie dotyczy</td><td>Wszelkie inne obrazowanie można korzystać z oprogramowania</td></tr></tbody></table>

generowanie mapy przyczepności przy ścinaniu przy użyciu syntetycznych sieci mikronaczyniowych synvivo

Generation of Shear Adhesion Map Using SynVivo Synthetic Microvascular Networks

Testy adhezji komórek/cząstek są kluczowe dla zrozumienia interakcji biochemicznych związanych z patofizjologią choroby i mają ważne zastosowania w dążeniu do rozwoju nowych terapii. Testy wykorzystujące warunki statyczne nie są w stanie uchwycić zależności adhezji od ścinania, co ogranicza ich korelację ze środowiskiem in vivo. Równoległe komory przepływowe płytowe, które określają ilościowo przyczepność pod wpływem fizjologicznego przepływu płynu, wymagają wielu eksperymentów w celu wygenerowania mapy przyczepności przy ścinaniu. Ponadto nie reprezentują one skali i morfologii in vivo i wymagają dużych objętości (~ml) odczynników do eksperymentów. W tym badaniu demonstrujemy generowanie mapy adhezji przy ścinaniu na podstawie pojedynczego eksperymentu przy użyciu urządzenia mikroprzepływowego opartego na sieci mikronaczyniowej, SynVivo-SMN. To urządzenie odtwarza złożone naczynia krwionośne in vivo, w tym skalę geometryczną, elementy morfologiczne, cechy przepływu i interakcje komórkowe w formacie in vitro, zapewniając w ten sposób biologicznie realistyczne środowisko dla podstawowych i stosowanych badań nad zachowaniem komórek, dostarczaniem leków i odkrywaniem leków. Test został zademonstrowany poprzez badanie interakcji cząstek pokrytych biotyną o wielkości 2 μm z powierzchniami mikroczipa pokrytymi awidyną. Cały zakres ścinania obserwowanego w mikrokrążeniu uzyskuje się w jednym teście umożliwiającym mapę adhezji i ścinania cząstek w warunkach fizjologicznych.

Rysunek 1A przedstawia schemat oraz obraz w polu jasnym urządzenia SynVivo-SMN. Rysunek 1B przedstawia urządzenie SynVivo-SMN zamontowane na szkiełku przedmiotowym. Rysunek 1C przedstawia urządzenie z przewodami po nasyceniu wodą w desykatorze próżniowym.
Rysunek 2A przedstawia schemat układu eksperymentalnego. Rysunek 2B przedstawia typowe urządzenie SynVivo-SMN powlekane awidyną po związaniu biotynylowanych ...

Komory przepływowe używane w eksperymentach adhezyjnych zazwyczaj składają się z liniowych ścieżek przepływu i wymagają wielu eksperymentów przy różnych prędkościach przepływu, aby wygenerować mapę adhezji ścinania. SynVivo-SMN umożliwia generowanie mapy przyczepności przy ścinaniu przy użyciu pojedynczego eksperymentu z wykorzystaniem objętości mikrolitrów, co skutkuje znaczną oszczędnością czasu i materiałów eksploatacyjnych.

Generowanie mapy przyczepności przy ścinaniu przy użyciu syntetycznych sieci mikronaczyniowych SynVivo

Cell/particle adhesion assays are critical to understanding the biochemical interactions involved in disease pathophysiology and have important ...

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest uzyskanie mapy adhezji cząsteczek komórkowych w zależności od sił ścinania podczas jednego doświadczenia z wykorzystaniem syntetycznych sieci mikronaczyniowych. Osiąga się to najpierw poprzez pokrycie urządzenia mikrofluidycznego badanym białkiem, w tym przypadku avadonem. W drugim kroku do urządzenia wstrzykuje się biotynilowane cząsteczki przy fizjologicznych szybkościach ścinania, które wiążą się z pokrytym avadonem urządzeniem w zróżnicowanych wzorach, zależnie od lokalnych szybkości ścinania.Następnie zlicza się liczbę związanych cząstek w celu wygenerowania mapy adhezji ścinającej cząstek, wykorzystując bazę danych wartości prędkości ścinania w sieci stworzoną obliczeniowo. Wyniki pokazują, że mapę adhezji ścinającej można uzyskać z jednego eksperymentu, co pozwala na znaczną oszczędność czasu i odczynników w porównaniu z konwencjonalnymi komorami przepływowymi z równoległymi płytkami. Główną zaletą tej technologii nad istniejącymi metodami, takimi jak liniowe kanały przepływowe, jest możliwość wygenerowania map adhezji z pojedynczego eksperymentu, co skutkuje istotną redukcją kosztów i czasu.Ta metoda może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu dostarczania leków, takie jak zdolność nośników leków do wiązania się z pożądanymi celami. Pomysł na tę metodę pojawił się po raz pierwszy podczas korzystania z komór przepływowych z płytą łopatkową w celu zrozumienia uszkodzeń komórkowych. Mimo że badanie odbywa się w warunkach przepływu płynu, celem tego testu jest dostarczenie podstawowych informacji na temat adhezji cząsteczek i komórek.Platformę syn vivo można zastosować do wielu innych układów, takich jak dostarczanie leków w nowotworach i do OUN, infekcje, stany zapalne, zakrzepica oraz zaburzenia mikrokrążenia. Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ etapy pracy z urządzeniem mikrofluidycznym są trudne do opanowania, wymagają przyzwyczajenia się do małych objętości próbek, a najlepsze praktyki zapobiegania powstawaniu pęcherzyków powietrza są łatwiejsze do przekazania w formie wizualnej. Procedurę zaprezentuje Ashley Smith, naukowiec z naszego laboratorium.Mikroprzepływowe urządzenie SynVivo SMN składa się z dwóch zestawów równoległych portów: jednego do wprowadzania powłoki powierzchniowej, grup funkcyjnych i/lub komórek do osadzenia, oraz drugiego do przeprowadzenia analizy. Aby rozpocząć, należy całkowicie zanurzyć urządzenie w szalce Petri zawierającej sterylną wodę dejonizowaną i umieścić szalkę w próżni. Proces odpowietrzania należy prowadzić do momentu usunięcia całego powietrza z kanałów urządzenia.Proces ten powinien trwać około 15 minut przed wyjęciem urządzenia z wody. Za pomocą pęsety precyzyjnej należy wprowadzić nasączone wodą rurki tigon do każdego portu urządzenia. Rurki powinny mieć długość około jednej cala.Urządzenie można teraz wyjąć z wody za pomocą pipety lub strzykawki. Należy nanieść kroplę wody wokół podstawy rurki jednego z portów wlotowych. Następnie ostrożnie należy usunąć rurkę.Kropla wody zapobiegnie przedostawaniu się powietrza do urządzenia. Następnie należy przygotować strzykawkę o pojemności jednego mililitra z napełnionym avadonem o stężeniu 20 µg/mL. Połączyć strzykawkę z igłą ze stali nierdzewnej o rozmiarze 24 G oraz z drenem. Nieużywany port wlotowy należy zacisnąć za pomocą zacisku szczękowego.Wprowadź rurkę do portu wlotowego urządzenia. Wstrzyknij avadon z prędkością przepływu 1 µL/min przez 10 minut, aby zapewnić całkowitą perfuzję urządzenia. Po zakończeniu czasu przepływu.Zaciśnij wszystkie przewody za pomocą zacisków szczękowych i pozostaw urządzenie w temperaturze 4°C przez noc. Pozwól urządzeniu osiągnąć temperaturę pokojową. Następnie umieść urządzenie na odwróconym mikroskopie fluorescencyjnym wyposażonym w zmotoryzowany stół i kamerę o wysokiej rozdzielczości.Przygotować roztwór biotynylowanych cząsteczek o rozmiarze 2 µm w stężeniu 5 milionów cząsteczek na ml w buforze fosforanowym (PBS). Napełnić strzykawkę o pojemności 1 ml cząsteczkami. Przygotować drugą strzykawkę o pojemności 1 ml z PBS.Należy jedynie załadować każdą strzykawkę do pompy strzykawkowej, a następnie połączyć je z igłą i rurkami za pomocą strzykawki pipetującej. Należy nanieść kroplę wody wokół podstawy rurki portu wlotowego i ostrożnie usunąć rurkę służącą do powlekania urządzenia. Następnie należy ostrożnie wprowadzić rurki dla cząsteczek biotynylowanych oraz dla PBS do każdego z portów wlotowych.Następnie rozpocząć wtryskiwanie biotynylowanych cząsteczek z szybkością przepływu 2,5 µL/min. Monitorować port wlotowy pod mikroskopem do momentu pojawienia się pierwszych cząsteczek. Uruchomić stoper i kontynuować przepływ przez trzy minuty.Po upływie trzech minut zatrzymaj przepływ biotynilowanych cząsteczek, jednocześnie rozpoczynając przepływ PBS z prędkością 2,5 µl/min. Pozostaw PBS w urządzeniu przez trzy minuty, aby wypłukać niezwiązane cząsteczki. Aby rozpocząć akwizycję, użyj funkcji skanowania dużego obrazu w oprogramowaniu do obrazowania, aby uzyskać obraz całego urządzenia, a następnie kolejno ponumeruj rozgałęzienia w urządzeniu i utwórz okrągły obszar zainteresowania o średnicy dwukrotnie większej od średnicy kanałów.W tym przypadku ustaw średnicę obszaru zainteresowania na 200 mikronów, ponieważ średnica kanału wynosi 100 mikronów. Użyj funkcji automatycznego zliczania w oprogramowaniu do obrazowania, aby wyeksportować liczbę cząsteczek w każdym obszarze zainteresowania do arkusza kalkulacyjnego. Podobnie, użyj funkcji automatycznego zliczania, aby wyeksportować liczbę cząsteczek w całym urządzeniu.Przeprowadzono symulacje CFD, a wyniki zapisano w bazie danych do dalszej analizy. Informacje zawarte w wynikach obejmują szybkości ścinania przy ściankach, strumienie cząstek prędkości oraz przyleganie do urządzenia. Informacje te są wykorzystywane do określenia liczby cząstek przylegających w każdym obszarze zainteresowania przy określonym wejściowym stężeniu cząstek.Aby wygenerować mapę adhezji ścinającej, w ostatnim kroku oblicz procent adhezji zgodnie ze szczegółami opisanymi w protokole tekstowym. Wykreśl mapę adhezji ścinającej, wykorzystując szybkość ścinania w każdym rozgałęzieniu sieci oraz wartości procentowe adhezji. Ten obraz przedstawia typowe urządzenie syn vivo SMN powlekane avidanem po związaniu dwumikronowych cząstek biotynilowanych.Należy zauważyć, że cząstki przylegają preferencyjnie w pobliżu rozgałęzień w sieci. Ponumerowane rozgałęzienia w sieci SMN syn vivo można zobaczyć tutaj. Ten obraz przedstawia przykładową mapę naprężeń ścinających przy ściankach, wygenerowaną przez model CFD urządzenia.Szybkość ścinania w urządzeniu zmienia się w zakresie od 250 s⁻¹ do 15 s⁻¹, co odpowiada wartościom obserwowanym w mikrokrążeniu in vivo. Należy zauważyć, że tak zróżnicowane szybkości ścinania nie mogą być uzyskane jednocześnie w liniowych kanałach mikroprzepływowych, ponieważ zapewniają one stałą szybkość ścinania dla każdego przepływu. Przedstawiony tutaj wykres wartości szybkości ścinania w każdym z rozgałęzień sieci pokazuje, że wzorce szybkości ścinania są złożone i, w przeciwieństwie do liniowych kanałów przepływowych, nie mogą być opisane prostym związkiem analitycznym.Ponadto w sieci występuje wiele rozgałęzień, które mieszczą się w tym samym przedziale ścinania, co zwiększa pewność statystyczną przedstawionych danych. Poniżej zaprezentowano przykładowe wyniki analizy CFD dla strumieni cząstek w sieci, które są wykorzystywane do obliczenia strumieni cząstek w odnogach i rozgałęzieniach sieci eksperymentalnej.Mapa adhezji ścinającej obliczona na podstawie pojedynczego eksperymentu SMN syn vivo wykazuje zależność odwrotną do tej obserwowanej na mapach adhezji ścinającej uzyskanych z eksperymentów w kanałach liniowych. Jednakże, dzięki zastosowaniu testu SynVivo, pojedynczy eksperyment pozwala na wygenerowanie takiej mapy ścinania, podczas gdy w przypadku kanałów liniowych konieczne jest przeprowadzenie wielu serii doświadczalnych. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć, jak wykorzystywać urządzenia SynVivo SMN do wyznaczania adhezji ścinającej na podstawie pojedynczego eksperymentu.Podczas przeprowadzania tego eksperymentu należy pamiętać o tym, aby nie wprowadzać pęcherzyków powietrza do urządzenia mikroprzepływowego SynVivo SMN po jego przygotowaniu. Technika ta utorowała drogę badaczom zajmującym się stanami zapalnymi do badania interakcji leukocytów z śródbłonkiem przy różnych prędkościach ścinania w ramach jednego eksperymentu. W kolejnej generacji urządzeń badacze będą mogli analizować toczanie, adhezję i migrację leukocytów w jednym teście, co obecnie nie jest możliwe.Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne metody badające adhezję leków, nośników leków oraz komórek, aby przeanalizować kwestie takie jak fizjologiczny wpływ przepływu na adhezję międzykomórkową, adhezję komórka-lek oraz adhezję komórka-nośnik leku.

generation-shear-adhesion-map-using-synvivo-synthetic-microvascular

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Generowanie mapy adhezji ścinającej przy użyciu syntetycznych mikrosieci naczyniowych SynVivo

Mikrofluidyczne komory przepływowe, wytrawione metodą fotolitografii i wykonane z PDMS, są stosowane do badania wyników funkcjonalnych związanych z dysfunkcją EC i stanem zapalnym. W reprezentatywnym eksperymencie wykazano zdolność różnicowego naprężenia ścinającego do modulowania adhezji komórek monocytarnych do monowarstw EC aktywowanych cytokinami.

Fenotypowanie zapalne śródbłonka na chipie

Source: Claes, J., et al, In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates an in vivo method for analyzing shear-dependent bacterial adhesion in a live mouse model. Following surgical preparation and catheterization, the mesenteric vasculature is exposed for real-time imaging under a fluorescence microscope. Perfusion with an ionophore and fluorescently labeled bacteria reveals how shear stress triggers...

An In Vivo Model to Study Shear-Dependent Bacterial Adhesion

Pierwotne ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC) zostały wyhodowane do zbiegu w mikroprzepływowym urządzeniu sieciowym. Zilustrowano połączenie komórkowe śródbłonka i rozkład F-aktyny, a zmiany w wewnątrzkomórkowym stężeniu wapnia i produkcji tlenku azotu w odpowiedzi na adenozynotrójfosforan (ATP) określono ilościowo w czasie rzeczywistym na poszczególnych poziomach komórek.

Opracowanie i charakterystyka sieci mikronaczyń in vitro oraz pomiary ilościowe produkcji śródbłonka [Ca2+]i i tlenku azotu

Ten manuskrypt przedstawia metodę formowania wtryskowego do inżynierii mikronaczyń, które podsumowują fizjologiczne właściwości śródbłonka. Proces oparty na mikroprzepływach tworzy opatentowane sieci naczyniowe 3D z dostosowanymi warunkami, takimi jak przepływ, skład komórkowy, geometria i gradienty biochemiczne. Opisano proces wytwarzania i przykłady potencjalnych zastosowań.

Mikrowzorowanie i montaż trójwymiarowych mikonaczyń

Ten protokół opisuje implementację sterowanej obrazem, laserowej degradacji hydrożelu do wytwarzania naczyniowych, biomimetycznych sieci mikroprzepływowych osadzonych w hydrożelach diakrylanowych z poli(glikolu etylenowego) (PEGDA). Te biomimetyczne systemy mikroprzepływowe mogą być przydatne w zastosowaniach inżynierii tkankowej, generowaniu modeli chorób in vitro i wytwarzaniu zaawansowanych urządzeń "na chipie".

Sterowane obrazem, laserowe wytwarzanie sieci mikroprzepływowych pochodzenia naczyniowego

Progenitorzy śródbłonka pochodzący z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC-EPs) mają potencjał, aby zrewolucjonizować leczenie chorób sercowo-naczyniowych i umożliwić tworzenie bardziej wiernych modeli chorób sercowo-naczyniowych. W artykule opisano enkapsulację iPSC-EP w trójwymiarowych (3D) mikrośrodowiskach kolagenu oraz analizę ilościową potencjału naczyniowego tych komórek.

Model 3D in vitro i potok obliczeniowy do ilościowego określenia potencjału naczyniopochodnego progenitorów śródbłonka pochodzących z iPSC

Zmodyfikowane tkanki w dużym stopniu polegają na odpowiednich sieciach naczyniowych, które dostarczają niezbędnych składników odżywczych i gazów oraz usuwają odpady metaboliczne. W tej pracy protokół stopniowego wysiewu komórek śródbłonka i komórek podporowych tworzy wysoce zorganizowane sieci naczyniowe na wysokoprzepustowej platformie do badania rozwijającego się zachowania naczyń w kontrolowanym środowisku 3D.

Stopniowe wysiewanie komórek na mozaikowych rusztowaniach w celu zbadania kiełkujących naczyń krwionośnych

Tutaj dostarczamy chip mikroprzepływowy i automatycznie sterowany, wysoce wydajny system mikroprzepływowy krążenia, który podsumowuje początkowe mikrośrodowisko neowaskularyzacji, umożliwiając stymulację komórek śródbłonka (EC) przez wysokie naprężenie ścinające światło, fizjologiczny poziom przepływu przezśródbłonkowego i rozkład różnych czynników wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF) jednocześnie.

Model mikroprzepływowy naśladujący początkowe zdarzenie neowaskularyzacji

Celem tego protokołu jest opisanie generacji i analizy objętościowej unaczynionych odpowiedników ludzkiej skóry przy użyciu dostępnych i prostych technik dla długoterminowej hodowli. W miarę możliwości opisano uzasadnienie kroków, aby umożliwić badaczom dostosowanie ich do ich potrzeb badawczych.

Generacja samoorganizujących się unaczynionych odpowiedników ludzkiej skóry

W tym protokole, do badania interakcji między komórkami leukocytów w chorobie zapalnej stosuje się biomimetyczne badanie mikropłynów, które może odtworzyć fizjologicznie istotne środowisko mikrokrążenia i odtworzyć całą kaskadę adhezji/migracji leukocytów.

System mikrofizjologiczny do badania interakcji między leukocytami a komórkami śródbłonka podczas stanu zapalnego

Angiogeneza kiełkowania, fundamentalna dla rozwoju i choroby, obejmuje złożone procesy molekularne i mechaniczne. Przedstawiamy wszechstronny model 2,5D ex vivo, który analizuje kiełkowanie komórek z tętnic szyjnych świń, ujawniając angiogenezę zależną od sztywności i wyraźną mechanikę komórek lidera-podążacza. Model ten pomaga w rozwijaniu strategii inżynierii tkankowej i podejść do terapii nowotworów.

Model 2.5D do mechanicznej charakterystyki ex vivo angiogenezy kiełkowania w żywej tkance

Poznaj generowanie map przyczepności przy ścinaniu w syntetycznych sieciach mikronaczyniowych SynVivo. Ta metoda obliczeniowa pozwala uzyskać pełną mapę z jednego eksperymentu, oszczędzając czas i odczynniki w porównaniu do tradycyjnych komór przepływowych.

Generowanie mapy przyczepności przy ścinaniu przy użyciu syntetycznych sieci mikronaczyniowych SynVivo

Przeglądaj więcej filmów