Generowanie mapy przyczepności przy ścinaniu przy użyciu syntetycznych sieci mikronaczyniowych SynVivo

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest uzyskanie czystej mapy adhezji cząstek komórkowych z pojedynczego eksperymentu przy użyciu syntetycznych sieci mikronaczyniowych. Osiąga się to poprzez uprzednie pokrycie urządzenia mikroprzepływowego białkiem będącym przedmiotem zainteresowania, w tym przypadku avadonu. W drugim etapie biotynylowane cząstki są wstrzykiwane do urządzenia z fizjologiczną szybkością ścinania, które wiążą się z urządzeniem pokrytym avadonem z różnymi wzorami w zależności od lokalnych szybkości ścinania.

Następnie zliczana jest liczba związanych cząstek w celu wygenerowania mapy przyczepności cząstek przy użyciu utworzonej obliczeniowo bazy danych wartości czystej szybkości w sieci. Wyniki pokazują, że w pojedynczym eksperymencie można uzyskać czystą mapę przyczepności, co skutkuje znaczną oszczędnością czasu i odczynników w porównaniu z konwencjonalnymi równoległymi komorami przepływowymi. Główną przewagą tej technologii nad istniejącymi metodami, takimi jak liniowe kanały przepływowe, jest to, że możemy generować współdzielone mapy a z jednego eksperymentu, co skutkuje znaczną oszczędnością kosztów i czasu.

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie dostarczania leków, takie jak zdolność pojazdów dostarczających leki do wiązania się z pożądanymi celami. Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy używaliśmy komór przepływowych z płytką łopatkową do zrozumienia konkretnych zmian chorobowych komórek. Jednak w warunkach płynnych celem tego testu jest dostarczenie podstawowych informacji na temat adhezji cząstek i komórek.

Platforma syn vivo może być stosowana w wielu innych systemach, takich jak rak i OUN, infekcje i stany zapalne, zakrzepica i zaburzenia mikrokrążenia. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ trudno jest nauczyć się kroków urządzenia mikroprzepływowego, przyzwyczaić się do małych objętości próbek, a najlepsze praktyki unikania tworzenia się pęcherzyków są lepiej komunikowane wizualnie. Procedurę zademonstruje Ashley Smith, naukowiec z naszego laboratorium.

Urządzenie mikroprzepływowe SynVivo SMN składa się z dwóch zestawów równoległych portów, jednego do przepływu w powłoce powierzchniowej, ugrupowań i/lub komórek do osadzania, a drugi do przeprowadzania testu. Aby rozpocząć, całkowicie zanurz urządzenie w szalce Petriego zawierającej sterylną wodę dejonizowaną i umieść naczynie w próżni. Osuszanie Pozwól osuszaczowi działać, dopóki całe powietrze nie zostanie usunięte z kanałów urządzenia.

Powinno to zająć około 15 minut przed wyjęciem urządzenia z wody. Użyj cienkich kleszczyków punktowych, aby umieścić rurkę tigon zalaną wodą w każdym porcie urządzenia. Rurka powinna mieć około jednego cala długości.

Urządzenie można teraz wyjąć z wody za pomocą pipety lub strzykawki. Umieść kroplę wody wokół podstawy jednej rurki portu wlotowego. Ostrożnie wyjmij rurkę.

Kropla wody zapobiegnie przedostawaniu się powietrza do urządzenia. Następnie przygotuj jednomililitrową strzykawkę wypełnioną awadonem o stężeniu 20 mikrogramów na mililitr. Podłącz strzykawkę do igły i rurki ze stali nierdzewnej o rozmiarze 24 Clamp port wlotowy, który nie jest używany, z zaciskiem szczękowym.

Włóż rurkę do portu wlotowego urządzenia. Wstrzykiwać avadon z szybkością przepływu jednego mikrolitra na minutę przez 10 minut, aby umożliwić pełną perfuzję urządzenia. Na koniec czasu przepływu.

Zaciśnij wszystkie rurki za pomocą zacisków szczękowych i umieść urządzenie w czterech stopniach na noc. Pozwól, aby urządzenie osiągnęło temperaturę pokojową. Następnie umieść urządzenie na odwróconym mikroskopie fluorescencyjnym wyposażonym w zmotoryzowany stolik i kamerę o wysokiej wydajności.

Przygotować roztwór dwóch mikronów biotynylowanych cząstek o stężeniu 5 milionów cząstek na mililitr w buforze fosforanowym, soli fizjologicznej lub PBS. Załaduj cząstki do strzykawki o pojemności jednego mililitra. Przygotować drugą strzykawkę o pojemności jednego mililitra PBS.

Tylko Każdą strzykawkę należy załadować do pompy strzykawkowej, a następnie podłączyć ją do igły i rurki za pomocą strzykawki pipetrycznej. Umieść kroplę wody wokół podstawy rurki portu wlotowego i ostrożnie wyjmij rurkę używaną do pokrycia urządzenia. Ostrożnie włóż rurki dla cząstek biotynylowanych i PBS do każdego z portów wlotowych.

Następnie zacznij wstrzykiwać biotynylowane cząstki z natężeniem przepływu 2,5 mikrolitra na minutę. Monitoruj otwór wlotowy w mikroskopie pod pierwszymi oznakami cząstek. Uruchom minutnik i kontynuuj przepływ przez trzy minuty.

Pod koniec trzech minut zatrzymaj przepływ biotynylowanych cząstek, jednocześnie rozpoczynając przepływ PBS z natężeniem przepływu 2,5 mikrolitra na minutę. Pozwól PBS przepływać w urządzeniu przez trzy minuty, aby zmyć niezwiązane cząstki. Aby rozpocząć akwizycję, użyj funkcji skanowania dużego obrazu w oprogramowaniu do obrazowania, aby uzyskać obraz całego urządzenia, a następnie sekwencyjnie ponumeruj rozwidlenia w urządzeniu i utwórz okrągły obszar zainteresowania o dwukrotnie większej średnicy kanałów.

W takim przypadku ustaw średnicę obszaru zainteresowania na 200 mikronów, ponieważ średnica kanału wynosi 100 mikronów. Użyj funkcji automatycznego zliczania w oprogramowaniu do obrazowania, aby wyeksportować liczbę cząstek w każdym obszarze zainteresowania do arkusza kalkulacyjnego. Podobnie użyj funkcji automatycznego konta, aby wyeksportować liczbę cząstek w całym urządzeniu.

Przeprowadzane są symulacje CFD, a wyniki są przechowywane w bazie danych w celu dalszej analizy. Informacje zawarte w wynikach obejmują szybkość ścinania ścian, prędkość, strumień cząstek i przyleganie do urządzenia. Informacje w tym miejscu są wykorzystywane do określenia liczby cząstek, które przylegają do każdego obszaru zainteresowania, biorąc pod uwagę zdefiniowany wkład stężenia cząstek.

Aby wygenerować mapę przyczepności przy ścinaniu, w ostatnim kroku oblicz procent przyczepności zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Narysuj mapę przyczepności gładkiej, używając szybkości pochylenia przy każdym rozwidleniu sieci i wartości procentowych przyczepności. Zdjęcie przedstawia typowe urządzenie SMN syn vivo pokryte avidanem po związaniu dwóch mikronowych biotynylowanych cząstek.

Należy pamiętać, że cząstki preferencyjnie przylegają w pobliżu rozwidleń w sieci. Ponumerowane rozwidlenia w sieci SMN syn vivo można zobaczyć tutaj. Ten obraz jest przykładową mapą ścinania ścian wygenerowaną przez model CFD urządzenia.

Szybkość ścinania zmienia się w urządzeniu od 250 sekund odwrotnych do 15 sekund odwrotnych, jak obserwowano w mikronaczyniach in vivo. Należy pamiętać, że te różne szybkości ścinania nie mogą być uzyskane jednocześnie w liniowych kanałach mikroprzepływowych, ponieważ zapewniają one stałą szybkość ścinania dla każdego natężenia przepływu. Przedstawiony tutaj wykres wartości szybkości ścinania w każdym z rozwidleń sieci pokazuje, że wzorce szybkości ścinania są złożone i nie można ich uzyskać za pomocą prostej zależności analitycznej, w przeciwieństwie do liniowych kanałów przepływu.

Co więcej, w sieci występuje wiele rozwidleń, które wpadają do tego samego przezroczystego pojemnika. Zwiększa to pewność statystyczną przedstawionych danych. Poniżej znajdują się przykładowe wyniki analizy CFD dla strumieni cząstek w sieci, które są wykorzystywane do obliczania strumieni cząstek w gałęziach i rozwidleniach sieci eksperymentalnej.

Przezroczysta mapa adhezji obliczona na podstawie pojedynczego eksperymentu SMN syn vivo jest zgodna z odwrotną zależnością, jak zaobserwowano na podstawie map adhezji czystej uzyskanych z eksperymentów z kanałami liniowymi. Jednak przy użyciu testu SynVivo, pojedynczy eksperyment pozwala na wygenerowanie tej czystej mapy, podczas gdy wiele przebiegów eksperymentalnych jest pozyskiwanych z kanałów liniowych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak używać urządzeń SynVivo SMN do generowania współdzielonej adhezji z pojedynczego eksperymentu.

Podczas wykonywania tego eksperymentu należy pamiętać, aby nie wprowadzać pęcherzyków powietrza do urządzenia mikroprzepływowego SynVivo SMN po jego opracowaniu. Technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się zapaleniem do badania interakcji śródbłonka leukocytów w różnym tempie w jednym eksperymencie. W nowej generacji urządzeń naukowcy będą mogli badać adhezję i migrację leukocytów za pomocą jednego testu, co obecnie nie jest możliwe.

Zgodnie z tą procedurą, można wykonać inne metody badania adhezji leków, nośników leków i komórek w celu zbadania takich kwestii, jak fizjologiczny wpływ przepływu na komórkę komórkową, adhezję leku komórkowego i nośnika leku.