Generowanie mapy przyczepności przy ścinaniu przy użyciu syntetycznych sieci mikronaczyniowych SynVivo

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest uzyskanie mapy adhezji cząsteczek komórkowych w zależności od sił ścinania podczas jednego doświadczenia z wykorzystaniem syntetycznych sieci mikronaczyniowych. Osiąga się to najpierw poprzez pokrycie urządzenia mikrofluidycznego badanym białkiem, w tym przypadku avadonem. W drugim kroku do urządzenia wstrzykuje się biotynilowane cząsteczki przy fizjologicznych szybkościach ścinania, które wiążą się z pokrytym avadonem urządzeniem w zróżnicowanych wzorach, zależnie od lokalnych szybkości ścinania.

Następnie zlicza się liczbę związanych cząstek w celu wygenerowania mapy adhezji ścinającej cząstek, wykorzystując bazę danych wartości prędkości ścinania w sieci stworzoną obliczeniowo. Wyniki pokazują, że mapę adhezji ścinającej można uzyskać z jednego eksperymentu, co pozwala na znaczną oszczędność czasu i odczynników w porównaniu z konwencjonalnymi komorami przepływowymi z równoległymi płytkami. Główną zaletą tej technologii nad istniejącymi metodami, takimi jak liniowe kanały przepływowe, jest możliwość wygenerowania map adhezji z pojedynczego eksperymentu, co skutkuje istotną redukcją kosztów i czasu.

Ta metoda może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu dostarczania leków, takie jak zdolność nośników leków do wiązania się z pożądanymi celami. Pomysł na tę metodę pojawił się po raz pierwszy podczas korzystania z komór przepływowych z płytą łopatkową w celu zrozumienia uszkodzeń komórkowych. Mimo że badanie odbywa się w warunkach przepływu płynu, celem tego testu jest dostarczenie podstawowych informacji na temat adhezji cząsteczek i komórek.

Platformę syn vivo można zastosować do wielu innych układów, takich jak dostarczanie leków w nowotworach i do OUN, infekcje, stany zapalne, zakrzepica oraz zaburzenia mikrokrążenia. Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ etapy pracy z urządzeniem mikrofluidycznym są trudne do opanowania, wymagają przyzwyczajenia się do małych objętości próbek, a najlepsze praktyki zapobiegania powstawaniu pęcherzyków powietrza są łatwiejsze do przekazania w formie wizualnej. Procedurę zaprezentuje Ashley Smith, naukowiec z naszego laboratorium.

Mikroprzepływowe urządzenie SynVivo SMN składa się z dwóch zestawów równoległych portów: jednego do wprowadzania powłoki powierzchniowej, grup funkcyjnych i/lub komórek do osadzenia, oraz drugiego do przeprowadzenia analizy. Aby rozpocząć, należy całkowicie zanurzyć urządzenie w szalce Petri zawierającej sterylną wodę dejonizowaną i umieścić szalkę w próżni. Proces odpowietrzania należy prowadzić do momentu usunięcia całego powietrza z kanałów urządzenia.

Proces ten powinien trwać około 15 minut przed wyjęciem urządzenia z wody. Za pomocą pęsety precyzyjnej należy wprowadzić nasączone wodą rurki tigon do każdego portu urządzenia. Rurki powinny mieć długość około jednej cala.

Urządzenie można teraz wyjąć z wody za pomocą pipety lub strzykawki. Należy nanieść kroplę wody wokół podstawy rurki jednego z portów wlotowych. Następnie ostrożnie należy usunąć rurkę.

Kropla wody zapobiegnie przedostawaniu się powietrza do urządzenia. Następnie należy przygotować strzykawkę o pojemności jednego mililitra z napełnionym avadonem o stężeniu 20 µg/mL. Połączyć strzykawkę z igłą ze stali nierdzewnej o rozmiarze 24 G oraz z drenem. Nieużywany port wlotowy należy zacisnąć za pomocą zacisku szczękowego.

Wprowadź rurkę do portu wlotowego urządzenia. Wstrzyknij avadon z prędkością przepływu 1 µL/min przez 10 minut, aby zapewnić całkowitą perfuzję urządzenia. Po zakończeniu czasu przepływu.

Zaciśnij wszystkie przewody za pomocą zacisków szczękowych i pozostaw urządzenie w temperaturze 4°C przez noc. Pozwól urządzeniu osiągnąć temperaturę pokojową. Następnie umieść urządzenie na odwróconym mikroskopie fluorescencyjnym wyposażonym w zmotoryzowany stół i kamerę o wysokiej rozdzielczości.

Przygotować roztwór biotynylowanych cząsteczek o rozmiarze 2 µm w stężeniu 5 milionów cząsteczek na ml w buforze fosforanowym (PBS). Napełnić strzykawkę o pojemności 1 ml cząsteczkami. Przygotować drugą strzykawkę o pojemności 1 ml z PBS.

Należy jedynie załadować każdą strzykawkę do pompy strzykawkowej, a następnie połączyć je z igłą i rurkami za pomocą strzykawki pipetującej. Należy nanieść kroplę wody wokół podstawy rurki portu wlotowego i ostrożnie usunąć rurkę służącą do powlekania urządzenia. Następnie należy ostrożnie wprowadzić rurki dla cząsteczek biotynylowanych oraz dla PBS do każdego z portów wlotowych.

Następnie rozpocząć wtryskiwanie biotynylowanych cząsteczek z szybkością przepływu 2,5 µL/min. Monitorować port wlotowy pod mikroskopem do momentu pojawienia się pierwszych cząsteczek. Uruchomić stoper i kontynuować przepływ przez trzy minuty.

Po upływie trzech minut zatrzymaj przepływ biotynilowanych cząsteczek, jednocześnie rozpoczynając przepływ PBS z prędkością 2,5 µl/min. Pozostaw PBS w urządzeniu przez trzy minuty, aby wypłukać niezwiązane cząsteczki. Aby rozpocząć akwizycję, użyj funkcji skanowania dużego obrazu w oprogramowaniu do obrazowania, aby uzyskać obraz całego urządzenia, a następnie kolejno ponumeruj rozgałęzienia w urządzeniu i utwórz okrągły obszar zainteresowania o średnicy dwukrotnie większej od średnicy kanałów.

W tym przypadku ustaw średnicę obszaru zainteresowania na 200 mikronów, ponieważ średnica kanału wynosi 100 mikronów. Użyj funkcji automatycznego zliczania w oprogramowaniu do obrazowania, aby wyeksportować liczbę cząsteczek w każdym obszarze zainteresowania do arkusza kalkulacyjnego. Podobnie, użyj funkcji automatycznego zliczania, aby wyeksportować liczbę cząsteczek w całym urządzeniu.

Przeprowadzono symulacje CFD, a wyniki zapisano w bazie danych do dalszej analizy. Informacje zawarte w wynikach obejmują szybkości ścinania przy ściankach, strumienie cząstek prędkości oraz przyleganie do urządzenia. Informacje te są wykorzystywane do określenia liczby cząstek przylegających w każdym obszarze zainteresowania przy określonym wejściowym stężeniu cząstek.

Aby wygenerować mapę adhezji ścinającej, w ostatnim kroku oblicz procent adhezji zgodnie ze szczegółami opisanymi w protokole tekstowym. Wykreśl mapę adhezji ścinającej, wykorzystując szybkość ścinania w każdym rozgałęzieniu sieci oraz wartości procentowe adhezji. Ten obraz przedstawia typowe urządzenie syn vivo SMN powlekane avidanem po związaniu dwumikronowych cząstek biotynilowanych.

Należy zauważyć, że cząstki przylegają preferencyjnie w pobliżu rozgałęzień w sieci. Ponumerowane rozgałęzienia w sieci SMN syn vivo można zobaczyć tutaj. Ten obraz przedstawia przykładową mapę naprężeń ścinających przy ściankach, wygenerowaną przez model CFD urządzenia.

Szybkość ścinania w urządzeniu zmienia się w zakresie od 250 s⁻¹ do 15 s⁻¹, co odpowiada wartościom obserwowanym w mikrokrążeniu in vivo. Należy zauważyć, że tak zróżnicowane szybkości ścinania nie mogą być uzyskane jednocześnie w liniowych kanałach mikroprzepływowych, ponieważ zapewniają one stałą szybkość ścinania dla każdego przepływu. Przedstawiony tutaj wykres wartości szybkości ścinania w każdym z rozgałęzień sieci pokazuje, że wzorce szybkości ścinania są złożone i, w przeciwieństwie do liniowych kanałów przepływowych, nie mogą być opisane prostym związkiem analitycznym.

Ponadto w sieci występuje wiele rozgałęzień, które mieszczą się w tym samym przedziale ścinania, co zwiększa pewność statystyczną przedstawionych danych. Poniżej zaprezentowano przykładowe wyniki analizy CFD dla strumieni cząstek w sieci, które są wykorzystywane do obliczenia strumieni cząstek w odnogach i rozgałęzieniach sieci eksperymentalnej.

Mapa adhezji ścinającej obliczona na podstawie pojedynczego eksperymentu SMN syn vivo wykazuje zależność odwrotną do tej obserwowanej na mapach adhezji ścinającej uzyskanych z eksperymentów w kanałach liniowych. Jednakże, dzięki zastosowaniu testu SynVivo, pojedynczy eksperyment pozwala na wygenerowanie takiej mapy ścinania, podczas gdy w przypadku kanałów liniowych konieczne jest przeprowadzenie wielu serii doświadczalnych. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć, jak wykorzystywać urządzenia SynVivo SMN do wyznaczania adhezji ścinającej na podstawie pojedynczego eksperymentu.

Podczas przeprowadzania tego eksperymentu należy pamiętać o tym, aby nie wprowadzać pęcherzyków powietrza do urządzenia mikroprzepływowego SynVivo SMN po jego przygotowaniu. Technika ta utorowała drogę badaczom zajmującym się stanami zapalnymi do badania interakcji leukocytów z śródbłonkiem przy różnych prędkościach ścinania w ramach jednego eksperymentu. W kolejnej generacji urządzeń badacze będą mogli analizować toczanie, adhezję i migrację leukocytów w jednym teście, co obecnie nie jest możliwe.

Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne metody badające adhezję leków, nośników leków oraz komórek, aby przeanalizować kwestie takie jak fizjologiczny wpływ przepływu na adhezję międzykomórkową, adhezję komórka-lek oraz adhezję komórka-nośnik leku.