Badania przesiewowe genetyki za pośrednictwem VIGS w celu identyfikacji genów zaangażowanych w oporność na zwierzęta inne niż gospodarz

Ogólnym celem jest zademonstrowanie metodologii wykorzystującej wyciszanie genów indukowane przez wirusa do identyfikacji genów zaangażowanych w oporność nie-gospodarzy w celu osiągnięcia VIG rośliny endogennej. Gen docelowy zaszczepia rośliny nicotiana hamama wirusem grzechotki tytoniowej konstruuje figi przenoszące fragment genu docelowego, przygotowuje i zaszczepia kultury patogenów niebędących gospodarzami, eksprymujące białko zielonej fluorescencji na wyciszonych liściach roślin z genem. Następnie oceń zielone fluorescencyjne kolonie patogenów niebędących gospodarzami w świetle UV w ciemności.

Aby zidentyfikować rośliny wyciszone genowo, które osłabiają odporność innych niż gospodarze, zidentyfikuj gen docelowy poprzez sekwencjonowanie wstawki w wektorze wirusa. Ogólnie rzecz biorąc, ta metodologia przesiewowych badań genetycznych za pośrednictwem VIX pozwala naukowcom łatwo zidentyfikować geny zaangażowane w odporność roślin na patogeny bakteryjne niebędące gospodarzami. W krótkim czasie zdaliśmy sobie sprawę, że znaczenie połączenia wyciszania genów indukowanego przez wirusa pośredniczyło w genetyce postępowej z patogenami eksprymującymi GFP UV w celu zidentyfikowania genów odpowiedzialnych za oporność na ST.

Podczas gdy wcześniej przeprowadziliśmy żmudne badanie genetyczne do przodu, oceniając śmierć komórki wywołaną nadwrażliwością i śmierć komórki wywołaną chorobą. Tak więc nasiona nicotiana Ben na bezglebowej mieszance doniczkowej kiełkują nasiona w komorze wzrostowej. Po trzech tygodniach przesadź sadzonki do pojedynczych doniczek, hoduj je w szklarni przez co najmniej dwa do trzech dni przed wirusem grzechotki tytoniowej.

Inokulacja wektorem figowym stopniowo rozmraża zamrożone łodygi agrobacterium zawierające klony cDNA. Intv dwa wektory w sterylnych warunkach zaszczepiają poszczególne kultury agrobacterium na Luria. Na płytkach agro Berti inkubuje się płytki w temperaturze 28 stopni Celsjusza przez okres do dwóch dni.

Hodować cztery repliki kolonii dla każdego klonu, tak aby dostępna była odpowiednia ilość inokulum agrobacterium do inokulacji dwóch roślin. Zaszczepić TRV w płynnym podłożu Luria berti. Zbierz wyhodowane przez noc kultury przez odwirowanie, ponownie zawieś bakterie w inokulacji, buforuj i inkubuj przez trzy godziny w temperaturze pokojowej na wytrząsarce z prędkością 50 obr./min.

Po zebraniu komórek przez odwirowanie, zmierzyć gęstość optyczną i resus, zawiesić granulki bakteryjne w pięciomilimolowym buforze MES o pH 5,5 Następnie zaszczepić T RV jedną kulturę bakteryjną o OD 600 0,3 w stronę osi trzech do czterech liści nicotiana hamama za pomocą strzykawki bezigłowej w miejscu zaszczepienia T RV one. Nakłuj liście inokulum odpowiednich dwóch kolonii T RV za pomocą wykałaczki przez dwa tygodnie. Utrzymuj rośliny w niskiej temperaturze z odpowiednim odżywianiem, ponieważ energiczny wzrost jest ważny dla skutecznego wyciszania genów przez świnie.

Jako przykład w tym eksperymencie użyto pomidora Pseudomonas senge PV T one. Patogeny powinny przenosić plazmid, który może wyrażać G-F-P-U-V rosnąć szczepy PGE w królach być płynne, podłoże uzupełnione 10 mikrogramami na mililitr. Ryfampicyna 50 mikrogramów na mililitr może mycyna w temperaturze 28 stopni Celsjusza przez 12 godzin.

Zbierz kultury bakterii przez odwirowanie, a następnie potwierdź obecność zielonej fluorescencji za pomocą lampy UV o długiej długości fali w ciemności. Po dwóch płukaniach w sterylnej wodzie, resus zawiesić komórki w żądanym stężeniu sterylnej wody i wyregulować OD 600. Następnie zaszczepić odpowiednie patogeny po osiowej stronie celu.

W razie potrzeby wyciszone przez gen liście otaczają okolice o średnicy około 1,5 centymetra. Jednocześnie przetestuj kilka patogenów niebędących gospodarzami pod kątem ich wzrostu w docelowym genie wyciszonym rośliny, w tym kontrolę wektorów do oglądania. Wszczepić bakterię w okresie od dwóch do pięciu dni.

Wystaw zaszczepione liście na działanie światła UV o dużej długości fali w ciemności. Pamiętaj, aby nosić ochronę skóry i oczu. Monitoruj kolonie bakterii jako zielone fluorescencyjne plamy po osiowej stronie liścia na tle czerwonej fluorescencji emitowanej przez powierzchnię liścia.

Sprawdź zieloną fluorescencję emitowaną przez patogen gospodarza, który działa jak kontrola pozytywna. Obserwuj wzrost patogenu codziennie od dwóch do pięciu dni po zaszczepieniu. Sporządź listę klonów, które wyciszenie spowodowało wzrost jednego lub więcej patogenów niebędących gospodarzami.

Aby usunąć wyniki fałszywie dodatnie z pierwszego ekranu. Powtórz VIG dla wybranych klonów i ponownie przetestuj reakcję roślin wyciszonych genowo na patogeny niegenerujące kosztów. Użyj colony PCR na wybranym klonie, aby amplifikować insert, używając A TTB i TB dwóch starterów w T RV dwóch wektorów lub starterów wygaszających miejsce klonowania.

Uruchom produkt PCR na żelu aros i sprawdź amplifikację pojedynczego prążka. Następnie zsekwencjonuj wstawkę genu roślinnego w dwuwektorowym wektorze T RV za pomocą starterów A TTB lub starterów flankujących miejsce klonowania. Wykonaj blast przy użyciu sekwencji i zidentyfikuj szczegóły genu.

Uogólniony protokół wyciszania dużej liczby genów za pomocą fig na bazie wirusa grzechotki tytoniowej w nicotiana. Hamana jest pokazana na tym schemacie blokowym. Niektóre z wyciszonych genów roślin wykazywały różne zmiany fenotypowe, w tym zahamowanie wzrostu, żółknięcie i fenotypy fotobielenia.

Dane te pokazują zieloną fluorescencję patogenu wystawionego na działanie światła UV w ciemności przed inokulacją roślin i ich implantami wzrostowymi trzy dni po inokulacji, ten sam liść wystawiony na działanie białego światła jest pokazany jako kontrola. Ten eksperyment śledzi wzrost bakterii eksprymujących G-F-P-U-V w planie. Trzy osoby niebędące gospodarzami.

Patogeny wykorzystano do zademonstrowania procesu identyfikacji rośliny wyciszonej genowo podatnej na patogeny niebędące żywicielami u dzikich roślin nons silenced nicotiana hamama z odpornością. Te patogeny nie rosły. Jednak co najmniej dwa patogeny niebędące gospodarzami rosły na liściach wyciszonych przez gen NB sgt.One

. Dane ilościowe dotyczące wzrostu bakterii pokazują proces identyfikacji roślin wyciszonych genowo, które są zagrożone pod kątem oporności innej niż ST. Korzystając z tego podejścia do genetyki zapośredniczonej przez figi, wyciszyliśmy około 5 000 genów u nicotiana hamana i zidentyfikowaliśmy rośliny zagrażające odporności na choroby inne niż ST w okresie około półtora roku.

Jako przykład pokazano tutaj wzrost patogenów niebędących gospodarzami w dwóch roślinach wyciszonych genami zidentyfikowanych na tym ekranie. Mamy nadzieję, że udało nam się przekazać, w jaki sposób przeprowadzić indukowane przez wirusa wyciszanie setek genów, a następnie ocenić wyciszone rośliny, obserwując wzrost niekosztownych patogenów w planach w celu zbadania odporności niekosztowej. Korzystając z tego genu indukowanego przez wirusa, protokołu wyciszania, można wyciszyć setki genów w ciągu około dwóch do trzech tygodni, a następnie ocenić wzrost patogenów innych niż końskie znakowane GFP UV w ciągu około dwóch do trzech godzin dziennie, trwających około dwóch do pięciu dni.