Badania przesiewowe genetyki za pośrednictwem VIGS w celu identyfikacji genów zaangażowanych w oporność na zwierzęta inne niż gospodarz

Ogólnym celem niniejszego opracowania jest zaprezentowanie metodologii wykorzystującej wyciszanie genów indukowane wirusem w celu identyfikacji genów zaangażowanych w odporność organizmów niebędących gospodarzami, aby uzyskać VIGs endogennych roślin. W celu ukierunkowania na konkretny gen, rośliny nicotiana hamama inokuluje się konstruktem wirusa tobacco rattle virus zawierającym fragment genu docelowego, a następnie przygotowuje i inokuluje kultury patogenów niebędących gospodarzami, wykazujące ekspresję zielonego białka fluorescencyjnego, na liście rośliny z wyciszonym genem. Następnie, w ciemności i przy świetle UV, ocenia się obecność zielonych fluorescencyjnych kolonii patogenów niebędących gospodarzami.

Aby zidentyfikować rośliny z wyciszonymi genami, co upośledza odporność gatunków niegospodarzy, należy określić gen docelowy poprzez sekwencjonowanie wkładki w wektorze wirusowym. Ogólnie ta metodologia przesiewowej genetyki przekazowej z wykorzystaniem VIGS pozwala badaczom na łatwą identyfikację genów zaangażowanych w odporność roślin niegospodarzy na patogeny bakteryjne. W krótkim czasie uświadomiliśmy sobie znaczenie połączenia genetyki przekazowej opartej na wirusowym wyciszaniu genów z patogenami wykazującymi ekspresję GFP w świetle UV w celu zidentyfikowania genów odpowiedzialnych za odporność typu non-ST.

Wcześniej przeprowadziliśmy żmudny forward genetic screen, oceniając odpowiedź w postaci indukowanej nadmiernej śmierci komórek oraz śmierci komórek indukowanej chorobą. Nasiona Nicotiana benthamiana wysiano na bezglebową mieszankę doniczkową i kiełkowano w komorze wzrostowej. Po trzech tygodniach siewki przesadzono do oddzielnych doniczek i hodowano w szklarni przez co najmniej dwa do trzech dni przed zakażeniem tobacco rattle virus.

Podczas inokulacji wektorem fig, zamrożone łodygi zawierające klony cDNA Agrobacterium są stopniowo rozmrażane. W warunkach sterylnych inokuluje się poszczególne kultury Agrobacterium na płytki z pożywką Luria-Bertani (LB). Płytki inkubuje się w temperaturze 28 stopni Celsjusza przez maksymalnie dwa dni.

Wyhoduj cztery powtórne kolonie dla każdego klonu, aby uzyskać odpowiednią ilość inokulum agrobacterium do zaszczepienia dwóch roślin. Zaszczep TRV one do płynnej pożywki Luria Berti. Zbierz kultury po nocnej inkubacji poprzez wirowanie, resuspenduj bakterie w buforze do inokulacji i inkubuj przez trzy godziny w temperaturze pokojowej na wytrząsarce przy 50 RPM.

Po zebraniu komórek przez wirowanie, zmierz gęstość optyczną i resuspenduj granulki bakteryjne w buforze MES 5 mM o pH 5.5. Następnie zaszczep kulturę bakteryjną TRV1 o OD 600 wynoszącej 0.3 w łodyżkę od trzech do czterech liści Nicotiana hamama, używając strzykawki bez igły w miejscu inokulacji TRV1. Przez dwa tygodnie nakłuwaj liście inokulum z odpowiednich kolonii TRV2, używając wykałaczki. Utrzymuj rośliny w niskiej temperaturze z odpowiednim nawożeniem, ponieważ intensywny wzrost jest istotny dla efektywnego wyciszania genów przez TRV.

Jako przykład w tym eksperymencie wykorzystano szczep Pseudomonas syringae PV tomato T1. Patogeny powinny posiadać plazmid umożliwiający ekspresję GFP. Hodować szczepy PGE w płynnym podłożu King's B uzupełnionym o 10 µg/ml rifampicyny i 50 µg/ml kanamycyny w temperaturze 28 °C przez 12 godzin.

Zbiór kultur bakteryjnych przeprowadź poprzez wirowanie, a następnie potwierdź obecność zielonej fluorescencji, używając lampy UV o długiej fali w ciemności. Po dwukrotnym przemyciu w sterylnej wodzie, ponownie zawieś komórki w sterylnej wodzie do pożądanego stężenia i dostosuj OD 600. Następnie zaszczep odpowiednie patogeny na stronę osiową celu.

W razie potrzeby wycina się krążki z liści o średnicy około 1,5 cm z wyciszonym genem. Jednocześnie testuje się wzrost kilku patogenów niebędących gospodarzami na roślinach z wyciszonym genem docelowym, uwzględniając również kontrolę wektorową do obserwacji. Wzrost bakteryjny stwierdza się między drugim a piątym dniem.

Naświetl zaszczepione liście światłem UV o długiej fali w ciemności. Należy pamiętać o stosowaniu ochrony skóry i oczu. Obserwuj kolonie bakteryjne jako zielone fluorescencyjne punkty na stronie wierzchołkowej liścia na tle czerwonej fluorescencji emitowanej przez powierzchnię liścia.

Zweryfikuj zieloną fluorescencję emitowaną przez patogen gospodarza, który służy jako kontrola dodatnia. Codziennie obserwuj wzrost patogenu od drugiego do piątego dnia po inokulacji. Sporządź listę klonów, w których wyciszenie doprowadziło do wzrostu jednego lub więcej patogenów niebędących gospodarzami.

Aby wyeliminować wyniki fałszywie dodatnie z pierwszego przesiewu, należy powtórzyć VIGs dla wybranych klonów, a następnie ponownie przetestować odpowiedź roślin z wyciszonymi genami na patogeny niekosztowe. Przeprowadzić PCR kolonii na wybranym klonie w celu amplifikacji wstawki przy użyciu starterów A TTB one i TB two w wektorze T RV two lub starterów flankujących miejsce klonowania.

Produkty PCR poddaj elektroforezie na żelu agarozowym i zweryfikuj amplifikację pojedynczego prążka. Następnie przeprowadź sekwencjonowanie wstawki genu roślinnego w wektorze T RV two, wykorzystując primery A TTB lub primery flankujące miejsce klonowania. Wykonaj analizę blast z wykorzystaniem uzyskanej sekwencji i określ szczegółowe informacje o genie.

Ogólny protokół wyciszania dużych liczb genów z wykorzystaniem wektorów opartych na wirusie mozaiki tytoniowej (TRV) u Nicotiana hamana przedstawiono na tym schemacie. Niektóre z roślin z wyciszonymi genami wykazywały różne zmiany fenotypowe, w tym zahamowany wzrost, żółknięcie oraz fenotypy fotobleachingu.

Dane te przedstawiają zieloną fluorescencję patogenu poddanego działaniu światła UV w ciemności przed inokulacją rośliny oraz wzrost implantów trzy dni po inokulacji; jako kontrola przedstawiono ten sam liść poddany działaniu światła białego. Eksperyment ten śledzi wzrost bakterii wykazujących ekspresję G-F-P-U-V w trzech gatunkach roślin niegospodarzy.

Patogenów użyto do zademonstrowania procesu identyfikacji rośliny z wyciszonym genem, podatnej na patogeny nienakładowe, w porównaniu z roślinami typu dzikiego *Nicotiana hamama* (nie-wyciszonymi), które wykazują odporność. Patogeny te nie rosły. Jednakże co najmniej dwa patogeny nienakładowe rosły na NB sgt.

Liście z wyciszonym pojedynczym genem. Dane ilościowe dotyczące wzrostu bakterii obrazują proces identyfikacji roślin z wyciszonym genem, u których upośledzona jest odporność typu non-ST. Stosując to podejście genetyki przekazu oparte na T-DNA, wyciszyliśmy około 5 000 genów u nicotiana hamana i w okresie około półtora roku zidentyfikowaliśmy rośliny o upośledzonej odporności typu non-ST.

Jako przykład przedstawiono tutaj wzrost patogenów niegospodarzy w dwóch roślinach z wyciszonymi genami, zidentyfikowanych w tym badaniu. Mamy nadzieję, że przekazaliśmy sposób przeprowadzania wyciszania genów indukowanego wirusem dla setek genów, a następnie oceny wyciszonych roślin poprzez obserwację wzrostu patogenów niegospodarzy in plano w celu przeanalizowania odporności niegospodarzy. Dzięki zastosowaniu tego protokołu wyciszania genów indukowanego wirusem możliwe jest wyciszenie setek genów w okresie od dwóch do trzech tygodni, a następnie ocena wzrostu patogenów niegospodarzy znakowanych GFP UV w czasie od dwóch do trzech godzin dziennie, przez około dwa do pięciu dni.