C. elegans (C. elegans) Konserwacja
Właściwa pielęgnacja i utrzymanie Caenorhabditis elegans jest niezbędne do udanych eksperymentów.
Zajmują bardzo mało miejsca, są tanie w utrzymaniu, mają wysoką płodność i są łatwe w obsłudze. Ale tylko dlatego, że są łatwe w utrzymaniu, nie oznacza to słabej nauki. W rzeczywistości Sydney Brenner nazwał C. elegans "Darem natury dla nauki", a od czasu jego wprowadzenia w 1974 roku robak ten był opisywany w wielu eksperymentach nagrodzonych Nagrodą Nobla.
W tym filmie pokażemy podstawowe metody utrzymania C. elegans w laboratorium, w tym: trzymanie i karmienie, obchodzenie się, a także zamrażanie i rozmrażanie robaków.
W naturze C. elegans znajdują się w glebie i żywią się rozkładającą się materią roślinną. W laboratorium ważne jest, aby nicienie były tak szczęśliwe, jak to tylko możliwe, dlatego trzymamy je i karmimy przy użyciu bardzo specyficznych metod.
C. elegans może być uprawiany w temperaturze 16, 20 lub 25 °C, w zależności od wymagań eksperymentu, i może być uprawiany na podłożach stałych lub płynnych. W obu przypadkach są karmione OP50, standaryzowanym szczepem E. coli używanym specjalnie do hodowli nicieni w każdym laboratorium robaków na całym świecie.
Uprawiane w temperaturze 25 °C, C. elegans kończą swój cykl życiowy 2,1 razy szybciej niż w temperaturze 16 °C. Szybszy cykl życiowy oznacza, że robaki dojrzewają szybciej, składają więcej jaj i spożywają więcej pokarmu. Jeśli robaki mogą umrzeć z głodu lub stać się zbyt zatłoczone, wchodzą w stadium larwalne zwane stadium dauer. Larwy Dauer są odporne na stres i nie starzeją się.
Utrzymywane na pożywkach stałych, C. elegans są hodowane na płytkach agarowych przygotowanych z pożywką hodowlaną nicieni lub pożywką NGM. Dzień przed przygotowaniem płytek zaszczepij płynne podłoże LB pojedynczą kolonią OP50 E. coli. Inkubować pożywkę w temperaturze 37 °C przez noc, wytrząsając.
Aby uzyskać stałe podłoże, należy odmierzyć i połączyć odpowiednie ilości tych składników z wodą dejonizowaną w kolbie Erlenmeyera.
Po sterylizacji w autoklawie przez co najmniej 15 minut, pozostawić agar do ostygnięcia do temperatury 55 °C w łaźni wodnej. Gdy podłoże ostygnie do 55 °C, powinno być w stanie wygodnie trzymać szklany pojemnik gołymi rękami. Stosując odpowiednią technikę aseptyczną, w tym czasie można dodawać dodatki, takie jak leki lub antybiotyki. Zamieszaj, aby wymieszać. Następnie pipetować stopiony NGM na płytki Petriego, aż będą wypełnione w 2/3. Pozostaw nowo przygotowane talerze do wyschnięcia na ławce na noc.
Następnego ranka osadzaj OP50 w stężeniu 3500 x g przez 10 minut, a następnie ponownie zawieś bakterie w pożywce LB do 10-krotnego stężenia. Teraz odpipetuj centralny trawnik na każdą płytkę. Unikać dotykania końcówki pipety do powierzchni NGM i uważać, aby kultura nie dotykała ścianek płytki. Pozostaw talerze do wyschnięcia na ławce na noc. Po wyschnięciu wystaw płytki na działanie światła UV, aby je wysterylizować. Są teraz gotowe do użycia podczas hodowli robaków.
C. elegans są indywidualnie manipulowane za pomocą narzędzia znanego jako kilof. Kilof jest zwykle wykonany z drutu o grubości 30 90% platyny i 10% irydu, chociaż niektórzy badacze mogą preferować nieco inny skład metalu. Aby dokonać kilofa, zacznij od złamania końcówki pipety Pasteura na preferowaną długość.
Odetnij około 3 do 4 cm drutu i umieść 0,5 cm go wewnątrz końcówki pipety. Uszczelnij drut do szyby nad palnikiem Bunsena. Długość drutu wystającego ze szkła wynosi około 3 do 3,5 cm, ale może się różnić w zależności od indywidualnych preferencji.
Spłaszcz koniec drutu za pomocą twardej krawędzi. Następnie zegnij spłaszczoną część do góry, aby utworzyć szufelkę. Na koniec przeszlifuj krawędzie kilofa, aby zapobiec uszkodzeniu robaka lub agaru.
Aby zbierać robaki, wysterylizuj drut kilofa na płomieniu. Następnie pokryj końcówkę grubym, lepkim OP50 E. coli z płytki NGM. Zachowaj ostrożność, aby nie przebić ani nie pozostawić blizn na powierzchni agaru.
Patrząc przez lunetę do sekcji, delikatnie zgarnij robaka na spłaszczony, lepki kilof, aż robak przyklei się do kilofa.
Gdy robak znajdzie się na kilofie, natychmiast przenieś, lekko przytrzymując końcówkę na nowej powierzchni nowej płytki i przesuwając ją po bakteryjnym trawniku. Robak powinien odczołgać się od kilofa. Robak nie powinien zbyt długo pozostawać na kilofie, ponieważ może wyschnąć.
Jednym z powodów, dla których C. elegans jest popularnym modelem badawczym, jest to, że kultury mogą być przechowywane przez długi czas bez żadnych negatywnych skutków.
Najpierw umyj świeżo zagłodzone larwy za pomocą 0,5 ml buforu M9, delikatnie zamieszaj, aby rozluźnić wszystkie larwy i dorosłe zwierzęta, a następnie przenieś do mikrowirówki lub krioprobunki. Następnie dodaj równą ilość 30% glicerolu do M9 Buffer. Na koniec zapakuj fiolkę do izolowanego pudełka i przechowuj w temperaturze -80 °C.
Aby odzyskać robaki, wyjmij probówkę z zamrażarki -80 i pozwól mu rozmrozić się w temperaturze pokojowej, aż zawartość całkowicie się rozpuści. Odpipetować płyn na świeżą płytkę NGM z trawnikiem OP50 i inkubować w temperaturze 20 °C. Po 2-3 dniach przenieś 10-15 zwierząt na nową płytkę i pozwól im rozmnażać się przez jedno pokolenie. Zbierz potomstwo i oceń prawidłowe fenotypy.
Teraz, gdy już widzieliśmy, jak C. elegans jest utrzymywany w laboratorium, przyjrzyjmy się, jak modyfikowane są warunki karmienia, przetrzymywania i obchodzenia się z nim w eksperymentach.
Nagrodzone Nagrodą Nobla odkrycie interferencji RNA pozwoliło naukowcom wyciszyć dowolny gen C. elegans w celu określenia jego funkcji.
Możemy indukować RNAi w C. elegans, najpierw przygotowując płytki z E. coli, które wyrażają docelowy gen dsRNA, który zostaną zjedzone przez robaki.
Następnie robaki w czwartym stadium larwalnym są przenoszone na płytki RNAi i pozostawiane do złożenia jaj. Na pożądanym etapie rozwoju potomstwo jest zbierane i oceniane pod kątem fenotypów. Ponieważ dzielimy około połowy naszego genomu z robakiem, wiele z zebranych spostrzeżeń ma zastosowanie do chorób u ludzi.
Ze względu na swój szybki cykl życia, C. elegans szczególnie dobrze nadaje się jako model starzenia.
Po pierwsze, generowana jest zsynchronizowana w czasie populacja C. elegans, umożliwiając dorosłym hermafrodytom składanie jaj na płytkach NGM. Robaki składają jaja przez 6-8 godzin, a następnie są usuwane.
Gdy robaki osiągną pożądany etap, są przenoszone na nowe płytki NGM zawierające ampicylinę, aby zapobiec skażeniu bakteryjnemu, i FUDR, aby zapobiec rozmnażaniu.
Od tego momentu dorosłe robaki obserwuje się co 2-3 dni, aż wszystkie robaki umrą. Martwe robaki są usuwane z płytki i rejestrowana jest liczba żywych i martwych robaków.
Analiza długości życia w kontekście urazów genetycznych lub środowiskowych może dostarczyć istotnych informacji na temat procesu starzenia.
Za pomocą laserów można wykonywać aksotomie lub wycinanie pojedynczych aksonów, u żywych C. elegans w celu zbadania, jak regenerują się komórki nerwowe.
Ale ponieważ robaki nigdy nie pozostają w bezruchu, umieszcza się je na 10% podkładkach agarozowych w roztworze mikrogranulek. Na wierzchu umieszcza się szkiełko nakrywkowe. Mikrogranulki zwiększają współczynnik tarcia interakcji podkładka-szkiełko nakrywkowe, skutecznie zamrażając robaka w miejscu.
Szkiełko jest teraz przygotowane do wykonywania aksotomii. Neurony są umieszczane w polu widzenia i centrowane pod mikroskopem. Laser jest następnie odpalany za pomocą pedału nożnego. Optymalna moc lasera przetnie neuron bez uszkadzania sąsiednich struktur. Na jedno zwierzę wycina się jak najwięcej aksonów.
Podkładka agarozowa jest następnie ostrożnie usuwana ze szkiełka, a robaki mogą dojść do siebie na wysiewanej płytce NGM w temperaturze 20 °C. Między 8 a 48 godzinami po aksotomii neurony mogą być przygotowane do uzyskania punktów do regeneracji. W dystalnej części cięcia neuron tworzy kikut. Jednak w części proksymalnej neuron regeneruje się, tworząc wydłużone neuryty.
Właśnie obejrzałeś podejście JoVE do podstawowej pielęgnacji Ceanorhabditis elegans. W tym filmie omówiliśmy: trzymanie i karmienie C. elegans, obchodzenie się z nimi oraz zamrażanie i odzyskiwanie nicieni.
Przeprowadziliśmy również krótką wycieczkę po niektórych aplikacjach, które sprawiają, że C. elegans jest tak potężnym narzędziem badawczym. Chociaż C. elegans różnią się od ssaków pod wieloma względami, ich podobny skład genetyczny, łatwość utrzymania i prosta manipulacja sprawiają, że są ważnym modelem w dążeniu do zrozumienia biologii i chorób ssaków. Dzięki za oglądanie!
Ceanorhabditis elegans był i nadal jest używany z wielkim powodzeniem jako organizm modelowy do badania różnych zjawisk rozwojowych, genetycznych, mol…
Właściwa pielęgnacja i utrzymanie Caenorhabditis elegans jest niezbędne do udanych eksperymentów.
Zajmują bardzo mało miejsca, są tanie w utrzymaniu, mają wysoką płodność i są łatwe w obsłudze. Ale tylko dlatego, że są łatwe w utrzymaniu, nie oznacza to słabej nauki. W rzeczywistości Sydney Brenner nazwał C. elegans "Darem natury dla nauki", a od czasu jego wprowadzenia w 1974 roku robak ten był opisywany w wielu eksperymentach nagrodzonych Nagrodą Nobla.
W tym filmie pokażemy podstawowe metody utrzymania C. elegans w laboratorium, w tym: trzymanie i karmienie, obchodzenie się, a także zamrażanie i rozmrażanie robaków.
W naturze C. elegans znajdują się w glebie i żywią się rozkładającą się materią roślinną. W laboratorium ważne jest, aby nicienie były tak szczęśliwe, jak to tylko możliwe, dlatego trzymamy je i karmimy przy użyciu bardzo specyficznych metod.
C. elegans może być uprawiany w temperaturze 16, 20 lub 25 °C, w zależności od wymagań eksperymentu, i może być uprawiany na podłożach stałych lub płynnych. W obu przypadkach są karmione OP50, standaryzowanym szczepem E. coli używanym specjalnie do hodowli nicieni w każdym laboratorium robaków na całym świecie.
Uprawiane w temperaturze 25 °C, C. elegans kończą swój cykl życiowy 2,1 razy szybciej niż w temperaturze 16 °C. Szybszy cykl życiowy oznacza, że robaki dojrzewają szybciej, składają więcej jaj i spożywają więcej pokarmu. Jeśli robaki mogą umrzeć z głodu lub stać się zbyt zatłoczone, wchodzą w stadium larwalne zwane stadium dauer. Larwy Dauer są odporne na stres i nie starzeją się.
Utrzymywane na pożywkach stałych, C. elegans są hodowane na płytkach agarowych przygotowanych z pożywką hodowlaną nicieni lub pożywką NGM. Dzień przed przygotowaniem płytek zaszczepij płynne podłoże LB pojedynczą kolonią OP50 E. coli. Inkubować pożywkę w temperaturze 37 °C przez noc, wytrząsając.
Aby uzyskać stałe podłoże, należy odmierzyć i połączyć odpowiednie ilości tych składników z wodą dejonizowaną w kolbie Erlenmeyera.
Po sterylizacji w autoklawie przez co najmniej 15 minut, pozostawić agar do ostygnięcia do temperatury 55 °C w łaźni wodnej. Gdy podłoże ostygnie do 55 °C, powinno być w stanie wygodnie trzymać szklany pojemnik gołymi rękami. Stosując odpowiednią technikę aseptyczną, w tym czasie można dodawać dodatki, takie jak leki lub antybiotyki. Zamieszaj, aby wymieszać. Następnie pipetować stopiony NGM na płytki Petriego, aż będą wypełnione w 2/3. Pozostaw nowo przygotowane talerze do wyschnięcia na ławce na noc.
Następnego ranka osadzaj OP50 w stężeniu 3500 x g przez 10 minut, a następnie ponownie zawieś bakterie w pożywce LB do 10-krotnego stężenia. Teraz odpipetuj centralny trawnik na każdą płytkę. Unikać dotykania końcówki pipety do powierzchni NGM i uważać, aby kultura nie dotykała ścianek płytki. Pozostaw talerze do wyschnięcia na ławce na noc. Po wyschnięciu wystaw płytki na działanie światła UV, aby je wysterylizować. Są teraz gotowe do użycia podczas hodowli robaków.
C. elegans są indywidualnie manipulowane za pomocą narzędzia znanego jako kilof. Kilof jest zwykle wykonany z drutu o grubości 30 90% platyny i 10% irydu, chociaż niektórzy badacze mogą preferować nieco inny skład metalu. Aby dokonać kilofa, zacznij od złamania końcówki pipety Pasteura na preferowaną długość.
Odetnij około 3 do 4 cm drutu i umieść 0,5 cm go wewnątrz końcówki pipety. Uszczelnij drut do szyby nad palnikiem Bunsena. Długość drutu wystającego ze szkła wynosi około 3 do 3,5 cm, ale może się różnić w zależności od indywidualnych preferencji.
Spłaszcz koniec drutu za pomocą twardej krawędzi. Następnie zegnij spłaszczoną część do góry, aby utworzyć szufelkę. Na koniec przeszlifuj krawędzie kilofa, aby zapobiec uszkodzeniu robaka lub agaru.
Aby zbierać robaki, wysterylizuj drut kilofa na płomieniu. Następnie pokryj końcówkę grubym, lepkim OP50 E. coli z płytki NGM. Zachowaj ostrożność, aby nie przebić ani nie pozostawić blizn na powierzchni agaru.
Patrząc przez lunetę do sekcji, delikatnie zgarnij robaka na spłaszczony, lepki kilof, aż robak przyklei się do kilofa.
Gdy robak znajdzie się na kilofie, natychmiast przenieś, lekko przytrzymując końcówkę na nowej powierzchni nowej płytki i przesuwając ją po bakteryjnym trawniku. Robak powinien odczołgać się od kilofa. Robak nie powinien zbyt długo pozostawać na kilofie, ponieważ może wyschnąć.
Jednym z powodów, dla których C. elegans jest popularnym modelem badawczym, jest to, że kultury mogą być przechowywane przez długi czas bez żadnych negatywnych skutków.
Najpierw umyj świeżo zagłodzone larwy za pomocą 0,5 ml buforu M9, delikatnie zamieszaj, aby rozluźnić wszystkie larwy i dorosłe zwierzęta, a następnie przenieś do mikrowirówki lub krioprobunki. Następnie dodaj równą ilość 30% glicerolu do M9 Buffer. Na koniec zapakuj fiolkę do izolowanego pudełka i przechowuj w temperaturze -80 °C.
Aby odzyskać robaki, wyjmij probówkę z zamrażarki -80 i pozwól mu rozmrozić się w temperaturze pokojowej, aż zawartość całkowicie się rozpuści. Odpipetować płyn na świeżą płytkę NGM z trawnikiem OP50 i inkubować w temperaturze 20 °C. Po 2-3 dniach przenieś 10-15 zwierząt na nową płytkę i pozwól im rozmnażać się przez jedno pokolenie. Zbierz potomstwo i oceń prawidłowe fenotypy.
Teraz, gdy już widzieliśmy, jak C. elegans jest utrzymywany w laboratorium, przyjrzyjmy się, jak modyfikowane są warunki karmienia, przetrzymywania i obchodzenia się z nim w eksperymentach.
Nagrodzone Nagrodą Nobla odkrycie interferencji RNA pozwoliło naukowcom wyciszyć dowolny gen C. elegans w celu określenia jego funkcji.
Możemy indukować RNAi w C. elegans, najpierw przygotowując płytki z E. coli, które wyrażają docelowy gen dsRNA, który zostaną zjedzone przez robaki.
Następnie robaki w czwartym stadium larwalnym są przenoszone na płytki RNAi i pozostawiane do złożenia jaj. Na pożądanym etapie rozwoju potomstwo jest zbierane i oceniane pod kątem fenotypów. Ponieważ dzielimy około połowy naszego genomu z robakiem, wiele z zebranych spostrzeżeń ma zastosowanie do chorób u ludzi.
Ze względu na swój szybki cykl życia, C. elegans szczególnie dobrze nadaje się jako model starzenia.
Po pierwsze, generowana jest zsynchronizowana w czasie populacja C. elegans, umożliwiając dorosłym hermafrodytom składanie jaj na płytkach NGM. Robaki składają jaja przez 6-8 godzin, a następnie są usuwane.
Gdy robaki osiągną pożądany etap, są przenoszone na nowe płytki NGM zawierające ampicylinę, aby zapobiec skażeniu bakteryjnemu, i FUDR, aby zapobiec rozmnażaniu.
Od tego momentu dorosłe robaki obserwuje się co 2-3 dni, aż wszystkie robaki umrą. Martwe robaki są usuwane z płytki i rejestrowana jest liczba żywych i martwych robaków.
Analiza długości życia w kontekście urazów genetycznych lub środowiskowych może dostarczyć istotnych informacji na temat procesu starzenia.
Za pomocą laserów można wykonywać aksotomie lub wycinanie pojedynczych aksonów, u żywych C. elegans w celu zbadania, jak regenerują się komórki nerwowe.
Ale ponieważ robaki nigdy nie pozostają w bezruchu, umieszcza się je na 10% podkładkach agarozowych w roztworze mikrogranulek. Na wierzchu umieszcza się szkiełko nakrywkowe. Mikrogranulki zwiększają współczynnik tarcia interakcji podkładka-szkiełko nakrywkowe, skutecznie zamrażając robaka w miejscu.
Szkiełko jest teraz przygotowane do wykonywania aksotomii. Neurony są umieszczane w polu widzenia i centrowane pod mikroskopem. Laser jest następnie odpalany za pomocą pedału nożnego. Optymalna moc lasera przetnie neuron bez uszkadzania sąsiednich struktur. Na jedno zwierzę wycina się jak najwięcej aksonów.
Podkładka agarozowa jest następnie ostrożnie usuwana ze szkiełka, a robaki mogą dojść do siebie na wysiewanej płytce NGM w temperaturze 20 °C. Między 8 a 48 godzinami po aksotomii neurony mogą być przygotowane do uzyskania punktów do regeneracji. W dystalnej części cięcia neuron tworzy kikut. Jednak w części proksymalnej neuron regeneruje się, tworząc wydłużone neuryty.
Właśnie obejrzałeś podejście JoVE do podstawowej pielęgnacji Ceanorhabditis elegans. W tym filmie omówiliśmy: trzymanie i karmienie C. elegans, obchodzenie się z nimi oraz zamrażanie i odzyskiwanie nicieni.
Przeprowadziliśmy również krótką wycieczkę po niektórych aplikacjach, które sprawiają, że C. elegans jest tak potężnym narzędziem badawczym. Chociaż C. elegans różnią się od ssaków pod wieloma względami, ich podobny skład genetyczny, łatwość utrzymania i prosta manipulacja sprawiają, że są ważnym modelem w dążeniu do zrozumienia biologii i chorób ssaków. Dzięki za oglądanie!
Zaloguj się lub , aby uzyskać dostęp do pełnej treści. Dowiedz się więcej o dostępie Twojej instytucji do treści JoVE tutaj
Właściwa pielęgnacja i utrzymanie Caenorhabditis elegans jest niezbędne do udanych eksperymentów.
Zajmują bardzo mało miejsca, są tanie w utrzymaniu, mają wysoką płodność i są łatwe w obsłudze. Ale tylko dlatego, że są łatwe w utrzymaniu, nie oznacza to słabej nauki. W rzeczywistości Sydney Brenner nazwał C. elegans "Darem natury dla nauki", a od czasu jego wprowadzenia w 1974 roku robak ten był opisywany w wielu eksperymentach nagrodzonych Nagrodą Nobla.
W tym filmie pokażemy podstawowe metody utrzymania C. elegans w laboratorium, w tym: trzymanie i karmienie, obchodzenie się, a także zamrażanie i rozmrażanie robaków.
W naturze C. elegans znajdują się w glebie i żywią się rozkładającą się materią roślinną. W laboratorium ważne jest, aby nicienie były tak szczęśliwe, jak to tylko możliwe, dlatego trzymamy je i karmimy przy użyciu bardzo specyficznych metod.
C. elegans może być uprawiany w temperaturze 16, 20 lub 25 °C, w zależności od wymagań eksperymentu, i może być uprawiany na podłożach stałych lub płynnych. W obu przypadkach są karmione OP50, standaryzowanym szczepem E. coli używanym specjalnie do hodowli nicieni w każdym laboratorium robaków na całym świecie.
Uprawiane w temperaturze 25 °C, C. elegans kończą swój cykl życiowy 2,1 razy szybciej niż w temperaturze 16 °C. Szybszy cykl życiowy oznacza, że robaki dojrzewają szybciej, składają więcej jaj i spożywają więcej pokarmu. Jeśli robaki mogą umrzeć z głodu lub stać się zbyt zatłoczone, wchodzą w stadium larwalne zwane stadium dauer. Larwy Dauer są odporne na stres i nie starzeją się.
Utrzymywane na pożywkach stałych, C. elegans są hodowane na płytkach agarowych przygotowanych z pożywką hodowlaną nicieni lub pożywką NGM. Dzień przed przygotowaniem płytek zaszczepij płynne podłoże LB pojedynczą kolonią OP50 E. coli. Inkubować pożywkę w temperaturze 37 °C przez noc, wytrząsając.
Aby uzyskać stałe podłoże, należy odmierzyć i połączyć odpowiednie ilości tych składników z wodą dejonizowaną w kolbie Erlenmeyera.
Po sterylizacji w autoklawie przez co najmniej 15 minut, pozostawić agar do ostygnięcia do temperatury 55 °C w łaźni wodnej. Gdy podłoże ostygnie do 55 °C, powinno być w stanie wygodnie trzymać szklany pojemnik gołymi rękami. Stosując odpowiednią technikę aseptyczną, w tym czasie można dodawać dodatki, takie jak leki lub antybiotyki. Zamieszaj, aby wymieszać. Następnie pipetować stopiony NGM na płytki Petriego, aż będą wypełnione w 2/3. Pozostaw nowo przygotowane talerze do wyschnięcia na ławce na noc.
Następnego ranka osadzaj OP50 w stężeniu 3500 x g przez 10 minut, a następnie ponownie zawieś bakterie w pożywce LB do 10-krotnego stężenia. Teraz odpipetuj centralny trawnik na każdą płytkę. Unikać dotykania końcówki pipety do powierzchni NGM i uważać, aby kultura nie dotykała ścianek płytki. Pozostaw talerze do wyschnięcia na ławce na noc. Po wyschnięciu wystaw płytki na działanie światła UV, aby je wysterylizować. Są teraz gotowe do użycia podczas hodowli robaków.
C. elegans są indywidualnie manipulowane za pomocą narzędzia znanego jako kilof. Kilof jest zwykle wykonany z drutu o grubości 30 90% platyny i 10% irydu, chociaż niektórzy badacze mogą preferować nieco inny skład metalu. Aby dokonać kilofa, zacznij od złamania końcówki pipety Pasteura na preferowaną długość.
Odetnij około 3 do 4 cm drutu i umieść 0,5 cm go wewnątrz końcówki pipety. Uszczelnij drut do szyby nad palnikiem Bunsena. Długość drutu wystającego ze szkła wynosi około 3 do 3,5 cm, ale może się różnić w zależności od indywidualnych preferencji.
Spłaszcz koniec drutu za pomocą twardej krawędzi. Następnie zegnij spłaszczoną część do góry, aby utworzyć szufelkę. Na koniec przeszlifuj krawędzie kilofa, aby zapobiec uszkodzeniu robaka lub agaru.
Aby zbierać robaki, wysterylizuj drut kilofa na płomieniu. Następnie pokryj końcówkę grubym, lepkim OP50 E. coli z płytki NGM. Zachowaj ostrożność, aby nie przebić ani nie pozostawić blizn na powierzchni agaru.
Patrząc przez lunetę do sekcji, delikatnie zgarnij robaka na spłaszczony, lepki kilof, aż robak przyklei się do kilofa.
Gdy robak znajdzie się na kilofie, natychmiast przenieś, lekko przytrzymując końcówkę na nowej powierzchni nowej płytki i przesuwając ją po bakteryjnym trawniku. Robak powinien odczołgać się od kilofa. Robak nie powinien zbyt długo pozostawać na kilofie, ponieważ może wyschnąć.
Jednym z powodów, dla których C. elegans jest popularnym modelem badawczym, jest to, że kultury mogą być przechowywane przez długi czas bez żadnych negatywnych skutków.
Najpierw umyj świeżo zagłodzone larwy za pomocą 0,5 ml buforu M9, delikatnie zamieszaj, aby rozluźnić wszystkie larwy i dorosłe zwierzęta, a następnie przenieś do mikrowirówki lub krioprobunki. Następnie dodaj równą ilość 30% glicerolu do M9 Buffer. Na koniec zapakuj fiolkę do izolowanego pudełka i przechowuj w temperaturze -80 °C.
Aby odzyskać robaki, wyjmij probówkę z zamrażarki -80 i pozwól mu rozmrozić się w temperaturze pokojowej, aż zawartość całkowicie się rozpuści. Odpipetować płyn na świeżą płytkę NGM z trawnikiem OP50 i inkubować w temperaturze 20 °C. Po 2-3 dniach przenieś 10-15 zwierząt na nową płytkę i pozwól im rozmnażać się przez jedno pokolenie. Zbierz potomstwo i oceń prawidłowe fenotypy.
Teraz, gdy już widzieliśmy, jak C. elegans jest utrzymywany w laboratorium, przyjrzyjmy się, jak modyfikowane są warunki karmienia, przetrzymywania i obchodzenia się z nim w eksperymentach.
Nagrodzone Nagrodą Nobla odkrycie interferencji RNA pozwoliło naukowcom wyciszyć dowolny gen C. elegans w celu określenia jego funkcji.
Możemy indukować RNAi w C. elegans, najpierw przygotowując płytki z E. coli, które wyrażają docelowy gen dsRNA, który zostaną zjedzone przez robaki.
Następnie robaki w czwartym stadium larwalnym są przenoszone na płytki RNAi i pozostawiane do złożenia jaj. Na pożądanym etapie rozwoju potomstwo jest zbierane i oceniane pod kątem fenotypów. Ponieważ dzielimy około połowy naszego genomu z robakiem, wiele z zebranych spostrzeżeń ma zastosowanie do chorób u ludzi.
Ze względu na swój szybki cykl życia, C. elegans szczególnie dobrze nadaje się jako model starzenia.
Po pierwsze, generowana jest zsynchronizowana w czasie populacja C. elegans, umożliwiając dorosłym hermafrodytom składanie jaj na płytkach NGM. Robaki składają jaja przez 6-8 godzin, a następnie są usuwane.
Gdy robaki osiągną pożądany etap, są przenoszone na nowe płytki NGM zawierające ampicylinę, aby zapobiec skażeniu bakteryjnemu, i FUDR, aby zapobiec rozmnażaniu.
Od tego momentu dorosłe robaki obserwuje się co 2-3 dni, aż wszystkie robaki umrą. Martwe robaki są usuwane z płytki i rejestrowana jest liczba żywych i martwych robaków.
Analiza długości życia w kontekście urazów genetycznych lub środowiskowych może dostarczyć istotnych informacji na temat procesu starzenia.
Za pomocą laserów można wykonywać aksotomie lub wycinanie pojedynczych aksonów, u żywych C. elegans w celu zbadania, jak regenerują się komórki nerwowe.
Ale ponieważ robaki nigdy nie pozostają w bezruchu, umieszcza się je na 10% podkładkach agarozowych w roztworze mikrogranulek. Na wierzchu umieszcza się szkiełko nakrywkowe. Mikrogranulki zwiększają współczynnik tarcia interakcji podkładka-szkiełko nakrywkowe, skutecznie zamrażając robaka w miejscu.
Szkiełko jest teraz przygotowane do wykonywania aksotomii. Neurony są umieszczane w polu widzenia i centrowane pod mikroskopem. Laser jest następnie odpalany za pomocą pedału nożnego. Optymalna moc lasera przetnie neuron bez uszkadzania sąsiednich struktur. Na jedno zwierzę wycina się jak najwięcej aksonów.
Podkładka agarozowa jest następnie ostrożnie usuwana ze szkiełka, a robaki mogą dojść do siebie na wysiewanej płytce NGM w temperaturze 20 °C. Między 8 a 48 godzinami po aksotomii neurony mogą być przygotowane do uzyskania punktów do regeneracji. W dystalnej części cięcia neuron tworzy kikut. Jednak w części proksymalnej neuron regeneruje się, tworząc wydłużone neuryty.
Właśnie obejrzałeś podejście JoVE do podstawowej pielęgnacji Ceanorhabditis elegans. W tym filmie omówiliśmy: trzymanie i karmienie C. elegans, obchodzenie się z nimi oraz zamrażanie i odzyskiwanie nicieni.
Przeprowadziliśmy również krótką wycieczkę po niektórych aplikacjach, które sprawiają, że C. elegans jest tak potężnym narzędziem badawczym. Chociaż C. elegans różnią się od ssaków pod wieloma względami, ich podobny skład genetyczny, łatwość utrzymania i prosta manipulacja sprawiają, że są ważnym modelem w dążeniu do zrozumienia biologii i chorób ssaków. Dzięki za oglądanie!
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: What temperature conditions are best for growing C. elegans in the lab?
C. elegans can be grown at 16, 20, or 25 °C depending on experimental requirements. Temperature directly affects life cycle speed: at 25 °C, worms complete their life cycle 2.1 times faster than at 16 °C. Faster growth means worms mature quicker, lay more eggs, and consume more food, making temperature selection critical for experimental design.
Q2: What do C. elegans eat and how are they fed in the laboratory?
C. elegans are fed OP50, a standardized strain of E. coli used in every worm lab worldwide. In the wild, worms feed on decomposing plant matter, but in the lab they consume OP50 cultured on nematode growth media (NGM) plates or in liquid media. This standardized diet ensures consistent experimental conditions across research facilities.
Q3: How do you make and prepare NGM plates for C. elegans culture?
Combine nematode growth media ingredients with deionized water, autoclave for at least 15 minutes, then cool to 55 °C. Add aseptic additives if needed, pipette into Petri plates until 2/3 full, and dry overnight. Inoculate with OP50 E. coli resuspended to 10X concentration, dry overnight, then expose to UV light for sterilization before use.
Q4: What is a worm pick and how is it constructed?
A worm pick is a tool made from 30 gauge platinum-iridium wire sealed into a Pasteur pipet tip. The wire is flattened at the end and bent upward to form a scoop, then sanded smooth. The pick allows researchers to individually manipulate and transfer worms under a dissection microscope without damaging them or the agar surface.
Q5: How are C. elegans frozen and recovered for long-term storage?
Wash freshly starved larvae in M9 Buffer, transfer to a cryotube, add equal volume of 30% glycerol in M9 Buffer, and store at -80 °C. To recover, thaw at room temperature, pipette onto fresh NGM plates with OP50, and incubate at 20 °C. After 2-3 days, transfer animals to new plates and allow one generation of reproduction before scoring phenotypes.
Q6: What happens to C. elegans when they experience stress or overcrowding?
When starved or overcrowded, C. elegans enter the dauer stage, a stress-resistant larval stage where worms do not age. This survival mechanism allows populations to persist under adverse conditions until resources become available again, making dauer larvae useful for long-term storage and experimental manipulation.
Q7: How is RNA interference used to study gene function in C. elegans?
Researchers prepare plates with E. coli expressing target gene dsRNA, which worms consume. Fourth larval stage worms are transferred to RNAi plates to lay eggs, then progeny are collected at desired developmental stages and scored for phenotypes. This approach silences specific genes to determine their function, leveraging insights from development and reproduction of caenorhabditis elegans for disease research.
Rozdziały w tym filmie
0:00
Overview
0:57
Housing and Feeding
3:54
Handling C. elegans
5:43
Freezing and Recovery of C. elegans
6:52
Applications
10:08
Summary