Utrzymanie C. elegans

Prawidłowa opieka i utrzymanie Caenorhabditis elegans są niezbędne dla powodzenia eksperymentów.

Wymagają one bardzo niewielkiej przestrzeni, są tanie w utrzymaniu, charakteryzują się wysoką płodnością i są łatwe w manipulacji. Jednak fakt, że są proste w hodowli, nie oznacza, że służą do prowadzenia trywialnych badań. W rzeczywistości Sydney Brenner słynnie nazwał C. elegans "darem natury dla nauki," a od czasu wprowadzenia go do badań w 1974 roku, nicienie te brały udział w wielu eksperymentach uhonorowanych Nagrodą Nobla.

W tym filmie zaprezentujemy podstawowe metody utrzymywania C. elegans w laboratorium, w tym: zakwaterowanie i karmienie, obchodzenie się z nimi, a także zamrażanie i odmrażanie nicieni.

W naturze C. elegans występują w glebie i żywią się rozkładającą się materią roślinną. W laboratorium ważne jest, aby zapewnić nicieniom jak najlepsze warunki, dlatego utrzymujemy i karmimy je, stosując bardzo konkretne metody.

C. elegans można hodować w temperaturze 16, 20 lub 25 °C w zależności od wymagań eksperymentu, zarówno na pożywkach stałych, jak i w płynnych. W obu przypadkach są one karmione szczepem OP50, zestandaryzowanym szczepem E. coli stosowanym specjalnie do hodowli nicieni w laboratoriach na całym świecie.

W temperaturze 25 °C C. elegans kończą swój cykl życiowy 2,1 raza szybciej niż w temperaturze 16 °C. Szybszy cykl życiowy oznacza, że nicienie szybciej dojrzewają, składają więcej jaj i zużywają więcej pożywienia. Jeśli nicienie zostaną poddane głodzeniu lub ich zagęszczenie stanie się zbyt duże, przechodzą w stadium larwalne zwane stadiem dauer. Larwy dauer są odporne na stres i nie starzeją się.

W przypadku utrzymywania na pożywkach stałych, C. elegans hoduje się na płytkach agarowych przygotowanych z pożywki do wzrostu nicieni lub pożywki NGM. Dzień przed przygotowaniem płytek należy zaszczepić płynną pożywkę LB pojedynczą kolonią E. coli OP50. Pożywkę inkubuje się w temperaturze 37 °C przez noc z wytrząsaniem.

Aby przygotować pożywkę stałą, należy odmierzyć i połączyć odpowiednie ilości tych składników z wodą dejonizowaną w kolbie Erlenmeyera.

Po autoklawowaniu przez co najmniej 15 minut należy pozwolić agarowi ostygnąć do 55 °C w kąpieli wodnej. Gdy pożywka ostygnie do 55 °C, szklany pojemnik powinien dać się swobodnie trzymać gołymi rękami. Stosując odpowiednią technikę aseptyczną, można w tym czasie dodać dodatki, takie jak leki lub antybiotyki. Zamieszać poprzez delikatne kręcenie kolbą. Następnie za pomocą pipety nalać płynne NGM na płytki Petri, aż będą wypełnione w 2/3. Pozostawić nowo przygotowane płytki do wyschnięcia na blacie na całą noc.

Następnego ranka należy odwirować OP50, tworząc pellet przy 3500 x g przez 10 minut, a następnie resuspendować bakterie w pożywce LB do stężenia 10X. Teraz należy nanieść za pomocą pipety centralną plamkę na każdą płytkę. Należy unikać dotykania końcówki pipety powierzchni NGM i dbać o to, aby kultura nie dotknęła ścianek płytki. Pozostawić płytki do wyschnięcia na blacie na całą noc. Po wyschnięciu płytki należy poddać działaniu światła UV w celu ich sterylizacji. Są one teraz gotowe do użycia w hodowli nicieni.

C. elegans manipuluje się pojedynczo za pomocą narzędzia zwanego wykałaczką do nicieni (worm pick). Wykałaczka jest zazwyczaj wykonana z drutu 30 gauge składającego się z 90% platyny i 10% irydu, choć niektórzy badacze mogą preferować nieco inny skład metalu. Aby wykonać wykałaczkę, należy zacząć od odłamania końcówki pipety Pasteura do pożądanej długości.

Odetnij około 3 do 4 cm drutu i umieść 0,5 cm w końcówce pipety. Przyspawaj drut do szkła nad palnikiem Bunsena. Długość drutu wystającego ze szkła wynosi około 3 do 3,5 cm, ale może się różnić w zależności od indywidualnych preferencji.

Spłaszcz koniec drutu, używając twardej krawędzi. Następnie zegnij spłaszczoną część ku górze, aby utworzyć wgłębienie. Na koniec oszlifuj krawędzie wykałaczki, aby zapobiec uszkodzeniu nicienia lub agaru.

Aby pobrać nicienie, wysterylizuj drut wykałaczki w płomieniu. Następnie pokryj końcówkę gęstą, lepką kulturą E. coli szczep OP50 z płytki NGM. Zachowaj ostrożność, aby nie przebić ani nie porysować powierzchni agaru.

Patrząc przez stereomikroskop, delikatnie podnieś nicienia spłaszczoną, lepką końcówką wykałaczki, aż nicień przywrze do niej.

Gdy nicień znajdzie się na wykałaczce, natychmiast przenieś go, delikatnie przykładając końcówkę do powierzchni nowej płytki i przesuwając ją po warstwie bakterii. Nicień powinien zejść z wykałaczki. Nicień nie może pozostawać na wykałaczce zbyt długo, ponieważ mógłby wyschnąć.

Jednym z powodów, dla których C. elegans jest popularnym modelem badawczym, jest możliwość przechowywania kultur przez długi czas bez żadnych negatywnych skutków.

Najpierw przemyć świeżo głodzone larwy za pomocą 0,5 ml buforu M9, delikatnie zamieszać, aby odseparować wszystkie larwy i osobniki dorosłe, a następnie przenieść je do mikroprobówki lub probówki kriogenicznej. Następnie dodać równą ilość 30% glicerolu w buforze M9. Na koniec umieścić probówkę w izolacyjnym pudełku i przechowywać w temperaturze -80 °C.

Aby zregenerować nicienie, wyjąć probówkę z zamrażarki -80 °C i pozostawić do rozmrożenia w temperaturze pokojowej, aż zawartość całkowicie się rozpuści. Przenieść ciecz pipetą na świeżą płytkę NGM z trawnikiem OP50 i inkubować w temperaturze 20 °C. Po 2-3 dniach przenieść 10-15 osobników na nową płytkę i pozwolić im rozmnożyć się przez jedno pokolenie. Zebrać potomstwo i ocenić pod kątem prawidłowych fenotypów.

Po zapoznaniu się ze sposobem utrzymania C. elegans w laboratorium, przyjrzyjmy się temu, jak modyfikuje się warunki karmienia, zakwaterowania i manipulacji na potrzeby eksperymentów.

Nagrodzone Noblem odkrycie interferencji RNA pozwoliło badaczom wyciszać dowolny gen C. elegans w celu określenia jego funkcji.

Interferencję RNA (RNAi) w C. elegans możemy indukowanie poprzez wcześniejsze przygotowanie płytek z E. coli, które wykazują ekspresję dsRNA docelowego genu, którym będą żywić się nicienie.

Następnie nicienie w 4. stadium larwalnym są przenoszone na płytki RNAi i pozostawia się je do zniesienia jaj. Na pożądanym etapie rozwoju potomstwo jest zbierane i oceniane pod kątem fenotypów. Ponieważ dzielimy z tym nicieniem około połowy naszego genomu, wiele zdobytych informacji ma zastosowanie w badaniach chorób ludzkich.

Ze względu na szybki cykl życiowy, C. elegans szczególnie dobrze nadaje się jako model starzenia.

Najpierw generowana jest zsynchronizowana czasowo populacja C. elegans poprzez umożliwienie dorosłym hermafrodytom zniesienia jaj na płytkach NGM. Nicienie znoszą jaja przez 6-8 hr, a następnie są usuwane.

Gdy nicienie osiągną pożądany etap rozwoju, są przenoszone na nowe płytki NGM zawierające ampicylinę, aby zapobiec kontaminacji bakteryjnej, oraz FUDR, aby zapobiec rozmnażaniu.

Od tego momentu dorosłe nicienie są obserwowane co 2-3 dni, aż do śmierci wszystkich osobników. Martwe nicienie są usuwane z płytki, a liczba żywych i martwych osobników jest rejestrowana.

Analiza długości życia w kontekście uszkodzeń genetycznych lub środowiskowych może dostarczyć istotnych informacji na temat procesu starzenia.

Z wykorzystaniem laserów możliwe jest przeprowadzanie aksotomii, czyli przecinania pojedynczych aksonów w żywych C. elegans, aby zbadać, w jaki sposób regenerują się komórki nerwowe.

Ponieważ jednak nicienie nigdy nie pozostają w bezruchu, umieszcza się je na podkładkach z 10% agarozy w roztworze mikrokulek. Na wierzchu kładzie się szkiełko nakrywkowe. Mikrokulki zwiększają współczynnik tarcia w oddziaływaniu podkładka-nakrywka, co skutecznie unieruchamia nicienia w miejscu.

Preparat jest teraz gotowy do wykonania aksotomii. Neurony zostają wprowadzone w pole widzenia i wycentrowane w mikroskopie. Następnie laser jest uruchamiany za pomocą pedału. Optymalna moc lasera przetnie neuron, nie uszkadzając sąsiednich struktur. W każdym zwierzęciu przecina się jak najwięcej aksonów.

Następnie podkładka agarowa jest ostrożnie usuwana z preparatu, a nicieniom pozwala się na regenerację na zaszczepionej płytce NGM w temperaturze 20 °C. Od 8-48 hr po aksotomii neurony można przygotować do oceny regeneracji. W dystalnej części cięcia neuron tworzy pień. Jednak w części proksymalnej neuron regeneruje się, tworząc wydłużone neuryty.

Właśnie obejrzeli Państwo materiał JoVE dotyczący podstawowej hodowli Ceanorhabditis elegans. W tym filmie omówiliśmy: warunki utrzymania i karmienie C. elegans, zasady obchodzenia się z nimi oraz mrożenie i regenerację nicieni.

Przeprowadziliśmy również krótki przegląd zastosowań, które czynią C. elegans tak potężnym narzędziem badawczym. Chociaż C. elegans w wielu aspektach różnią się od ssaków, ich podobna budowa genetyczna, łatwość utrzymania oraz prostota manipulacji sprawiają, że są one istotnym modelem w dążeniu do zrozumienia biologii i chorób ssaków. Dziękujemy za uwagę!