Name: Inżynieria tkankowa: budowa wielokomórkowego rusztowania 3D do dostarczania warstwowych arkuszy komórkowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Poznaj metodę tworzenia inżynieryjnych łat tkankowych z arkuszy komórkowych przy użyciu termoczułego polimeru pNIPAM. Technika ta umożliwia budowę wielowarstwowych struktur do implantacji z zachowaniem integralności komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została sfinansowana przez New Faculty Award II od California Institute of Regenerative Medicine (CIRM; RN2-00921-1), finansowana przez NIH National Research Award (F32-HL104924) oraz CIRM Training Grant (TG21163). Materiały dostarczyli: Glycosan Biosystems Inc / BioTime oraz dr Stephen Badylak (University of Pittsburgh)

1. Tworzenie płyt pokrytych pNIPAAM
<ol>
	<li>Rozpuścić 2,6 g pNIPAAM w 2 ml 60% roztworu toluenu/40% heksanu.</li>
	<li>Podgrzać mieszaninę do temperatury 60 °C przez 10 minut, mieszając, aż do rozpuszczenia pNIPAAM.</li>
	<li>Pokrój bibułę filtracyjną w okrąg o średnicy 60 mm i umieść papier w lejku Buchnera.</li>
	<li>Przefiltruj roztwór przez lejek Buchnera do wstępnie zważonej szklanej zlewki (nie używaj tworzyw sztucznych, ponieważ heksan stopi tworzywa sztuczne).</li>
	<li>Umieścić zlewkę i zawartość w odkurzaczu dzwonowym (24 psi) O/N (16 godzin). Uwaga: Dopóki pozostałość nie zareaguje z izopropylem, ulegnie utlenieniu, więc upewnij się, że nie ma kontaktu z tlenem.</li>
	<li>Zważyć zlewkę, aby ustalić masę pNIPAAM.</li>
	<li>Dodać alkohol izopropylowy do pNIPAAM, tworząc roztwór 50/50 w/w.</li>
	<li>Umieścić 2 ml roztworu na powierzchni płytki do hodowli tkankowej i pokryć przez 5 minut w świetle UV.</li>
	<li>Umyj płytkę 2 ml ciepłego PBS dwukrotnie przed użyciem do hodowli komórkowej.</li>
</ol>
2. Tworzenie arkuszy komórkowych
Uwaga: Arkusze komórek pierwotnych dla narządu docelowego mogą być tworzone przy użyciu wielu różnych metod, lub poprzez powlekanie powierzchni kultur tkankowych polimerem reagującym na termo, jak opisano tutaj. Wstępnie powlekane płyty termoczułe są również oferowane przez wielu dostawców.
Uwaga: Ten protokół dotyczy hodowli przy użyciu szalki 35 mm. Krótko mówiąc, komórki są najpierw inkubowane w temperaturze 37 °C przez co najmniej 24 godziny przy zbiegu, aby ustanowić boczne połączenia między sąsiednimi komórkami. Aby uwolnić arkusze komórek, płytki poddaje się działaniu temperatur poniżej 32 °C. Arkusz komórek jest następnie przenoszony do mocnej podstawowej macierzy włóknistej zawierającej neonaskularny permisywny hydrożel z komórkami śródbłonka naczyń krwionośnych.
<ol>
	<li>Odizoluj populację komórek. Uwaga: Ta metoda jest zależna od indywidualnych procedur wyprowadzania i typu komórek. W tym przykładzie użyto komórek mięśni gładkich aorty szczura (RASMC). Są to pierwotne komórki mięśni gładkich wyizolowane z aorty brzusznej szczura.</li>
	<li>Umyj komórki 2 ml ciepłego PBS.</li>
	<li>Dodaj 3 ml trypsyny (lub innego roztworu rozszczepiającego/oddzielającego) do komórek przez 5 minut.</li>
	<li>Zahamować działanie trypsyny przez dodanie 3 ml pożywki hodowlanej lub roztworu buforu fosforanowego (PBS) zawierającego 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS).</li>
	<li>Zebrać komórki w stożkowej probówce i odliczyć podwielokrotność.</li>
	<li>Wiruj komórki z prędkością 1 000 obr./min (228 x g) przez 5 minut.</li>
	<li>Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w ich pożywce wzrostowej (do RASMC stosuje się pożywkę hodowlaną SmGM2 plus bullet kit).</li>
	<li>Umieść pożywkę zawierającą komórki na termoczułej płytce o średnicy 35 mm – płytce pokrytej pNIPAAM w stężeniu, które pozwoli osiągnąć 100% zbieżność. Uwaga: W przypadku RASMC liczba ta została określona na 100 000 komórek/cm2. Jednak ze względu na utratę komórek podczas przechodzenia, 120% tej wartości jest wykorzystywane.</li>
	<li>Umieścić w inkubatorze w temperaturze 37 °C O/N. Uwaga: Ważne jest, aby utrzymać komórki w temperaturze 37 °C, aby utrzymać przyleganie komórek do płytki.</li>
</ol>
3. Przygotowanie Matrycy Podstawowej
Uwaga: Różne matryce włókniste 3D mogą być używane do nakładania mocnych matryc włóknistych między delikatne arkusze komórek. Oto kilka przykładów: pianka żelowa, bioszkło, naturalne materiały akomórkowe26 lub materiały nanoprzędzone27,28 Macierz pęcherza moczowego świń (UBM) wykorzystana w tych badaniach została hojnie dostarczona przez naszego współpracownika, dr Badylaka. 29
<ol>
	<li>Przed użyciem określ charakterystykę macierzy, w tym brak zawartości komórkowej, jeśli używana jest matryca bezkomórkowa, 27,28 specyficzną żywotność komórki i pustą przestrzeń. 22 Rozdział 22</li>
	<li>Wytnij wstępnie wysterylizowaną matrycę do pożądanego rozmiaru i kształtu. Uwaga: W tym przypadku dziurkacz służy do wycinania koła o średnicy 4 mm.</li>
</ol>
4. Umieszczanie komórek śródbłonka w neowaskularnym permisywnym hydrożelu
Uwaga: Komórki śródbłonka mogą być pozyskiwane z różnych źródeł, w tym z różnicowania z komórek macierzystych lub progenitorowych. W tym przypadku stosowane są HuVEC.
<ol>
	<li>Używaj dowolnego dopuszczalnego hydrożelu (fibryny, żeli kolagenowych), o ile czas sieciowania jest wystarczająco krótki, aby komórki pozostały żywotne. Uwaga: W tym przypadku stosuje się żel na bazie hialuronianu (HA) usieciowany mostkiem dwusiarczkowym.</li>
	<li>Hydrożel HA należy przygotować zgodnie z protokołem zakładowym.</li>
	<li>Zbierz komórki śródbłonka i rozprosz się w roztworze jednokomórkowym za pomocą 1x trypsyny. Uwaga: Accutase lub bufor dysocjacyjny komórek może być również używany do dyspersji pojedynczych komórek.</li>
	<li>Dezaktywować enzym trypsyny za pomocą równej ilości inhibitora trypsyny sojowej (jeśli ważne jest, aby komórki nie miały kontaktu z surowicą) lub 10% FBS w PBS, zbierając roztwór/komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Policz komórki i oblicz objętość potrzebną do wymiarów łaty (wcześniej określonych ilościowo). Uwaga: W przypadku plastra o średnicy 4 mm stosuje się tutaj 2 miliony komórek śródbłonka.</li>
	<li>Wyekstrahuj 2 miliony komórek i umieść w nowej stożkowej probówce o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Wirować z prędkością (228 x g) przez 5 min.</li>
	<li>Odessać supernatant, pozostawiając komórki w postaci osadu w stożkowej probówce.</li>
	<li>Wymieszaj płynne materiały HA i żelatynę w proporcji 1:1. Następnie dodaj 80% całkowitej objętości do stożkowej rurki zawierającej osad.</li>
	<li>Zawiesić komórki śródbłonka w mieszaninie 1:1 HA / żelatyna</li>
	<li>Umieść zawieszone komórki w mieszaninie HA / żelatyny w podstawowej matrycy włóknistej z kroku 2.</li>
	<li>Dodaj 1/5 (20 procent) całkowitej objętości pożądanej przez urządzenie sieciujące</li>
	<li>Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.</li>
</ol>
5. Izolacja arkuszy komórek
<ol>
	<li>Wyjąć z inkubatora płytki o średnicy 35 mm zawierające komórki poddane działaniu pNIPAAM i umieścić w kapturze do hodowli komórkowych w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Szybko odessać pożywkę z komórek i dodać 2 ml 6% normalnej żelatyny, która została podgrzana do temperatury 37 °C.</li>
	<li>Gdy żelatyna jest jeszcze ciepła, umieść metalową siatkę w żelatynie, zanurzając ją pod powierzchnią normalnej żelatyny (film 1).</li>
	<li>Umieść całą płytkę na lodzie na 5 do 7 minut, pozwalając żelatynie stwardnieć.</li>
	<li>Po 7 minutach za pomocą szpatułki ostrożnie oddziel brzegi żelatyny od boku płytki, a następnie za pomocą kleszczy podnieś metalową kratę z płytki Uwaga: 6% żelatyny i arkusz komórek powinny unosić się wraz z siatką.</li>
	<li>Przenieś arkusz komórek do naczynia i umieść na wierzchu podstawowej kombinacji włóknistej matrycy i hydrożelu, ostrożnie ustawiając siatkę na wierzchu konstrukcji. Uwaga: Wierzchołkowa strona arkusza komórek będzie nadal znajdować się w górnej pozycji.</li>
	<li>Dodać 2 ml ciepłej pożywki (37 °C).</li>
	<li>Inkubować O/N, pozwalając arkuszowi komórek przylegać do powierzchni hydrożelu.</li>
	<li>Usuń metalową siatkę po ogrzaniu roztworu (około 1 godziny) lub następnego dnia.</li>
</ol>

<ol><li>Ohashi, K., Okano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+tissue+engineering+of+the+liver+and+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec+%28Hoboken%29%22%5BJournal%5D)">Functional tissue engineering of the liver and islets.</a> Anat Rec (Hoboken). 297, 73-82 (2014).</li>
<li>Chen, Q. Z., Harding, S. E., Ali, N. N., Lyon, A. R., Boccaccini, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomaterials+in+cardiac+tissue+engineering%3A+Ten+years+of+research+survey%5BTitle%5D)+AND+%22Mat+Sci+Eng+R%22%5BJournal%5D)">Biomaterials in cardiac tissue engineering: Ten years of research survey.</a> Mat Sci Eng R. 59, 1-37 (2008).</li>
<li>Jakob, P., Landmesser, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+status+of+cell-based+therapy+for+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Heart+Fail+Rep%22%5BJournal%5D)">Current status of cell-based therapy for heart failure.</a> Curr Heart Fail Rep. 10, 165-176 (2013).</li>
<li>Tongers, J., Losordo, D. W., Landmesser, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+and+progenitor+cell-based+therapy+in+ischaemic+heart+disease%3A+promise%2C+uncertainties%2C+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Heart+J%22%5BJournal%5D)">Stem and progenitor cell-based therapy in ischaemic heart disease: promise, uncertainties, and challenges.</a> Eur Heart J. 32, 1197-1206 (2011).</li>
<li>Etzion, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+embryonic+cardiomyocyte+transplantation+on+the+progression+of+heart+failure+in+a+rat+model+of+extensive+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Influence of embryonic cardiomyocyte transplantation on the progression of heart failure in a rat model of extensive myocardial infarction.</a> J Mol Cell Cardiol. 33, 1321-1330 (2001).</li>
<li>Masuda, S., Shimizu, T., Yamato, M., Okano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+sheet+engineering+for+heart+tissue+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">Cell sheet engineering for heart tissue repair.</a> Adv Drug Deliv Rev. 60, 277-285 (2008).</li>
<li>Koh, G. Y., Soonpaa, M. H., Klug, M. G., Field, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+myocardial+repair%5BTitle%5D)+AND+%22J+Interv+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Strategies for myocardial repair.</a> J Interv Cardiol. 8, 387-393 (1995).</li>
<li>Li, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+a+bioengineered+cardiac+graft%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thorac+Cardiovasc+Surg%22%5BJournal%5D)">Construction of a bioengineered cardiac graft.</a> J Thorac Cardiovasc Surg. 119, 368-375 (2000).</li>
<li>Muller-Ehmsen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rebuilding+a+damaged+heart%3A+long-term+survival+of+transplanted+neonatal+rat+cardiomyocytes+after+myocardial+infarction+and+effect+on+cardiac+function%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Rebuilding a damaged heart: long-term survival of transplanted neonatal rat cardiomyocytes after myocardial infarction and effect on cardiac function.</a> Circulation. , 105-1720 (2002).</li>
<li>Reinecke, H., Zhang, M., Bartosek, T., Murry, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival%2C+integration%2C+and+differentiation+of+cardiomyocyte+grafts%3A+a+study+in+normal+and+injured+rat+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Survival, integration, and differentiation of cardiomyocyte grafts: a study in normal and injured rat hearts.</a> Circulation. , 100-193 (1999).</li>
<li>Roell, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+cardiomyoplasty+improves+survival+after+myocardial+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Cellular cardiomyoplasty improves survival after myocardial injury.</a> Circulation. 105, 2435-2441 (2002).</li>
<li>Soonpaa, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+approaches+for+myocardial+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Potential approaches for myocardial regeneration.</a> Ann N Y Acad Sci. 752, 446-454 (1995).</li>
<li>Akins, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Can+tissue+engineering+mend+broken+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Can tissue engineering mend broken hearts.</a> Circ Res. 90, 120-122 (2002).</li>
<li>Goodell, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+plasticity+in+muscle+and+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Stem cell plasticity in muscle and bone marrow.</a> Ann N Y Acad Sci. 938, 208-218 (2001).</li>
<li>Menasche, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myoblast+transplantation+for+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Myoblast transplantation for heart failure.</a> Lancet. 357, 279-280 (2001).</li>
<li>Murry, C. E., Wiseman, R. W., Schwartz, S. M., Hauschka, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+myoblast+transplantation+for+repair+of+myocardial+necrosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Skeletal myoblast transplantation for repair of myocardial necrosis.</a> J Clin Invest. 98, 2512-2523 (1172).</li>
<li>Orlic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplanted+adult+bone+marrow+cells+repair+myocardial+infarcts+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Transplanted adult bone marrow cells repair myocardial infarcts in mice.</a> Ann N Y Acad Sci. 938, 221-229 (2001).</li>
<li>Elia, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silk-hyaluronan-based+composite+hydrogels%3A+a+novel%2C+securable+vehicle+for+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomater+Appl%22%5BJournal%5D)">Silk-hyaluronan-based composite hydrogels: a novel, securable vehicle for drug delivery.</a> J Biomater Appl. 27, 749-762 (2013).</li>
<li>Kai, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell-loaded+nanofibrous+patch+promotes+the+regeneration+of+infarcted+myocardium+with+functional+improvement+in+rat+model%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Stem cell-loaded nanofibrous patch promotes the regeneration of infarcted myocardium with functional improvement in rat model.</a> Acta Biomater. , (2014).</li>
<li>Hong, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracheal+reconstruction+using+chondrocytes+seeded+on+a+poly%28l-lactic-co-glycolic+acid%29-fibrin%2Fhyaluronan%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res+A%22%5BJournal%5D)">Tracheal reconstruction using chondrocytes seeded on a poly(l-lactic-co-glycolic acid)-fibrin/hyaluronan.</a> J Biomed Mater Res A. , (2014).</li>
<li>Serpooshan, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+bioengineered+acellular+collagen+patch+on+cardiac+remodeling+and+ventricular+function+post+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The effect of bioengineered acellular collagen patch on cardiac remodeling and ventricular function post myocardial infarction.</a> Biomaterials. 34, 9048-9055 (2013).</li>
<li>Turner, W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+tissue+development+for+delivery+of+embryonic+stem+cell-derived+endothelial+and+cardiac+cells+in+natural+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res+B+Appl+Biomater%22%5BJournal%5D)">Cardiac tissue development for delivery of embryonic stem cell-derived endothelial and cardiac cells in natural matrices.</a> J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 100, 2060-2072 (2012).</li>
<li>Sato, M., Yamato, M., Hamahashi, K., Okano, T., Mochida, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Articular+cartilage+regeneration+using+cell+sheet+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec+%28Hoboken%29%22%5BJournal%5D)">Articular cartilage regeneration using cell sheet technology.</a> Anat Rec (Hoboken). 297, 36-43 (2014).</li>
<li>Sawa, Y., Miyagawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Present+and+future+perspectives+on+cell+sheet-based+myocardial+regeneration+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Present and future perspectives on cell sheet-based myocardial regeneration therapy.</a> Biomed Res Int. 2013, 583912(2013).</li>
<li>Demirbag, B., Huri, P. Y., Kose, G. T., Buyuksungur, A., Hasirci, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+cell+therapies+with+and+without+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+J%22%5BJournal%5D)">Advanced cell therapies with and without scaffolds.</a> Biotechnol J. 6, 1437-1453 (2011).</li>
<li>Song, J. J., Ott, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ+engineering+based+on+decellularized+matrix+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Organ engineering based on decellularized matrix scaffolds.</a> Trends Mol Med. 17, 424-432 (2011).</li>
<li>Badylak, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+extracellular+matrix+as+an+inductive+scaffold+for+the+partial+replacement+of+functional+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">The use of extracellular matrix as an inductive scaffold for the partial replacement of functional myocardium.</a> Cell Transplant. 15, Suppl 1. S29-S40 (2006).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+restriction+of+human+hepatic+stem+cells+to+mature+fates+is+made+efficient+by+tissue-specific+biomatrix+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Lineage restriction of human hepatic stem cells to mature fates is made efficient by tissue-specific biomatrix scaffolds.</a> Hepatology. 53, 293-305 (2011).</li>
<li>Gilbert, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen+fiber+alignment+and+biaxial+mechanical+behavior+of+porcine+urinary+bladder+derived+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Collagen fiber alignment and biaxial mechanical behavior of porcine urinary bladder derived extracellular matrix.</a> Biomaterials. 29, 4775-4782 (2008).</li>
<li>Luna, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiscale+biomimetic+topography+for+the+alignment+of+neonatal+and+embryonic+stem+cell-derived+heart+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+C+Methods%22%5BJournal%5D)">Multiscale biomimetic topography for the alignment of neonatal and embryonic stem cell-derived heart cells.</a> Tissue Eng Part C Methods. 17, 579-588 (2011).</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

Krytyczne kroki w protokole obejmują: powlekanie powierzchni płyt termoczułym polimerem i manipulowanie arkuszami komórek po schłodzeniu płyt. Ponieważ różne ogniwa wykazują różne właściwości fizyczne, takie jak przyczepność, czas podnoszenia powinien być zoptymalizowany dla każdego typu ogniwa. Drugi i najbardziej wymagający element tego protokołu koncentruje się na manipulacji arkuszem komórek, krytycznym aspekcie metod składania tkanek. Pojedyncza warstwa komórek w arkuszu komórek jest dość delikatna i może się łatwo ...

Wstrzykiwanie komórek i/lub pojedynczych materiałów samo w sobie wykazało zmienny sukces w innych układach narządów i ograniczony sukces w regeneracji serca. 5,7-12 Obecnie komórki pochodzące z komórek macierzystych są dostarczane do uszkodzonej tkanki przy użyciu różnych metod dostarczania, w tym: bezpośredniego wstrzyknięcia komórek do tkanki i perfuzji do krwiobiegu. 13-17 Inni mają wszczepione same komórki, materiały same i/lub w połączeniu z nośnikami materialnymi, aby pomóc w regeneracji uszkodzonych narządów. 18-21 Ten projekt łączy w sobie wiele strategii, które zapewniają wytrzymałość materiału, wzór w wielu materiałach i wielu typach komórek. 
W szczególności, podstawowa akomórkowa matryca włóknista zapewnia podstawową siłę fizyczną konstrukcji, dzięki czemu nadaje się do wszycia w pacjenta, jeśli to konieczne. Puste przestrzenie w macierzy podstawowej są wypełnione komórkami śródbłonka w neowaskularnym permisywnym hydrożelu22 w celu szybkiego unaczynienia wszczepionego konstruktu. Kompozyt ten jest następnie integrowany ze wstępnie wzorzystymi arkuszami komórek, które umożliwiają lepszą komunikację między komórkami, bardziej naśladując tkankę natywną. 1,23-25 Ogólny proces produkcji warstwowego plastra komórkowego przedstawiono na schemacie blokowym na rysunku 1.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reodczynniki</td></tr><tr><td>Calcein-AM</td><td>Invitrogen</td><td>C3099</td><td>Cell tracker / live dye</td></tr><tr><td>Lysotracker Red</td><td>Invitrogen</td><td>L7528</td><td>Cell tracker</td></tr><tr><td>Neutral Red</td><td>Sigma</td><td>N7005</td><td>Visible Cell barwnik</td></tr><tr><td>pNIPAAM</td><td>Sigma Aldrich</td><td>412780250</td><td>Poly(N-izopropylacrylamid)</td></tr><tr><td>Toluen</td><td>Sigma Aldrich</td><td>244511-1L</td><td></td></tr><tr><td>Hexane</td><td>Sigma Aldrich</td><td>296090-1L</td><td></td></tr><tr><td>RAOSMC</td><td>Lonza</td><td>R-ASM-580</td><td>Szczurze komórki mięśni gładkich aorty</td></tr><tr><td>SmGM2</td><td>Lonza</td><td>CC-4149</td><td>Media do mięśni gładkich</td></tr><tr><td>HUVEC</td><td>Invitrogen</td><td>C-003-5C</td><td>Ludzkie komórki śródbłonka żylnego</td></tr><tr><td>HyStem</td><td>Glikozan/ Biotime</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alkohol izopropylowy</td><td>VWR International</td><td>BDH1133-4LP</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna</td><td>Corning Cellgro</td><td>25-053-C1</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>14287-072</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>16140-071</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Specjalistyczne wyposażenie</td></tr><tr><td>Bibuła filtracyjna</td><td>Ahlstrom&nbsp;</td><td>6310-0900&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Lejek Buchnera&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>Z247308&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Płyty UpCell&nbsp;</td><td>Nut&nbsp;</td><td>2014-11&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Światło UV</td><td>Jelight Company&nbsp;</td><td>Środek czyszczący UVO Model nr 42</td><td></td></tr></tbody></table>

inżynieria tkankowa: budowa wielokomórkowego rusztowania 3d do dostarczania warstwowych arkuszy komórkowych

Tissue Engineering: Construction of a Multicellular 3D Scaffold for the Delivery of Layered Cell Sheets

Wiele tkanek, takich jak serca dorosłych ludzi, nie jest w stanie odpowiednio zregenerować się po uszkodzeniu. 2,3 Strategie w inżynierii tkankowej proponują innowacje wspomagające organizm w regeneracji i naprawie. Na przykład, metody TE mogą być w stanie osłabić przebudowę serca po zawale mięśnia sercowego (MI) i prawdopodobnie zwiększyć całkowitą czynność serca do prawie normalnego poziomu sprzed zawału mięśnia sercowego. Podobnie jak w przypadku każdej tkanki funkcjonalnej, skuteczna regeneracja tkanki serca polega na prawidłowym dostarczeniu wielu typów komórek z sygnałami środowiskowymi sprzyjającymi integracji i przeżyciu wszczepionej komórki / przeszczepu tkankowego. Zmodyfikowane tkanki powinny uwzględniać wiele parametrów, w tym: sygnały rozpuszczalne, interakcje między komórkami i materiały matrycowe oceniane jako nośniki dostarczania, ich wpływ na przeżycie komórek, wytrzymałość materiału i ułatwienie organizacji komórka-tkanka. Badania wykorzystujące bezpośrednią iniekcję przeszczepów tylko ignorują te podstawowe elementy. 2,5,6 Projekt tkanki łączącej te składniki nie został jeszcze opracowany. W tym miejscu przedstawiamy przykład zintegrowanych projektów wykorzystujących nakładanie warstw wzorzystych arkuszy komórek z dwoma różnymi typami materiałów pochodzenia biologicznego, zawierających typ komórek narządu docelowego i komórki śródbłonka w celu usprawnienia tworzenia nowych naczyń w "tkance". Chociaż badania te koncentrują się na generowaniu tkanki podobnej do serca, ta konstrukcja tkanki może być stosowana do wielu narządów innych niż serce przy minimalnych zmianach konstrukcyjnych i materiałowych i ma być gotowym produktem do terapii regeneracyjnych. Protokół zawiera pięć szczegółowych kroków. Wrażliwy na temperaturę poli(N-izopropyloakrylaamid) (pNIPAAM) jest używany do powlekania naczyń do kultur tkankowych. Następnie komórki specyficzne dla tkanki są hodowane na powierzchni powlekanych płytek/powierzchni mikrowzorów w celu utworzenia arkuszy komórkowych o silnych zrostach bocznych. Po trzecie, macierz podstawowa jest tworzona dla tkanki poprzez połączenie porowatej macierzy z neowaskularnymi przepuszczalnymi hydrożelami i komórkami śródbłonka. Na koniec arkusze komórek są wyjmowane z naczyń pokrytych pNIPAAM i przenoszone na element podstawowy, tworząc kompletną konstrukcję.

Schemat blokowy (Rysunek 1) przedstawia ogólną metodę przygotowania wielowarstwowego patcha. Arkusze komórkowe są oddzielane od płytki potraktowanej pNIPAAM poprzez obniżenie temperatury poniżej 32 °C. Następnie arkusz komórkowy jest umieszczany na wierzchu sieciowanego hydrożelu zawierającego komórki śródbłonka zasiane w podścielonej macierzy włóknistej (Rysunek 1). Do tworzenia arkuszy komórkowych można również wykorzystać wstępnie potraktowane płytki termoczułe. Specjalne powierzchnie...

Aby stworzyć wysoce zorganizowane struktury złożonej tkanki, należy złożyć wiele typów materiałów i komórek w zintegrowany kompozyt. Ten kombinatoryczny projekt obejmuje warstwowe arkusze komórek specyficzne dla narządów z dwoma odrębnymi materiałami pochodzenia biologicznego, zawierającymi silną włóknistą podstawę macierzy oraz komórki śródbłonka w celu usprawnienia tworzenia nowych naczyń.

Inżynieria tkankowa: budowa wielokomórkowego rusztowania 3D do dostarczania warstwowych arkuszy komórkowych

Many tissues, such as the adult human hearts, are unable to adequately regenerate after damage.2,3 Strategies in tissue engineering propose innovations to ...

Ogólnym celem tej procedury jest wykorzystanie arkuszy komórkowych do stworzenia inżynieryjnego płata tkankowego. Osiąga się to poprzez uprzednie opracowanie powierzchni hodowli komórkowej polimerem termowrażliwym, polipropyloakrylamidem, zwanym również p nipam. Drugim krokiem jest hodowla interesujących komórek o wysokiej gęstości na powierzchni pokrytej polimerem w celu wytworzenia arkuszy komórkowych.Następnie arkusze są podnoszone poprzez obniżenie temperatury płytki, co pozwala komórkom oddzielić się od niej w formie arkusza komórkowego. Ostatnim krokiem jest przeniesienie nienaruszonych arkuszy komórkowych, bez ich rozrywania, na konstrukt do implantacji. W końcowym etapie można wykorzystać prostą mikroskopię świetlną, aby wykazać, że arkusz komórkowy został utworzony i zachował spójność podczas manipulacji służącej stworzeniu materiału do inżynierii tkankowej przeznaczonego do implantacji.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, które polegają na osadzaniu komórek w macierzy takiej jak hydrożele, jest możliwość generowania i utrzymywania bocznych granic komórek w postaci funkcjonalnej tkanki. Metody te mogą ponadto umożliwić dalsze badania z zakresu inżynierii tkankowej. Przykładowo, można badać, jak dobrze komórki przeżywają po transplantacji, gdy znajdują się w tym zorganizowanym stanie.Procedurę tę zaprezentują dr William Turner, stażysta podoktorski w moim laboratorium oraz pani Snapshot sand do. Aby rozpocząć procedurę, należy rozpuścić 2,6 g PNIPAM w 2 mL roztworu składającego się w 60% z toluenu i 40% z heksanu. Następnie mieszaninę należy podgrzać do 60 °C przez 10 minut i mieszać do czasu rozpuszczenia PNIPAM.Następnie wyciąć z papieru filtracyjnego krążek o średnicy 60 milimetrów i umieścić go w lejku Buchnera. Przefiltrować roztwór przez lejek Buchnera do uprzednio zważonego szklanego zlewka. Zlewek wraz z zawartością pozostawić w desykatorze próżniowym na noc.Następnie zważ zlewkę z p nipam. Po tym dodaj alkohol izopropylowy do P nipam, aby przygotować roztwór w stosunku masowym 50:50. Następnie nanieś dwa mililitry roztworu na powierzchnię płytki do hodowli tkankowej i utwardzaj go przez pięć minut pod światłem UV.Następnie dwukrotnie przemyj płytkę dwiema mililitrami ciepłego PBS przed użyciem jej do hodowli komórkowej. W tej procedurze najpierw wyizoluj komórki mięśni gładkich aorty szczura, przemywając komórki dwiema mililitrami ciepłego PBS. Następnie dodaj do komórek trzy mililitry trypsyny lub innego roztworu dysocjującego i inkubuj przez pięć minut.Następnie dodaj do komórek trzy mililitry pożywki hodowlanej lub PBS zawierającego 10% FBS. Po tym czasie zbierz komórki do probówki stożkowej i dokonaj ich przeliczenia. Następnie wirować komórki przy 1000 RPM przez pięć minut.Odssać supernatant i resuspendować komórki w pożywce wzrostowej. Następnie przenieść pożywkę z komórkami na 35 milimetrową płytkę termoczułą w stężeniu zapewniającym 100% konfluencji, a następnie inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc, aby zapewnić przyleganie komórek do płytki. Teraz zebrać komórki śródbłonka i rozproszyć je w roztworze pojedynczych komórek.Do dyspersji pojedynczych komórek można również użyć 1x trypsyny, Accutase lub buforu do dysocjacji komórek. Następnie należy zneutralizować enzym trypsynowy równą ilością inhibitora trypsyny sojowej lub 10% FBS w PBS. Po tym czasie komórki należy zebrać do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.Policz komórki za pomocą hemocytometru i oblicz objętość wymaganą dla wymiarów łaty; dla łaty o rozmiarze czterech milimetrów wykorzystuje się 2 miliony komórek śródbłonka. Następnie wydziel 2 miliony komórek i umieść je w nowej probówce stożkowej o pojemności 15 mililitrów. Odwiruj komórki przez pięć minut, a następnie odessij nadsącz, pozostawiając komórki w postaci osadu w probówce stożkowej. Teraz przygotuj hydrożel wysokojodowy zgodnie z protokołem producenta.Wymieszaj wysokostężony aurin i żelatynę w stosunku jeden do jednego. Następnie przenieś 80% całkowitej objętości końcowej do probówki stożkowej zawierającej osad i resuspenduj komórki śródbłonka w mieszaninie żelatyny z aurinem. Następnie przenieś zawieszone komórki do macierzy włóknistej.Dodać 20% całkowitej objętości końcowej sieciującego i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez jedną godzinę. Na tym etapie wyjąć z inkubatora płytkę 35 milimetrów potraktowaną P nypa zawierającą komórki i umieścić ją w dygestorium do hodowli komórkowych. W temperaturze pokojowej szybko odessać pożywkę z komórek.Następnie, gdy żelatyna jest jeszcze ciepła, dodaj do płytki dwa mililitry 6% żelatyny normalnej o temperaturze 37 °C, umieść metalową kratkę w żelatynie, zanurzając ją poniżej jej powierzchni. Następnie umieść całą płytkę na lodzie na pięć do siedmiu minut, aby żelatyna stężała. Po siedmiu minutach za pomocą szpatułki ostrożnie oddziel brzegi żelatyny od ścianek płytki.Następnie za pomocą pęsety podnieś metalową kratkę z płytki. Przenieś arkusz komórek do naczynia i umieść go na powierzchni kombinacji hydrożelu z macierzą włóknistą. Do płytki hodowlanej dodaj 2 mL pożywki o temperaturze 37 °C i inkubuj przez noc, aby umożliwić przyleganie arkusza komórek do powierzchni hydrożelu.W międzyczasie, po ogrzaniu się roztworu, należy usunąć metalową kratkę. W tym badaniu komórki hodowano na powierzchni powlekanej Pippą, a następnie przeniesiono jako płat na powierzchnię matrycy włóknistej. Wcześniejsze próby, w których nie zastosowano żelatynowej kratki metalowej, skutkowały powstaniem niewielkich, poszarpanych fragmentów.Ten obraz przedstawia wczesny projekt kompozycyjny łaty, łączący obraz z zastosowaniem mito trackera, czerwieniego barwnika w komórkach mięśni gładkich aorty szczura, fluorescencyjnego barwnika calcium am green w komórkach śródbłonka żyły pępkowej człowieka oraz obrazu w świetle przechodzącym. Jest to kompozycja arkusza komórkowego połączonego z mocniejszą bazową włóknistą macierzą hydrożelową. Ten obraz kompozytowy został wykonany od spodu łaty przez mocniejszą bazową macierz włóknistą, natomiast ten obraz kompozycyjny arkuszy komórkowych wykonano nad bazową macierzą włóknistą.Komórki w kombinacji hydrożelowej w arkuszu pokrywają podstawową kombinację hydrożelu z macierzy włóknistej, która wykazuje zwiększoną fluorescencję na krawędziach z powodu skupiania się komórek. Jest to obraz transmisyjny konstrukcji, na którym przedstawiono autofluorescencyjną naturalną włóknistą macierz podstawową w DPI. Po zastosowaniu tej procedury inne eksperymenty z zakresu inżynierii tkankowej mogą odpowiedzieć na kolejne pytania, takie jak wpływ orientacji i komunikacji komórek na sukces transplantacji.Technika ta pozwala badaczom w dziedzinie inżynierii tkankowej badać złożone metody przeszczepiania wielu typów komórek. Należy pamiętać, że praca z rozpuszczalnikami może być niezwykle niebezpieczna. Podczas wykonywania tej procedury należy zawsze przestrzegać środków ostrożności, takich jak stosowanie odpowiednich masek i praca pod wyciągiem chemicznym.

tissue-engineering-construction-multicellular-3d-scaffold-for

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Inżynieria tkankowa: Budowa wielokomórkowej 3D scaffold dla dostarczania warstwowych arkuszy komórek

W tej pracy prezentujemy technikę szybkiego wytwarzania żywych tkanek naczyniowych poprzez bezpośrednią hodowlę kolagenu, komórek mięśni gładkich i komórek śródbłonka. Ponadto opisano nowy protokół charakterystyki mechanicznej zmodyfikowanych tkanek naczyniowych.

Inżynieria 3D cellularnych żeli kolagenowych do regeneracji tkanki naczyniowej

A kartezjańska biodrukarka została zaprojektowana i wyprodukowana, aby umożliwić osadzanie wielu materiałów w precyzyjnych, powtarzalnych geometriach, jednocześnie umożliwiając kontrolę czynników środowiskowych. Korzystając z trójwymiarowej biodrukarki, można drukować i łatwo odtwarzać złożone i żywotne konstrukcje.

Żywotność biodrukowanych konstruktów komórkowych przy użyciu drukarki kartezjańskiej z trzema dozownikami

Ten manuskrypt opisuje technikę opartą na miękkiej litografii, polegającą na inżynierii jednolitych układów trójwymiarowych (3D) tkanek nabłonkowych o określonej geometrii otoczonych macierzą zewnątrzkomórkową. Metoda ta jest dostosowana do szerokiej gamy typów komórek i kontekstów eksperymentalnych oraz pozwala na wysokoprzepustowe badania przesiewowe identycznych kontrprób.

Inżynieria trójwymiarowych tkanek nabłonkowych osadzonych w macierzy zewnątrzkomórkowej

W tej pracy, rusztowania z poli(kwasu mlekowego)/glikolu polietylenowego (PLA/PEG) zostały przygotowane przy użyciu kombinacji mieszania stopionego i selektywnego ługowania. Omawiana tu metoda pozwoliła na opracowanie rusztowań trójwarstwowych poprzez ścisłą kontrolę zarówno porowatości, jak i wielkości porów. Właściwości mechaniczne oceniano również w środowisku fizjologicznym.

Łatwa i przyjazna dla środowiska metoda wytwarzania rusztowań z poli(kwasu mlekowego) o stopniowanej wielkości porów

Pokazujemy nowatorską metodę konstruowania jednokomórkowego trójwymiarowego (3D) montażu bez sztucznego rusztowania.

Manipulowanie żywymi komórkami w celu zbudowania stabilnego zespołu komórkowego 3D bez sztucznego rusztowania

Ten protokół opisuje metodę opartą na pleśni sieciowej do tworzenia trójwymiarowych, wolnych od rusztowań tkanek serca o zadowalającej integralności strukturalnej i synchronicznym zachowaniu bicia.

Oparta na formie metoda trójwymiarowego tworzenia tkanki serca bez rusztowań

Ten artykuł dostarcza efektywnej i wykonalnej metody tworzenia wielowarstwowych arkuszy komórek macierzystych o korzystnych właściwościach komórek macierzystych.

Budowa wielowarstwowego arkusza mezenchymalnych komórek macierzystych z systemem dynamicznej hodowli 3D

Prezentowany tutaj jest prosty w użyciu, trójwymiarowy zestaw do biodruku z rdzeniem/powłoką, do jednoetapowego wytwarzania pustych rusztowań, odpowiedni do inżynierii tkankowej naczyń krwionośnych i innych struktur rurowych.

Rusztowania drukarskie rdzeniowe / skorupowe do inżynierii tkankowej struktur rurowych

Tutaj demonstrujemy trzyetapowy model organoidów (dwuwymiarowa ekspansja [2D], stymulacja 2D, trójwymiarowe dojrzewanie [3D]), oferujący obiecujące narzędzie do podstawowych badań nad ścięgnami i potencjalną metodę inżynierii tkanek ścięgien bez rusztowań.

Demonstracja samoorganizującej się hodowli arkuszy komórkowych i ręcznego generowania organoidu 3D przypominającego ścięgno/więzadło przy użyciu ludzkich fibroblastów skórnych

Zaprojektowaliśmy nowatorski bioreaktor obciążenia mechanicznego, który może zastosować jednoosiowe lub dwuosiowe naprężenie mechaniczne do biokompozytu chrząstki przed przeszczepem do ubytku chrząstki stawowej.

Projekt dwuosiowego bioreaktora obciążenia mechanicznego dla inżynierii tkankowej

Poznaj metodę tworzenia inżynieryjnych łat tkankowych z arkuszy komórkowych przy użyciu termoczułego polimeru pNIPAM. Technika ta umożliwia budowę wielowarstwowych struktur do implantacji z zachowaniem integralności komórek.

Inżynieria tkankowa: budowa wielokomórkowego rusztowania 3D do dostarczania warstwowych arkuszy komórkowych

Przeglądaj więcej filmów