Inżynieria tkankowa: budowa wielokomórkowego rusztowania 3D do dostarczania warstwowych arkuszy komórkowych
October 3rd, 2014
Aby stworzyć wysoce zorganizowane struktury złożonej tkanki, należy złożyć wiele typów materiałów i komórek w zintegrowany kompozyt. Ten kombinatoryczny projekt obejmuje warstwowe arkusze komórek specyficzne dla narządów z dwoma odrębnymi materiałami pochodzenia biologicznego, zawierającymi silną włóknistą podstawę macierzy oraz komórki śródbłonka w celu usprawnienia tworzenia nowych naczyń.
Ogólnym celem tej procedury jest wykorzystanie arkuszy komórkowych do skonstruowania plastra inżynierii tkankowej. Osiąga się to poprzez uprzednie potraktowanie powierzchni hodowli komórkowej termoczułym polimerem polipropyloakrylamidu, zwanym również p nipamem. Drugim krokiem jest hodowla interesujących komórek o dużej gęstości na powierzchni pokrytej polimerem w celu stworzenia arkuszy komórek.
Następnie arkusze są podnoszone poprzez obniżenie temperatury płyty, co pozwala na odłączenie komórek od płyty jako arkusza komórek. Ostatnim krokiem jest przeniesienie nienaruszonych arkuszy komórek bez rozrywania ich na konstrukcję w celu implantacji. Ostatecznie prosta mikroskopia świetlna może być wykorzystana do wykazania, że arkusz komórek został stworzony i utrzymany podczas manipulacji podczas tworzenia wszczepialnego materiału inżynierii tkankowej.
Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, które osadzają komórki w macierzy jak hydrożele, jest to, że w tej technice boczne granice komórek mogą być generowane i utrzymywane jako tkanka funkcjonalna. Metody te mogą również umożliwić dalsze badania w dziedzinie inżynierii tkankowej. Na przykład, jak dobrze komórki przeżywają po przeszczepie, gdy są w tym zorganizowanym stanie?
Zademonstruje tę procedurę dr William Turner, doktor habilitowany w moim laboratorium i pani Snapshot Sand. Aby rozpocząć tę procedurę, rozpuść 2,6 grama P nipam w dwóch mililitrach 60% roztworu toluenu i 40% heksanu. Następnie podgrzej mieszaninę do 60 stopni Celsjusza przez 10 minut i mieszaj, aż P nipam się rozpuści.
Następnie pokrój bibułę filtracyjną w okrąg o średnicy 60 milimetrów i umieść ją w lejku Buchnera. Przefiltrować roztwór przez lejek Buchnera do wstępnie zważonej szklanej zlewki. Przechowuj zlewkę i zawartość w odkurzaczu dzwonowym przez noc.
Następnie zważ zlewkę za pomocą p nipamu. Następnie dodaj alkohol izopropylowy do P nipam, aby uzyskać roztwór o masie 50 50. Następnie umieść dwa mililitry roztworu na powierzchni płytki do hodowli tkankowej i pokryj ją na pięć minut w świetle UV.
Następnie umyj płytkę dwoma mililitrami ciepłego PBS dwukrotnie przed użyciem jej do hodowli komórek. W tej procedurze najpierw wyizoluj komórki mięśni gładkich aorty szczura, myjąc komórki dwoma mililitrami ciepłego PBS. Następnie dodaj trzy mililitry trypsyny lub innego rozszczepiającego roztworu dysocjującego do komórek i inkubuj przez pięć minut.
Następnie dodaj do komórek trzy mililitry pożywki hodowlanej lub PBS zawierającego 10% FBS. Następnie zbierz komórki w stożkowej probówce i policz je. Następnie obracaj ogniwa z prędkością 1000 obr./min przez pięć minut.
Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w pożywce wzrostowej. Następnie umieść pożywkę zawierającą komórki na 35-milimetrowej płytce termoczułej w stężeniu, które pozwoli osiągnąć 100% konfluencji, a następnie inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc, aby utrzymać przyczepność komórek do płytki. Teraz zbierz komórki śródbłonka i rozprosz je w roztworze jednokomórkowym.
Używając jednego x trypsyny, akuat lub bufor dysocjacji komórek może być również użyty do dyspersji pojedynczych komórek. Następnie dezaktywuj enzym trypsyny równą ilością inhibitora trypsyny sojowej lub 10% FBS w PBS. Następnie zbierz komórki w stożkowej probówce o pojemności 15 mililitrów.
Policz komórki za pomocą hemocytometru i oblicz objętość potrzebną do wymiarów łatki dla czteromilimetrowej łaty, następnie używa się 2 milionów komórek śródbłonka, wyodrębnij 2 miliony komórek i umieść je w nowej stożkowej probówce o pojemności 15 mililitrów. Następnie odwirować komórki przez pięć minut, odessać supernatant, pozostawiając komórki w postaci osadu w stożkowej probówce. Teraz przygotuj hydrożel o wysokiej zawartości auryny zgodnie z protokołem firmy.
Wymieszaj wysoką zawartość auryny i płynną żelatynę w stosunku jeden do jednego. Następnie przenieś 80% całkowitej objętości końcowej do stożkowej probówki zawierającej osad, ponownie zawieś komórki śródbłonka w mieszaninie żelatyny o wysokiej zawartości auryny. Następnie przenieś zawieszone komórki do macierzy włóknistej.
Dodać 20% całkowitej końcowej objętości środka sieciującego i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę. Na tym etapie należy wyjąć z inkubatora 35-milimetrową płytkę nasączoną P nypa zawierającą komórki i umieścić ją w kapturze do hodowli komórkowych. W temperaturze pokojowej szybko odessaj pożywkę z komórek.
Następnie dodaj dwa mililitry 37 stopni Celsjusza, 6% normalnej żelatyny do płytki, gdy żelatyna jest jeszcze ciepła, umieść metalową siatkę w żelatynie, zanurzając ją pod powierzchnią normalnej żelatyny. Następnie umieść cały talerz na lodzie na pięć do siedmiu minut, pozwalając żelatynie stwardnieć. Po siedmiu minutach za pomocą szpatułki ostrożnie oddziel brzegi żelatyny od boku płytki.
Następnie podnieś metalową kratę z płyty za pomocą kleszczy. Przenieś arkusz komórek do naczynia i umieść go na wierzchu kombinacji hydrożelu z matrycą włóknistą. Dodaj dwa mililitry pożywki o temperaturze 37 stopni Celsjusza do płytki do hodowli tkankowej i inkubuj przez noc, aby arkusz komórek przylegał do powierzchni hydrożelu.
W międzyczasie usuń metalową siatkę po rozgrzaniu roztworu. W tym przypadku komórki hodowano na powierzchni pokrytej Pippa, a następnie przenoszono w postaci arkusza na powierzchnię włóknistej matrycy. Wczesne próby, które nie zostały przeniesione za pomocą żelatynowej sieci metalowej, skutkowały małymi postrzępionymi plamami.
Ten obraz przedstawia wczesny złożony obraz z projektem łaty łączący tracker mito, barwione na czerwono komórki mięśni gładkich aorty szczura, fluorescencyjne ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej w kolorze wapń i zieleni oraz obraz światła przechodzącego. Jest to kompozyt arkusza komórkowego w połączeniu z mocniejszą kombinacją hydrożelu z matrycą włóknistą. Ten złożony obraz został wykonany od spodu łaty przez silniejszą podstawową matrycę włóknistą, a ten złożony obraz arkuszy komórek został wykonany na podstawowej matrycy włóknistej.
Komórki kombinowane hydrożelu w arkuszu pokrywają podstawową kombinację hydrożelu z matrycą włóknistą, które wykazują zwiększoną fluorescencję na krawędziach z powodu grupowania komórek. Jest to obraz transmisyjny konstruktu, a tutaj pokazano autofluorescencyjną naturalną włóknistą matrycę zasadową w DPI. Po tej procedurze inne eksperymenty inżynierii tkankowej mogą odpowiedzieć na inne pytania, takie jak wpływ wyrównania komórek i komunikacji na powodzenie przeszczepu.
Technika ta pozwala naukowcom zajmującym się inżynierią tkankową badać złożone sposoby przeszczepiania wielu typów komórek. Nie zapominaj, że praca z rozpuszczalnikami może być bardzo niebezpieczna. Podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować środki ostrożności, takie jak noszenie odpowiednich masek i kapturów chemicznych.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
To badanie koncentruje się na konstruowaniu łaty tkankowej z wykorzystaniem arkuszy komórkowych. Proces polega na traktowaniu powierzchni kultury komórkowej termoczułym polimerem i hodowlą komórek w celu stworzenia nienaruszonych arkuszy do implantacji.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Inżynieria tkankowa
- Techniki hodowli komórek
- Biomateriały
Tło
- Tworzenie uporządkowanych struktur złożonych tkanek wymaga wielu rodzajów materiałów i komórek.
- Wykorzystanie warstwowianych arkuszy komórkowych specyficznych dla narządów poprawia integrację tkankową.
- Materiały pochodzenia biologicznego mogą wspierać nowe formowanie naczyń.
- Termoczułe polimery ułatwiają oderwanie arkuszy komórkowych.
Cel badania
- Opracowanie metody budowy łaty tkankowej.
- Wykorzystanie arkuszy komórkowych do ulepszonych technik implantacji.
- Wykazanie wykonalności utrzymania integralności komórek podczas manipulacji.
Zastosowane metody
- Traktowanie powierzchni kultury komórkowej polipropyloakrylamidem (pNIPAM).
- Hodowla komórek w wysokiej gęstości na powierzchni pokrytej polimerem.
- Odłączanie arkuszy komórkowych poprzez obniżenie temperatury.
- Przenoszenie nienaruszonych arkuszy komórkowych na konstrukt do implantacji.
Główne wyniki
- Udana kreacja arkuszy komórkowych, które można manipulować bez rozdarcia.
- Mikroskopia świetlna potwierdziła integralność arkuszy komórkowych podczas procesu.
- Metoda pozwala na budowę implantowalnych materiałów inżynierii tkankowej.
- Wykazano potencjał poprawy unaczynienia w inżynierii tkankowej.
Wnioski
- Badanie przedstawia żywotną metodę tworzenia łat tkankowych.
- Wykorzystanie termoczułych polimerów jest skuteczne w manipulacji arkuszami komórkowymi.
- To podejście może znacząco postępować w dziedzinie inżynierii tkankowej.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This method enables the construction of multicellular 3D scaffolds using layered cell sheets, addressing a key challenge in regenerative medicine: delivering organized, multi-cellular constructs with preserved cell-cell interactions and vascular potential. By preserving lateral cell borders and enabling sheet transfer onto biomatrix composites, the technique supports predictive confidence in preclinical models of tissue integration and function. It offers a scalable, off-the-shelf approach for therapeutic tissue design applicable across multiple organ systems beyond cardiac tissue.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by maintaining cell sheet integrity and lateral adhesions during manipulation.
- Operational Value: Provides a reproducible system for functional target validation through organized cell delivery.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream compound evaluation by creating standardized, implantable tissue constructs.
- Operational Value: Supports assay readiness through temperature-dependent sheet detachment and transfer, enabling scalable workflow.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Enhances disease relevance by combining organ-specific cells with neovascular-permissive hydrogels and endothelial cells.
- Operational Value: Facilitates translational continuity from discovery to preclinical validation via off-the-shelf, implantable patches.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from early target validation through lead identification to preclinical studies, supporting hypothesis testing and mechanistic de-risking in tissue engineering applications.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling controlled delivery of layered cell types with preserved interactions.
- Screening: Enables assay readiness through reproducible cell sheet formation and transfer onto biomatrix platforms.
- Analytics: Generates quantitative outputs via light microscopy and fluorescence tracking to assess sheet integrity and vascular integration.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by constructing implantable patches with vascular potential for functional tissue assessment.
- Enterprise Reuse: Represents a reusable capability for generating off-the-shelf tissue constructs across multiple organ targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence through maintained cell-cell interactions and organized tissue architecture.
- Operational Value: Standardization and scalability via temperature-sensitive polymer coating and sheet lifting.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions by reducing mechanistic ambiguity in tissue integration and survival.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization through enhanced predictive value in preclinical tissue models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, biomaterials handling, and temperature-sensitive polymer techniques.
- Depends on UV crosslinking, hydrogel preparation, and precise temperature control for sheet detachment.
- Necessitates cross-team standardization for consistent sheet quality and transfer efficiency.
- Involves adaptation considerations when applying to different cell types or organ-specific matrices.
- Includes practical limitations such as solvent hazards during pNIPAM preparation and the need for aseptic handling throughout.
