Zautomatyzowane, ilościowe badania poznawczo-behawioralne myszy: do genetyki, farmakologii, poznania zwierząt i nauczania na studiach licencjackich

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest badanie przesiewowe genetycznie i farmakologicznie zmodyfikowanych myszy pod kątem nieprawidłowego działania i podstawowych mechanizmów poznawczych. Osiąga się to poprzez dokonywanie psychofizycznych pomiarów fizjologicznych znaczących właściwości ilościowych w pełni zautomatyzowanym, wysokoprzepustowym systemie fenotypowania behawioralnego 24 7. Kolejnym krokiem jest analiza i wykres napływających danych w czasie quasi rzeczywistym, co umożliwia zautomatyzowaną kontrolę testów w czasie rzeczywistym na zasadzie mysz po myszy.

Następnie surowe dane, kod protokołu testowego i wszystkie statystyki pośrednie są archiwizowane w jednej strukturze danych. Aby udostępnić dane publicznie i zachęcić do dalszej analizy, wyniki pokazują specyficzne dla szczepu zmiany we frakcji czasowej pary w oparciu o zadanie przełączania. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z innymi metodami, takimi jak labirynt wodny, jest to, że daje ona fizjologicznie znaczące wyniki, bardzo wysoką przepustowość i brak kontaktu z myszami.

Tak więc ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie neurogenetyki poznawczej, takie jak: czy istnieją zmutowane szczepy, które mają ilościowo zmienione mechanizmy czasowe interwałów? Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię lub diagnozę genetycznych deficytów poznawczych, ponieważ może ona prowadzić do odkrycia genów, które określają krytyczne składniki tych mechanizmów. Osoby, które dopiero zaczynają przygodę z tą metodą, muszą zrozumieć podstawy programowania w MATLAB i zrozumieć moc ilościowych zautomatyzowanych testów psychofizycznych.

Adam i ja po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł stworzenia tego systemu, gdy zobaczyliśmy pracochłonny i nieilościowy charakter testów, które były przeprowadzane na genetycznie zmanipulowanych myszach. Umożliwia to jednoczesne uruchomienie 80 myszy. Każde środowisko testowe składa się z polipropylenowej wanny na mysz połączonej akrylową rurką z pudełkiem testowym myszy.

Skrzynka testowa posiada trzy leje samowyładowcze, które są monitorowane przez wiązki podczerwieni. Dwa zewnętrzne zbiorniki mają dołączone podajniki peletów i mogą dostarczać granulki żywności, podczas gdy środkowy zbiornik nie dostarcza granulek żywności. przechodzące przez port w ścianie imprezowej łączą środowiska testowe z kartami interfejsu elektrycznego i dedykowanymi komputerami w innym pomieszczeniu, które uruchamiają programy sterujące protokołem.

Na każde dwie szafy wymagany jest jeden komputer. Komputery te są połączone siecią lokalną z serwerem, na którym działa oprogramowanie do analizy danych i tworzenia wykresów. Skonfiguruj sieć lokalną w taki sposób, aby serwer, na którym jest zainstalowane oprogramowanie do analizy danych, mógł uzyskać dostęp do dysków twardych komputerów kontrolujących środowiska testowe.

Następnie ustanów konto synchronizacji plików do przechowywania danych w chmurze. Dodaj folder systemowy TS i jego podfoldery do ścieżki wyszukiwania programu MATLAB i upewnij się, że folder systemowy TS jest folderem zsynchronizowanym z chmurą. System TS to biblioteka oprogramowania typu open source zawierająca ponad 30 funkcji wysokiego poziomu napisanych w MATLAB, które ułatwiają tworzenie złożonego kodu do analizy danych i wykresów danych.

W przyborniku systemu TS wywołaj funkcję Ts begin, aby utworzyć hierarchiczną strukturę danych, w której dane pierwotne i wszystkie wyniki z nich pochodzące zostaną umieszczone przez inne funkcje w przyborniku systemu TS. Następne wywołanie ts add protocol w celu określenia parametrów kontrolnych dla protokołu eksperymentalnego w celu określenia kodu decyzyjnego, który zautomatyzuje decyzję o zakończeniu protokołu i przejścia do następnego oraz w celu określenia kryteriów decyzyjnych, które mają być użyte. Teraz umieść myszy w 24 7 środowiskach testowych na żywo, po jednej myszy na środowisko.

Zanotuj numer identyfikacyjny myszy, numer pudełka i literę identyfikującą komputer kontrolny eksperymentu w sieci lokalnej oraz jego adres IP. Następne wywołanie, ts rozpocznij sesję, aby rozpocząć sesję eksperymentalną. Sesje eksperymentalne trwają od jednego do dwóch tygodni, podczas których przeprowadzanych jest kilka różnych protokołów testów behawioralnych.

Następnie na jednym komputerze sterującym wywołaj makro, które uruchomi wszystkie pola sterowane przez ten komputer. To makro zostało utworzone przez sesję startową TS. Powtórz to na innych komputerach sterujących.

Analizę danych można przeprowadzić, pisząc nowy kod do analizy danych i tworzenia wykresów za pomocą poleceń w przyborniku systemu usług terminalowych lub używając lub modyfikując istniejący kod do analizy danych i wykresów udostępniony w bibliotece TS. Po rozpoczęciu eksperyment w większości przebiega sam, chociaż przez cały czas trwania eksperymentu wymagane jest pewne monitorowanie. Monitoruj pocztę e-mail pod kątem alertów z programu do analizy danych systemu TIA wskazujących możliwe awarie sprzętu, takie jak awarie zasilania, spontaniczne sterowanie, ponowne uruchomienie komputera i awarie podajnika pelletu.

Te alerty e-mail umożliwiają terminową naprawę usterki dwa do czterech razy dziennie. Wykresy wydajności, które kod analizujący dane systemu TS generuje za każdym razem, gdy jest wywoływany przez czasomierz analizy. Wykresy te mogą być monitorowane z dowolnego miejsca na świecie w dowolnym czasie, a w razie potrzeby protokół eksperymentalny może zostać zmieniony online zdalnie z miejsca, w którym myszy są testowane.

Użyj również przeglądarki TS do badania danych i statystyk podsumowujących w hierarchicznej strukturze danych, gdy stają się one dostępne w czasie quasi, wykresy skumulowanej nierównowagi w czasie rzeczywistym dla uzyskanych granulek, określane jako dochód, są wykreślone na czerwono, a czas trwania wizyty jest wykreślony na czarno dla trzech myszy typu dzikiego i trzech heterozygot L one. Odwrócenie harmonogramu nastąpiło w punkcie, w którym zbocza skręcały w dół, oznaczone pionowymi czerwonymi liniami przerywanymi dla trzech myszy. Nachylenie wykresu skumulowanej nierównowagi wizyt linia ściśle odwzorowuje nachylenie skumulowanej nierównowagi dochodów.

Czerwona linia, oznacza to niemal idealne dopasowanie stosunku średniego czasu trwania wizyty do stosunku dochodów. Zwróć uwagę, jak szybko dostosowuje się stosunek czasu trwania wizyty do zmiany stosunku dochodów w punktach przegięcia w dół. Z drugiej strony, inna mysz nie dopasowała się podczas drugich sesji karmienia, co pokazuje zerowe nachylenie skumulowanej wizyty.

Wykres nierównowagi czasu trwania jest zaznaczony na czarno, podczas gdy nachylenie nierównowagi dochodów jest zasadniczo dodatnie. Jednak podczas trzeciej fazy karmienia zbocza są równoległe, co oznacza, że ta mysz zaczęła nagle na początku tej fazy, aby dopasować swój stosunek odwiedzin do wskaźnika dochodów. Najwyraźniej więc był w stanie to zrobić, ale z jakiegoś powodu nie zrobił tego podczas części testów.

Pokazuje to, jak ważna jest wizualizacja całego przebiegu wydajności, a nie poleganie wyłącznie na kilku statystykach podsumowujących. Ta mysz pasowała dokładnie podczas pierwszego stosunku dochodów, ale kiedy został odwrócony, mysz nie odwróciła w pełni innej myszy nadmiernie dopasowanej podczas trzeciej fazy karmienia. Oznacza to, że średnie niezrównoważenie dochodów w tym kraju było większe niż średnie nierównowaga w dochodach i nie dostosowało się w pełni do odwrócenia nierównowagi dochodów.

Zauważmy jednak, że wszystkie sześć myszy, zarówno trzy dzikie typy, jak i trzy heterozygoty, pasowały z precyzją podczas pierwszej czterogodzinnej fazy karmienia i wykazywały nagłą reakcję na odwrócenie stosunku dochodów. Świadczy to o nienaruszonym funkcjonowaniu w heterozygotach wielu podstawowych mechanizmów poznawczych, takich jak czas trwania, szacowanie, liczba, estymacja szybkości szacowania, lokalizacja przestrzenna i zdolność do zapamiętywania prostych wielkości abstrakcyjnych. W neurogenetyce poznawczej równie ważne jest określenie, co nadal działa normalnie, jak znalezienie tego, co nie działa lub ma jakąś interesującą ilościową zmianę w swoim działaniu.

Cykle skumulowane lub wizyta w pierwszym zbiorniku, po której następuje wizyta w zbiorniku drugim, a następnie powrót do pierwszego zbiornika są wykreślane jako funkcja czasu sesji. Tutaj przerywane zielone piony oznaczają początek faz karmienia. Ciągłe czerwone piony oznaczają.

Przesunięcie karmienia szybkością, z jaką mysz zaczyna krążyć między lejkami, jest miarą tego, co można nazwać jej śmiałością lub skłonnością do eksploracji. Pięć z sześciu wykazało się pewną eksploracją przed nadejściem pierwszej fazy karmienia i zaczęło nagle przełączać się między lejami, gdy tylko się zaczęła. Jedna mysz nie wykazywała jednak żadnych zachowań eksploracyjnych, ani jednego cyklu aż do połowy drugiej fazy karmienia, w którym to momencie zaczęła gwałtownie przełączać się między lejkami.

Analiza instrumentalnych i klasycznych eksperymentów kondycjonowania dostarcza skumulowanych zapisów szybkości inicjacji próby. Eksperymenty te mierzyły tempo uczenia się, czyli liczbę par przed pojawieniem się uwarunkowanego zachowania. Pionowe linie przerywane oznaczają próbę przejęcia w każdym rekordzie.

Próba akwizycyjna jest pierwszą próbą, podczas której następuje znaczny wzrost prędkości inicjacji próby, pod warunkiem, że nowa wyższa prędkość jest większa niż prędkość w pierwszym segmencie. To postanowienie dotyczące drabiny jest wymagane, ponieważ czasami następuje znaczny spadek przed pierwszym znaczącym wzrostem. Skumulowane rozkłady opóźnień inicjacji badania przedstawiono tutaj.

Punkt powyżej osi X, w którym linia pozioma o wartości 0,5 przecina rozkład skumulowany, jest medianą opóźnienia potrzebną do zainicjowania próby. Skumulowane zapisy różnic między szybkością szturchania podczas leja paszowego a szybkością szturchania w poprzednim interwale między próbami są pokazane tutaj. Początkowo nachylenie tego rekordu jest zerowe lub ujemne, ponieważ mysz mniej szturcha podczas oświetlenia leja niż podczas przerwy między próbami.

Nachylenie zmienia się w dodatnie, gdy mysz zaczyna wbijać się w podświetlany lej w oczekiwaniu na zbliżającą się dostawę apelacji. Kropki pełne oznaczają punkt, w którym nachylenie staje się dodatnie, czyli próbę, w której odpowiedź warunkowa po raz pierwszy niezawodnie pojawia się na tych wykresach. Niebieskie linie to empiryczne funkcje skumulowanego rozkładu pokazujące skumulowany rozkład opóźnień przełączania dla jednej myszy przy trzech różnych ustawieniach opóźnienia podawania na długim zbiorniku.

Cienkie czerwone krzywe, które nałożyły się prawie dokładnie na funkcje empiryczne, to sześć parametrów funkcji belga pasujących do tych danych. Grube czerwone linie są odpowiadającymi im funkcjami gęstości prawdopodobieństwa dla rozkładów mieszaniny belga. Skrócenie długiego opóźnienia posuwu spowodowało, że mysz skróciła średnią opóźnień przełączania i zwiększyła ich precyzję.

Spowodowało to również pojawienie się pewnych przełączników impulsowych, co pokazuje wybrzuszenie w lewym ogonie funkcji gęstości prawdopodobieństwa na dolnym wykresie. Miarą tej impulsywności jest ułamek mieszaniny przypisany składnikowi Weibela przez najlepiej dopasowaną wersję rozkładu mieszaniny Weibela Gaussa. W tej analizie krótkie próby są oznaczone małymi czerwonymi plusami na dole wykresu, podczas gdy długie próby są oznaczone małymi czerwonymi plusami na górze wykresu.

Zmiana gęstości powstałych czerwonych smug na dole i na górze wskazuje na zmianę względnej częstotliwości krótkich i długich prób. Opóźnienia przełącznika są oznaczone małymi otwartymi kółkami. Zauważ, że gdy kolor czerwony na dole staje się bardziej gęsty, co oznacza, że krótkie próby są bardziej prawdopodobne, małe okręgi przesuwają się w górę, a gdy kolor czerwony na górze staje się gęstszy, co oznacza wzrost prawdopodobieństwa długiej próby, okręgi przesuwają się w dół.

Niebieskie linie to mediany rozkładów. Pokazano tutaj 24-godzinny wykres rastrowy zdarzeń behawioralnych i środowiskowych w 90-dniowym okresie testowym. Czarne kropki rejestrują szturchnięcia, a czerwone i zielone kropki rejestrują dostarczanie granulek do dwóch lejów zasypowych.

Pierwsze czarne trójkąty rejestrują wyłączone światła, podczas gdy drugie czarne trójkąty rejestrują światła na pierwszej kolumnie cyjanowych trójkątów rejestrują początek interwału karmienia o zmierzchu, który występuje godzinę przed zmierzchem, a druga kolumna cyjanowych trójkątów rejestruje przesunięcie interwału karmienia o zmierzchu, który występuje trzy godziny po wyłączeniu świateł. Te purpurowe trójkąty rejestrują niepodpisany początek interwałów karmienia o świcie, który następuje dwie godziny przed włączeniem świateł, a ostatnia kolumna karmazynowych trójkątów rejestruje przesunięcia karmienia o świcie. Początki aktywności antycypacyjnej karmienia przed karmieniem o zmierzchu są oznaczone niebieskimi gwiazdkami w okresie od sześciu do 15 dni.

Po rozpoczęciu testów, myszy zaczynają wykazywać aktywność antycypacyjną polegającą na wypychaniu pokarmu na około godzinę przed okresem karmienia o zmierzchu, co wskazuje na ustanowienie pamięci okołodobowej. Heterozygoty zawierające mutację w genie L one wykazują większą precyzję interwału czasowego niż ich kontrole z miotu typu dzikiego. Rysunek ten przedstawia skumulowane rozkłady oszacowań precyzji dla kontrolek typu dzikiego jako linii ciągłych, a ich jarzmowych rodaków z miotu jako linii przerywanych, gdy są prowadzone w blokach prób z coraz węższymi odstępami między czasowymi słupkami bramkowymi, co pokazują różnice w kolorach.

W przeciwieństwie do tego, heterozygoty noszące twarz nietoperza lub mutację BFC wykazują niższą precyzję czasu interwału niż ich dzikie grupy kontrolne. Gdy już opanujesz tę technikę, testy można wykonać w ciągu zaledwie jednego dnia lub nawet kilku tygodni. Dopasowanie zajmuje tylko jeden dzień jedzenia.

Uczenie się z wyprzedzeniem trwa dwa lub trzy tygodnie.