Name: Symulacja neuroplastyczności trzustki: test plastyczności podwójnych neuronów in vitro (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-14T17:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 29 s
Description: Poznaj metodę symulacji neuroplastyczności trzustki z wykorzystaniem neuronów DRG i MP szczurów. Technika umożliwia badanie zmian morfologicznych i elektrofizjologicznych neuronów w odpowiedzi na ekstrakty tkanek trzustki.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wszyscy autorzy przyczynili się do powstania i walidacji prezentowanego testu oraz do powstania szkicu manuskryptu.

Wszystkie procedury eksperymentalne na zwierzętach w protokole są zgodne z wytycznymi Technische Universität München, Niemcy.
1. Przygotowanie podłoża/ekstraktu
<ol>
	<li>Homogenizacja tkanek 
	Jakość homogenizacji tkanek ma kluczowe znaczenie dla późniejszego wykrywania zmian neuroplastycznych w hodowanych neuronach. W tym przypadku zalecany jest homogenizator, który umożliwia dysocjację tkanek bez znacznego wzrostu temperatury tkanek.
	<ol>
		<li>Przenieść kostki tkanki trzustki o wymiarach 5 mm x 5 mm bezpośrednio z temperatury -80 °C do ciekłego azotu i umieścić w fazie stałej w homogenatorze tkankowym. Idealny homogenator dysocjowałby tkankę wystarczająco szybko, nie dopuszczając do jej rozmrożenia.</li>
		<li>Natychmiast po dysocjacji zawiesić stały, sproszkowany homogenat w 300-500 μl 0,1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS). W tym przypadku nie należy używać żadnego buforu do lizy (takiego jak RIPA), ponieważ może to spowodować lizę neuronów.</li>
		<li>Odwirowywać homogenaty przez co najmniej 15 minut z maksymalną prędkością wirówki stołowej (np. 21 130 x g). Zebrać klarowny sklarowany sklarowany szwaczek górski, który reprezentuje ekstrakt tkankowy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Supernatanty linii komórkowej
	<ol>
		<li>Niech interesujące komórki osiągną co najmniej 70-80% zbiegu w normalnym podłożu wzrostowym.</li>
		<li>Zazwyczaj pożywki te zawierają składniki surowicy i mogą wywierać niekontrolowany wpływ na wzrost neuronów. Dlatego po osiągnięciu pożądanej gęstości komórek, umyj komórki co najmniej 3 razy PBS klasy hodowli komórkowej i umieść je w pożywce bez surowicy (SFM) na maksymalnie 48 godzin. 
		nuta: Tutaj weź pod uwagę, że niektóre komórki (takie jak komórki gwiaździste trzustki) mogą potrzebować surowicy w pożywce wzrostowej, aby utrzymać swój normalny stan i strukturę. W takich przypadkach należy wykonać seryjne rozcieńczenia surowicy w pożywce komórki będącej przedmiotem zainteresowania, aby znaleźć najniższą możliwą zawartość surowicy niezbędną do nienaruszonego funkcjonowania komórki.</li>
		<li>Zmierzyć stężenie białka w homogenacie tkankowym lub supernatantach komórkowych za pomocą testu białkowego Bradforda. Chociaż wartości te różnią się w zależności od typu tkanki i komórki, w przypadku ekstraktów z tkanki trzustki można oczekiwać zakresu stężeń w zakresie 5-12 μg/μl, a w przypadku supernatantów linii komórkowych między 3-8 μg/μl.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Ekstrakty z podwielokrotności i supernatanty komórkowe
W zależności od stężenia, które ma być użyte w teście, końcowe stężenie ekstraktu lub supernatantu w pożywce neuronalnej powinno wynosić 100 μg/ml 5,8.
Uwaga: Do testu z neuronami rosnącymi w podłożu 500 μl w każdym dołku płytki 24-dołkowej, potrzeba 50 μg białka z każdego ekstraktu lub supernatantu na studzienkę. Przy typowym stężeniu ekstraktu wynoszącym około 10 μg/μl, na każdy studzienek potrzeba 5 μl ekstraktu/supernatantu. W każdym ustawieniu wykonanym w trzech próbach odpowiada to 15 μl ekstraktu/supernatantu. Dla różnych typów tkanek lub komórek należy przeprowadzić seryjne rozcieńczenia końcowego stężenia ekstraktu lub supernatantu i porównać zaobserwowane efekty neurotroficzne między różnymi stężeniami ekstraktu/supernatantu.
3. Izolacja neuronów
Gdy pobieranie ekstraktu/supernatantu zostanie zakończone, kontynuuj izolację neuronów.
<ol>
	<li>W przypadku neuronów DRG należy pobrać DRG od szyjki macicy do odcinka lędźwiowego nowonarodzonych szczurów między dniem pourodzeniowym (P) 2-12 po dekapitacji i stereomikroskopowym rozwarstwieniu DRG (ryc. 1A). Aby mieć wystarczającą ilość neuronów DRG dla 24-dołkowej płytki, należy zebrać wszystkie DRG od szyjki macicy do odcinka lędźwiowego jednego nowonarodzonego szczura (co odpowiada 52 DRG) na płytkę.
	<ol>
		<li>Odetnij peryferyjne (nerwowe) i centralne wypustki (korzenie) DRG za pomocą mikronożyczek. 
		Pozostawienie wypustek na miejscu utrudnia rozcieranie i zwiększa ryzyko zanieczyszczenia hodowli przez fibroblasty.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W przypadku neuronów MP należy odciąć krezkę od jelita cienkiego i ręcznie i ostrożnie usunąć warstwę surowiczo-mięśniową jelita cienkiego (szczegółowy protokół izolacji MP znajduje się w Schäfer i wsp.9, Rysunek 1B). W przypadku MP należy pobrać splot od dwóch szczurów na płytkę 24-dołkową. 
	nuta: Staraj się być tak delikatny, jak to możliwe, aby uniknąć rozdarć w warstwie surowiczo-mięśniowej, ponieważ utrudniają one jej pomyślne oddzielenie od jelita cienkiego.</li>
	<li>Zebrać DRG i warstwę surowiczo-mięśniową w lodowatej pożywce MEM (minimal essential substance) dostarczanej z gentamycyną (20 mg w 500 ml pożywki) i metronidazolem (2,5 mg w 500 ml pożywki).</li>
	<li>Po zebraniu DRG inkubuj je w zrównoważonym roztworze soli Hanka (HBSS) dostarczonym z kolagenazą typu II przez 20-30 minut. W celu izolacji MP inkubować w rodzaju kolagenazy od 1 do 3 godzin, w zależności od wieku zwierzęcia (ryc. 1C).</li>
	<li>W przypadku MP zbierz przypominające siatkę kawałki MP pod mikroskopem stereoskopowym i przenieś do lodowatego MEM.</li>
	<li>Następnie rozprowadzić DRG i MP przez strzykawki o zmniejszającej się średnicy. 
	nuta: Nadmierne roztarcie może zniszczyć neurony, ale mniej komórki glejowe.</li>
	<li>Gdy pożywka zawierająca DRG lub MP stanie się mętna, odwirować zawiesinę o stężeniu 93,9 x g przez 5 minut, wyrzucić pożywkę i ponownie zawiesić w pożywce Neurobaseal (uzupełnionej 100 U/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny, 0,5 mM L-glutaminy i 2% B-27).</li>
	<li>Policz całkowitą liczbę komórek (tj. neuronów ORAZ gleju) za pomocą hemocytometru. 
	nuta: Liczba potrzebnych komórek zależy od parametru pomiaru. Do ilościowego określenia gęstości neurytów potrzebne są gęstsze hodowle, a tym samym większa liczba komórek niż do pomiaru wzrostu neurytów, wielkości okołokarionalnej i wzoru rozgałęzień poszczególnych neuronów. Do pomiarów gęstości neurytów użyj np. 10 000 komórek (neuron + glej) / studzienka lub 1 500 neuronów / studnia. W przypadku morfometrii pojedynczych neuronów zaleca się krótką (1-minutową) próbę komórek i wysiew 2500 komórek/studnię lub 400 neuronów/studnię. Typowa wydajność komórek uzyskanych od jednego szczura wynosi około 300 000-500 000 komórek.</li>
	<li>Wysiewaj komórki na 13-milimetrowych szkiełkach nakrywkowych, które zostały pokryte poprzedniej nocy i przykryj dołki pożywką Neurobaseal (uzupełnioną 100 U/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny, 0,5 mM L-glutaminy i 2% B-27) (Figura 1D). 
	nuta: Stosować szkiełka nakrywkowe pokryte poli-D-lizyną (40 mg/m2) LUB ornityną i lamininą (1 mg/ml każdy). Komórki przyłączają się do poli-D-lizyny niezwykle szybko, dzięki czemu nadaje się ona do eksperymentów, w których potrzebnych jest wiele komórek (np. pomiary gęstości neurytów). Przywiązanie do lamininy jest na ogół nieco słabsze, ale laminina jest silnym promotorem wzrostu neurytów. Dlatego do pomiarów rozgałęzień neuronalnych i długości neurytów preferowane jest powlekanie ornityną/lamininą.</li>
	<li>Pozwól komórkom przyczepić się do studzienek na noc. Następnego dnia przygotować pożywkę uzupełnioną ekstraktem (przy końcowym stężeniu ekstraktu/supernatantu 100 μg/ml).</li>
	<li>Zassać podłoże wysiewające i wykonać opcjonalne, bardzo delikatne płukanie PBS, a następnie powoli pipetować pożywkę z ekstraktem/supernatantem (rysunek 1E).</li>
	<li>Pozwól komórkom rosnąć przez 48 godzin. Odessać pożywkę i utrwalić w 4% paraformaldehydzie w celu barwienia immunologicznego (ryc. 1F).</li>
	<li>Wykonaj podwójne barwienie immunofluorescencyjne przy użyciu markerów specyficznych dla neuronów (np. tubulina beta III) i glejowych (np. kwaśne białko fibryallaryczne gleju / GFAP) (Figura 1G).</li>
	<li>Do morfometrii należy użyć mikroskopu światła odwróconego wyposażonego w kamerę CCD w połączeniu ze zautomatyzowanym oprogramowaniem, które umożliwia pomiar gęstości neurytów (patrz tabela).</li>
	<li>Gęstość neurytów w kulturach neuronalnych mierzy się na 4-5 reprezentatywnych mikrofotografiach w 200-krotnym powiększeniu z 4 różnych regionów o najgęstszym wzroście na każdym szkiełku nakrywkowym, nakładając siatkę 50 μm x 50 μm i zliczając gęstość włókien na kwadrat mierzoną w przecinających się włóknach. Przerost neurytowy, średnia liczba gałęzi na neuron, średnia długość gałęzi i rozmiar okołokarionalny można zmierzyć z losowo wybranych 30 pojedynczych neuronów z każdego szkiełka nakrywkowego, oznaczając neuryty i perikarya (ryc. 1H).</li>
</ol>

<ol><li>Demir, I. E., Schafer, K. H., Tieftrunk, E., Friess, H., Ceyhan, G. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+plasticity+in+the+gastrointestinal+tract%3A+chronic+inflammation%2C+neurotrophic+signals%2C+and+hypersensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Neural plasticity in the gastrointestinal tract: chronic inflammation, neurotrophic signals, and hypersensitivity.</a> Acta Neuropathol. 125, 491-509 (2013).</li>
<li>Vasina, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enteric+neuroplasticity+evoked+by+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Auton.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Enteric neuroplasticity evoked by inflammation.</a> Auton. Neurosci. 126-127, 264-272 (2006).</li>
<li>Lomax, A. E., Fernandez, E., Sharkey, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+the+enteric+nervous+system+during+intestinal+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Neurogastroenterol.+Motil%22%5BJournal%5D)">Plasticity of the enteric nervous system during intestinal inflammation.</a> Neurogastroenterol. Motil. 17, 4-15 (2005).</li>
<li>Demir, I. E., et al. Neural Invasion in Pancreatic Cancer: The Past, Present and Future. 2, 1513-1527 (2010).</li>
<li>Demir, I. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microenvironment+in+chronic+pancreatitis+and+pancreatic+cancer+induces+neuronal+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Neurogastroenterol.+Motil%22%5BJournal%5D)">The microenvironment in chronic pancreatitis and pancreatic cancer induces neuronal plasticity.</a> Neurogastroenterol. Motil. 22, 480-490 (2010).</li>
<li>Schafer, K. H., Mestres, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+GDNF-induced+neurite+outgrowth+and+neuronal+survival+in+dissociated+myenteric+plexus+cultures+of+the+rat+small+intestine+decreases+postnatally%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">The GDNF-induced neurite outgrowth and neuronal survival in dissociated myenteric plexus cultures of the rat small intestine decreases postnatally.</a> Exp. Brain Res. 125, 447-452 (1999).</li>
<li>Schafer, K. H., Van Ginneken, C., Copray, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+and+neural+stem+cells+in+the+enteric+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Anat.+Rec%22%5BJournal%5D)">Plasticity and neural stem cells in the enteric nervous system.</a> Anat. Rec. 292, 1940-1952 (2009).</li>
<li>Liebl, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+severity+of+neural+invasion+is+associated+with+shortened+survival+in+colon+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">The severity of neural invasion is associated with shortened survival in colon cancer.</a> Clin. Cancer Res. 19, 50-61 (2012).</li>
<li>Schäfer, K. H., Saffrey, M. J., Burnstock, G., Mestres-Ventura, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+method+for+the+isolation+of+myenteric+plexus+from+the+newborn+rat+gastrointestinal+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res.+Brain+Res.+Protoc%22%5BJournal%5D)">A new method for the isolation of myenteric plexus from the newborn rat gastrointestinal tract.</a> Brain Res. Brain Res. Protoc. 1, 109-113 (1997).</li>
<li>Ceyhan, G. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nerve+growth+factor+and+artemin+are+paracrine+mediators+of+pancreatic+neuropathy+in+pancreatic+adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Surg%22%5BJournal%5D)">Nerve growth factor and artemin are paracrine mediators of pancreatic neuropathy in pancreatic adenocarcinoma.</a> Ann. Surg. 251, 923-931 (2010).</li>
<li>Demir, I. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+plasticity+in+chronic+pancreatitis+is+mediated+via+the+neurturin%2FGFRalpha2+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Gastrointest.+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Neuronal plasticity in chronic pancreatitis is mediated via the neurturin/GFRalpha2 axis.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 303, 1017-1028 (2012).</li>
<li>Joseph, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enteric+glia+are+multipotent+in+culture+but+primarily+form+glia+in+the+adult+rodent+gut%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Enteric glia are multipotent in culture but primarily form glia in the adult rodent gut.</a> J. Clin. Invest. 121, 3398-3411 (2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają sprzecznych interesów i nie ujawniają informacji finansowych.

Niniejszy protokół ma na celu zilustrowanie metodologii testu neuroplastyczności trzustki in vitro , który został niedawno opracowany przez naszą grupę w celu zbadania mechanizmów neuroplastyczności w PCa i CP5. Protokół obejmuje trzydniową procedurę, którą można łatwo zastosować, gdy wykonawca zdobędzie wystarczające doświadczenie w izolacji i hodowli neuronów DRG i MP. Ponadto stanowi cenne narzędzie do badania jednoczesnej reakcji gleju jelitowego i związanego z DRG na składniki mikrośrodowiskowe t...

Zmiany w morfologii i gęstości nerwów przewodu pokarmowego (GI) od dawna przyciągają uwagę gastroenterologów i patologów, ale ich znaczenie dla patofizjologii chorób przewodu pokarmowego pozostaje nieznane1-3. Rzeczywiście, kilka bardzo powszechnych zaburzeń przewodu pokarmowego, takich jak zapalenie żołądka, refluksowe zapalenie przełyku, zapalenie jelita grubego, zapalenie uchyłków i zapalenie wyrostka robaczkowego, wiąże się ze zwiększoną gęstością unerwienia w obszarach tkanek objętych stanem zapalnym1. Jednak do tej pory nie poświęcono prawdziwej uwagi mechanizmom i znaczeniu neuroplastyczności w przewodzie pokarmowym. Czy zmienione morfologicznie nerwy przewodu pokarmowego różnią się od prawidłowych nerwów przewodu pokarmowego, czyli prawidłowego stanu jelitowego układu nerwowego, pod względem ich funkcji? Jakie są implikacje zmienionej zawartości neuropeptydu/neuroprzekaźnika w plastikowych nerwach jelitowych? Czy neuroplastyczność obwodowa zawsze pociąga za sobą zmienioną sygnalizację do ośrodkowego układu nerwowego? A gdzie są centralne projekcje plastycznych zewnętrznych ścieżek neuronowych przewodu pokarmowego? Długa seria takich kluczowych pytań może być łatwo wygenerowana, gdy spojrzymy na niedostatek naszej wiedzy na temat funkcjonalnych aspektów neuroplastyczności przewodu pokarmowego. 

Badanie neuroplastyczności przewodu pokarmowego na poziomie funkcjonalnym wymaga wiarygodnych, powtarzalnych i wciąż łatwych do zastosowania modeli eksperymentalnych. W erze rosnącej popularności i akceptacji genetycznie modyfikowanych warunkowych modeli myszy (GECoMM), takie ustawienia in vivo mają potencjał, aby wyjaśnić nieznane wcześniej aspekty neuroplastyczności przewodu pokarmowego w realistyczny sposób1. Jednak projektowanie i produkcja GECoMM pozostaje kosztowne, pracochłonne, a przede wszystkim czasochłonne. Ponadto wymagają one warunkowej modulacji a priori celu u genetycznie zmienionej myszy (np. transgeniczna nadekspresja czynnika wzrostu nerwów / NGF w komórkach nabłonka jelitowego). W związku z tym, aby zaprojektować udany GECoMM, naukowcy potrzebują pewnych wskaźników (np. wcześniejszych danych eksperymentalnych) wartościowego celu, tj. że można oczekiwać, że cząsteczka będąca przedmiotem zainteresowania (w tym przypadku NGF) będzie przynajmniej wywierać pewien biologicznie istotny wpływ na nerwy przewodu pokarmowego.

Takie wskaźniki można łatwo wyprowadzić z odpowiednich modeli in vitro, w których izolowane podtypy komórek ze złożonego mikrośrodowiska systemu in vivo mogą być selektywnie kohodowane w sposób heterotypowy4-7. Modulacja celów molekularnych w takich heterotypowych warunkach hodowli jest średnio technicznie mniej kłopotliwa, szybsza, a zatem może pomóc we wstępnym filtrowaniu wartościowych celów do weryfikacji w badaniach in vivo.
Niedawno zaprezentowaliśmy test neuroplastyczności in vitro, który miał na celu symulację zwiększonej gęstości neuronalnej i przerostu nerwów wewnątrztrzustkowych w tkankach ludzkiego raka trzustki (PCa) i przewlekłego zapalenia trzustki (CP). W tym przypadku neurony pochodzące ze zwojów korzenia grzbietowego nowonarodzonego szczura (DRG) lub splotu mięśniowo-jelitowego (MP) wystawiono na działanie ekstraktów tkankowych z chirurgicznie wyciętych próbek tkanek PCa lub CP i porównano z tymi hodowanymi w normalnych ekstraktach tkankowych ludzkiej trzustki (NP)5. Zamiast ekstraktów tkankowych można również użyć supernatantów linii komórkowych do badania wpływu wybranych typów komórek na neuroplastyczność. W połączeniu ze standaryzowanym pomiarem morfometrycznym, przedstawiony test neuroplastyczności pozwala na prawidłową i powtarzalną ocenę plastyczności neuronów w odpowiedzi na różne mikrośrodowiska trzustki. W szczególności umożliwia symulację 1) neuroplastyczności morfologicznej, tj. zmian w przeroscie neurytów, wzorze rozgałęzień i wielkości neuronów, oraz 2) neuroplastyczności funkcjonalnej, tj. zmian w pobudliwości neuronów obwodowych. Co więcej, nie tylko neurony obwodowe (tj. jelitowe), ale także centralne (np. DRG lub rdzeniowe drugiego rzędu) mogą być włączone do niniejszego testu w celu oceny ich morfologicznej i funkcjonalnej reakcji na różną zawartość tkanki przewodu pokarmowego. W tym samouczku wideo demonstrujemy protokół techniczny dotyczący wykonywania tego testu oraz omawiamy jego zalety i wady. Ponadto zwracamy uwagę na możliwość zastosowania podstawowego pojęcia tego testu do badania neuroplastyczności w dowolnym narządzie żołądkowo-jelitowym.

<table><tbody><tr><td>Bromowodorek poli-D-lizyny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1149</td><td></td></tr><tr><td>Ornityna/laminina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2533/L4544</td><td></td></tr><tr><td>13 mm Szkiełka nakrywkowe</td><td>Merck</td><td></td><td>Do stosowania w płytkach 24-dołkowych</td></tr><tr><td>Dysmembranator S</td><td>Sartorius</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-beta-III-tubulinowe</td><td>Milipore</td><td>MAB1637</td><td>stężenie 1:200</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-GFAP</td><td>DAKO</td><td>M0761</td><td>o stężeniu 1:400</td></tr><tr><td>Bufor RIPA + inhibitor</td><td></td><td></td> proteazy <td>Dowolny dostawca</td></tr><tr><td>Podłoże neurobazalne</td><td>Gibco/Nauki Przyrodnicze</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Suplement</td><td>Gibco/Nauki Przyrodnicze</td><td>17504044</td><td>Wiadomo, że jakość witaminy B-27 zależy od numeru partii</td></tr><tr><td>Gentamycyna/Metronidazol</td><td></td><td></td><td>Dowolny dostawca</td></tr><tr><td>Minimalne niezbędne medium</td><td>Gibco/Nauki Przyrodnicze</td><td>31095-029</td><td></td></tr><tr><td>Hank' s Zrównoważony roztwór soli (HBSS)</td><td>Gibco/Nauki przyrodnicze</td><td>24020133</td><td>Poprawia aktywność kolagenazy, gdy zawiera Ca / Mg</td></tr><tr><td>Kolagenaza typu II</td><td>Worthington Biochemical</td><td>CLS-2</td><td>Uzyskaj partie o aktywności co najmniej 200 U/mg</td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA 0,25%</td><td>Gibco/Nauki Przyrodnicze</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>4% Paraformaldehyd</td><td></td><td></td><td>Dowolny dostawca</td></tr><tr><td>analizaSIS docu oprogramowanie</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

symulacja neuroplastyczności trzustki: test plastyczności podwójnych neuronów in vitro

Simulating Pancreatic Neuroplasticity: In Vitro Dual-neuron Plasticity Assay

Neuroplastyczność jest nieodłączną cechą jelitowego układu nerwowego i unerwienia przewodu pokarmowego (GI) w warunkach patologicznych. Jednak patofizjologiczna rola neuroplastyczności w zaburzeniach przewodu pokarmowego pozostaje nieznana. Nowatorskie modele eksperymentalne, które umożliwiają symulację i modulację neuroplastyczności przewodu pokarmowego, mogą umożliwić lepsze zrozumienie wpływu neuroplastyczności w szczególności choroby przewodu pokarmowego, takie jak rak trzustki (PCa) i przewlekłe zapalenie trzustki (CP). W tym artykule przedstawiono protokół symulacji neuroplastyczności trzustki w warunkach in vitro z wykorzystaniem neuronów zwojów korzenia grzbietowego (DRG) i splotu mięśniowo-jelitowego (MP) nowonarodzonych szczurów. To podejście oparte na dwóch neuronach nie tylko pozwala na monitorowanie neuroplastyczności zarówno wewnętrznej, jak i zewnętrznej, ale także stanowi cenne narzędzie do oceny morfologii neuronów i gleju oraz elektrofizjologii. Ponadto umożliwia funkcjonalną modulację dostarczanych treści mikrośrodowiskowych w celu badania ich wpływu na neuroplastyczność. Po ustaleniu, obecny test neuroplastyczności ma potencjał, aby można go było zastosować do badania neuroplastyczności w dowolnym narządzie żołądkowo-jelitowym.

Morfologiczna neuroplastyczność
W wskazanym przedziale wiekowym noworodków szczurzych (P2-12) oraz przy zastosowanych gęstościach wysiewu, neurony MP i DRG tworzą już gęste sieci neuronalne po 48 h (Rysunek 2A). Porównanie gęstości neurytów między neuronami hodowanymi w ekstraktach PCa, CP i NP wykazuje większą gęstość neurytów neuronów DRG w ekstraktach PCa lub CP niż w ekstraktach NP (Rysunek 2A)5. Do pomiarów na pojedynczych neuronach pr...

Plastyczność neuronalna jest coraz bardziej rozpoznawaną, ale niedostatecznie poznaną cechą przewodu pokarmowego (GI). Tutaj, na przykładzie zaburzeń trzustki u człowieka, przedstawiamy test neuroplastyczności in vitro do badania plastyczności neuronalnej w przewodzie pokarmowym zarówno na poziomie morfologicznym, jak i funkcjonalnym.

Symulacja neuroplastyczności trzustki: test plastyczności podwójnych neuronów in vitro

Neuroplasticity is an inherent feature of the enteric nervous system and gastrointestinal (GI) innervation under pathological conditions. However, the ...

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest badanie reaktywnych zmian w neuronach obwodowych w odpowiedzi na różne mikrośrodowiska trzustki. Cel ten zostaje osiągnięty poprzez przygotowanie w pierwszej kolejności lizatów tkanek z prawidłowej ludzkiej trzustki oraz z tkanki trzustkowej chorobowo zmienionej. W drugim kroku izolowane są komórki zzęsłowych zwojów grzbietowych (DRG) od nowonarodzonych szczurów, które następnie poddawane są działaniu wyizolowanych lizatów tkankowych.Następnie, po 48-godzinnej inkubacji, komórki są utrwalane w celu przeprowadzenia późniejszego podwójnego barwienia immunofluorescencyjnego. Wyniki wykazują różnice w gęstości neurytów i wzorcu ich rozgałęziania w neuronach oraz w gęstości gleju w neuronach hodowanych w różnych ekstraktach tkankowych. Metoda ta może ułatwić badania w dziedzinie neurogastrologii, takie jak badanie roli mediatorów molekularnych w zmianach neuroplastycznych w różnych chorobach przewodu pokarmowego.Chociaż metoda ta może dostarczyć wiedzy na temat różnych cech neurotroficznych chorób trzustki, można ją również zastosować do innych układów, takich jak nowotwory lub stany zapalne całego przewodu pokarmowego. Po raz pierwszy pomysł zastosowania tej metody pojawił się podczas rozpoczynania współpracy z badaczami w dziedzinie chorób neuropatycznych w pediatrii, takich jak np. choroba Ong, a następnie wykorzystaliśmy ją do naszych celów w celu homogenizacji ludzkiej tkanki trzustki. Przenieść sześciany tkanki trzustki o wymiarach 5x5x5 mm bezpośrednio z temperatury -80 °C do ciekłego azotu.Następnie umieść zamrożone blokami najpierw w probówkach do homogenizacji, w których mogą znajdować się metalowe kulki do dysocjacji, a następnie w homogenizatorze do tkanek homogenizuj, nie dopuszczając do rozmrożenia tkanki bezpośrednio po dysocjacji. Resuspenduj homogenizat w postaci stałego proszku w 300 do 500 µL lodowatego 0,1 X PBS. Nie używaj żadnego buforu lizującego, ponieważ może to.Zlizuj neurony, a następnie odwiruj homogenat z prędkością 21 130 ×g w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez co najmniej 15 minut. Zbierz klarowny supernatant zawierający ekstrakt tkankowy; aby zebrać supernatant z linii komórkowych, wykorzystaj ludzkie linie komórkowe trzustki. Hoduj komórki do uzyskania co najmniej 70 do 80% konfluencji w standardowej pożywce wzrostowej.Po uzyskaniu odpowiedniego stanu, przemyj komórki co najmniej trzykrotnie kulturą komórkową, używając PBS klasy laboratoryjnej, a następnie hoduj je w medium bezzbiórkowym przez maksymalnie 48 godzin. Następnie zmierz stężenie białka w homogenacie tkankowym lub w nadnadnadkładach linii komórkowych za pomocą metody Bradforda. Potem podziel ekstrakty tkankowe i nadnadnadkłady linii komórkowych na alikwoty w taki sposób, aby końcowe stężenie ekstraktu lub nadnadnadkładu w medium neuronalnym wynosiło 100 µg/mL.Następnie przechowywać je w temperaturze -80 °C. U noworodka szczura w wieku od P2 do P12 z usuniętą głową, naciąć skórę i odsłonić kolumnę kręgosłupa. Następnie przeprowadzić przednią laminektomię w celu odsłonięcia rdzenia kręgowego.Następnie odsłoń i usuń zwoje korzeni grzbietowych (DRG). Umieść DRG w schłodzonym na lodzie medium MEM z dodatkiem gentamycyny i metronidazolu. Kontynuuj pobieranie zwojów DRG, zaczynając od zwojów kokcygealnych, a następnie przesuwając się w stronę górnych szyjnych zwojów DRG.Po zakończeniu procesu zebrać 52 zwoje korzeni grzbietowych (DRG), co jest ilością wystarczającą do wypełnienia płytki 24-dołkowej. Następnie, używając mikronożyczek, oddzielić DRG od korzeni i nerwów. Na koniec odciąć wszelkie pozostałe projekcje obwodowe i ośrodkowe.Po pobraniu zwojów korzeniowych (DRGs) inkubować je w HBSS z dodatkiem kolagenazy typu drugiego w temperaturze 37°C przez 20 do 30 minut. Po inkubacji poddać zwoje korzeniowe trituracji za pomocą strzykawek o zmniejszającej się średnicy.Należy pamiętać, że nadmiar tri może niszczyć neurony, ale jest mniej szkodliwy dla gleju. Gdy medium zawierające DRGs stanie się mętne, odwiruj zawiesinę przy 93,9 ×g przez pięć minut. Następnie odlej medium i resuspenduj.Resuspenduj komórki w pożywce neurobasal, aby przygotować je do hodowli. Użyj komory countingowej (cytometru hematologicznego), aby oszacować całkowitą liczbę neuronów i gleju. Następnie wysiej komórki na pokrywki szkiełkowe o średnicy 13 mm, uprzednio powlekane.W płytce 24-dołkowej rodzaj zastosowanej powłoki zależy od celów eksperymentu. Następnie do dołków należy wlać pożywkę neurobasalną i pozostawić komórki do przytwierdzenia do ścianek dołków przez noc. Następnego dnia należy rozmrozić pożywkę uzupełnioną ekstraktem tkankowym lub pożywkę uzupełnioną supernatorem z linii komórkowej.Następnie odessaj pożywkę do wysiewu z DRGs i wykonaj opcjonalne, bardzo delikatne płukanie w PBS. Następnie powoli nanieś pipetą na komórki pożywkę uzupełnioną ekstraktem tkankowym lub pożywkę uzupełnioną nadsączem linii komórkowej, aby uzyskać stężenie 100 µg/mL. Pozostaw komórki do wzrostu na 48 godzin w temperaturze 37 °C w pożywce z ekstraktem tkankowym lub nadsączem linii komórkowej.Odssać pożywkę i utrwalić w 4% paraformaldehydzie do barwienia immunocytochemicznego. W przypadku podwójnego barwienia immunofluorescencyjnego zastosować markery specyficzne dla neuronów oraz glii w celu analizy geometrii morfologicznej. Użyć odwróconego mikroskopu świetlnego wyposażonego w kamerę CCD wraz z automatycznym oprogramowaniem do pomiaru gęstości neurytów przy 200-krotnym powiększeniu.Zmierz gęstość neurytów w kulturach neuronalnych, nakładając siatkę o oczkach 50 na 50 mikrometrów i zliczając gęstość włókien na metr kwadratowy w miejscach przecięcia włókien. Powtórz tę analizę dla czterech różnych obszarów o najgęstszym wzroście na czterech do pięciu reprezentatywnych mikrografiach na każdym szkiełku podstawnym. Zmierz średnią liczbę odgałęzień na neuron, średnią długość odgałęzień oraz rozmiar perikaryonu dla 30 losowo wybranych pojedynczych neuronów z każdego szkiełka podstawnego, zaznaczając neuryty i perikaria. Przedstawiono tutaj neurony DRG hodowane z ekstraktem tkankowym z prawidłowej trzustki.W przeciwieństwie do nich, neurony z zwojów rdzeniowych (DRG) hodowane z ekstraktami tkanek w przebiegu przewlekłego zapalenia trzustki lub raka trzustki wykazują większą gęstość neurytów. Przedstawiono tutaj neurony splotu mięktniowego hodowane z różnymi ekstraktami tkanek trzustki człowieka.Neurony splotu miękkiego hodowane w ekstraktach z przewlekłego zapalenia trzustki lub raka trzustki tworzą dłuższe wypustki i wykazują bardziej złożony wzór rozgałęzień niż neurony hodowane w ekstraktach z prawidłowej trzustki. Gdy neurony zzęzłów korzeni grzbietowych (DRG) hodowano z supernatantem z komórek raka trzustki, zaobserwowano również wzrost gęstości neuronowej, podobny do tego, który wystąpił przy zastosowaniu ekstraktów tkankowych. Wzrost ten był jednak odwracalny po usunięciu lub zablokowaniu wybranych czynników neurotroficznych, takich jak our tein lub czynnik wzrostu nerwów.Komórki Ggl reagują również odmiennie na różne ekstrakty z tkanki trzustkowej; ekstrakty z przewlekłego zapalenia trzustki lub raka trzustki zwiększały wzrost gleju oraz liczbę komórek glejowych w kulturach glejowych pochodzących z zwojów korzeniowych tylnych (DRG). Efekt ten był bardziej wyraźny w przypadku raka trzustki niż w przypadku ekstraktów z przewlekłego zapalenia trzustki. Po opanowaniu tej techniki, przy prawidłowym wykonaniu, procedurę można przeprowadzić w ciągu czterech do pięciu godzin od momentu jej opracowania.Metoda ta utorowała drogę badaczom z dziedziny neurogastrologii do zgłębiania mechanizmów neuroplastyczności w różnych chorobach przewodu pokarmowego, w tym w zapalnych i nowotworowych schorzeniach układu pokarmowego. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo uzyskać dobrą wiedzę na temat tego, jak izolować neurony obwodowe w celu badania neuroplastyczności trzustki oraz jak wdrożyć ten system i inne analizy zmian neuronalnych oraz neuroplastyczności w schorzeniach przewodu pokarmowego.

simulating-pancreatic-neuroplasticity-vitro-dual-neuron-plasticity

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Symulowanie neuroplastyczności trzustki: in vitro dwunurkowy test na neuroplastyczność

Opisano trójwymiarowy test kolonogenny, który pozwala progenitorom o fenotypie trzustkowym na różnicowanie się w kolonie wykazujące ekspresję insuliny. Metoda ta wykorzystuje półstałe podłoża zawierające metylocelulozę, Matrigel oraz czynniki wzrostu, w których pojedyncze komórki progenitorowe proliferują i różnicują się in vitro, co umożliwia ilościowe określenie liczby funkcjonalnych progenitorów w populacji.

Ilościowe oznaczenie progenitorów tworzących kolonie wykazujących ekspresję insuliny

W niniejszej pracy opisujemy metodę izolacji, hodowli i manipulacji embrionalną trzustką myszy. Stanowi ona doskonały system ex vivo do badania różnych aspektów rozwoju trzustki, w tym morfogenezy, różnicowania i wzrostu. Eksplanty pąka trzustki mogą być hodowane przez kilka dni i wykorzystywane w szerokim zakresie zastosowań, w tym w immunofluorescencji całych preparatów oraz obrazowaniu na żywo.

System do hodowli ex vivo trzustki embrionalnej

Ten film demonstruje test neuroplastyczności in vitro w celu zbadania zmian morfologicznych w zwojach korzenia grzbietowego i neuronach splotu mięśniowo-rdzeniowego wystawionych na działanie zdrowych i rakowych ekstraktów z ludzkiej tkanki trzustkowej. Ten test pozwala nam zbadać przerost neurytów, wzór rozgałęzień i rozmiar neuronów.

Test neuroplastyczności trzustki in vitro: badanie zmian w neuronach przewodu pokarmowego narażonych na zdrowe i nowotworowe ekstrakty z ludzkiej tkanki trzustki

Ten film demonstruje test migracji neurosfery komórek prekursorowych neuronów - test in vitro do badania odpowiedzi migracyjnej neuronalnych komórek prekursorowych z neurosfery - za pomocą analizy mikroskopowej.

Test neurosfery NPC: Test in vitro do oceny odpowiedzi migracyjnej neuronalnych komórek prekursorowych z neurosfery

Przejście nabłonkowe do mezenchymalnego (EMT) pozwala nowotworom stać się inwazyjnymi. W celu zbadania EMT opisano model in vitro oparty na neuronalnych komórkach macierzystych (NSC) pozbawiony surowicy i enzymów. Ten ustandaryzowany system umożliwia ilościową i jakościową ocenę migracji komórek, ekspresji genów i białek. Model nadaje się do odkrywania leków.

Wolny od enzymów i surowicy model hodowli nerwowych komórek macierzystych do badań EMT, odpowiedni do odkrywania leków

Tutaj stworzyliśmy tanią i łatwą w obsłudze metodę, która kieruje szybkim i efektywnym różnicowaniem się od embrionalnych komórek macierzystych do neuronów. Metoda ta nadaje się do popularyzacji wśród laboratoriów i może być przydatnym narzędziem do badań neurologicznych.

Różnicowanie neuronalne na podstawie embrionalnych komórek macierzystych myszy in vitro

Opisujemy metodę różnicowania rdzenia kręgowego, indukowanych przez człowieka astrocytów i neuronów pochodzących z pluripotencjalnych źródeł oraz ich wspólnej hodowli do zapisu elektrofizjologicznego.

Stworzenie platformy elektrofizjologicznej do modelowania ALS z wykorzystaniem specyficznych regionalnie astrocytów i neuronów pochodzących z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Obecny protokół opisuje ulepszoną metodę zwiększania koekspresji czynników transkrypcyjnych PDX1 i NKX6.1 w progenitorach trzustki pochodzących z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) w płaskich monowarstwach. Osiąga się to poprzez uzupełnienie świeżej macierzy, manipulowanie gęstością komórek i dysocjację komórek endodermalnych.

Różnicowanie ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w prekursory komórek beta trzustki w systemie hodowli 2D

Tutaj używamy HD-MEA, aby zagłębić się w dynamikę obliczeniową dużych zespołów neuronalnych, szczególnie w hipokampie, obwodach opuszki węchowej i ludzkich sieciach neuronowych. Uchwycenie aktywności czasoprzestrzennej w połączeniu z narzędziami obliczeniowymi zapewnia wgląd w złożoność zespołu neuronalnego. Metoda ta pomaga lepiej zrozumieć funkcje mózgu, potencjalnie identyfikując biomarkery i metody leczenia zaburzeń neurologicznych.

Rejestrowanie i analizowanie multimodalnej dynamiki zespołów neuronalnych na zintegrowanej z CMOS matrycy mikroelektrod o dużej gęstości

Ten protokół ma na celu stabilne umieszczanie grzbietowo-brzusznych zrośniętych asembloidów na wieloelektrodowych układach do modelowania padaczki in vitro.

Wieloelektrodowa platforma matrycowa do modelowania padaczki przy użyciu ludzkich pluripotencjalnych zespołów mózgowych pochodzących z komórek macierzystych

Oferujemy minimalnie inwazyny protokół do domięśniowej transplantacji wyspików komórek macierzystych trzustki pochodzących z ludzkich komórek macierzystych do szczurów immunodeficytarnych w celu in vivo implantacji i dalszej analizy.

Przeszczep domięśniowy ludzkich pluripotentnych komórek macierzystych pochodzenia trzustkowego do szczurów

Poznaj metodę symulacji neuroplastyczności trzustki z wykorzystaniem neuronów DRG i MP szczurów. Technika umożliwia badanie zmian morfologicznych i elektrofizjologicznych neuronów w odpowiedzi na ekstrakty tkanek trzustki.

Symulacja neuroplastyczności trzustki: test plastyczności podwójnych neuronów in vitro

Przeglądaj więcej filmów