Symulacja neuroplastyczności trzustki: test plastyczności podwójnych neuronów in vitro

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest badanie reaktywnych zmian w neuronach obwodowych w odpowiedzi na różne mikrośrodowiska trzustki. Cel ten zostaje osiągnięty poprzez przygotowanie w pierwszej kolejności lizatów tkanek z prawidłowej ludzkiej trzustki oraz z tkanki trzustkowej chorobowo zmienionej. W drugim kroku izolowane są komórki zzęsłowych zwojów grzbietowych (DRG) od nowonarodzonych szczurów, które następnie poddawane są działaniu wyizolowanych lizatów tkankowych.

Następnie, po 48-godzinnej inkubacji, komórki są utrwalane w celu przeprowadzenia późniejszego podwójnego barwienia immunofluorescencyjnego. Wyniki wykazują różnice w gęstości neurytów i wzorcu ich rozgałęziania w neuronach oraz w gęstości gleju w neuronach hodowanych w różnych ekstraktach tkankowych. Metoda ta może ułatwić badania w dziedzinie neurogastrologii, takie jak badanie roli mediatorów molekularnych w zmianach neuroplastycznych w różnych chorobach przewodu pokarmowego.

Chociaż metoda ta może dostarczyć wiedzy na temat różnych cech neurotroficznych chorób trzustki, można ją również zastosować do innych układów, takich jak nowotwory lub stany zapalne całego przewodu pokarmowego. Po raz pierwszy pomysł zastosowania tej metody pojawił się podczas rozpoczynania współpracy z badaczami w dziedzinie chorób neuropatycznych w pediatrii, takich jak np. choroba Ong, a następnie wykorzystaliśmy ją do naszych celów w celu homogenizacji ludzkiej tkanki trzustki. Przenieść sześciany tkanki trzustki o wymiarach 5x5x5 mm bezpośrednio z temperatury -80 °C do ciekłego azotu.

Następnie umieść zamrożone blokami najpierw w probówkach do homogenizacji, w których mogą znajdować się metalowe kulki do dysocjacji, a następnie w homogenizatorze do tkanek homogenizuj, nie dopuszczając do rozmrożenia tkanki bezpośrednio po dysocjacji. Resuspenduj homogenizat w postaci stałego proszku w 300 do 500 µL lodowatego 0,1 X PBS. Nie używaj żadnego buforu lizującego, ponieważ może to.

Zlizuj neurony, a następnie odwiruj homogenat z prędkością 21 130 ×g w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez co najmniej 15 minut. Zbierz klarowny supernatant zawierający ekstrakt tkankowy; aby zebrać supernatant z linii komórkowych, wykorzystaj ludzkie linie komórkowe trzustki. Hoduj komórki do uzyskania co najmniej 70 do 80% konfluencji w standardowej pożywce wzrostowej.

Po uzyskaniu odpowiedniego stanu, przemyj komórki co najmniej trzykrotnie kulturą komórkową, używając PBS klasy laboratoryjnej, a następnie hoduj je w medium bezzbiórkowym przez maksymalnie 48 godzin. Następnie zmierz stężenie białka w homogenacie tkankowym lub w nadnadnadkładach linii komórkowych za pomocą metody Bradforda. Potem podziel ekstrakty tkankowe i nadnadnadkłady linii komórkowych na alikwoty w taki sposób, aby końcowe stężenie ekstraktu lub nadnadnadkładu w medium neuronalnym wynosiło 100 µg/mL.

Następnie przechowywać je w temperaturze -80 °C. U noworodka szczura w wieku od P2 do P12 z usuniętą głową, naciąć skórę i odsłonić kolumnę kręgosłupa. Następnie przeprowadzić przednią laminektomię w celu odsłonięcia rdzenia kręgowego.

Następnie odsłoń i usuń zwoje korzeni grzbietowych (DRG). Umieść DRG w schłodzonym na lodzie medium MEM z dodatkiem gentamycyny i metronidazolu. Kontynuuj pobieranie zwojów DRG, zaczynając od zwojów kokcygealnych, a następnie przesuwając się w stronę górnych szyjnych zwojów DRG.

Po zakończeniu procesu zebrać 52 zwoje korzeni grzbietowych (DRG), co jest ilością wystarczającą do wypełnienia płytki 24-dołkowej. Następnie, używając mikronożyczek, oddzielić DRG od korzeni i nerwów. Na koniec odciąć wszelkie pozostałe projekcje obwodowe i ośrodkowe.

Po pobraniu zwojów korzeniowych (DRGs) inkubować je w HBSS z dodatkiem kolagenazy typu drugiego w temperaturze 37°C przez 20 do 30 minut. Po inkubacji poddać zwoje korzeniowe trituracji za pomocą strzykawek o zmniejszającej się średnicy.

Należy pamiętać, że nadmiar tri może niszczyć neurony, ale jest mniej szkodliwy dla gleju. Gdy medium zawierające DRGs stanie się mętne, odwiruj zawiesinę przy 93,9 ×g przez pięć minut. Następnie odlej medium i resuspenduj.

Resuspenduj komórki w pożywce neurobasal, aby przygotować je do hodowli. Użyj komory countingowej (cytometru hematologicznego), aby oszacować całkowitą liczbę neuronów i gleju. Następnie wysiej komórki na pokrywki szkiełkowe o średnicy 13 mm, uprzednio powlekane.

W płytce 24-dołkowej rodzaj zastosowanej powłoki zależy od celów eksperymentu. Następnie do dołków należy wlać pożywkę neurobasalną i pozostawić komórki do przytwierdzenia do ścianek dołków przez noc. Następnego dnia należy rozmrozić pożywkę uzupełnioną ekstraktem tkankowym lub pożywkę uzupełnioną supernatorem z linii komórkowej.

Następnie odessaj pożywkę do wysiewu z DRGs i wykonaj opcjonalne, bardzo delikatne płukanie w PBS. Następnie powoli nanieś pipetą na komórki pożywkę uzupełnioną ekstraktem tkankowym lub pożywkę uzupełnioną nadsączem linii komórkowej, aby uzyskać stężenie 100 µg/mL. Pozostaw komórki do wzrostu na 48 godzin w temperaturze 37 °C w pożywce z ekstraktem tkankowym lub nadsączem linii komórkowej.

Odssać pożywkę i utrwalić w 4% paraformaldehydzie do barwienia immunocytochemicznego. W przypadku podwójnego barwienia immunofluorescencyjnego zastosować markery specyficzne dla neuronów oraz glii w celu analizy geometrii morfologicznej. Użyć odwróconego mikroskopu świetlnego wyposażonego w kamerę CCD wraz z automatycznym oprogramowaniem do pomiaru gęstości neurytów przy 200-krotnym powiększeniu.

Zmierz gęstość neurytów w kulturach neuronalnych, nakładając siatkę o oczkach 50 na 50 mikrometrów i zliczając gęstość włókien na metr kwadratowy w miejscach przecięcia włókien. Powtórz tę analizę dla czterech różnych obszarów o najgęstszym wzroście na czterech do pięciu reprezentatywnych mikrografiach na każdym szkiełku podstawnym. Zmierz średnią liczbę odgałęzień na neuron, średnią długość odgałęzień oraz rozmiar perikaryonu dla 30 losowo wybranych pojedynczych neuronów z każdego szkiełka podstawnego, zaznaczając neuryty i perikaria. Przedstawiono tutaj neurony DRG hodowane z ekstraktem tkankowym z prawidłowej trzustki.

W przeciwieństwie do nich, neurony z zwojów rdzeniowych (DRG) hodowane z ekstraktami tkanek w przebiegu przewlekłego zapalenia trzustki lub raka trzustki wykazują większą gęstość neurytów. Przedstawiono tutaj neurony splotu mięktniowego hodowane z różnymi ekstraktami tkanek trzustki człowieka.

Neurony splotu miękkiego hodowane w ekstraktach z przewlekłego zapalenia trzustki lub raka trzustki tworzą dłuższe wypustki i wykazują bardziej złożony wzór rozgałęzień niż neurony hodowane w ekstraktach z prawidłowej trzustki. Gdy neurony zzęzłów korzeni grzbietowych (DRG) hodowano z supernatantem z komórek raka trzustki, zaobserwowano również wzrost gęstości neuronowej, podobny do tego, który wystąpił przy zastosowaniu ekstraktów tkankowych. Wzrost ten był jednak odwracalny po usunięciu lub zablokowaniu wybranych czynników neurotroficznych, takich jak our tein lub czynnik wzrostu nerwów.

Komórki Ggl reagują również odmiennie na różne ekstrakty z tkanki trzustkowej; ekstrakty z przewlekłego zapalenia trzustki lub raka trzustki zwiększały wzrost gleju oraz liczbę komórek glejowych w kulturach glejowych pochodzących z zwojów korzeniowych tylnych (DRG). Efekt ten był bardziej wyraźny w przypadku raka trzustki niż w przypadku ekstraktów z przewlekłego zapalenia trzustki. Po opanowaniu tej techniki, przy prawidłowym wykonaniu, procedurę można przeprowadzić w ciągu czterech do pięciu godzin od momentu jej opracowania.

Metoda ta utorowała drogę badaczom z dziedziny neurogastrologii do zgłębiania mechanizmów neuroplastyczności w różnych chorobach przewodu pokarmowego, w tym w zapalnych i nowotworowych schorzeniach układu pokarmowego. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo uzyskać dobrą wiedzę na temat tego, jak izolować neurony obwodowe w celu badania neuroplastyczności trzustki oraz jak wdrożyć ten system i inne analizy zmian neuronalnych oraz neuroplastyczności w schorzeniach przewodu pokarmowego.