Protokół odpowiedzi na wydłużenie trąby do badania plastyczności behawioralnej u owadów: zastosowanie do badań podstawowych, biomedycznych i rolniczych

Protokół warunkowania Proboscis Extension Response (PER), opracowany dla pszczół miodnych (Apis mellifera), dostarcza ekologicznie istotnych i łatwo mierzalnych środków do badania kilku różnych mechanizmów uczenia się u wielu gatunków owadów.

Ogólnym celem tej procedury jest pokazanie, w jaki sposób można wdrożyć warunkowanie behawioralne prostej odruchowej reakcji na pokarm u pszczół miodnych. Osiąga się to poprzez najpierw chwytanie pszczół miodnych, krępowanie ich w uprzęży, podawanie im niewielkiej ilości sekretnego roztworu, a następnie pozwalanie im przyzwyczaić się do ograniczenia. Następnie do kondycjonowania wybierane są koraliki, które wykazują wystarczającą motywację, gdy ich anteny są dotknięte sacharozą.

Podczas kondycjonowania prezentacja zapachu jest połączona z nagrodą w postaci sacharozy, aby wywołać uwarunkowaną reakcję. Następnie, niewzmocnione badania mierzą obecność lub brak odpowiedzi, opóźnienie odpowiedzi i czas trwania odpowiedzi. Ostatnim krokiem jest analiza danych i graficzna prezentacja prób kondycjonowania i testów.

Technika ta została z powodzeniem zastosowana w badaniach nad biologią pszczół miodnych, a zachowania związane z uczeniem się zdrowia są szczególnie wrażliwe na destrukcyjne zabiegi, takie jak pestycydy, co umożliwia ocenę wpływu tego typu zabiegów na zachowanie pszczół miodnych na poziomach subletalnych. Wizualna demonstracja tej metody pomaga w zrozumieniu czasu bodźca wymaganego do skutecznego warunkowania oraz typowych błędów, które zmniejszają skuteczność. Osoba, która dopiero zaczyna przygodę z tą metodą, będzie miała problemy z dbałością o szczegóły wymaganą zarówno w protokole, jak i w otaczających warunkach.

Na początek zbieraj pszczoły robotnice od wejścia do kolonii, gdy zatrzymują się przed odejściem lub wracają z żerowania. Złap tylko jedną pszczołę w fiolce. Trzymać otwór fiolki poziomo lub skierowany w dół, jednocześnie zamykając wieczko, aby zapobiec ucieczce.

Po zebraniu pszczół wróć do laboratorium i umieść po kilka fiolek na raz w zawiesinie lodowatej wody. Gdy pszczoła jest nieruchoma, natychmiast wyjmij fiolkę z lodu, aby uniknąć nadmiernej ekspozycji i umieść pszczołę w uprzęży krępjącej. Unieruchomić pszczołę tak, aby jej grzbietowa klatka piersiowa była skierowana w stronę wyciętej części uchwytu, a jej głowa znajdowała się tuż nad wierzchołkiem.

Delikatnie dociśnij pszczołę tak, aby jej części gębowe wystawały poza krawędź uchwytu. Wsuń pasek taśmy klejącej między głowę a klatkę piersiową po stronie grzbietowej i mocno przymocuj wolny koniec do boku uchwytu. Upewnij się, że taśma na uprzęży jest gładka i napięta.

Nie powinno być zauważalnych szczelin między przodem uchwytu na pszczoły a taśmą. Jeśli są luki, pszczoła może nie być w stanie prawidłowo wysunąć swojego per bois lub może być w stanie uciec. Pozwól pszczołom na około 30 minut na regenerację po uprzęży przed karmieniem.

Następnie w obszarze znacznie oddalonym od obszaru treningowego nakarm każdą pszczołę około trzech do czterech mikrolitrów 0,5 molowej sacharozy w przerwie między karmieniem a kondycjonowaniem. Umieść pszczoły w cichym miejscu laboratorium i w plastikowym pojemniku z mokrymi ręcznikami papierowymi. W tym czasie, na kilka minut przed rozpoczęciem kondycjonowania, Testa jest zmotywowany do karmienia, dotykając czułków małą kropelką 0,5-molowego roztworu sacharozy.

Nie pozwalaj im jeść podczas tego testu. Jeśli zareagują poprzez rozszerzenie swojej psis, prawdopodobnie są wystarczająco zmotywowani do nauki i mogą być wykorzystane w protokole. Gdy będzie gotowa, umieść szklaną strzykawkę zapachową w uchwycie z plasteliny i wyreguluj ją tak, aby otwór w szerokim końcu był skierowany bezpośrednio na pszczoły i 10 E. Koniec strzykawki powinien znajdować się od jednego do dwóch centymetrów od pszczoły, bezpiecznie umieszczonej złączki łączącej wkład z rurką Airstream i systemem zaworów nad wąskim końcem strzykawki.

Na początku każdej próby umieść zaprzężoną pszczołę na kołku na arenie kondycjonowania z czułkami skierowanymi bezpośrednio w stronę wkładu zapachowego. Pozwól pszczole odpocząć na arenie przez 15 do 25 sekund przed rozpoczęciem bodźca zapachowego, aby umożliwić jej przyzwyczajenie się do nowego otoczenia. Naciśnij przycisk start, aby uruchomić mechanizm czasowy dostarczania zapachu.

Monitoruj reakcję pszczoły na zapach po nadejściu bodźca i przed wystąpieniem bodźca bezwarunkowego. Po każdej próbie pozwól pszczole odpocząć w obszarze kondycjonowania przez kolejne 15 do 25 sekund, aby umożliwić początkowe utworzenie pamięci. Zbyt wczesne przemieszczenie pszczoły po próbie znacznie zmniejszy skuteczność każdej próby kondycjonowania.

Aby dostarczyć sacharozę, przytrzymaj końcówkę igły w odległości od dwóch do trzech centymetrów od pszczoły, gdy pojawi się zapach. Użyj krawędzi areny treningowej, aby zapobiec potrząsaniu strzykawką, ponieważ ten ruch może rozpraszać pszczołę. Podczas prezentacji bodźca zapachowego rozlegnie się sygnał karmienia.

Gdy tylko rozlegnie się sygnał karmienia, delikatnie dotknij czułków, aż pszczoła wysunie się jako trąba, a następnie nakarm pszczołę. Czas między prezentacją zapachu a prezentacją sacharozy ma kluczowe znaczenie. Idealnie byłoby, gdyby te dwa bodźce na chwilę się nakładały.

Jeśli między pojawieniem się zapachu a pojawieniem się sacharozy upłynie więcej niż kilka sekund, wydajność kondycjonowania zmniejszy się. Po kondycjonowaniu użyj niewzmocnionych prób testowych, aby ocenić, jak dobrze pszczoły zapamiętują uwarunkowane skojarzenie. Najpierw ustaw kamerę wideo na statywie nad obszarem treningowym i ustaw kamerę na przedniej części głowy pszczoły, aby czułki i probus były ostre.

Upewnij się, że mała dioda LED, która sygnalizuje prezentację bodźca zapachowego, znajduje się w obszarze za pszczołą i w miejscu, w którym jest widoczna na filmie, ale nie dla pszczoły. Pozwala to na identyfikację czasu powstania zapachu i jego przesunięcia podczas analizy. Aby uzyskać najbardziej spójne wyniki, użyj świeżo przygotowanych wkładów zapachowych do testowania, gdy wszystko zostanie skonfigurowane.

Rozpocznij testowanie od przedstawienia zapachu, jak pokazano wcześniej. Rozpocznij nagrywanie 20 sekund przed wyświetleniem zapachu i kontynuuj nagrywanie przez co najmniej 20 sekund później. Po przetestowaniu użyj oprogramowania do edycji wideo, aby ocenić reakcję każdej pszczoły na stan bodźca.

Użyj binarnego systemu oceniania, aby ocenić odpowiedź rozszerzenia psis, oceniając odpowiedzi jako pozytywne lub negatywne. Ocena odpowiedzi B jako pozytywna. Gdy B extensus psis poza linię utworzoną przez połączenie końcówek otwartych żuchw uzyskuje pozytywną odpowiedź tylko wtedy, gdy B wysuwa swoje prob bois po pojawieniu się zapachu, ale przed przesunięciem zapachu wynik B jako negatywny, gdy nie ma przedłużenia prob Bois podczas próby, lub jeśli Pro Bois jest przedłużony po przesunięciu środka zapachowego, Można zbierać inne parametry, takie jak opóźnienie do rozszerzenia oraz liczba i łączny czas trwania odpowiedzi odpowiedzi rozszerzenia na warunek.

Bodziec nasilał się w kolejnych próbach kondycjonowania. Reakcje na nowe zapachy testowe, które różniły się od bodźca długością łańcucha węglowego i/lub położeniem węgla węglowego, były zmniejszone proporcjonalnie do stopnia różnicy między bodźcem warunkowym a nowym zapachem testowym. Dane te ilustrują zmienność i skuteczne warunkowanie między nowymi badaczami.

Odpowiedzi na ósemkę różniły się w zależności od grupy przeprowadzającej test. Podczas prób testowych zapach używany jako bodziec stanowy wywołał najsilniejszą reakcję. Gdy jako bodziec stanowy zastosowano oktal, reakcja była silniejsza podczas testów w porównaniu z cyklonem metylowym, nowym zapachem.

Podobnie, cyklon metylowy wywoływał silniejsze reakcje, gdy był używany jako bodziec warunkowy. Gdy zastosowano parowanie wsteczne, reakcja warunkowa została zredukowana do poziomu zbliżonego do poziomu nowego zapachu, co ilustruje znaczenie precyzyjnego czasu dla udanego kondycjonowania po jego opracowaniu. Technika ta utorowała drogę naukowcom w dziedzinie neurobiologii do zbadania neuronalnych podstaw uczenia się i pamięci oraz organizmów modelowych owadów, takich jak pszczoła miodna.

Nie zapominaj, że praca z owadami, zwłaszcza pszczołami miodnymi, może być niebezpieczna. Upewnij się, że nosisz odpowiedni sprzęt ochronny podczas pracy z tymi zwierzętami.