Name: Protokół odpowiedzi na wydłużenie trąby do badania plastyczności behawioralnej u owadów: zastosowanie do badań podstawowych, biomedycznych i rolniczych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 31 s
Description: Poznaj protokół PER do badania plastyczności behawioralnej u pszczół miodnych Apis mellifera. Ta metoda pozwala ocenić wpływ stresorów środowiskowych na zachowanie owadów w badaniach neurobiologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

To badanie było wspierane przez NIH NCRR (R01 RR014166 do BHS), NIH NIDCD (R01 DC011422 BHS co-PI), Departament Rolnictwa USA (J Trumble PI; BH Smith co-PI) i Uniwersytet Stanowy Arizony. Warsztaty szkoleniowe dla studentów (dane na rysunku 4) zostały sfinansowane przez chilijską fundację naukową.

<ol><li>Rescorla, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+studies+of+Pavlovian+conditioning%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Behavioral studies of Pavlovian conditioning.</a> Annu Rev Neurosci. 11, 329-352 (1988).</li>
<li>Martin, S. J., Grimwood, P. D., Morris, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+plasticity+and+memory%3A+an+evaluation+of+the+hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Synaptic plasticity and memory: an evaluation of the hypothesis.</a> Annu Rev Neurosci. 23, 649-711 (2000).</li>
<li>Bitterman, M. E., Menzel, R., Fietz, A., Schafer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classical+conditioning+of+proboscis+extension+in+honeybees+%28Apis+mellifera%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Psychology%22%5BJournal%5D)">Classical conditioning of proboscis extension in honeybees (Apis mellifera).</a> Journal of Comparative Psychology. 97, 107-119 (1983).</li>
<li>Giurfa, M., Sandoz, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invertebrate+learning+and+memory%3A+Fifty+years+of+olfactory+conditioning+of+the+proboscis+extension+response+in+honeybees%5BTitle%5D)+AND+%22Learn+Mem%22%5BJournal%5D)">Invertebrate learning and memory: Fifty years of olfactory conditioning of the proboscis extension response in honeybees.</a> Learn Mem. 19, 54-66 (2012).</li>
<li>Smith, B. H., Wright, G. A., Daly, K. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSmith%2C+BH+%22The+Biology+of+Floral+Scents%22">The Biology of Floral Scents</a>. Dudareva, N., Pichersky, E. , CRC Press. 263-295 (2006).</li>
<li>Menzel, R., Giurfa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dimensions+of+cognition+in+an+insect%2C+the+honeybee%5BTitle%5D)+AND+%22Behav+Cogn+Neurosci+Rev%22%5BJournal%5D)">Dimensions of cognition in an insect, the honeybee.</a> Behav Cogn Neurosci Rev. 5, 24-40 (2006).</li>
<li>Kuwabara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bildung+des+bedingten+Reflexes+von+Pavlovs+Typus+bei+der+Honigbiene%2C+Apis+mellifera%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Faculty+of+Science%2C+Hokkaido+University%2C+Zoology%22%5BJournal%5D)">Bildung des bedingten Reflexes von Pavlovs Typus bei der Honigbiene, Apis mellifera.</a> Journal of the Faculty of Science, Hokkaido University, Zoology. 13, 458-464 (1957).</li>
<li>Menzel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+honeybee+as+a+model+for+understanding+the+basis+of+cognition%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The honeybee as a model for understanding the basis of cognition.</a> Nat Rev Neurosci. 13, 758-768 (2012).</li>
<li>Menzel, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMenzel%2C+R+%22Neurobiology+of+comparative+cognition%22">Neurobiology of comparative cognition</a>. Kesner, R. P., Olton, D. S. , Lawrence Erlbaum. 237-292 (1990).</li>
<li>Hammer, M., Menzel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Learning+and+memory+in+the+honeybee%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Learning and memory in the honeybee.</a> Journal of Neuroscience. 15, 1617-1630 (1995).</li>
<li>Strube-Bloss, M. F., Nawrot, M. P., Menzel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mushroom+body+output+neurons+encode+odor-reward+associations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mushroom body output neurons encode odor-reward associations.</a> J Neurosci. 31, 3129-3140 (2011).</li>
<li>Szyszka, P., Galkin, A., Menzel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Associative+and+non-associative+plasticity+in+kenyon+cells+of+the+honeybee+mushroom+body%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Syst+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Associative and non-associative plasticity in kenyon cells of the honeybee mushroom body.</a> Front Syst Neurosci. 2, (2008).</li>
<li>Fernandez, P. C., Locatelli, F. F., Person-Rennell, N., Deleo, G., Smith, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Associative+conditioning+tunes+transient+dynamics+of+early+olfactory+processing%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Associative conditioning tunes transient dynamics of early olfactory processing.</a> J Neurosci. 29, 10191-10202 (2009).</li>
<li>Locatelli, F. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonassociative+plasticity+alters+competitive+interactions+among+mixture+components+in+early+olfactory+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Nonassociative plasticity alters competitive interactions among mixture components in early olfactory processing.</a> Eur J Neurosci. 37, 63-79 (2013).</li>
<li>Farooqui, T., Robinson, K., Vaessin, H., Smith, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+early+olfactory+processing+by+an+octopaminergic+reinforcement+pathway+in+the+honeybee%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Modulation of early olfactory processing by an octopaminergic reinforcement pathway in the honeybee.</a> Journal of Neuroscience. 23, 5370-5380 (2003).</li>
<li>Mussig, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+disruption+of+the+NMDA+receptor+subunit+NR1+in+the+honeybee+brain+selectively+impairs+memory+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Acute disruption of the NMDA receptor subunit NR1 in the honeybee brain selectively impairs memory formation.</a> J Neurosci. 30, 7817-7825 (2010).</li>
<li>Hladun, K. R., Smith, B. H., Mustard, J. A., Morton, R. R., Trumble, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selenium+toxicity+to+honey+bee+%28Apis+mellifera+L.%29+pollinators%3A+effects+on+behaviors+and+survival%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Selenium toxicity to honey bee (Apis mellifera L.) pollinators: effects on behaviors and survival.</a> PLoS One. 7, e34137(2012).</li>
<li>Wiegmann, D. D., Smith, B. H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWiegmann%2C+DD+%22International+Journal+of+Comparative+Psychology%22">International Journal of Comparative Psychology</a>. 22, 141-152 (2009).</li>
<li>Drezner-Levy, T., Shafir, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parameters+of+variable+reward+distributions+that+affect+risk+sensitivity+of+honey+bees%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Biol%22%5BJournal%5D)">Parameters of variable reward distributions that affect risk sensitivity of honey bees.</a> J Exp Biol. 210, 269-277 (2007).</li>
<li>Drezner-Levy, T., Smith, B. H., Shafir, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+foraging+specialization+on+various+learning+tasks+in+the+honey+bee+%28Apis+mellifera%29%5BTitle%5D)+AND+%22Behavioral+Ecology+%26+Sociobiology%22%5BJournal%5D)">The effect of foraging specialization on various learning tasks in the honey bee (Apis mellifera).</a> Behavioral Ecology & Sociobiology. 64, 135-148 (2009).</li>
<li>Shafir, S., Menda, G., Smith, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caste-specific+differences+in+risk+sensitivity+in+honeybees%2C+Apis+mellifera%5BTitle%5D)+AND+%22Animal+Behaviour%22%5BJournal%5D)">Caste-specific differences in risk sensitivity in honeybees, Apis mellifera.</a> Animal Behaviour. 69, 859-868 (2005).</li>
<li>Smith, B. H., Menzel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+analysis+of+variability+in+the+feeding+motor+program+of+the+honey+bee%3B+the+role+of+learning+in+releasing+a+modal+action+pattern%5BTitle%5D)+AND+%22Ethology%22%5BJournal%5D)">An analysis of variability in the feeding motor program of the honey bee; the role of learning in releasing a modal action pattern.</a> Ethology. 82, 68-81 (1989).</li>
<li>Erber, J., Pribbenow, B., Kisch, J., Faensen, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Operant+conditioning+of+antennal+muscle+activity+in+the+honey+bee+%28Apis+mellifera+L%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Physiology+A-Sensory+Neural+%26+Behavioral+Physiology%22%5BJournal%5D)">Operant conditioning of antennal muscle activity in the honey bee (Apis mellifera L).</a> Journal of Comparative Physiology A-Sensory Neural & Behavioral Physiology. 186, 557-565 (2000).</li>
<li>Smith, B. H., Menzel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+electromyogram+recordings+to+quantify+odorant+discrimination+in+the+honey+bee%2C+Apis+mellifera%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Physiology%22%5BJournal%5D)">The use of electromyogram recordings to quantify odorant discrimination in the honey bee, Apis mellifera.</a> Journal of Insect Physiology. 35, 369-375 (1989).</li>
<li>Stopfer, M., Bhagavan, S., Smith, B. H., Laurent, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+odour+discrimination+on+desynchronization+of+odour-encoding+neural+assemblies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Impaired odour discrimination on desynchronization of odour-encoding neural assemblies.</a> Nature. 390, 70-74 (1997).</li>
<li>Daly, K. C., Christensen, T. A., Lei, H., Smith, B. H., Hildebrand, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Learning+modulates+the+ensemble+representations+for+odors+in+primary+olfactory+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Learning modulates the ensemble representations for odors in primary olfactory networks.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 10476-10481 (2004).</li>
<li>Matsumoto, Y., Menzel, R., Sandoz, J. C., Giurfa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revisiting+olfactory+classical+conditioning+of+the+proboscis+extension+response+in+honey+bees%3A+a+step+toward+standardized+procedures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Revisiting olfactory classical conditioning of the proboscis extension response in honey bees: a step toward standardized procedures.</a> J Neurosci Methods. 211, 159-167 (2012).</li>
<li>Chandra, S. B., Hosler, J. S., Smith, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heritable+variation+for+latent+inhibition+and+its+correlation+with+reversal+learning+in+honeybees+%28Apis+mellifera%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Psychology%22%5BJournal%5D)">Heritable variation for latent inhibition and its correlation with reversal learning in honeybees (Apis mellifera).</a> Journal of Comparative Psychology. 114, 86-97 (2000).</li>
<li>Chandra, S. B., Hunt, G. J., Cobey, S., Smith, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+trait+loci+associated+with+reversal+learning+and+latent+inhibition+in+honeybees+%28Apis+mellifera%29%5BTitle%5D)+AND+%22Behavior+Genetics%22%5BJournal%5D)">Quantitative trait loci associated with reversal learning and latent inhibition in honeybees (Apis mellifera).</a> Behavior Genetics. 31, 275-285 (2001).</li>
<li>Hammer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neural+basis+of+associative+reward+learning+in+honeybees%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">The neural basis of associative reward learning in honeybees.</a> Trends in Neurosciences. 20, 245-252 (1997).</li>
<li>Frisch, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFrisch%2C+K+%22The+Dance+Language+and+Orientation+of+Bees%22">The Dance Language and Orientation of Bees</a>. , Harvard University Press. (1965).</li>
<li>Daly, K. C., Smith, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Associative+olfactory+learning+in+the+moth+Manduca+sexta%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Biol%22%5BJournal%5D)">Associative olfactory learning in the moth Manduca sexta.</a> J Exp Biol. 203, 2025-2038 (2000).</li>
<li>Fan, R. J., Anderson, P., Hansson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioural+analysis+of+olfactory+conditioning+in+the+moth+spodoptera+littoralis+%28Boisd.%29+%28Lepidoptera%3A+noctuidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Biol.+200%22%5BJournal%5D)">Behavioural analysis of olfactory conditioning in the moth spodoptera littoralis (Boisd.) (Lepidoptera: noctuidae).</a> J Exp Biol. 200. 23 (Pt 23), 2969-2976 (1997).</li>
<li>Paranjpe, P., Rodrigues, V., VijayRaghavan, K., Ramaswami, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gustatory+habituation+in+Drosophila+relies+on+rutabaga+%28adenylate+cyclase%29-dependent+plasticity+of+GABAergic+inhibitory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Learn+Mem%22%5BJournal%5D)">Gustatory habituation in Drosophila relies on rutabaga (adenylate cyclase)-dependent plasticity of GABAergic inhibitory neurons.</a> Learn Mem. 19, 627-635 (2012).</li>
<li>Vinauger, C., Lallement, H., Lazzari, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Learning+and+memory+in+Rhodnius+prolixus%3A+habituation+and+aversive+operant+conditioning+of+the+proboscis+extension+response%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Biol%22%5BJournal%5D)">Learning and memory in Rhodnius prolixus: habituation and aversive operant conditioning of the proboscis extension response.</a> J Exp Biol. 216, 892-900 (2013).</li>
<li>Smith, B. H., Abramson, C. I., Tobin, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+withholding+of+proboscis+extension+in+honeybees+%28Apis+mellifera%29+during+discriminative+punishment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Psychology%22%5BJournal%5D)">Conditional withholding of proboscis extension in honeybees (Apis mellifera) during discriminative punishment.</a> Journal of Comparative Psychology. 105, 345-356 (1991).</li>
<li>Smith, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+analysis+of+blocking+in+odorant+mixtures%3A+an+increase+but+not+a+decrease+in+intensity+of+reinforcement+produces+unblocking%5BTitle%5D)+AND+%22Behav+Neurosci%22%5BJournal%5D)">An analysis of blocking in odorant mixtures: an increase but not a decrease in intensity of reinforcement produces unblocking.</a> Behav Neurosci. 111, 57-69 (1997).</li>
<li>Gerber, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Honey+bees+transfer+olfactory+memories+established+during+flower+visits+to+a+proboscis+extension+paradigm+in+the+laboratory%5BTitle%5D)+AND+%22Animal+Behaviour%22%5BJournal%5D)">Honey bees transfer olfactory memories established during flower visits to a proboscis extension paradigm in the laboratory.</a> Animal Behaviour. 52, 1079-1085 (1996).</li>
<li>Rueppell, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetic+architecture+of+sucrose+responsiveness+in+the+honeybee+%28Apis+mellifera+L%29%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The genetic architecture of sucrose responsiveness in the honeybee (Apis mellifera L).</a> Genetics. 172, 243-251 (2006).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

W protokole tym przedstawiono dwie wiarygodne metody kondycjonowania przy użyciu procedury PER. Są to dwie z kilku metod, które zostały z powodzeniem zastosowane27,21. Stosujemy Metodę 2 we wszystkich badaniach eksperymentalnych z użyciem PER, ponieważ jest ona niezmiennie wiarygodna, nawet w przypadku różnych eksperymentatorów.
Ta sama podstawowa procedura została zaadaptowana do wielu różnych rodzajów badań z udziałem pszczół miodnych, w tym do wykorzystania różnych bodźców warunkowych i różnych odruchów behawioralnych. Powiązano to również z badaniami genetycznych podstaw różnic w uczeniu się28,29, fizjologicznych korelatów percepcji węchowej i pamięci w mózgu13,14,30 oraz modulacyjnych i molekularnych genetycznych podstaw zachowania15,16,31. Ze względu na zaawansowaną wiedzę na temat ekologicznego znaczenia uczenia się węchu dla pszczół miodnych, która rozpoczęła się wraz z pierwszymi badaniami Karla von Frischa ponad 100 lat temu31 , wyniki PER można łatwo powiązać z potrzebami przetrwania kolonii. Ostatnio został zaadaptowany do badań rolniczych w celu zbadania subletalnych skutków behawioralnych pestycydów i toksyn środowiskowych17.
Podstawowa procedura jest potężna, ponieważ może być stosowana do badania problemów również u innych gatunków. Dwa gatunki ciem, Manduca sexta i Spodoptera littoralis, zostały wykorzystane w badaniach PER w celu zbadania neuronalnych podstaw identyfikacji zapachów i zdolności uczenia się węchu każdego gatunku32,33. Eksperymenty PER z muszkami owocowymi dostarczyły wielu informacji na temat molekularnych kaskad sygnalizacyjnych zaangażowanych w chemosensację i uczenie się34. A PER został ostatnio wykorzystany do badania habituacji u pchły (Rhodnius prolixus)35, ważnego wektora choroby.
Ogólnie rzecz biorąc, procedura jest odporna na zmiany metody; Stosowanie różnych metod prawdopodobnie spowoduje taką samą względną różnicę między grupami leczenia. Pomimo stosunkowo prostej procedury, kilka problemów może czasami uniemożliwić pszczołom miodnym nauczenie się związku zapachu i sacharozy. Poniższe tematy zawierają możliwe zmiany w protokole i niektóre z najczęstszych problemów, które mogą wystąpić podczas kondycjonowania PER.
Rozważania dotyczące liczby i rodzaju prób w protokole kondycjonowania
Każdy protokół uczenia się będzie wymagał wystawienia pszczół na szereg prób w fazie pozyskiwania. Liczba ta zależy w dużej mierze od trudności zadania. Pszczoły miodne mogą nauczyć się prostego zadania po jednej próbie, ale potrzebują co najmniej trzech prób, aby wywołać tworzenie pamięci długotrwałej. Zgodnie z przewidywaniami, pszczoły miodne będą potrzebowały znacznie więcej prób, aby odpowiednio nauczyć się trudnego zadania. Ogólnie rzecz biorąc, istnieje maksymalna liczba prób, po przekroczeniu których pszczoły nie poprawiają już znacząco swojej wydajności. To maksimum zależy od konkretnego zadania, rodzajów i stężeń zapachu oraz stężenia sacharozy.
W przypadku korzystania z więcej niż jednego rodzaju próby z różnymi zapachami, przedstaw różne typy prób w sekwencji pseudolosowej, aby pszczoły nie zapamiętały prostej sekwencji prezentacji zapachów zamiast uczenia się różnic między zapachami36. W tych pseudolosowych sekwencjach musi być równa liczba prób dla każdego z typów zapachu. Ponadto prawdopodobieństwo, że próba jednego rodzaju zapachu jest poprzedzona i następuje po tym samym zapachu lub którymkolwiek z pozostałych zapachów, musi być równe dla wszystkich zapachów. Dla dwóch zapachów – A i B – użyj następującej sekwencji: ABBABAAB. W ośmiu próbach każdy zapach jest prezentowany czterokrotnie. Połącz identyczne sekwencje, aby osiągnąć pożądaną liczbę prób dla każdego zapachu.
Niezależnie od projektu eksperymentu, istnieje kilka parametrów, które muszą pozostać stałe, aby zoptymalizować uczenie się. Nakładanie się na siebie CS i USA ma kluczowe znaczenie dla skutecznego kondycjonowania. Interwał między próbami (Rysunek 1, Tabela 1) musi być stały i zoptymalizowany, ponieważ nieregularność lub zbyt krótki lub zbyt długi odstęp między próbami może znacząco wpłynąć na skuteczność protokołu kondycjonowania1.
Rozważania na temat znaczenia i projektowania prób testów behawioralnych
Użyteczne mogą być odpowiedzi zarejestrowane podczas "fazy akwizycji" eksperymentu, kiedy CS i US są prezentowane razem. Należy jednak pamiętać, że warunki prezentacji zapachu mogą się różnić w zależności od rodzaju próby. Podczas wzmocnionych prób zapach, po którym następuje sacharoza, jest prezentowany w połączeniu z bodźcem wizualnym (ruchem urządzenia do dostarczania kropelki sacharozy), który może wpływać na reakcję pszczoły. A pszczoły mają tylko trzy sekundy na pokazanie odpowiedzi (cztery sekundy stymulacji zapachem minus jedna sekunda nakładania się na prezentację sacharozy; Rysunek 1). Jeśli eksperyment polega na tym, że pszczoły uczą się rozróżniać dwa zapachy (np. wzmocniony i niewzmocniony), niewzmocniony zapach prezentowany w alternatywnych próbach występuje bez bodźca wizualnego w postaci prezentacji nagrody, a pszczoły mają pełne cztery sekundy na odpowiedź. W związku z tym reakcje na te dwa zapachy nie są w pełni porównywalne podczas akwizycji. W przypadku dowolnego protokołu kondycjonowania nie należy polegać wyłącznie na krzywych akwizycji1. Aby lepiej ustalić, czego nauczyły się pszczoły, wprowadź serię niewzmocnionych prób testowych, podczas których żaden zapach nie jest wzmacniany, co zapewnia, że testowanie wszystkich bodźców odbywa się w identycznych warunkach.
W zależności od konkretnego celu eksperymentu, testowanie może składać się z pojedynczych prób testowych kondycjonowanego zapachu lub serii prób z kondycjonowanym zapachem lub kombinacją kondycjonowanych i nowych zapachów. Pojedyncza próba testowa kondycjonowanego zapachu zapewnia prosty test, czy pszczoły pamiętają uwarunkowany zapach. Jednak odpowiedź na pierwszą próbę testową może odzwierciedlać poziom motywacji pszczół, a także ich przypomnienie sobie uwarunkowanego zapachu. Do oceny pamięci można również wykorzystać serię prób testowych, albo serię prób wygaszania uwarunkowanego zapachu, albo serię pojedynczych testów kondycjonowanego i jednego lub więcej nowych zapachów. Seria prób wymierania może ocenić, jak silnie pszczoły pamiętają uwarunkowane skojarzenie. Im silniejsze przypomnienie, tym większa liczba prób potrzebnych do wygaszenia uwarunkowanej reakcji. Seria pojedynczych testów kondycjonowanych i nowych zapachów może również ocenić specyficzność pamięci pszczół na temat uwarunkowanego zapachu.
Konieczne jest również kondycjonowanie i testowanie zarówno grupy kontrolnej, jak i leczonej w tych samych punktach czasowych. Porównywanie wydajności pszczół wkrótce po kondycjonowaniu z pszczołami trzymanymi przez dłuższy czas jest problematyczne ze względu na ekspozycję na sacharozę US poprzez karmienie pszczół do sytości. Na przykład spadek wydajności po długich przerwach może być spowodowany zanikiem pamięci lub może być spowodowany zmianami w stanie motywacji i/lub uczeniu się wywołanymi przez niewzmocnioną ekspozycję na USA, co sprawia, że wyniki są niejednoznaczne. W związku z tym wyniki grupy leczonej powinny być zawsze oceniane w stosunku do grupy kontrolnej kondycjonowanej i testowanej w tych samych punktach czasowych.
Stężenie i integralność zapachu
Istnieje kilka sposobów, w jakie stężenie i integralność zapachu (CS) mogą być zagrożone. Najczęstszym problemem związanym z dostarczaniem zapachów jest wyczerpanie wkładów zapachowych w wyniku nadmiernego zużycia (rysunek 2). Wymieniaj wkłady 10-12 razy (co 2 lub 3 próby z grupami 5 pszczół miodnych), aby uniknąć tej pułapki. Bardzo ważne jest również stosowanie świeżych wkładów do prób testowych, ponieważ zużyte wkłady mogą być różnie wyczerpane, a tym samym wykazywać nierównomierne bodźce zapachowe. Innym częstym problemem jest zanieczyszczenie wkładu zapachowego spowodowane używaniem wkładu do więcej niż jednego zapachu bez jego całkowitego oczyszczenia. Brudny lub zanieczyszczony przepływ powietrza może również nieumyślnie wprowadzić dodatkowy bodziec węchowy (filtry z węglem aktywnym mogą zapobiegać zanieczyszczeniu tła). Jest to szczególnie problematyczne w przypadku sprzężenia kondycjonowania PER z pomiarami fizjologicznych reakcji na zapach. Nieszczelne wkłady zapachowe stanowią problem, ponieważ pszczoły miodne są narażone na zapach przed rozpoczęciem próby, co zmniejsza znaczenie bodźca zapachowego. Luźne mocowanie na dopływie powietrza do dostarczania zapachu może skutkować niewielkim lub zerowym dostarczaniem zapachu po otwarciu zaworu, sztucznie zmniejszając reakcję pszczół na zamierzony zapach.
Roztwór sacharozy i bezwarunkowy bodziec (nagroda)
Ilość, stężenie i integralność roztworu sacharozy użytego w USA mają kluczowe znaczenie dla powodzenia eksperymentu. Kondycjonowanie jest funkcją ilości i stężenia roztworu sacharozy i wody użytego jako US37. Strzykawki mikrometryczne stosowane w Metodzie 2 pozwalają na bardzo precyzyjną (do 0,2 μl) kontrolę podawania w USA i zalecamy ich stosowanie w obu opisanych metodach. Użycie wykałaczek (metoda 1) jest odpowiednie w okolicznościach, w których drogie strzykawki nie mogą być użyte, takich jak szkolenie dużych grup studentów, praca w terenie lub przy niższych budżetach. Staranne wdrożenie Metody 1 jest w porządku, o ile dotrzymany jest czas z regularną wymianą wykałaczek, aby uniknąć gromadzenia się sacharozy (i dostarczonego stężenia). Jednak przy użyciu wykałaczek trudniej jest dokładnie kontrolować i oszacować ilość i wielkość dostarczonego roztworu amerykańskiego, co jest ważne dla badań kondycjonujących1. Stężenie sacharozy potrzebne do zapewnienia wystarczającej nagrody, aby utrzymać motywację pszczół do nauki uwarunkowanego skojarzenia, może zależeć od trudności zadania i wewnętrznego stanu pszczół lub pory roku. Trudniejsze zadania wymagają wyższego roztworu sacharozy, aby pszczoły mogły skutecznie nauczyć się tego zadania. Pleśń może gromadzić się w roztworach sacharozy nawet w temperaturze 5 °C, co zagrozi integralności roztworu, wpływając na zdrowie pszczół i postrzeganie nagrody podczas eksperymentu. Najlepiej wymieniać roztwór co kilka dni.
Precyzja, czas i spójność dostaw CS i USA
Najbardziej krytyczną kwestią dotyczącą prawidłowego wdrożenia procedury PER lub jakiejkolwiek procedury kondycjonowania jest precyzja, czas i spójność dostarczania CS i US (rysunek 1). Badacze, którzy są nowicjuszami w procedurze, często nie są precyzyjni w dostarczaniu jednego lub obu bodźców. ISI, które nie pozwalają na nakładanie się CS i USA, skutkują słabą wydajnością kondycjonowania. Sterownik PLC automatyzuje sygnał dźwiękowy dla eksperymentatora, aby dostarczyć sacharozę 3 sekundy po rozpoczęciu dostarczania zapachu. Badacze powinni trzymać kropelkę sacharozy/wody blisko pszczoły w celu szybkiego dostarczenia po sygnale. Procedury te pomagają w uzyskaniu spójnego ISI. Umieszczenie stopera przy arenie kondycyjnej pozwala na wygodne umiejscowienie próby w czasie, a także monitorowanie czasu przebywania pszczół na arenie zarówno przed, jak i po dostarczeniu bodźców. W ten sposób ZIT mogą być względnie spójne, a cała procedura może być prowadzona w kontrolowanym tempie. Zbyt krótkie lub zbyt długie ITI, na przykład krótsze niż 1 minuta, lub zbyt długie, mogą prowadzić do słabej wydajności kondycjonowania1.
Sezonowy, środowiskowy i kontekstowy wpływ na wydajność pszczół miodnych
Na wydajność pszczół miodnych może mieć znaczący wpływ otoczenie zarówno przed, jak i w trakcie kondycjonowania. Często wahania temperatury i dostępności pożywienia, które pojawiają się wraz ze zmieniającymi się porami roku, zmieniają motywację pszczół do nauki. Kiedy kwitną kwiaty, motywacja pszczół do uczenia się uwarunkowanych skojarzeń w laboratorium spada38. Kiedy kolonia jest zestresowana – z powodu ekstremalnych temperatur, niedoborów pożywienia lub stresu związanego z chorobą – pszczoły wykazują zmniejszenie zdolności uczenia się w środku. Pszczoły miodne trzymane w pomieszczeniu do lotów mogą dobrze się uczyć przez jakiś czas, ale również tam stres związany z chorobami i starzeniem się pogarsza ich zdolność uczenia się z czasem. Kontekst podczas kondycjonowania może również zmniejszyć wydajność pszczół. Wszelkie obce zapachy, ruch i inne bodźce mogą odciągnąć pszczołę od bodźców eksperymentalnych. Aby uniknąć tego problemu, utrzymuj w miarę spójny, uproszczony kontekst wizualny.
Genotyp i doświadczenie wpływają na wydajność PER
Robotnice pszczół miodnych mogą znacznie różnić się wydajnością w dowolnej procedurze kondycjonowania ze względu na specjalizację zadania, genotyp lub inne czynniki środowiskowe20. Dlatego ważne jest, aby w jak największym stopniu ujednolicić rodzaje zwierząt wykorzystywanych w eksperymencie w celu zmniejszenia zmienności międzyosobniczej. W kolonii prowadzonej przez królową krytą w otwartym stanie, co oznacza, że kojarzyła się z wieloma różnymi trutniami, robotnice będą się różnić genotypem ojcowskim. Podłoże genetyczne może prowadzić do dramatycznych różnic w reagowaniu sensorycznym39 i zdolnościach uczenia się29. Wykorzystanie kolonii prowadzonych przez królowe instrumentalnie zapłodnione plemnikami pojedynczych trutni28 zmniejsza tę zmienność międzyosobniczą.
Opisane powyżej protokoły obejmują metodę zbierania robotnic pszczół miodnych z wejścia do gniazda. Jednak te pszczoły miodne różnią się od siebie wiekiem lub zadaniem behawioralnym. Mogą to być młodzi (niedoświadczeni) lub starsi (bardziej doświadczeni) zbieracze. Mogą to być młode pszczoły miodne wykonujące swoje pierwsze loty orientacyjne. Mogą też być pszczołami stróżującymi. Aby zmniejszyć zmienność, oznacz pszczoły szybkoschnącą farbą emaliowaną lub znacznikami, gdy wyłaniają się jako dorosłe osobniki (w celu kontroli wieku) i/lub gdy zaczynają żerować (w celu kontroli doświadczenia). Następnie, kilka dni później, zbierz oznaczone pszczoły w celu kondycjonowania. Robotnice, które są zaangażowane w zachowania pielęgnacyjne, można zebrać z ramek w ulu. Pielęgniarki można pozytywnie zidentyfikować, gdy wkładają głowy do komórki czerwiowej, aby karmić i opiekować się larwą w środku.
Używanie Virgin Queens lub dronów do kondycjonowania PER
Oprócz robotnic pszczół miodnych, dziewicze królowe pszczół miodnych i trutnie mogą być łatwo kondycjonowane w procedurze PER do badań mających na celu opracowanie linii genetycznych pszczół miodnych, które różnią się wydajnością uczenia się28. Dziewicze królowe powinny być zbierane wkrótce po wyjściu z przepoczwarzenia i umieszczane bezpośrednio w uprzęży krępujących bez znieczulenia. Młode, niedojrzałe trutnie zebrane z grzebienia czerwiu wewnątrz kolonii na ogół nie są zmotywowane do nauki. Po rozpoczęciu lotów godowych drony łatwo uczą się zadań PER28. Powinny być zbierane po powrocie z lotu godowego i trzymane przez noc w małej klatce w kolonii używanej do odchowu królowych. Nie próbuj ich zaparzyć dzień przed kondycjonowaniem; Nie przetrwają dobrze w uprzężach z dnia na dzień. Na kilka godzin przed kondycjonowaniem drony można wyjąć z klatek i umieścić w uprzężach krępujących bez znieczulenia.
Wnioski
Ta procedura PER, pod względem metod, stanowi punkt wyjścia do projektowania eksperymentów PER. Większość protokołów PER będzie wymagała, aby opisana procedura została w jakiś sposób zmieniona, aby wdrożyć konkretne cele eksperymentu i uwzględnić wiele grup leczenia. Jest łatwy do wdrożenia. Prawidłowa implementacja wymaga jednak dbałości o szczegóły i praktyki. Po opanowaniu może to być potężna procedura, którą można dodać jako narzędzie badawcze dla kilku podstawowych i stosowanych programów badawczych z różnymi gatunkami owadów.

Wiele owadów dowiaduje się o bodźcach istotnych z ekologicznego punktu widzenia, a następnie zmieniają swoje reakcje behawioralne na te bodźce, aby dostosować się do nowych relacji predykcyjnych w swoim otoczeniu. U podstaw tej plastyczności behawioralnej może leżeć kilka różnych mechanizmów (np. nieasocjacyjny, asocjacyjny/Pawłowski i instrumentalny/instrumentalny1). Te rodzaje plastyczności różnią się tym, jak bodźce lub zachowania są związane z ważnymi wydarzeniami, takimi jak pojawienie się jedzenia, partnera lub niebezpieczeństwa. Zrozumienie tych form plastyczności jest bardzo ważne dla podstawowych badań nad tym, jak zmienia się układ nerwowy, aby kodowaćnowe wspomnienia. Jest to również ważne dla zrozumienia zachowań adaptacyjnych owadów, które są ważnymi wektorami chorób (np. tse-tse i komary) oraz owadów, które są ważne rolniczo, zarówno w produkcji roślinnej (pszczoły miodne), jak i jako szkodniki.
Badanie plastyczności behawioralnej u dowolnego zwierzęcia wymaga poziomu eksperymentalnej kontroli nad wieloma zmiennymi, który nie jest osiągalny w dziedzinie1. Wymaga to opracowania solidnego protokołu warunkowania, który może być stosowany w bardziej kontrolowanych warunkach, ale który jest nadal istotny dla zachowania w warunkach naturalnych. Pszczoła miodna (Apis mellifera) jest doskonałym modelem do opracowania protokołu wykonywania kontrolowanych analiz plastyczności behawioralnej3,4. Reakcja na wydłużenie trąbki (PER) u pszczół miodnych jest naturalnym odruchem behawioralnym, w którym pszczoła miodna rozciąga trąbkę w odpowiedzi na stymulację czułkową roztworem cukru. Podczas normalnych zachowań związanych z żerowaniem PER występuje, gdy pszczoła miodna znajdzie nektar w kwiatku. Na szczęście pszczoły miodne z łatwością wykażą to proste i łatwe do zmierzenia zachowanie w laboratorium. Umożliwia to badanie, w kontrolowanych warunkach, mechanizmów, które wpływają na to ekologicznie istotne zachowanie5. PER może być również stosowany w ramach protokołu warunkowania do badania percepcji bodźców oraz uczenia się i pamięci w różnych warunkach leczenia, które mają na celu ujawnienie mechanizmów behawioralnych i neuronalnych, które leżą u podstaw plastyczności6.
Od pierwszych badań Kuwabara7, warunkowanie PER jest szeroko stosowane do ujawniania mechanizmów nieasocjacyjnych, asocjacyjnych i instrumentalnych, które leżą u podstaw plastyczności behawioralnej u pszczółmiodnych 8. Mechanizmy te są identyczne do tych ujawnionych w badaniach swobodnie latających pszczół miodnych9. W przeciwieństwie do badań swobodnie latających pszczół miodnych, protokoły kondycjonowania PER można połączyć z elektrofizjologią10,11 lub obrazowaniem fluorescencyjnym żywych komórek12-14 mózgu. Ponadto protokoły PER pozwalają na eksperymentalną manipulację szlakami neuronalnymi za pomocą leczenia farmakologicznego lub genetyki molekularnej w celu przetestowania hipotez dotyczących ról określonych składników sieci, takich jak neuromodulatory15,16. Protokoły PER dostarczyły również ważnego sposobu oceny subletalnego wpływu warunków środowiskowych, a także toksyn na zdrowie i efektywność żerowania pszczół miodnych17.
Ta procedura opisuje dwie metody dostarczania zapachu równolegle. Metoda 1 to wersja dostarczania zapachu i bezwarunkowego bodźca (sacharozy), która zapewnia niedrogą i technicznie prostą metodę prezentacji zapachu i nagrody w postaci sacharozy. Ta metoda jest dobra do szkolenia podstawowego i gdy automatyzacja nie jest możliwa. Jest to doskonały sposób na wprowadzenie tej techniki do klasy lub laboratorium dydaktycznego. Podczas kondycjonowania do eksperymentów obejmujących trudniejsze zadania i sprzężone fizjologiczne oceny percepcji zapachu, uczenia się lub pamięci, bardzo ważne jest dokładne i precyzyjne regulowanie początku, czasu dostarczania bodźców. Aby zapewnić najbardziej niezawodne dostarczanie bodźców, użyj środków automatyzacji dostarczania zapachów i precyzyjnej metody dostarczania nagrody. Metoda 2 wykorzystuje automatyczne dostarczanie zapachu i bardziej precyzyjne dostarczanie sacharozy. Jest technicznie bardziej wyrafinowana i wymaga więcej do początkowej konfiguracji niż metoda 1, ale znacznie zwiększa spójność czasu i ilości bodźców używanych do warunkowania i powinna być stosowana, gdy tylko jest to możliwe.

<table><tbody><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9378-1KG</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Związki zapachowe (na przykład)&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;1-heksanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>471402-100ML</td><td>W celu uzyskania dodatkowych przykładów</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;2-oktanon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W280208-800G-K</td><td>odpachów, zobacz dowolny z</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;heptanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>51778-5ML</td><td>prace dotyczące węchu</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;geraniol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>163333-25G</td><td>przetwarzanie z</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;nonanal</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>131210-100ML</td><td>Laboratorium Smitha.</td></tr><tr><td>Heksan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>296090-1L</td><td></td></tr><tr><td>Ciężki olej mineralny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>330760-1L</td><td>Upewnij się, że&amp;rsquo;bezwonny.</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>459836-1L</td><td></td></tr><tr><td>Fiolki scyntylacyjne</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z190535-1PAK</td><td>Za pomocą małego wiertła należy wywiercić niewielki otwór w zakrętce probówek.</td></tr><tr><td>Uprząż dla pszczół</td><td></td><td></td><td>Wykonane na zamówienie z plastikowych słomek do napojów o średnicy 0,9 cm lub z twardych rurek plastikowych/metalowych.</td></tr><tr><td>Taśma naprawcza (duct tape)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z188956-1PAK</td><td></td></tr><tr><td>Butelki zmywaki</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z560847-3EA</td><td>Dla 70% etanolu.</td></tr><tr><td>Przewody suszarki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;WYŁĄCZNIE DLA METODY 1&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>jednorazowe plastikowe strzykawki o pojemności 20 ml</td><td>Cole-Parmer</td><td>WU-07945-18</td><td></td></tr><tr><td>wycinki papieru filtracyjnego o średnicy 15 mm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z274844-1PAK</td><td></td></tr><tr><td>Szpinki pushpin</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wykałaczki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;WYŁĄCZNIE DLA METODY 2&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Strzykawka mikrometryczna Gilmont, 0,2 ml</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-07840-00</td><td></td></tr><tr><td>końcówka mikrometrycznej strzykawki Gilmont</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-07841-00</td><td></td></tr><tr><td>26 G 3/8&amp;rdquo; igły hipodermiczne z złączem Luer</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-826-10</td><td></td></tr><tr><td>strzykawki tuberkulinowe 1 ml (plastikowe/szklane)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z181641-1EA LUB Z192090-200EA</td><td>Dostępne są szklane strzykawki tuberkulinowe, jednak strzykawki plastikowe są znacznie tańsze i sprawdzą się przy ograniczonej liczbie zastosowań.</td></tr><tr><td>Małe ograniczniki gumowe/silikonowe</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-95702-02</td><td>Wykonane z rurek silikonowych o średnicy zewnętrznej 4,8 mm lub z gumowych końcówek tłoków strzykawki o pojemności 1 cc.</td></tr><tr><td colspan="4">[nagłówek]</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7793-1EA</td><td></td></tr><tr><td>papier filtracyjny 75 x 100 mm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z695106-500EA</td><td></td></tr><tr><td>Programowalny Sterownik Logiczny Direct Logic 05</td><td><a href="http://www.koyoele.co.jp/english/product/plc/index.html" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Koyo Electronics Industries Co, Ltd</a></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 mm, 4 mm, &amp;amp; przewód z PVC lub silikonu o średnicy wewnętrznej 6 mm</td><td>Cole-Parmer</td><td>Różnorodne</td><td>Firma Cole-Parmer oferuje szeroki wybór odpowiednich przewodów.</td></tr><tr><td>Złączki polipropylenowe &amp;amp; złączki Luer</td><td>Cole-Parmer</td><td>Różne</td><td>Firma Cole-Parmer oferuje szeroki wybór złączy i kształtek do wielu rozmiarów rurek.</td></tr><tr><td>Korelowany przepływomierz 65 mm</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-03216-08</td><td>Aluminium z szklanym pływakiem; do cieczy i gazów, z zaworem.</td></tr><tr><td colspan="4">lub</td></tr><tr><td>Pompa napowietrzająca do akwarium Tetra Whisper 300 (Tetratek DW96-2)</td><td><a href="http://www.aquacave.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Aquacave</a></td><td>AE-TETRA-300</td><td></td></tr><tr><td>Elektrozawory z serii LIF do rurek o średnicy wewnętrznej 0,042", konfiguracja „E”</td><td><a href="http://www.theleeco.com/LEEWEB2.NSF" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> The Lee Company</a></td><td>LFAA1200118H</td><td>neopren, stal nierdzewna 430, stal nierdzewna 302, 280 mW</td></tr><tr><td>Buzzer piezoelektryczny 12 V DC 70 dB na płytkę PCB</td><td><a href="http://www.radioshack.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> RadioShack</a></td><td>273-074</td><td></td></tr></tbody></table>

protokół odpowiedzi na wydłużenie trąby do badania plastyczności behawioralnej u owadów: zastosowanie do badań podstawowych, biomedycznych i rolniczych

A Proboscis Extension Response Protocol for Investigating Behavioral Plasticity in Insects: Application to Basic, Biomedical, and Agricultural Research

Owady modyfikują swoje reakcje na bodźce poprzez doświadczenie kojarzenia tych bodźców z wydarzeniami ważnymi dla przetrwania (np. jedzenie, partnerzy, zagrożenia). Istnieje kilka mechanizmów behawioralnych, dzięki którym owad uczy się istotnych skojarzeń i wiąże je z tymi wydarzeniami. Ważne jest, aby zrozumieć tę plastyczność behawioralną dla programów mających na celu pomoc owadom, które są korzystne dla rolnictwa. Wiedza ta może być również wykorzystana do odkrywania rozwiązań problemów biomedycznych i rolniczych tworzonych przez owady, które działają jako wektory chorób i szkodniki. Protokół kondycjonowania Proboscis Extension Response (PER) został opracowany dla pszczół miodnych (Apis mellifera) ponad 50 lat temu w celu zbadania, w jaki sposób postrzegają i uczą się o zapachach kwiatowych, które sygnalizują zasoby nektaru i pyłku, których kolonia potrzebuje do przetrwania. Procedura PER zapewnia solidne i łatwe do zastosowania ramy do badania kilku różnych ekologicznie istotnych mechanizmów plastyczności behawioralnej. Można go łatwo przystosować do użytku z kilkoma innymi gatunkami owadów i innymi odruchami behawioralnymi. Protokoły te mogą być łatwo stosowane w połączeniu z różnymi środkami do monitorowania aktywności neuronalnej w OUN za pomocą elektrofizjologii lub bioobrazowania lub do manipulowania docelowymi szlakami neuromodulacyjnymi. Jest to solidny test do szybkiego wykrywania subletalnych skutków dla zachowania spowodowanych stresorami środowiskowymi, toksynami lub pestycydami.
Pokazujemy, jak prosty jest protokół PER do wdrożenia przy użyciu dwóch procedur. Jeden z nich nadaje się jako ćwiczenie laboratoryjne dla studentów lub do szybkich testów efektu eksperymentalnego leczenia. Drugi zapewnia dokładniejszą kontrolę zmiennych, co jest ważne dla badań nad warunkowaniem behawioralnym. Pokazujemy, w jaki sposób do testowania hipotez można wykorzystać kilka miar odpowiedzi behawioralnej, od binarnego tak/nie do bardziej ciągłych zmiennych, takich jak opóźnienie i czas trwania przedłużenia trąbki. Omawiamy też niektóre pułapki, na które często napotykają badacze, gdy korzystają z tej procedury po raz pierwszy.

Przedstawiamy dwa przykłady zastosowania opisanych powyżej protokołów PER. W pierwszym przykładzie wykorzystano Metodę 2 do zbadania, w jaki sposób pszczoły miodne postrzegają różne zapachy w zależności od podobieństwa molekularnego do zapachu użytego jako CS5,24,25. Drugi przykład ilustruje zastosowanie Metody 1 oraz niektóre środki ostrożności, które należy podjąć przy rozpoczynaniu eksperymentów z warunkowaniem PER w laboratorium badawczym.
Badania tego typu były wykorzystywane do opisu węchowej „przestrzeni percepcyjnej” pszczół miodnych i ciem w połączeniu z obrazowaniem biologicznym13 lub analizami elektrofizjologicznymi26. Pszczoły miodne (n = 20) poddano warunkowaniu w celu skojarzenia substancji zapachowej, jaką jest decanal, z wzmocnieniem w postaci sacharozy w ciągu 12 prób warunkowania z parowaniem w przód (Ryc. 3A). Około 10% pszczół miodnych zareagowało „spontanicznie” w pierwszej próbie, co jest zjawiskiem normalnym. Następnie odsetek osobników reagujących wzrastał w kolejnych próbach, aż do osiągnięcia 100% odpowiedzi w piątej próbie i w każdej kolejnej. Kilka badań wykazało, że ten wzrost odpowiedzi jest specyficzny dla warunku parowania w przód (Ryc. 1) w stosunku do kilku istotnych procedur kontrolnych3. Po fazie nabywania, każdą pszczołę miodną poddano serii niezwzmocnionych prób testowych (Ryc. 3B), które polegały na ekspozycji na zapach CS oraz na kilka innych substancji zapachowych, które systematycznie różniły się strukturą cząsteczkową od CS. Pszczoły miodne najsilniej reagowały na CS. Ich reakcje na inne substancje zapachowe malały w funkcji systematycznych zmian w strukturze, przy czym najniższe reakcje odnotowano w przypadku substancji zapachowych najmniej podobnych do CS.
Na Rysunku 4 przedstawiono wyniki niedawnych warsztatów, podczas których studenci po raz pierwszy uczyli się, jak warunkować pszczoły miodne przy użyciu Metody 1. Studenci w pierwszej kolejności warunkowali pszczoły miodne poprzez parowanie progresywne metyloheksanonu (MCH) lub oktanolu (OCT) z wzmocnieniem w postaci sacharozy (Rysunek 4A). Procent odpowiedzi był niższy w pierwszej próbie i wzrastał w kolejnych próbach, co wskazuje na to, że pszczoły nauczyły się związku między zapachem a sacharozą. Wystąpiły różnice w stopniu, w jakim pszczoły nauczyły się warunkowanego związku w różnych grupach studentów. W naszym doświadczeniu tego rodzaju różnice mogą wynikać z zapachu użytego jako CS, z nieprecyzyjnych elementów metody (Metoda 1) lub z poziomu przeszkolenia eksperymentatorów. W tym ostatnim przypadku wyniki szybko stają się bardziej spójne wraz ze wzrostem doświadczenia eksperymentatorów. Po warunkowaniu każda pszczoła miodna była testowana dwukrotnie z każdym z zapachów. W grupach pszczół miodnych, które zostały poddane warunkowaniu poprzez parowanie progresywne OCT lub MCH, reakcja była, zgodnie z oczekiwaniami, najsilniejsza w odpowiedzi na zapach warunkowany (Rysunek 4B).
Druga grupa pszczół miodnych, u której zastosowano parowanie w przód (forward pairing) z OCT, była warunkowana równolegle z inną grupą, w której zapach OCT był parowany w tył (backward pairing) z sacharozą. Parowanie w tył jest jednym z kilku rodzajów procedur kontrolnych służących do wykazania, że wzrost reakcji jest specyficzny dla parowania w przód, a nie wynika z innego procesu, takiego jak niespecyficzne pobudzenie wynikające z sensytyzacji. W przypadku parowania w tył bodziec bezwarunkowy (US) w postaci sacharozy oraz bodziec warunkowy (CS) w postaci zapachu są prezentowane w kolejności odwrotnej do tej, która została przedstawiona na Rysunku 1. Dane dotyczące nabywania odruchu w parowaniu w tył nie zostały przedstawione, ponieważ nie można ocenić reakcji warunkowej (CR), biorąc pod uwagę prezentację zapachu CS po prezentacji sacharozy. Zgodnie z przewidywaniami dla warunkowania asocjacyjnego, poziomy odpowiedzi na OCT były wyższe w grupie z parowaniem w przód w porównaniu z grupą z parowaniem w tył (Rysunek 4C).
<img alt="Schemat warunkowania pawłowowskiego, oś czasu prób, odstępy CS/US, proces odpowiedzi behawioralnej." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51057/51057fig1highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Schematy projektu eksperymentalnego dla warunkowania z wykorzystaniem parowania w przód. Definicje terminów użytych na tym rysunku znajdują się w Tabeli 1. (A) CS (zapach) poprzedza i nakłada się na US (roztwór sacharozy/wody). Przedstawiona relacja między CS a US jest optymalna dla warunkowania pszczół miodnych i ciem. Jednak optymalny ISI może zależeć od protokołu warunkowania oraz gatunku zwierzęcia1. (B) Podział i wzglósety czasowe CS, CR, US oraz UR. CR, która występuje przed prezentacją US lub podczas niezwierciadłowanych prób „testowych”, stanowi zmienną zależną w protokołach eksperymentalnych.
<img alt="Wykres porównujący wyniki prób z użyciem oleju mineralnego i heksanu w różnych warunkach, z markerami istotności." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51057/51057fig2highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Wyczerpywanie się zapachu przy wielokrotnym użyciu wkładów. Do uzyskania tych danych wkłady zapachowe przygotowano z heksanolem zgodnie z opisem w tekście. Heksanol jest powszechnie stosowany jako CS w badaniach PER; jednak rzeczywiste tempo wyczerpywania zależy od rodzaju zapachu i rozpuszczalnika. Wkłady były następnie używane jednokrotnie przez 4 sec w każdej minucie przez 8 prób (zakładając 5 pszczół miodnych/próbę w standardowym eksperymencie, co odpowiadałoby 40 użyciom). Rozcieńczenia w wskazanym rozpuszczalniku, które są stosunkowo standardowe dla eksperymentów PER, wynosiły 2.0 M (A) oraz 0.2 M (B). (A, B) Próbki zapachu pobrano po pierwszej i ósmej próbie poprzez adsorpcję na włóknie do mikroekstrakcji w fazie stałej (SPME), a następnie desorbowały je w chromatografie gazowym. Względne powierzchnie pod pikami były wyższe po pierwszej próbie w porównaniu do ósmej dla obu rozpuszczalników i obu stężeń (test znaków rang Wilcoxona p &lt; 0.05 [*] lub więcej), co wskazuje, że z wkładu uwalniano mniej zapachu po wielokrotnym jego użyciu. (C, D) Te same dane przedstawiające wyłącznie ósmą próbę z powiększoną osią y. Wykazują one, że wyczerpywanie było nieco większe dla heksanu w porównaniu do oleju mineralnego, ale tylko przy niższym stężeniu.
<img alt="Wykres A: Krzywa przyswajania uczenia się wyrażona jako procent odpowiedzi. Wykres B: Porównanie odpowiedzi na zapach testowy." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51057/51057fig3highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Przyswajanie i test z wykorzystaniem decanalu jako CS oraz metody 2 warunkowania. (A) Odpowiedź (CR) w kolejnych próbach podczas 12 prób parowania bezpośredniego (Rycina 1). Dane pochodzą od n = 20 pszczół miodnych warunkowanych w czterech grupach po 5 osobników w każdej. ISI wynosiło 3 sec, a ITI 6 min. (B) Testy bez wzmocnienia z użyciem zapachów różniących się od decanalu długością łańcucha węglowego i/lub pozycją węgla karbonylowego. Zapachy prezentowano w zrandomizowanej serii we wszystkich czterech grupach, przeplatając je próbami wzmocnionymi decanalem (co dwie do trzech prób), aby uniknąć wygaszenia CR.
<img alt="Wykresy krzywych uczenia się pokazujące procent odpowiedzi dla MCH, OCT Gp1 oraz Gp2 w kolejnych próbach." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51057/51057fig4highres.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Dane z warsztatów, podczas których studenci studiów magisterskich i doktoranckich byli szkoleni w warunkowaniu pszczół miodnych z wykorzystaniem metody PER 1. (A) Dane z procesu nabywania odruchu w trzech grupach pszczół miodnych warunkowanych oktanolem (n = 23 i 15 odpowiednio dla Gp 1 i 2) oraz metylocykloheksanonem (n = 10). (B) Odruchy warunkowe (CR) podczas testów bez wzmocnienia z obydwoma zapachami; cztery próby przedstawione w losowych seriach w poszczególnych grupach. (C) Testy bez wzmocnienia z obydwoma zapachami w dwóch grupach pszczół miodnych, jednej z parowaniem w przód (Gp 1, n = 23) i jednej z parowaniem w tył (n = 25).
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Termin (skrót)</td>
			<td>Definicja</td>
			<td>Istotny przykład</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bodziec warunkowy (CS)</td>
			<td>Bodziec, który początkowo wywołuje niewielką lub żadną reakcję i sygnalizuje wystąpienie US</td>
			<td>ZAPACH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reakcja warunkowa (CR)a</td>
			<td>Reakcja na CS po skojarzeniu go z US</td>
			<td>WYCIĄGNIĘCIE TRĄBKOWATEGO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bodziec bezwarunkowy (US)</td>
			<td>Biologicznie istotny bodziec, który wywołuje reakcję</td>
			<td>ROZTWÓR SAKROZY/WODY</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reakcja bezwarunkowa (UR)a</td>
			<td>Reakcja na US</td>
			<td>WYCIĄGNIĘCIE TRĄBKOWATEGO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interwał międzybodźcowy (ISI)</td>
			<td>Czas między wystąpieniem CS a wystąpieniem US</td>
			<td>Interwał od ZAPACHU do SAKROZY</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Interwał międzypróbny (ITI)</td>
			<td>Czas między kolejnymi parami CS-US dla jednego zwierzęcia</td>
			<td>Interwał od ZAPACHU (próba n) do ZAPACHU (próba n+1)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1. Ważna terminologia. Ilustrację tych terminów przedstawiono na Rysunku 1. aW przypadku warunkowania PER reakcja warunkowa (CR) i reakcja bezwarunkowa (UR) są takie same, choć w przypadku innych rodzajów skojarzeń i odruchów CR i UR mogą się od siebie różnić.
<a href="/files/ftp_upload/51057/BEE_4.avi" target="_blank">Film 1.</a> Nagranie wideo przedstawiające pszczołę miodną wykazującą PER po uwarunkowaniu odpowiedzią na zapach. Należy zwrócić uwagę na reakcję PER pszczoły około 1,5 sec po pojawieniu się zapachu. Oprogramowanie do śledzenia zmapowało ruchy czułków w odpowiedzi na prezentację zapachu. Linie wykreślone w prawym górnym rogu wideo przedstawiają rzeczywiste ruchy czułków. Dwa wykresy na dole ekranu pokazują ruchy czułków w osiach X (lewa) i Y (prawa). Linie pionowe na wykresie pokazanym w wideo wskazują, od lewej do prawej: włączenie światła (light ON), PER, wyłączenie światła (light off) oraz cofnięcie trąbki.

Protokół warunkowania Proboscis Extension Response (PER), opracowany dla pszczół miodnych (Apis mellifera), dostarcza ekologicznie istotnych i łatwo mierzalnych środków do badania kilku różnych mechanizmów uczenia się u wielu gatunków owadów.

Protokół odpowiedzi na wydłużenie trąby do badania plastyczności behawioralnej u owadów: zastosowanie do badań podstawowych, biomedycznych i rolniczych

Insects modify their responses to stimuli through experience of associating those stimuli with events important for survival (e.g., food, mates, threats). ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przedstawienie sposobu wdrażania warunkowania behawioralnego prostej reakcji odruchowej na pokarm u pszczół miodnych. Osiąga się to poprzez uprzednie odłowienie pszczół, unieruchomienie ich w uchwytach, podanie niewielkiej ilości roztworu cukrowego, a następnie przyzwyczajenie ich do ograniczenia ruchów. Następnie do warunkowania wybiera się osobniki, które wykazują wystarczającą motywację po dotknięciu ich czułków sacharozą.Podczas warunkowania prezentację zapachu łączy się z nagrodą w postaci sacharozy, aby wywołać reakcję uwarunkowaną. Następnie w próbach bez wzmocnienia mierzy się obecność lub brak reakcji, latencję reakcji oraz czas trwania reakcji. Ostatnim krokiem jest analiza danych i graficzna prezentacja prób warunkowania oraz testowania.Technika ta została z sukcesem zastosowana w badaniach nad biologią i zdrowiem pszczoły miodowej; zachowanie uczenia się jest szczególnie wrażliwe na zabiegi zaburzające, takie jak stosowanie pestycydów, co umożliwia ocenę wpływu tego typu działań na zachowanie pszczół miodowych w dawkach podprogowych. Wizualna demonstracja tej metody pomaga w zrozumieniu czasu podawania bodźca wymaganego do skutecznego warunkowania oraz typowych błędów obniżających efektywność. Osoba nieznająca tej metody może mieć trudności z zachowaniem dbałości o szczegóły wymagane zarówno w samym protokole, jak i w warunkach otoczenia.Aby rozpocząć, należy zebrać pszczoły robotnice przy wlocie do kolonii, gdy zatrzymują się przed wylotem lub gdy powracają z żerowania. Do każdej probówki należy przechwycić tylko jedną pszczołę. Podczas zakręcania pokrywki należy trzymać otwór probówki poziomo lub skierowany w dół, aby zapobiec ucieczce owada.Po zebraniu pszczół należy wrócić do laboratorium i umieszczać po kilka probówek jednocześnie w zawiesinie z lodu i wody. Gdy pszczoła stanie się nieruchoma, należy natychmiast wyjąć probówkę z lodu, aby uniknąć nadmiernej ekspozycji, i umieścić pszczołę w uprzęży stabilizującej. Pszczołę należy unieruchomić tak, aby jej grzbietowa część klatki piersiowej była skierowana w stronę wycięcia uchwytu, a głowa znajdowała się tuż powyżej jego górnej krawędzi.Delikatnie dociśnij pszczołę tak, aby jej aparat gębowy wystawał poza krawędź uchwytu. Przesuń pasek taśmy klejącej pomiędzy głową a tułowiem po stronie grzbietowej i mocno przymocuj wolny koniec do boku uchwytu. Upewnij się, że taśma w uprzęży jest gładka i napięta.Między przednią częścią uchwytu dla pszczoły a taśmą nie powinno być widocznych szczelin. W przypadku występowania szczelin pszczoła może nie być w stanie prawidłowo wysunąć swojego per bois lub może zdołać uciec. Przed rozpoczęciem karmienia należy odczekać około 30 minut, aby pszczoły mogły dojść do siebie po założeniu uprzęży.Następnie, w obszarze oddalonym od miejsca treningu, podaj każdej pszczole około 3–4 µL 0,5 M sacharozy w odstępie czasu między karmieniem a warunkowaniem. Umieść pszczoły w cichej części laboratorium, w plastikowym pojemniku z mokrymi ręcznikami papierowymi. W tym czasie, na kilka minut przed rozpoczęciem warunkowania, pobudź pszczoły do żerowania, dotykając ich czułków małą kroplą 0,5 M roztworu sacharozy.Nie dopuszczaj ich do żerowania podczas tego testu. Jeśli zareagują poprzez wyciągnięcie psis, prawdopodobnie są wystarczająco zmotywowane do nauki i mogą zostać wykorzystane w protokole. Po przygotowaniu umieść szklaną strzykawkę do zapachów w uchwycie z modeliny i ustaw ją tak, aby otwór w szerokim końcu był skierowany bezpośrednio w stronę pszczół w odległości 10 E. Koniec strzykawki powinien znajdować się w odległości jednego do dwóch centymetrów od pszczół; bezpiecznie zamocuj złącze łączące wkład z przewodami przepływu powietrza i systemem zaworów nad wąskim końcem strzykawki.Na początku każdej próby umieść uprzężeńą pszczółkę na kołku w arena warunkowania, tak aby jej czułki były skierowane bezpośrednio w stronę wkładu z zapachem. Pozostaw pszczółkę w arenie na 15 do 25 sekund przed rozpoczęciem podawania bodźca zapachowego, aby mogła przyzwyczaić się do nowego otoczenia. Naciśnij przycisk start, aby uruchomić mechanizm czasowy dostarczania zapachu.Monitoruj reakcję pszczoły na zapach po wystąpieniu bodźca i przed podaniem bodźca bezwarunkowego. Po każdej próbie pozwól pszczole odpocząć w obszarze warunkowania przez kolejne 15 do 25 sekund, aby umożliwić wstępne utworzenie śladu pamięciowego. Zbyt szybkie przeniesienie pszczoły po zakończeniu próby znacząco obniży skuteczność każdej próby warunkowania.Aby podać sacharozę, należy trzymać końcówkę igły w odległości dwóch do trzech centymetrów od pszczoły podczas prezentacji zapachu. Wykorzystaj krawędź areny treningowej, aby zapobiec potrząsaniem strzykawki, ponieważ taki ruch może rozproszyć pszczołę. Podczas prezentacji bodźca zapachowego rozlegnie się sygnał karmienia.Zaraz po usłyszeniu sygnału do karmienia, lekko dotykaj czułków, aż pszczoła wysunie proboscis, a następnie nakarm pszczołę. Przerwa czasowa między prezentacją zapachu a podaniem sacharozy jest krytyczna. W idealnym przypadku oba te bodźce powinny na krótko się pokrywać.Jeśli między prezentacją zapachu a podaniem sacharozy upłynie więcej niż kilka sekund, efektywność warunkowania ulegnie pogorszeniu. Po zakończeniu warunkowania przeprowadź nieprzylegalne próby testowe, aby ocenić, jak dobrze pszczoły zapamiętały warunkowane skojarzenie. Najpierw ustaw kamerę wideo na statywie nad obszarem treningowym i ustaw ostrość na przód głowy pszczoły, tak aby czułki i proboscis były wyraźnie widoczne.Należy upewnić się, że mała dioda LED, sygnalizująca prezentację bodźca zapachowego, znajduje się w obszarze za pszczołą i jest widoczna na nagraniu wideo, ale nie dla pszczoły. Umożliwia to identyfikację czasu rozpoczęcia i zakończenia podawania zapachu podczas analizy. Aby uzyskać najbardziej powtarzalne wyniki, po zakończeniu wszystkich przygotowań należy do testów użyć świeżo przygotowanych wkładów zapachowych.Rozpocznij testowanie, prezentując zapach w sposób opisany wcześniej. Rozpocznij nagrywanie 20 sekund przed prezentacją zapachu i kontynuuj nagrywanie przez co najmniej 20 sekund po jego zakończeniu. Po zakończeniu testów wykorzystaj oprogramowanie do edycji wideo, aby ocenić reakcję każdej pszczoły na bodziec w danej warunkach.Zastosuj binarny system punktacji do oceny odpowiedzi w postaci wysunięcia proboscis, klasyfikując odpowiedzi jako pozytywne lub negatywne. Odpowiedź pszczoły ocenij jako pozytywną, gdy proboscis wysunie się poza linię wyznaczoną przez połączenie końcówek otwartych żuwaczek; tylko wtedy, gdy pszczoła wysunie proboscis po pojawieniu się zapachu, ale przed jego ustaniem, uznaj odpowiedź za pozytywną. Odpowiedź pszczoły ocenij jako negatywną, gdy podczas próby nie nastąpi wysunięcie proboscis lub gdy proboscis zostanie wysunięty po ustaniu bodźca zapachowego. Można zebrać inne parametry, takie jak czas latencji do wysunięcia oraz liczba i całkowity czas trwania odpowiedzi wysunięcia w danej kondycji.Bodziec zwiększano w kolejnych próbach warunkowania. Reakcje na nowe zapachy testowe, które różniły się od bodźca długością łańcucha węglowego i/lub pozycją wiązania węgiel-węgiel, były zredukowane proporcjonalnie do stopnia różnicy między bodźcem warunkującym a nowym zapachem testowym. Dane te ilustrują zmienność oraz pomyślne przeprowadzenie warunkowania przez nowych badaczy.Reakcje na octal różniły się w zależności od grupy poddawanej testom. Podczas prób testowych zapach użyty jako bodziec warunkujący wywołał najsilniejszą odpowiedź. Gdy octal służył jako bodziec warunkujący, reakcja podczas testowania była silniejsza w porównaniu do metylocyklonu, który był nowym zapachem.Podobnie, cyklometyl wywołał silniejsze reakcje, gdy został użyty jako bodziec warunkowy. W przypadku zastosowania parowania wstecznego, reakcja warunkowa została zredukowana do poziomu zbliżonego do poziomu nowego zapachu, co ilustruje znaczenie precyzyjnego czasu dla skutecznego warunkowania. Po opracowaniu, technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie neuronauki do eksploracji neuronalnych podstaw uczenia się i pamięci u modelowych organizmów owadzich, takich jak pszczoła miodna.Należy pamiętać, że praca z owadami, a w szczególności z pszczołami miodnymi, może być niebezpieczna. Upewnij się, że podczas pracy z tymi zwierzętami używasz odpowiedniego sprzętu ochronnego.

a-proboscis-extension-response-protocol-for-investigating-behavioral

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Protokół reakcji na rozciąganie trąbki do badania plastyczności behawioralnej u owadów: Zastosowanie w badaniach podstawowych, biomedycznych i rolniczych

Odruch wysuwania cycylka, znany jako PER, to test zachowań smakowych stosowany u muszek oraz pszczół miodnych. Gdy cycylek zetknie się z substancją atrakcyjną, mucha wysuwa go, aby spożyć tę substancję. Roztwory różnych cukrów są dla muchy bardzo atrakcyjne.

Test odpowiedzi wyciągania trąbka (PER) u Drosophila

Prezentujemy sposób wdrożenia metody farmakologii behawioralnej w paradygmacie apetycyjnego warunkowania węchowego u pszczół miodnych (Apis mellifera) poprzez systemiczne podawanie leków. Metoda ta pozwala w prosty i niezawodny sposób badać mechanizmy leżące u podstaw uczenia się i tworzenia pamięci.

Farmakologia behawioralna w klasycznym warunkowaniu odruchu wyciągania trąbka u pszczoły miodowej (Apis mellifera)

Układy węchowe owadów zapewniają wyjątkowe możliwości rejestrowania odpowiedzi indukowanych substancjami zapachowymi w formie elektroantenogramów (EAG) oraz rejestracji z pojedynczych sensyli (SSR), które stanowią odpowiednio sumaryczne odpowiedzi wszystkich neuronów receptorowych zapachowych (ORNs) zlokalizowanych na antenie oraz tych znajdujących się w poszczególnych sensylach.

Pomiary elektrofizjologiczne z systemu węchowego ćmy

Muszka owocówka, Drosophila melanogaster, wysuwa swój trąbek w celu żerowania w odpowiedzi na bodziec cukrowy działający na trąbek lub tarsus. Połączyłem obserwacje reakcji wysuwania trąbka (PER) z techniką obrazowania wapnia, co pozwala nam monitorować aktywność neuronów w mózgu równocześnie z obserwacją behawioralną.

Jednoczesna rejestracja sygnałów wapniowych z zidentyfikowanych neuronów i zachowań żerowania Drosophila melanogaster

W tym protokole pokazujemy, jak kondycjonować zaprzęgnięte pszczoły miodne do bodźców dotykowych i wprowadzamy technikę przechwytywania ruchu 2D do analizy kinematyki wzorca próbkowania anteny na małą skalę.

Kondycjonowanie dotykowe i analiza ruchu w strategiach pobierania próbek czułków u pszczół miodnych (Apis mellifera L.)

Pionowy olfaktometr labiryntu w kształcie litery T jest opisany do badania reakcji behawioralnej stawonogów. Olfaktometr pozwala eksperymentatorowi zmierzyć wybory dokonywane przez osoby badane pod wpływem dwóch potencjalnych pól zapachowych. Za pomocą tego urządzenia można zmierzyć zarówno przyciąganie, jak i odpychanie od substancji zapachowych.

Pionowy test wyboru labiryntu w kształcie litery T dla reakcji stawonogów na substancje zapachowe

Opisano nowy test behawioralny do badania krótkoterminowych reakcji smakowych swobodnie poruszających się trzmieli (Bombus terrestris) na składniki odżywcze i toksyny w roztworze.

Nowatorski test behawioralny do badania reakcji smakowych osobników, swobodnie poruszających się trzmieli (Bombus terrestris)

Ten manuskrypt opisuje kilka protokołów podawania środków farmakologicznych pszczołom miodnym, w tym proste nieinwazyjne metody dla pszczół swobodnie latających, a także bardziej inwazyjne warianty, które pozwalają na precyzyjne, miejscowe leczenie krępowanych pszczół.

Neurofarmakologiczna manipulacja skrępowanych i swobodnie latających pszczół miodnych, Apis mellifera

Ten protokół opisuje kroki korzystania z nowatorskiego oprogramowania, SwarmSight, do śledzenia klatka po klatce pozycji anteny owada i trąbki z konwencjonalnych kamer internetowych przy użyciu konwencjonalnych komputerów. Darmowe oprogramowanie typu open source przetwarza klatki około 120 razy szybciej niż ludzie i działa z dokładnością lepszą niż ludzka.

SwarmSight: Śledzenie w czasie rzeczywistym ruchów anteny owadów i odruchu wysuwania trąbki przy użyciu zwykłego preparatu i konwencjonalnego sprzętu

Ten protokół analizuje zachowanie nawigacyjne larwy Drosophila w odpowiedzi na jednoczesną optogenetyczną stymulację jej neuronów węchowych. Światło o długości fali 630 nm służy do aktywacji pojedynczych neuronów węchowych wyrażających rodopsynę z przesuniętym ku czerwieni kanałem. Ruch larw jest jednocześnie śledzony, rejestrowany cyfrowo i analizowany za pomocą specjalnie napisanego oprogramowania.

Śledzenie zachowań larw Drosophila w odpowiedzi na optogenetyczną stymulację neuronów węchowych

Ten artykuł przedstawia metody manipulacji optogenetycznej u Drosophila melanogaster, wykorzystując CsChrimson i GtACR2 do aktywacji i wyciszania określonych neuronów. Opisano cztery eksperymenty wykorzystujące optogenetykę do badania zachowań termotaktycznych i smakowych, dostarczając wglądu w podstawowe mechanizmy neuronalne rządzące tymi procesami.

Testy behawioralne do optogenetycznej manipulacji obwodami neuronalnymi u Drosophila melanogaster

Poznaj protokół PER do badania plastyczności behawioralnej u pszczół miodnych Apis mellifera. Ta metoda pozwala ocenić wpływ stresorów środowiskowych na zachowanie owadów w badaniach neurobiologicznych.

Protokół odpowiedzi na wydłużenie trąby do badania plastyczności behawioralnej u owadów: zastosowanie do badań podstawowych, biomedycznych i rolniczych (Wideo) | JoVE Journal

Protokół odpowiedzi na wydłużenie trąby do badania plastyczności behawioralnej u owadów: zastosowanie do badań podstawowych, biomedycznych i rolniczych

Przeglądaj więcej filmów