Cytologiczna analiza spermatogenezy: żywe i utrwalone preparaty jąder Drosophila

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wyizolowanie i przygotowanie jąder Drosophila do badań mikroskopowych. Jest to realizowane poprzez wypreparowanie par jąder z odwłoka samców much. Drugim krokiem jest rozerwanie jąder na odpowiednim etapie rozwoju oraz ich rozgniecenie w celu uwolnienia zawartych w nich komórek.

Następnie rozgniecione jądra zostają utrwalone, a potem inkubowane z przeciwciałami pierwotnymi i wtórnymi. Końcowym etapem jest osadzenie tkanki na szkiełku przedmiotowym w celu obrazowania. Ostatecznie wykorzystuje się mikroskopię w kontraście fazowym lub immunofluorescencyjną, aby obserwować komórki na różnych etapach spermatogenezy pod kątem defektów i morfologii, a także aby badać subkomórkową lokalizację różnych białek.

Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu biologii rozwoju, takie jak identyfikacja krytycznych ról białek podczas przebiegu spermatogenezy. Wizualna demonstracja sekcji jąder RAs jest kluczowa, ponieważ osoba początkująca w tej procedurze może początkowo mieć trudności z zlokalizowaniem jąder w odwłoku muchy. Ponadto łatwiej jest zademonstrować, niż opisać słowami, najskuteczniejszy sposób rozgniecania tkanki.

Aby rozpocząć sekcję, uśpij muchy w butelce lub fiolce za pomocą strumienia dwutlenku węgla. Następnie przenieś uśpione muchy na podkładkę do much. Posegreguj muchy pod mikroskopem stereotypowym, używając małego pędzla, aby zebrać od sześciu do ośmiu samców oph o pożądanym genotypie.

Następnie za pomocą pęsety usuń skrzydła z każdej muchy. Zapobiegnie to wypływaniu much na powierzchnię cieczy. Podczas sekcji nanieś jedną kroplę 500 µL soli fizjologicznej w buforze fosforanowym (PBS) na pokrytą silikonem szalkę sekcyjną z czarnym tłem.

Następnie skieruj pęsetę w stronę przedniego końca jednej z much pozbawionych skrzydeł. Chwyć ją za klatkę piersiową i zanurz w kropli PBS. Zidentyfikuj ciemnobrązową strukturę znajdującą się na tylnym końcu brzusznej strony odwłoka, a następnie za pomocą drugiej pęsety chwyć i pociągnij genitalia zewnętrzne do tyłu, aż oddzielą się od odwłoka.

W większości przypadków jądra, pęcherzyki nasienne i gruczół akcesoryjny zostaną usunięte z jamy brzusznej wraz z narządami płciowymi zewnętrznymi. Jeśli jednak tak się nie stanie, należy wprowadzić pęsetę do jamy brzusznej i delikatnie wydobyć jądra. Następnie, używając dwóch pęset, należy oddzielić jądra od gruczołów akcesoryjnych i narządów płciowych zewnętrznych.

Odróżnij jądra typu dzikiego od sąsiadujących białych tkanek po ich żółtym kolorze. Aby przygotować próbkę do obrazowania na żywo, użyj pęsety, aby delikatnie umieścić od dwóch do trzech par jąder w kropli 4–5 µL PBS na kwadratowej szkiełku nakrywkowym. Następnie rozrywaj.

Otwórz każdy jądra za pomocą pincety na odpowiednim poziomie, aby zmaksymalizować obecność pożądanych typów komórek linii zarodkowej w preparacie. Zawartość jąder wypłynie z rozerwanego obszaru na szkiełko. Podczas etapu rozcierania (squashing) w celu wzbogacenia preparatu w spermatogonia i spermatocyty, rozerwij jądra w pobliżu ich wierzchołka.

Aby uzyskać spermatocyty i spermatydy, rozerwij jądra w miejscu nieco bardziej podstawnym niż poziom pierwszy, aby zwiększyć liczbę bardziej dojrzałych komórek linii zarodkowej. Rozrywaj jądra bliżej miejsca, w którym zaczyna się zakrzywienie. Kolejnym krokiem jest rozgniecenie jąder poprzez delikatne nałożenie szkiełka przedmiotowego na szkiełko nakrywkowe.

Nie należy wywierać nacisku ręcznie i należy unikać powstawania pęcherzyków powietrza. W celu obserwacji żywych komórek próbkę należy wykorzystać w ciągu 15 minut od przygotowania. Podczas mikroskopii fazowo-kontrastowej należy delikatnie odsączyć nadmiar cieczy spod szkiełka nakrywnego za pomocą chusteczki do czyszczenia, aby umożliwić spłaszczenie preparatu, aż komórki rozrodcze zostaną wyraźnie ustawione w ostrości.

Przygotowane preparaty z rozgniecionymi jądrami poddaj szybkiemu zamrażaniu, zanurzając je za pomocą metalnej pęsety w ciekłym azocie, aż do zaprzestania bulgotania cieczy. Natychmiast usuń szkiełko nakrywkowe za pomocą żyletki. Następnie przenieś preparaty metalną pęsetą do uprzednio schłodzonego szklanego statywu na szkiełka wypełnionego lodowatym 95% etanolem i przechowuj próbkę w temperaturze -20°C przez 10 minut.

Przenieść wyrównane preparaty na szklaną kasetę wypełnioną 4% formaldehydem w PBS z dodatkiem 0,1% Triton X 100 lub PBST i inkubować w temperaturze pokojowej przez siedem minut. Następnie przenieść preparaty do kasety wypełnionej PBS. Płukać preparaty w PBS przez pięć minut w temperaturze pokojowej, wylewając roztwór z kasety i zastępując go świeżym roztworem PBS.

Powtórz płukanie raz. Odlej PBS i zanurz preparaty w PBST na 30 minut w temperaturze pokojowej, aby przeprowadzić permeabilizację błon komórkowych. Następnie wypłucz preparaty trzykrotnie w PBS przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Obrysuj tkankę w preparacie (metoda squash) za pomocą pisaka do tworzenia barier hydrofobowych, aby ograniczyć rozprzestrzenianie się roztworów przeciwciał i zapewnić stałe nawilżenie tkanki podczas barwienia immunocytochemicznego.

Następnie do tkanki wewnątrz okręgu należy dodać od 30 do 40 µL przeciwciała pierwszorzędowego rozcieńczonego w PBST. Po inkubacji z przeciwciałem pierwszorzędowym preparat należy inkubować w wilgotnej, ciemnej komorze przez dwie godziny w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C. Slajdy należy przemyć trzykrotnie w PBS przez pięć minut w temperaturze pokojowej.

Następnie należy dodać do tkanki od 30 do 40 µL koniugowanego przeciwciała wtórnego znakowanego fluorophorem, rozcieńczonego w PBS, i inkubować w ciemności przez jedną do dwóch godzin w temperaturze pokojowej. Następnie szkiełka należy przemyć trzykrotnie w PBS przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Na koniec do tkanki wewnątrz okręgu należy dodać od 30 do 40 µL roztworu DAPI.

Ostrożnie nałóż szkiełko nakrywkowe na tkankę, dbając szczególnie o to, aby nie uwięzić pęcherzyków powietrza. Jeśli pojawią się pęcherzyki powietrza, ostrożnie przesuwaj szkiełko nakrywkowe, nie niszcząc próbki, aż pęcherzyki ujdą bokami szkiełka. Nadmiar cieczy z krawędzi szkiełka przedmiotowego usuń za pomocą chusteczki do czyszczenia.

Następnie należy uszczelnić szkiełko nakrywkowe za pomocą laku do paznokci i ocenić barwienie immunofluorescencyjne komórek przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego w ciągu trzech do czterech godzin. Ten schemat przedstawia lokalizację różnych poziomów dojrzewania komórek w jądrach Drosophila. Poziom pierwszy zawiera młodsze komórki znajdujące się we wczesnych etapach spermatogenezy, a poziom trzeci zawiera bardziej dojrzałe komórki plemnikowe.

Poziom drugi zawiera mieszaną populację meiotycznych i postmeiotycznych komórek linii zarodkowej. Odpowiadający im obraz w kontraście fazowym pokazuje uwalnianie spermatogoniów oraz wczesnych i późnych spermatocytów pierwszego rzędu w momencie rozdarcia jądra na poziomie pierwszym. Żółta strzałka wskazuje również na fuzję dwóch lub więcej połączonych ze sobą komórek w wyniku niepełnej cytokinezy.

Artefaktem procedury zgniatania przedstawionej tutaj jest odpowiadający jej obraz w kontraście fazowym, ukazujący uwalnianie późnych spermatocytów pierwszorzędowych i komórek pomiotycznych, w tym spermatyd okrągłych, spermatyd wydłużających się oraz dojrzałych plemników w momencie rozerwania jąder na poziomie drugim. Obrazowanie w kontraście fazowym zgniatanych jąder może być również wykorzystane do łatwej identyfikacji defektów w licznych spermatydach okrągłych. Przedstawione tutaj spermatydy typu dzikiego z jasnym w świetle fazowym jądrem są przyłączone do ciemnego w świetle fazowym pojedynczego agregatu mitochondrialnego o zbliżonej wielkości.

W przeciwieństwie do tego, spermatydy z jąder Aun zawierają wiele małych jąder oraz jeden duży agregat mitochondriów, co jest wynikiem niepowodzenia cytokinezy i błędów w segregacji chromosomów. Przedstawione tutaj obrazy w skali szarości pochodzą z preparatu rozgniecionych jąder barwionych odczynnikami, które w kolorze identyfikują mikrotubule, DNA i centrosomy. Połączone obrazy przedstawiają dzielący się spermatocyt, szerokie pole okrągłych spermatyd oraz wiązkę dojrzałych plemników. Po opanowaniu techniki przygotowania próbek, mikroskopia w kontraście fazowym może zostać przeprowadzona w ciągu 20 do 30 minut.

Przygotowanie próbek do mikroskopii immunofluorescencyjnej może zostać przeprowadzone w ciągu sześciu godzin, jeśli proces zostanie wykonany prawidłowo. Oprócz opracowania jąder oph do mikroskopii, wypreparowane jądra mogą być alternatywnie wykorzystane do biochemicznej analizy białek.