Name: Cytologiczna analiza spermatogenezy: żywe i utrwalone preparaty jąder Drosophila (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: Poznaj metody izolacji i przygotowania jąder Drosophila do mikroskopii, w tym preparatywkę, utrwalanie oraz barwienie immunofluorescencyjne. Techniki te umożliwiają obserwację spermatogenezy na poziomie komórkowym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Michaelowi Andersonowi za ustanowienie w laboratorium Lee tych akceptowanych metod badania spermatogenezy z fachową poradą Karen Hales. H. Oda i Y. Akiyama-Oda hojnie dostarczyli stado much γ-tubulina-GFP. Praca ta była wspierana przez grant NIH R01 dla L.A.L. (GM074044).

1. Sekcja jąder
<ol>
	<li>Znieczulić muchy w butelce lub fiolce za pomocą strumienia CO2 i przenieść do podkładki na muchy.</li>
	<li>Sortuj muchy pod mikroskopem preparacyjnym za pomocą małego pędzla i zbierz odpowiednią liczbę (w zależności od eksperymentu) samców Drosophila o pożądanych genotypach. Młode samce (0-2 dni) są idealne do badania komórek we wcześniejszych stadiach spermatogenezy (np. spermatogonia, spermatocyty i wczesne plemniki postmejotyczne), natomiast nieco starsze samce (2-5 dni) są idealne do badania komórek w końcowych stadiach spermatogenezy (w szczególności dojrzałych plemników).</li>
	<li>Użyj kleszczy, aby usunąć skrzydła z każdej muchy (aby zapobiec unoszeniu się much w płynie podczas sekcji).</li>
	<li>Dodać ~500 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (130 mM NaCl, 7 mM Na2HPO4, 3 mM NaH2PO4; PBS) w kropli do pokrytego silikonem naczynia preparacyjnego na czarnym tle. Inne roztwory wodne są z powodzeniem stosowane do rozwarstwiania jąder3.</li>
	<li>Skieruj kleszcze w stronę przedniej części muchy, chwyć ją za klatkę piersiową i zanurz w kropli PBS. Podczas oglądania przez mikroskop preparacyjny użyj innej pary kleszczy, aby chwycić i pociągnąć zewnętrzne narządy płciowe (ciemnobrązowa struktura znajdująca się na tylnym końcu brzusznego brzucha) do tyłu, aż odczepią się od brzucha. W większości przypadków jądra, pęcherzyki nasienne i gruczoł dodatkowy zostaną usunięte z jamy brzusznej wraz z zewnętrznymi narządami płciowymi; Jeśli nie, włóż pojedynczą parę kleszczy do brzucha i wydłub jądra.</li>
	<li>Oddziel jądra od gruczołu dodatkowego i zewnętrznych narządów płciowych za pomocą dwóch par kleszczy w kropli PBS (ryc. 2). Jądra typu dzikiego można łatwo odróżnić od sąsiednich białych tkanek po ich żółtym kolorze. Przejdź od razu do kroku 2.</li>
	<li>Aby wyizolować jądra od samców pharate (tj. zamkniętych w opakowaniu poczwarki), należy najpierw wykonać dodatkowy krok, który polega na usunięciu muchy z obudowy poczwarki; ten krok został wcześniej opisany w innym miejscu31. Kontynuuj sekcję jak w przypadku jąder dorosłych, zaczynając od kroku 1.2.</li>
	<li>Aby wyizolować jądra od samców larwalnych, należy przeprowadzić modyfikację protokołu izolacji jajników larw Drosophila 32. Krótko mówiąc, larwy męskie można odróżnić od larw żeńskich po obecności pary dużych, przezroczystych, owalnych struktur (jąder larw) osadzonych w tylnej jednej trzeciej ciała tłuszczowego. Aby wyizolować jądra larw, należy częściowo otworzyć larwę samca, aby odizolować jądra i otaczające je ciało tłuszczowe od brzucha, jak opisano w przypadku izolacji jajników larw. Przejdź natychmiast do kroku 2 opisanego w niniejszym dokumencie protokołu; Jądra mogą być później usunięte z ciała tłuszczowego tuż przed zamontowaniem (kroki 2.3 lub 3.14), jak opisano dla jajników32.</li>
</ol>
2. Przygotowanie próbki i obrazowanie na żywo
<ol>
	<li>Użyj kleszczy, aby delikatnie umieścić 2-3 pary jąder w kropli 4-5 ml PBS na kwadratowym szklanym szkiełku nakrywkowym. Należy pamiętać, że stosunek liczby jąder do objętości PBS może wymagać dostosowania: zbyt dużo płynu uniemożliwi prawidłowe rozprzestrzenianie się komórek po zgnieceniu, podczas gdy zbyt mało płynu spowoduje pękanie komórek po zgnieceniu. Opcjonalnie: Użyj silikonowanych szkiełek nakrywkowych, aby zminimalizować przyleganie tkanki do szkiełka nakrywkowego w kroku 3.2.</li>
	<li>Użyj pary kleszczy, aby rozerwać każde jądro w odpowiedniej pozycji, tak aby zmaksymalizować obecność pożądanych typów komórek linii rozrodczej w preparacie (należy pamiętać, że zawartość jądra w większości wydostanie się z rozdartego obszaru na szkiełko podczas etapu zgniatania). Aby wzbogacić spermatogonię i spermatocyty, rozerwij jądro przylegające do jego wierzchołka (poziom 1, ryc. 2B). Aby wzbogacić spermatocyty i spermatydy, rozerwij jądro w pozycji lekko podstawowej do poziomu 1 (poziom 2, ryc. 2B). Aby wzbogacić o bardziej dojrzałe komórki linii rozrodczej, rozerwij jądro bliżej miejsca, w którym zaczyna się krzywizna (poziom 3, ryc. 2B).</li>
	<li>Delikatnie umieścić szkiełko mikroskopowe na szkiełku nakrywkowym, aby zmiażdżyć jądra; nie należy wywierać nacisku ręcznie, ponieważ ciężar samego szkiełka nakrywkowego jest wystarczający do uzyskania prawidłowo zgniecionej próbki. Staraj się unikać zatrzymywania pęcherzyków powietrza. Opcjonalnie: Użyj szkiełek mikroskopowych pokrytych poli-L-lizyną, aby zwiększyć przyleganie tkanki do szkiełka w kroku 3.2.</li>
	<li>Preparat należy natychmiast zużyć (najlepiej w ciągu 15 minut od przygotowania) w celu obserwacji żywych komórek za pomocą mikroskopii z kontrastem fazowym; w przypadku muszek transgenicznych z ekspresją fluorescencyjnie znakowanych białek w jądrach, żywe komórki można na tym etapie badać za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Alternatywnie można przystąpić do utrwalania i barwienia przeciwciałami (Protokół 3).</li>
	<li>Delikatnie odsączyć nadmiar płynu spod szkiełka nakrywkowego za pomocą chusteczki czyszczącej, aby umożliwić spłaszczenie preparatu, aż komórki rozrodcze będą wyraźnie ostre.</li>
</ol>
3. Utrwalanie formaldehydu i barwienie przeciwciał
<ol>
	<li>Zamroź zatrzaskowo każde szkiełko zawierające zgniecione jądra (z Protokołu 2) za pomocą pary metalowych szczypiec, aby zanurzyć je na krótko w ciekłym azocie (aż ciekły azot przestanie bulgotać).</li>
	<li>Natychmiast usuń szkiełko nakrywkowe za pomocą żyletki.</li>
	<li>Użyj metalowych szczypiec, aby przenieść szkiełka do wstępnie schłodzonego szklanego stojaka na szkiełka wypełnionego lodowatym 95% etanolem (klasa spektrofotometryczna, bez metanolu). Przechowywać w temperaturze -20 °C przez 10 min.</li>
	<li>Użyj metalowych szczypiec, aby przenieść szkiełka do szklanego stojaka wypełnionego 4% formaldehydem w PBS plus 0,1% Triton X-100 (PBS-T). Przechowywać w temperaturze pokojowej przez 7 minut.</li>
	<li>Użyj metalowych szczypiec, aby przenieść szkiełka do szklanego stojaka na szkiełka wypełnionego PBS. Myć szkiełka w PBS przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Powtórz 1x. Wszystkie mycia należy wykonać, wylewając roztwór do szklanego stojaka na szkiełka (tj. wylewając go) i zastępując go świeżym roztworem.</li>
	<li>Wyrzuć PBS i zanurz szkiełka w PBS-T na 30 minut w temperaturze pokojowej, aby przepuszczalność błon komórkowych.</li>
	<li>Myć szkiełka w PBS przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Powtórz 2 razy.</li>
	<li>Etap blokowania (opcjonalnie): Zanurz szkiełka w PBS plus 1% BSA na 45 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Za pomocą hydrofobowego pisaka barierowego narysuj okrąg na szkiełku wokół zgniecionej tkanki (łatwo widocznej gołym okiem) w celu ograniczenia roztworów przeciwciał (dodanych w krokach 3.9 i 3.11). Tkanka powinna być utrzymywana w wilgoci przez cały czas podczas wykonywania barwienia immunologicznego.</li>
	<li>Dodaj 30-40 ml przeciwciała pierwszorzędowego (rozcieńczonego w PBS-T, 1:400 do 1:50, w zależności od przeciwciała) do tkanki w okręgu. Jeśli przeprowadzono blokowanie, rozcieńczyć przeciwciało pierwszorzędowe w PBS-T plus 1% BSA. Przeciwciało anty-gamma-tubulinowe (do barwienia centrosomów na rycinie 4) rozcieńczono w stosunku 1:100. Inkubować w wilgotnej, ciemnej komorze (np. zamkniętym plastikowym pudełku z wilgotnymi ręcznikami papierowymi) przez 2 godziny w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Myć szkiełka w PBS przez 5 min w temperaturze pokojowej 3x. Jeśli wykonano blokowanie, umyć dwa razy w PBS-T i raz w PBS (po 5 minut w temperaturze pokojowej).</li>
	<li>Dodać 30-40 ml przeciwciała drugorzędowego sprzężonego z fluoroforem (rozcieńczonego w stosunku 1:400 w PBS) do tkanki i inkubować w ciemności przez 1-2 godziny w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Myć szkiełka w PBS przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Powtórz 2 razy.</li>
	<li>Dodać 30-40 ml roztworu DAPI (0,2 mg/ml w PBS) do tkanki w okręgu.</li>
	<li>Delikatnie umieść szklaną osłonę na chusteczce, uważając, aby nie uwięzić pęcherzyków powietrza. Jeśli pojawią się pęcherzyki powietrza, ostrożnie przesuwaj po szkiełku nakrywkowym, nie niszcząc dyni, aż pęcherzyki wydostaną się z boków szkiełka nakrywkowego.</li>
	<li>Użyj chusteczki czyszczącej, aby usunąć nadmiar DAPI z krawędzi szkiełka.</li>
	<li>Przymocuj szkiełko korekcyjne do szkiełka za pomocą przezroczystego lakieru do paznokci.</li>
	<li>Użyj tego preparatu w ciągu najbliższych 3-4 godzin, aby wyświetlić komórki barwione immunologicznie za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. W przypadku długotrwałego przechowywania szkiełek (do co najmniej kilku tygodni) należy używać twardych nośników na bazie glicerolu z DAPI i przechowywać szkiełka w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Alternatywnie, utrwal próbki w metanolu zamiast w formaldehydzie (w zależności od antygenu). Po wykonaniu całego protokołu w kroku 3.2, zanurz szkiełka ze zgniecionymi jądrami w metanolu na 10 minut w temperaturze -20 °C i przejdź do kroku 3.5 i dalej.</li>
</ol>

<ol><li>McKim, K. S., Joyce, E. F., Jang, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytological+analysis+of+meiosis+in+fixed+Drosophila+ovaries%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cytological analysis of meiosis in fixed Drosophila ovaries.</a> Methods Mol. Biol. 558, 197-216 (2009).</li>
<li>Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparing+individual+Drosophila+egg+chambers+for+live+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparing individual Drosophila egg chambers for live imaging.</a> J. Vis. Exp. , (2012).</li>
<li>Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBonaccorsi%2C+S+%22Drosophila+Protocols%22">Drosophila Protocols</a>. Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 87-109 (2000).</li>
<li>Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunostaining+of+Drosophila+testes%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb.+Protoc.%22%5BJournal%5D)">Immunostaining of Drosophila testes.</a> Cold Spring Harb. Protoc.. 2011, 1273-1275 (2011).</li>
<li>Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methanol-acetone+fixation+of+Drosophila+testes%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb.+Protoc.%22%5BJournal%5D)">Methanol-acetone fixation of Drosophila testes.</a> Cold Spring Harb. Protoc.. 2011, 1270-1272 (2011).</li>
<li>Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+live+testis+squashes+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb.+Protoc.%22%5BJournal%5D)">Preparation of live testis squashes in Drosophila.</a> Cold Spring Harb. Protoc.. 2011, (2011).</li>
<li>Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formaldehyde+fixation+of+Drosophila+testes%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb.+Protoc.%22%5BJournal%5D)">Formaldehyde fixation of Drosophila testes.</a> Cold Spring Harb. Protoc.. 2012, (2012).</li>
<li>Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paraformaldehyde+fixation+of+Drosophila+testes%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb.+Protoc.%22%5BJournal%5D)">Paraformaldehyde fixation of Drosophila testes.</a> Cold Spring Harb. Protoc.. 2012, 102-104 (2012).</li>
<li>Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((F-actin+staining+of+Drosophila+testes%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb.+Protoc.%22%5BJournal%5D)">F-actin staining of Drosophila testes.</a> Cold Spring Harb. Protoc.. 2012, 105-106 (2012).</li>
<li>Kibanov, M. V., Kotov, A. A., Olenina, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+fluorescence+imaging+of+whole-mount+Drosophila+testes+for+studying+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Multicolor fluorescence imaging of whole-mount Drosophila testes for studying spermatogenesis.</a> Anal. Biochem. 436, 55-64 (2013).</li>
<li>Singh, S. R., Hou, S. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistological+techniques+for+studying+the+Drosophila+male+germline+stem+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Immunohistological techniques for studying the Drosophila male germline stem cell.</a> Methods Mol. Biol. 450, 45-59 (2008).</li>
<li>Zamore, P. D., Ma, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Drosophila+melanogaster+Testes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of Drosophila melanogaster Testes.</a> J. Vis. Exp. (2641), (2011).</li>
<li>de Cuevas, M., Matunis, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+stem+cell+niche%3A+lessons+from+the+Drosophila+testis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The stem cell niche: lessons from the Drosophila testis.</a> Development. 138, 2861-2869 (2011).</li>
<li>Fabian, L., Brill, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+spermiogenesis%3A+Big+things+come+from+little+packages%5BTitle%5D)+AND+%22Spermatogenesis%22%5BJournal%5D)">Drosophila spermiogenesis: Big things come from little packages.</a> Spermatogenesis. 2, 197-212 (2012).</li>
<li>Giansanti, M. G., Sechi, S., Frappaolo, A., Belloni, G., Piergentili, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokinesis+in+Drosophila+male+meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Spermatogenesis%22%5BJournal%5D)">Cytokinesis in Drosophila male meiosis.</a> Spermatogenesis. 2, 185-196 (2012).</li>
<li>Matunis, E. L., Stine, R. R., de Cuevas, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+Drosophila+male+germline+stem+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Spermatogenesis%22%5BJournal%5D)">Recent advances in Drosophila male germline stem cell biology.</a> Spermatogenesis. 2, 137-144 (2012).</li>
<li>McKee, B. D., Yan, R., Tsai, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meiosis+in+male+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Spermatogenesis%22%5BJournal%5D)">Meiosis in male Drosophila.</a> Spermatogenesis. 2, 167-184 (2012).</li>
<li>Zoller, R., Schulz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+cyst+stem+cell+lineage%3A+Partners+behind+the+scenes%5BTitle%5D)+AND+%22Spermatogenesis%22%5BJournal%5D)">The Drosophila cyst stem cell lineage: Partners behind the scenes.</a> Spermatogenesis. 2, 145-157 (2012).</li>
<li>Cenci, G., Bonaccorsi, S., Pisano, C., Verni, F., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+and+microtubule+organization+during+premeiotic%2C+meiotic+and+early+postmeiotic+stages+of+Drosophila+melanogaster+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci.%22%5BJournal%5D)">Chromatin and microtubule organization during premeiotic, meiotic and early postmeiotic stages of Drosophila melanogaster spermatogenesis.</a> J. Cell Sci.. 107, 3521-3534 (1994).</li>
<li>Rebollo, E., Gonzalez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+the+spindle+checkpoint+in+Drosophila+spermatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Visualizing the spindle checkpoint in Drosophila spermatocytes.</a> EMBO Rep. 1, 65-70 (2000).</li>
<li>Castrillon, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+a+molecular+genetic+analysis+of+spermatogenesis+in+Drosophila+melanogaster%3A+characterization+of+male-sterile+mutants+generated+by+single+P+element+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Toward a molecular genetic analysis of spermatogenesis in Drosophila melanogaster: characterization of male-sterile mutants generated by single P element mutagenesis.</a> Genetics. 135, 489-505 (1993).</li>
<li>Giansanti, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+dissection+of+meiotic+cytokinesis+in+Drosophila+males%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Genetic dissection of meiotic cytokinesis in Drosophila males.</a> Mol. Biol. Cell. 15, 2509-2522 (2004).</li>
<li>Wakimoto, B. T., Lindsley, D. L., Herrera, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+a+comprehensive+genetic+analysis+of+male+fertility+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Toward a comprehensive genetic analysis of male fertility in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 167, 207-216 (2004).</li>
<li>Fuller, M. T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFuller%2C+MT+%22The+Development+of+Drosophila+melanogaster%22">The Development of Drosophila melanogaster</a>. Bate, M., Martinez-Arias, A. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 71-147 (1993).</li>
<li>Wolfner, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tokens+of+love%3A+functions+and+regulation+of+Drosophila+male+accessory+gland+products%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochem.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Tokens of love: functions and regulation of Drosophila male accessory gland products.</a> Insect Biochem. Mol. Biol. 27, 179-192 (1997).</li>
<li>Tram, U., Wolfner, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Male+seminal+fluid+proteins+are+essential+for+sperm+storage+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Male seminal fluid proteins are essential for sperm storage in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 153, 837-844 (1999).</li>
<li>Kemphues, K. J., Raff, E. C., Raff, R. A., Kaufman, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutation+in+a+testis-specific+beta-tubulin+in+Drosophila%3A+analysis+of+its+effects+on+meiosis+and+map+location+of+the+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mutation in a testis-specific beta-tubulin in Drosophila: analysis of its effects on meiosis and map location of the gene.</a> Cell. 21, 445-451 (1980).</li>
<li>Gunsalus, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+twinstar%2C+a+Drosophila+gene+encoding+a+cofilin%2FADF+homologue%2C+result+in+defects+in+centrosome+migration+and+cytokinesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mutations in twinstar, a Drosophila gene encoding a cofilin/ADF homologue, result in defects in centrosome migration and cytokinesis.</a> J. Cell Biol. 131, 1243-1259 (1995).</li>
<li>Anderson, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asunder+is+a+critical+regulator+of+dynein-dynactin+localization+during+Drosophila+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Asunder is a critical regulator of dynein-dynactin localization during Drosophila spermatogenesis.</a> Mol. Biol. Cell. 20, 2709-2721 (2009).</li>
<li>Sitaram, P., Anderson, M. A., Jodoin, J. N., Lee, E., Lee, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+dynein+localization+and+centrosome+positioning+by+Lis-1+and+asunder+during+Drosophila+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Regulation of dynein localization and centrosome positioning by Lis-1 and asunder during Drosophila spermatogenesis.</a> Development. 139, 2945-2954 (2012).</li>
<li>Martins, A. R., Machado, P., Callaini, G., Bettencourt-Dias, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscopy+methods+for+the+study+of+centriole+biogenesis+and+function+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Microscopy methods for the study of centriole biogenesis and function in Drosophila.</a> Methods in cell biology. 97, 223-242 (2010).</li>
<li>Maimon, I., Gilboa, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+and+staining+of+Drosophila+larval+ovaries%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Dissection and staining of Drosophila larval ovaries.</a> J. Vis. Exp. (10), (2011).</li>
<li>Gonzalez, C., Casal, J., Ripoll, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+between+chromosome+content+and+nuclear+diameter+in+early+spermatids+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genet.+Res%22%5BJournal%5D)">Relationship between chromosome content and nuclear diameter in early spermatids of Drosophila melanogaster.</a> Genet. Res. 54, 205-212 (1989).</li>
<li>Liebrich, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+cytochalasin+B+and+colchicine+on+the+morphogenesis+of+mitochondria+in+Drosophila+hydei+during+meiosis+and+early+spermiogenesis.+An+in+vitro+study%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue.+Res%22%5BJournal%5D)">The effects of cytochalasin B and colchicine on the morphogenesis of mitochondria in Drosophila hydei during meiosis and early spermiogenesis. An in vitro study.</a> Cell Tissue. Res. 224, 161-168 (1982).</li>
<li>Wong, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PIP2+hydrolysis+and+calcium+release+are+required+for+cytokinesis+in+Drosophila+spermatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">PIP2 hydrolysis and calcium release are required for cytokinesis in Drosophila spermatocytes.</a> Curr. Biol. 15, 1401-1406 (2005).</li>
<li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118, 401-415 (1993).</li>
<li>White-Cooper, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+cell+type+and+stage-specific+ectopic+gene+expression+and+RNAi+induction+in+the+Drosophila+testis%5BTitle%5D)+AND+%22Spermatogenesis%22%5BJournal%5D)">Tissue cell type and stage-specific ectopic gene expression and RNAi induction in the Drosophila testis.</a> Spermatogenesis. 2, 11-22 (2012).</li>
<li>Rebollo, E., Llamazares, S., Reina, J., Gonzalez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+noncentrosomal+microtubules+to+spindle+assembly+in+Drosophila+spermatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Contribution of noncentrosomal microtubules to spindle assembly in Drosophila spermatocytes.</a> PLoS Biol. 2, (2004).</li>
<li>Cheng, J., Hunt, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-lapse+live+imaging+of+stem+cells+in+Drosophila+testis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Stem+Cell.+Biol.%22%5BJournal%5D)">Time-lapse live imaging of stem cells in Drosophila testis.</a> Curr. Protoc. Stem Cell. Biol.. 2, 10-1002 (2009).</li>
<li>Sheng, X. R., Matunis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+the+Drosophila+spermatogonial+stem+cell+niche+reveals+novel+mechanisms+regulating+germline+stem+cell+output%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Live imaging of the Drosophila spermatogonial stem cell niche reveals novel mechanisms regulating germline stem cell output.</a> Development. 138, 3367-3376 (2011).</li>
<li>Belloni, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+Cog7+affect+Golgi+structure%2C+meiotic+cytokinesis+and+sperm+development+during+Drosophila+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Mutations in Cog7 affect Golgi structure, meiotic cytokinesis and sperm development during Drosophila spermatogenesis.</a> J. Cell Sci. 125, 5441-5452 (2012).</li>
<li>Moon, S., Cho, B., Min, S. H., Lee, D., Chung, Y. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+THO+complex+is+required+for+nucleolar+integrity+in+Drosophila+spermatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The THO complex is required for nucleolar integrity in Drosophila spermatocytes.</a> Development. 138, 3835-3845 (2011).</li>
<li>Wang, Z., Mann, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+for+two+nearly+identical+TGIF-related+homeobox+genes+in+Drosophila+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Requirement for two nearly identical TGIF-related homeobox genes in Drosophila spermatogenesis.</a> Development. 130, 2853-2865 (2003).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Chociaż jądra much typu dzikiego można łatwo zidentyfikować ze względu na ich żółty kolor (w przeciwieństwie do sąsiednich białych tkanek), jądra białych zmutowanych much są białe, a zatem czasami można je pomylić z jelitami. Większość szczepów transgenicznych, które zazwyczaj znajdują się na białym tle, ma również białe jądra, ponieważ gen mini-biały znajdujący się w elementach P nie sprzyja akumulacji pigmentu w jądrach. Kiedy jądra Drosophila nie mogą być rozróżniane po kol...

Jądra Drosophila są idealnym modelowym systemem do badania wielu procesów biologicznych, w tym regulacji komórek macierzystych, mejozy i rozwoju plemników13-18. Spermatocyty i ich wrzeciona mejotyczne są duże, a zatem wygodne do analizy cytologicznej, a rozluźnione punkty kontrolne cyklu komórkowego podczas spermatogenezy ułatwiają badanie mutacji w genach cyklu komórkowego. Różne typy komórek można zaobserwować w uporządkowanej progresji na całej długości jąder, a każde zakłócenie spermatogenezy może prowadzić do zmian w tym ogólnym układzie. Cechy te, w połączeniu z narzędziami genetycznymi Drosophila, ułatwiły analizę mutacji spermatogenezy21-23.
Etapy spermatogenezy Drosophila zostały dobrze zdefiniowane. Komórki linii rozrodczej, które rozwijają się synchronicznie w torbielach, przechodzą sekwencyjnie przez etapy spermatogenezy wzdłuż jądra. Zarówno podczas podziałów mitotycznych, jak i mejotycznych męskich komórek rozrodczych, cytokineza zachodzi niekompletnie, tak że komórki potomne pozostają połączone mostkami cytoplazmatycznymi znanymi jako kanały pierścieniowe (ryc. 1). Wierzchołkowy wierzchołek jądra zawiera populację zarodkowych komórek macierzystych, która daje początek komórkom spermatogonialnym, które przechodzą cztery podziały mitotyczne z niepełną cytokinezą w celu wytworzenia 16-komórkowych torbieli pierwotnych spermatocytów. Po premejotycznej fazie S pierwotne spermatocyty wchodzą w G2, przedłużony okres wzrostu ~90 godzin, podczas którego objętość komórkowa wzrasta ~25-krotnie. Postęp przez mejozę I i mejozę II powoduje powstawanie odpowiednio 32-komórkowych torbieli wtórnych spermatocytów i 64-komórkowych torbieli haploidalnych spermatidów. Niedojrzałe, okrągłe plemniki przechodzą rozległą przebudowę komórkową w celu wytworzenia dojrzałych plemników. Komórki postmejotyczne, w szczególności wiązki wydłużających się i dojrzałych spermatydów, zajmują większość objętości jądra.
Pomyślny transport funkcjonalnego plemnika do samic muszki wymaga koordynacji między różnymi częściami męskiego układu rozrodczego, który składa się z kilku sparowanych struktur (jądra, pęcherzyki nasienne i gruczoły dodatkowe) oraz pojedynczego przewodu wytryskowego (Rysunek 2). Plemniki są wytwarzane w jądrach i przechowywane w pęcherzykach nasiennych aż do kopulacji24. Gruczoły dodatkowe zawierają komórki wydzielnicze, które wytwarzają płyn nasienny. Plemniki migrujące z pęcherzyków nasiennych są mieszane z płynem nasiennym w przewodzie wytryskowym, który jest połączony zarówno z pęcherzykami nasiennymi, jak i gruczołami dodatkowymi. Ta mieszanina nasienia i płynu nasiennego jest ostatecznie wypompowywana z samca do pochwy samicy przez opuszkę wytryskową znajdującą się na tylnym końcu męskiego brzucha25. Białka w płynie nasiennym są niezbędne do długotrwałego przechowywania plemników w wyspecjalizowanych narządach zwanych spermatekami w drogach rozrodczych samic Drosophila 26.
Doskonałe metody izolacji jąder Drosophila i wizualizacji komórek na różnych etapach spermatogenezy są dostępne w literaturze naukowej3-12. W niniejszym dokumencie uzupełniamy ten zasób wiedzy, prezentując przykłady tych protokołów wraz z towarzyszącą demonstracją wideo. Protokół przygotowania żywych próbek jąder do mikroskopii z kontrastem fazowym opiera się na wcześniej opisanej metodzie27. Protokół wiązania formaldehydu i barwienia immunologicznego jąder również opiera się na wcześniej opisanej metodzie28. Opisane w niniejszym dokumencie podejścia zostały wykorzystane w wielu badaniach spermatogenezy Drosophila (na przykład do oceny roli dyneiny, silnika mikrotubul skierowanego na koniec ujemny, podczas spermatogenezy Drosophila).
Oprócz podstawowych protokołów, znajdują się sugestie dotyczące różnicowania sekcji tak, aby wzbogacić o spermatogonię, spermatocyty lub dojrzałe plemniki. Opisano różne metody przetwarzania jąder, tak aby torbiele albo pozostały nienaruszone, albo zostały przerwane w razie potrzeby. Zaletą stosowania jąder Drosophila jako systemu modelowego jest to, że w porównaniu z oocytami i zarodkami Drosophila, przeciwciała i barwniki mogą łatwo przenikać do komórek po ich rozproszeniu z jąder i wymagana jest mniejsza liczba etapów mycia; Dzięki temu protokoły mogą być wykonywane w stosunkowo krótkim czasie.

<table><tbody><tr><td>Sylgard</td><td>World Precision Instruments</td><td>SYLG184</td><td>Dwuczęściowy elastomer silikonowy do wytwarzania pokrytego silikonem naczynia preparacyjnego z szalki Petriego Kimax</td></tr><tr><td>długopis PAP</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9888126</td><td>Ted Pella #22309</td></tr><tr><td>Bezbarwny ochraniacz do paznokci</td><td>Wet n Wild</td><td>7780235001</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade z technologiami DAPI</td><td>Life</td><td>P36931</td><td></td></tr><tr><td>Mysie przeciwciało anty-gamma-tubulinowe (klon GTU-88)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6557</td><td></td></tr><tr><td>Cy3-AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG&nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-165-003</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-100</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC61511-0040</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A412-4</td><td></td></tr><tr><td>16% Formaldehyd</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>28908</td><td></td></tr><tr><td>Sigmacote</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SL2</td><td>Stosować zgodnie ze wskazówkami producenta do silikonowania szkiełek nakrywkowych</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-9542</td><td>0,5 mg/ml w 75% etanolu; przechowywać w temperaturze -20 & stopni; C</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Research Products International Corp.</td><td>S23020</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9763</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0751</td><td></td></tr><tr><td>Delikatne wycieraczki Kimwipes</td><td>Fisher Scientific</td><td>S47299</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Research Products International Corp.</td><td>A30075</td><td>Szklany</td></tr><tr><td>słoik do barwienia z kopliny</td> klasy biologii molekularnej, zakrętka <td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>70315</td><td></td></tr><tr><td>Pojedyncze matowe szkiełka mikroskopowe</td><td>Corning</td><td>2948-75X25</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe pokryte poli-L-lizyną</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>22247-1</td><td>Opcjonalnie (w celu wymiany nieobrobionych szkiełek mikroskopowych)</td></tr> <tr><td>Kwadratowa szklana osłona</td><td>Corning</td><td>2865-22</td><td></td></tr><tr><td>Żyletki</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>Kimax szalka Petriego</td><td>Fisher Scientific</td><td>S31473</td><td>Kimble #23060 10015</td></tr><tr><td>Kleszcze</td> EMD <td>Dumont</td><td>52100-51S</td><td>Wzór 5 Stereoskop</td></tr> <tr><td></td><td>INOX Stemi 2000-CSObiektyw Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eclipse 80i</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plan-Fluor 40X</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axiophot</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plan-Neofluar Ph2 40X Obiektyw</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

cytologiczna analiza spermatogenezy: żywe i utrwalone preparaty jąder drosophila

Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes

Drosophila melanogaster to potężny system modelowy, który był szeroko stosowany do wyjaśniania różnych procesów biologicznych. Na przykład badania zarówno żeńskich, jak i męskich linii rozrodczych Drosophila w znacznym stopniu przyczyniły się do obecnego zrozumienia mejozy, a także biologii komórek macierzystych. W literaturze dostępne są doskonałe protokoły izolacji i obrazowania jajników i jąder Drosophila 3-12. W niniejszym artykule opisano metody preparacji i przygotowania jąder Drosophila do analizy mikroskopowej wraz z dołączoną demonstracją wideo. Przedstawiono protokół izolacji jąder z brzucha dorosłych samców i przygotowania preparatów z żywymi tkankami do analizy za pomocą mikroskopii z kontrastem fazowym, a także protokół utrwalania i barwienia immunologicznego jąder do analizy za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Techniki te mogą być stosowane w charakterystyce mutantów Drosophila, które wykazują defekty w spermatogenezie, a także w wizualizacji subkomórkowych lokalizacji białek.

Przykład prawidłowo wypreparowanej pary narządów rozrodczych samca Drosophila przedstawiono na Rysunku 2A. Jądra usunięte z odwłoka dorosłego samca muchy są zazwyczaj połączone z przewodem wytryskowym (brązowy, Rysunek 2A') oraz parą gruczołów dodatkowych (zielone, Rysunek 2A') za pomocą pary pęcherzyków nasiennych (niebieskie, Rysunek 2A'). Aby oddzielić jądra od większości towarzyszącej tkanki somatycznej, należy odciąć i usunąć przewód wytrys...

Metody izolowania i przygotowywania próbek jąder Drosophila (żywych i stałych) do obrazowania za pomocą mikroskopii kontrastu fazowego i fluorescencji są opisane tutaj.

Cytologiczna analiza spermatogenezy: żywe i utrwalone preparaty jąder Drosophila

Drosophila melanogaster is a powerful model system that has been widely used to elucidate a variety of biological processes. For example, studies of both ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wyizolowanie i przygotowanie jąder Drosophila do badań mikroskopowych. Jest to realizowane poprzez wypreparowanie par jąder z odwłoka samców much. Drugim krokiem jest rozerwanie jąder na odpowiednim etapie rozwoju oraz ich rozgniecenie w celu uwolnienia zawartych w nich komórek.Następnie rozgniecione jądra zostają utrwalone, a potem inkubowane z przeciwciałami pierwotnymi i wtórnymi. Końcowym etapem jest osadzenie tkanki na szkiełku przedmiotowym w celu obrazowania. Ostatecznie wykorzystuje się mikroskopię w kontraście fazowym lub immunofluorescencyjną, aby obserwować komórki na różnych etapach spermatogenezy pod kątem defektów i morfologii, a także aby badać subkomórkową lokalizację różnych białek.Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu biologii rozwoju, takie jak identyfikacja krytycznych ról białek podczas przebiegu spermatogenezy. Wizualna demonstracja sekcji jąder RAs jest kluczowa, ponieważ osoba początkująca w tej procedurze może początkowo mieć trudności z zlokalizowaniem jąder w odwłoku muchy. Ponadto łatwiej jest zademonstrować, niż opisać słowami, najskuteczniejszy sposób rozgniecania tkanki.Aby rozpocząć sekcję, uśpij muchy w butelce lub fiolce za pomocą strumienia dwutlenku węgla. Następnie przenieś uśpione muchy na podkładkę do much. Posegreguj muchy pod mikroskopem stereotypowym, używając małego pędzla, aby zebrać od sześciu do ośmiu samców oph o pożądanym genotypie.Następnie za pomocą pęsety usuń skrzydła z każdej muchy. Zapobiegnie to wypływaniu much na powierzchnię cieczy. Podczas sekcji nanieś jedną kroplę 500 µL soli fizjologicznej w buforze fosforanowym (PBS) na pokrytą silikonem szalkę sekcyjną z czarnym tłem.Następnie skieruj pęsetę w stronę przedniego końca jednej z much pozbawionych skrzydeł. Chwyć ją za klatkę piersiową i zanurz w kropli PBS. Zidentyfikuj ciemnobrązową strukturę znajdującą się na tylnym końcu brzusznej strony odwłoka, a następnie za pomocą drugiej pęsety chwyć i pociągnij genitalia zewnętrzne do tyłu, aż oddzielą się od odwłoka.W większości przypadków jądra, pęcherzyki nasienne i gruczół akcesoryjny zostaną usunięte z jamy brzusznej wraz z narządami płciowymi zewnętrznymi. Jeśli jednak tak się nie stanie, należy wprowadzić pęsetę do jamy brzusznej i delikatnie wydobyć jądra. Następnie, używając dwóch pęset, należy oddzielić jądra od gruczołów akcesoryjnych i narządów płciowych zewnętrznych.Odróżnij jądra typu dzikiego od sąsiadujących białych tkanek po ich żółtym kolorze. Aby przygotować próbkę do obrazowania na żywo, użyj pęsety, aby delikatnie umieścić od dwóch do trzech par jąder w kropli 4–5 µL PBS na kwadratowej szkiełku nakrywkowym. Następnie rozrywaj.Otwórz każdy jądra za pomocą pincety na odpowiednim poziomie, aby zmaksymalizować obecność pożądanych typów komórek linii zarodkowej w preparacie. Zawartość jąder wypłynie z rozerwanego obszaru na szkiełko. Podczas etapu rozcierania (squashing) w celu wzbogacenia preparatu w spermatogonia i spermatocyty, rozerwij jądra w pobliżu ich wierzchołka.Aby uzyskać spermatocyty i spermatydy, rozerwij jądra w miejscu nieco bardziej podstawnym niż poziom pierwszy, aby zwiększyć liczbę bardziej dojrzałych komórek linii zarodkowej. Rozrywaj jądra bliżej miejsca, w którym zaczyna się zakrzywienie. Kolejnym krokiem jest rozgniecenie jąder poprzez delikatne nałożenie szkiełka przedmiotowego na szkiełko nakrywkowe.Nie należy wywierać nacisku ręcznie i należy unikać powstawania pęcherzyków powietrza. W celu obserwacji żywych komórek próbkę należy wykorzystać w ciągu 15 minut od przygotowania. Podczas mikroskopii fazowo-kontrastowej należy delikatnie odsączyć nadmiar cieczy spod szkiełka nakrywnego za pomocą chusteczki do czyszczenia, aby umożliwić spłaszczenie preparatu, aż komórki rozrodcze zostaną wyraźnie ustawione w ostrości.Przygotowane preparaty z rozgniecionymi jądrami poddaj szybkiemu zamrażaniu, zanurzając je za pomocą metalnej pęsety w ciekłym azocie, aż do zaprzestania bulgotania cieczy. Natychmiast usuń szkiełko nakrywkowe za pomocą żyletki. Następnie przenieś preparaty metalną pęsetą do uprzednio schłodzonego szklanego statywu na szkiełka wypełnionego lodowatym 95% etanolem i przechowuj próbkę w temperaturze -20°C przez 10 minut.Przenieść wyrównane preparaty na szklaną kasetę wypełnioną 4% formaldehydem w PBS z dodatkiem 0,1% Triton X 100 lub PBST i inkubować w temperaturze pokojowej przez siedem minut. Następnie przenieść preparaty do kasety wypełnionej PBS. Płukać preparaty w PBS przez pięć minut w temperaturze pokojowej, wylewając roztwór z kasety i zastępując go świeżym roztworem PBS.Powtórz płukanie raz. Odlej PBS i zanurz preparaty w PBST na 30 minut w temperaturze pokojowej, aby przeprowadzić permeabilizację błon komórkowych. Następnie wypłucz preparaty trzykrotnie w PBS przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Obrysuj tkankę w preparacie (metoda squash) za pomocą pisaka do tworzenia barier hydrofobowych, aby ograniczyć rozprzestrzenianie się roztworów przeciwciał i zapewnić stałe nawilżenie tkanki podczas barwienia immunocytochemicznego.Następnie do tkanki wewnątrz okręgu należy dodać od 30 do 40 µL przeciwciała pierwszorzędowego rozcieńczonego w PBST. Po inkubacji z przeciwciałem pierwszorzędowym preparat należy inkubować w wilgotnej, ciemnej komorze przez dwie godziny w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C. Slajdy należy przemyć trzykrotnie w PBS przez pięć minut w temperaturze pokojowej.Następnie należy dodać do tkanki od 30 do 40 µL koniugowanego przeciwciała wtórnego znakowanego fluorophorem, rozcieńczonego w PBS, i inkubować w ciemności przez jedną do dwóch godzin w temperaturze pokojowej. Następnie szkiełka należy przemyć trzykrotnie w PBS przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Na koniec do tkanki wewnątrz okręgu należy dodać od 30 do 40 µL roztworu DAPI.Ostrożnie nałóż szkiełko nakrywkowe na tkankę, dbając szczególnie o to, aby nie uwięzić pęcherzyków powietrza. Jeśli pojawią się pęcherzyki powietrza, ostrożnie przesuwaj szkiełko nakrywkowe, nie niszcząc próbki, aż pęcherzyki ujdą bokami szkiełka. Nadmiar cieczy z krawędzi szkiełka przedmiotowego usuń za pomocą chusteczki do czyszczenia.Następnie należy uszczelnić szkiełko nakrywkowe za pomocą laku do paznokci i ocenić barwienie immunofluorescencyjne komórek przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego w ciągu trzech do czterech godzin. Ten schemat przedstawia lokalizację różnych poziomów dojrzewania komórek w jądrach Drosophila. Poziom pierwszy zawiera młodsze komórki znajdujące się we wczesnych etapach spermatogenezy, a poziom trzeci zawiera bardziej dojrzałe komórki plemnikowe.Poziom drugi zawiera mieszaną populację meiotycznych i postmeiotycznych komórek linii zarodkowej. Odpowiadający im obraz w kontraście fazowym pokazuje uwalnianie spermatogoniów oraz wczesnych i późnych spermatocytów pierwszego rzędu w momencie rozdarcia jądra na poziomie pierwszym. Żółta strzałka wskazuje również na fuzję dwóch lub więcej połączonych ze sobą komórek w wyniku niepełnej cytokinezy.Artefaktem procedury zgniatania przedstawionej tutaj jest odpowiadający jej obraz w kontraście fazowym, ukazujący uwalnianie późnych spermatocytów pierwszorzędowych i komórek pomiotycznych, w tym spermatyd okrągłych, spermatyd wydłużających się oraz dojrzałych plemników w momencie rozerwania jąder na poziomie drugim. Obrazowanie w kontraście fazowym zgniatanych jąder może być również wykorzystane do łatwej identyfikacji defektów w licznych spermatydach okrągłych. Przedstawione tutaj spermatydy typu dzikiego z jasnym w świetle fazowym jądrem są przyłączone do ciemnego w świetle fazowym pojedynczego agregatu mitochondrialnego o zbliżonej wielkości.W przeciwieństwie do tego, spermatydy z jąder Aun zawierają wiele małych jąder oraz jeden duży agregat mitochondriów, co jest wynikiem niepowodzenia cytokinezy i błędów w segregacji chromosomów. Przedstawione tutaj obrazy w skali szarości pochodzą z preparatu rozgniecionych jąder barwionych odczynnikami, które w kolorze identyfikują mikrotubule, DNA i centrosomy. Połączone obrazy przedstawiają dzielący się spermatocyt, szerokie pole okrągłych spermatyd oraz wiązkę dojrzałych plemników. Po opanowaniu techniki przygotowania próbek, mikroskopia w kontraście fazowym może zostać przeprowadzona w ciągu 20 do 30 minut.Przygotowanie próbek do mikroskopii immunofluorescencyjnej może zostać przeprowadzone w ciągu sześciu godzin, jeśli proces zostanie wykonany prawidłowo. Oprócz opracowania jąder oph do mikroskopii, wypreparowane jądra mogą być alternatywnie wykorzystane do biochemicznej analizy białek.

cytological-analysis-spermatogenesis-live-fixed-preparations

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Analiza cytologiczna spermatogenezy: Żywe i utrwalone preparaty jąder Drosophila

Obrazowanie białek centrosomalnych podczas spermatogenezy Drosophila jest skuteczną metodą identyfikacji nowych białek krytycznych dla biologii centrosomów, a także wyjaśnienia szczególnej funkcji znanych graczy w tym procesie.

Obrazowanie centrosomów w jądrach much

Barwienie immunologiczne jest skuteczną techniką wizualizacji określonych typów komórek i białek w tkankach. Wykorzystując sonikację, opisany tutaj protokół łagodzi potrzebę preparowania tkanek Drosophila melanogaster z zarodków i larw w późnym stadium przed barwieniem immunologicznym. Zapewniamy skuteczną metodologię barwienia immunologicznego całych larw utrwalonych formaldehydem.

Wspomagane sonikacją barwienie immunofluorescencyjne tkanek drobnoustrojowych i larwalnych drobnoustrojowych i larwalnych Drosophila in situ

Ten protokół opisuje sekcję i hodowlę nienaruszonych jąder i torbieli linii zarodkowej poczwarek Drosophila melanogaster. Metoda ta pozwala na mikroskopową obserwację spermatogenezy ex vivo. Ponadto opisano test farmakologiczny wpływu inhibitorów na określone etapy rozwoju komórek rozrodczych w jądrach poczwarki.

Ex vivo Posiew jądra poczwarki Drosophila i pojedyncze torbiele linii zarodkowej samca: rozwarstwienie, obrazowanie i leczenie farmakologiczne

Przedstawiamy protokoły pobierania, przygotowania i obrazowania dojrzałych oocytów Drosophila. Metody te pozwalają na wizualizację zachowania chromosomów oraz składania i funkcji wrzeciona podczas mejozy.

Techniki obrazowania prometafazy i metafazy mejozy I w utrwalonych oocytach Drosophila

Celem tej techniki zgniatania kanalików jest szybka ocena cech cytologicznych rozwijających się mysich spermatocytów przy jednoczesnym zachowaniu integralności komórkowej. Metoda ta pozwala na badanie wszystkich etapów spermatogenezy i może być łatwo stosowana wraz z innymi biochemicznymi i molekularnymi podejściami biologicznymi do badania mejozy myszy.

Technika squasha kanalików nasiennych do cytologicznej analizy spermatogenezy z wykorzystaniem modelu mysiego

Celem tego protokołu jest analiza podziału komórek w nienaruszonej tkance za pomocą żywej i utrwalonej mikroskopii komórkowej przy użyciu mejocytów Drosophila. Protokół pokazuje, jak wyizolować całe, nienaruszone jądra od larw Drosophila i wczesnych poczwarek oraz jak je przetworzyć i zamontować pod mikroskopem.

Przygotowanie jąder larw i poczwarek Drosophila do analizy podziału komórkowego w żywych, nienaruszonych tkankach

Prezentujemy tutaj ulepszony protokół przygotowania całego mocowania i barwienia immunologicznego jąder Drosophila, odpowiedni do mikroskopii konfokalnej, a także umożliwiający powtarzalne i wiarygodne znakowanie. Ilustrujemy ten protokół poprzez reprezentację 3D i kwantyfikację eksperymentów kolokalizacyjnych na dużych spermatocytach S4-S5.

Barwienie immunologiczne jąder Drosophila w celu analizy konfokalnej 3D dużych spermatocytów

Prezentowany tutaj jest protokół mikroiniekcji i jednoczesnego obrazowania wielu zarodków Drosophila podczas rozwoju embrionalnego za pomocą obrazowania o wysokiej zawartości na płytce.

Przygotowanie zarodków Drosophila i mikroiniekcja do mikroskopii żywych komórek wykonana przy użyciu automatycznego analizatora o wysokiej zawartości

Tutaj prezentujemy prostą i skuteczną metodę izolowania żywych mejotycznych i postmejotycznych komórek rozrodczych od jąder dorosłych myszy. Korzystając z barwnika wiążącego DNA o niskiej cytotoksyczności, wzbudzonego fioletem i sortowania komórek aktywowanego fluorescencją, można wyizolować wysoce wzbogacone populacje komórek spermatogennych do wielu dalszych zastosowań.

Izolacja mysich komórek spermatogennych za pomocą fioletowo-wzbudzonego, przepuszczalnego dla komórek barwnika wiążącego DNA

Tutaj udostępniamy protokół sekcji wymagany do zobrazowania na żywo późnej embrionalnej męskiej gonady Drosophila. Protokół ten pozwoli na obserwację dynamicznych procesów komórkowych w normalnych warunkach lub po manipulacji transgenicznej lub farmakologicznej.

Sekcja i obrazowanie na żywo późnej embrionalnej gonady Drosophila

Ten artykuł opisuje in-vivo hamowanie CENP-E poprzez operację jamy brzusznej i wstrzyknięcie do jąder GSK923295, cenny model męskiego podziału mejotycznego. Korzystając z testów immunofluorescencji, cytometrii przepływowej i transmisyjnej mikroskopii elektronowej, pokazujemy, że hamowanie CENP-E powoduje niewspółosiowość chromosomów i niestabilność genomu w spermatocytach myszy.

Ocena funkcjonalna kinezyny-7 CENP-E w spermatocytach za pomocą inhibicji in vivo, immunofluorescencji i cytometrii przepływowej

Poznaj metody izolacji i przygotowania jąder Drosophila do mikroskopii, w tym preparatywkę, utrwalanie oraz barwienie immunofluorescencyjne. Techniki te umożliwiają obserwację spermatogenezy na poziomie komórkowym.

Cytologiczna analiza spermatogenezy: żywe i utrwalone preparaty jąder Drosophila

Przeglądaj więcej filmów