Drosophila Larwalne IHC

Drosophila melanogaster jest szeroko badanym organizmem modelowym ze względu na swoją wszechstronność i łatwość zastosowania.

Immunohistochemia przeprowadzona na preparatach larwalnych Drosophila jest nieocenioną metodą, która może dostarczyć informacji na temat obecności, lokalizacji i kolokalizacji białek.

W tym filmie omówione zostaną podstawowe metody preparacji, utrwalania, blokowania i montowania tkanek larwalnych Drosophila oraz przykłady ich zastosowań.

Immunohistochemia to proces, który wykorzystuje zmodyfikowane przeciwciała do celowania, wiązania i ostatecznie wizualizacji określonych białek w tkance.

Immunohistochemia larwy Drosophila zależy od prawidłowego rozwarstwienia, które wymaga dokładności i terminowości ze względu na wrażliwość tkanki larwalnej.

Sekcja jest zwykle wykonywana w soli fizjologicznej buforowanej fosforanami, w skrócie "PBS".

Po ekstrakcji narządy są tymczasowo umieszczane w PBS – roztworze soli fizjologicznej o takim samym pH jak wewnętrzne pH larwy.

Po rozbiorze, kolejnym krokiem w larwie Drosophila jest fiksacja.

Utrwalanie to proces, w którym tkankę umieszcza się w rozcieńczonym roztworze na bazie formaldehydu, który zachowuje tkankę.

To utrwalanie zapobiega enzymatycznemu rozkładowi białek w tkance.

Po utrwaleniu, w całym procesie barwienia immunologicznego zachodzi kilka etapów płukania przy użyciu PBS zawierającego Triton-X, zwanego PBST.

Triton-X100 dostarcza niewielką ilość detergentu, który służy jako łamacz napięcia powierzchniowego i przenika do komórki, umożliwiając wnikanie przeciwciał i innych odczynników.

Po utrwaleniu i umyciu tkanka jest gotowa do zablokowania.

Roztwór blokujący zawiera białka, które wiążą się z tkanką i zajmują niespecyficzne miejsca wiązania, do których w przeciwnym razie przylegałyby przeciwciała specyficzne dla celu. Blokowanie pomaga zapobiegać fałszywie dodatniemu sygnałowi białkowemu.

Po zablokowaniu tkanka jest przygotowywana do barwienia.

Barwienie obejmuje wysoce specyficzne "pierwszorzędowe" przeciwciało, które wiąże się z białkiem docelowym zwanym antygenem.

"Drugorzędowe" przeciwciało sprzężone z cząsteczką reporterową wiąże przeciwciało pierwszorzędowe.

Cząsteczka reporterowa emituje zlokalizowany sygnał, który można zwizualizować, który często ma charakter fluorescencyjny.

Po każdym etapie inkubacji przeciwciał nadmiar przeciwciał jest zmywany w celu usunięcia wszelkich przeciwciał, które związały się niespecyficznie.

Po procesie barwienia próbka musi zostać zamontowana.

Aby zobaczyć wyniki barwienia, tkankę należy ostrożnie zamontować na szkiełkach.

Do owinięcia tkanki używa się gęstego odczynnika lub podłoża montażowego.

Próbka jest następnie gotowa do obejrzenia pod mikroskopem.

Teraz, gdy przeszliśmy przez zasady immunohistochemii Drosophila, jesteśmy gotowi, aby zobaczyć, jak to się robi.

W tym filmie skupimy się na odczynnikach, narzędziach i procesach stosowanych w immunohistochemii mózgu larwalnego Drosophila, zaczynając od fiksacji.

Proces, który śledzimy, wykorzystuje cały mózg i jest znany jako barwienie całego wierzchowca.

Chociaż procedura preparacji różni się w zależności od typu tkanki użytej w eksperymencie, główne etapy IHC pozostają takie same, więc przejdziemy do etapu fiksacji.

Po zakończeniu sekcji mózgów larw należy usunąć PBS za pomocą pipety.

Dodaj utrwalacz i inkubuj zgodnie z określonym protokołem, dla mózgu użyj 23 min.

Po utrwaleniu przemyć próbki czterokrotnie w PBST.

Próbki należy inkubować w roztworze blokującym przez co najmniej 30 minut w temperaturze pokojowej.

Stosując odpowiednie rozcieńczenia, inkubować w roztworze przeciwciała pierwszorzędowego przez noc w temperaturze 4 °C.

Po okresie inkubacji umyć mózgi czterokrotnie w PBST końcówką pipety w temperaturze pokojowej.

Próbki należy inkubować w przeciwciałach drugorzędowych przez noc w temperaturze 4 °C w ciemności, aby zapobiec bieleniu fluoroforów.

Ponownie, umyj mózgi cztery razy w PBST.

Równowaga mózgów w pożywce montażowej przez jedną godzinę.

Po zrównoważeniu przenieś mózgi na szkiełko za pomocą pipety p200 z odciętą końcówką.

Umieść przekładki wokół próbki, aby zapobiec jej zgnieceniu.

Na próbki nałożyć szkiełko nakrywkowe.

Uszczelnij krawędzie poślizgu lakierem do paznokci. Mózgi larw są teraz gotowe do wizualizacji za pomocą immunohistochemii

Teraz, gdy omówiliśmy immunohistochemię mózgów Drosophila, przejdźmy do kilku alternatywnych sposobów stosowania procedur IHC.

Alternatywne techniki preparacji i utrwalania mogą być wykorzystane do przygotowania larwy Drosophila do obrazowania.

W tym eksperymencie naukowcy chcą dowiedzieć się, w jaki sposób komórki generują określone kształty.

Robią to, śledząc morfologie larwalnych komórek końcowych tchawicy.

Naukowcy wykorzystują zmutowaną linię muchową, która wykazuje ekspresję GFP.

Ekspresja GFP jest indukowana przez wystawienie na działanie ciepła w łaźni wodnej

Larwy są wybierane pod mikroskopem preparacyjnym z fluorescencją.

Muchy emitujące fluorescencję wskazują na udaną aktywację GFP.

Muchy te są poddawane alternatywnej formie utrwalania za pomocą ciepła; Nie jest konieczna żadna sekcja.

Po użyciu oprogramowania wspomagającego śledzenie identyfikowane są morfologie komórkowe gałęzi tchawicy i światła .

Jajnik Drosophila jest doskonałym modelem do zrozumienia, w jaki sposób komórki macierzyste oddziałują ze swoim środowiskiem komórkowym.

IHC jajników Drosophila zaczyna się od identyfikacji samic Drosophila na podstawie obecności jajników w porównaniu z jądrami, które są widoczne u samców.

Zebrane larwy samic są przenoszone do indywidualnych studzienek, gdzie są starannie preparowane w celu uzyskania struktury zwanej ciałem tłuszczowym, w której mieszczą się jajniki.

Ciała tłuszczowe są utrwalane i barwione, a następnie – po umieszczeniu tkanki na szkiełkach – jajniki są oddzielane od tkanki tłuszczowej ciała. Po zamontowaniu i wizualizacji szkiełek, barwienie fluorescencyjne ujawnia lokalizację komórek somatycznych i pierwotnych komórek rozrodczych w jajniku larwy .

Immunohistochemia larw Drosophila ma wiele podobieństw do poczwarki i dorosłego IHC.

Na przykład, naukowcy mogą użyć IHC do przyjrzenia się siatkówkom Drosophila na różnych etapach rozwoju: larwalnym, poczwarkowym i dorosłym, ilustrując w ten sposób różnicę między procedurami immunohistochemicznymi poczwarki, larwy i dorosłego.

Wyniki pokazują różne etapy rozwoju siatkówki Drosophila.

Immunohistochemia larwy Drosophila jest narzędziem o dużej liczbie zastosowań i odmian. W tym filmie omówiliśmy procedury barwienia immunologicznego larw, w tym preparację, utrwalanie, barwienie i mocowanie. Dzięki za oglądanie!