IHC larw Drosophila

Drosophila melanogaster jest szeroko badanym organizmem modelowym ze względu na swoją wszechstronność i łatwość w obsłudze.

Immunohistochemia przeprowadzana na preparatach larw Drosophila jest nieocenioną metodą, która pozwala uzyskać informacje o obecności, lokalizacji oraz ko-lokalizacji białek.

W niniejszym materiale wideo omówione zostaną podstawowe metody sekcji, fiksacji, blokowania i montowania tkanek larw Drosophila oraz przykłady ich zastosowań.

Immunohistochemia jest procesem, w którym wykorzystuje się zmodyfikowane przeciwciała do namierzania, wiązania i ostatecznie wizualizacji specyficznych białek w tkance.

Immunohistochemia larw Drosophila opiera się na prawidłowej sekcji, która wymaga precyzji i szybkości ze względu na wrażliwość tkanki larwalnej.

Sekcję przeprowadza się zazwyczaj w soli fizjologicznej z buforem fosforanowym, w skrócie „PBS”.

Po wyekstrahowaniu narządy umieszcza się tymczasowo w PBS – roztworze soli o pH równym pH wewnętrznemu larwy.

Kolejnym krokiem w procedurze IHC larw Drosophila po sekcji jest fiksacja.

Fiksacja to proces, w którym tkankę umieszcza się w rozcieńczonym roztworze na bazie formaldehydu, co pozwala na jej utrwalenie.

Roztwór utrwalający zapobiega enzymatycznemu rozkładowi białek w tkance.

Po fiksacji, w całym procesie barwienia immunologicznego, następuje kilka etapów płukania z użyciem PBS zawierającego Triton-X, zwanego PBST.

Triton-X100 dostarcza niewielką ilość detergentu, który działa jako środek zmniejszający napięcie powierzchniowe i zwiększa przepuszczalność komórek, umożliwiając wniknięcie przeciwciał i innych odczynników.

Po fiksacji i płukaniu tkanka jest gotowa do blokowania.

Roztwór blokujący zawiera białka, które wiążą się z tkanką i zajmują niespecyficzne miejsca wiązania, do których w przeciwnym razie przyczepiłyby się przeciwciała specyficzne dla celu. Blokowanie pomaga zapobiec wystąpieniu fałszywie dodatniego sygnału białkowego.

Po blokowaniu tkanka jest przygotowywana do barwienia.

Barwienie polega na zastosowaniu wysoce specyficznego przeciwciała „pierwotnego”, które wiąże się z białkiem docelowym zwanym antygenem.

Przeciwciało „wtórne”, sprzężone z cząsteczką raportującą, wiąże się z przeciwciałem pierwotnym.

Cząsteczka raportująca emituje zlokalizowany sygnał, który można zwizualizować, często o charakterze fluorescencyjnym.

Po każdym etapie inkubacji z przeciwciałami nadmiar przeciwciał jest wypłukiwany, aby usunąć wszystkie przeciwciała, które związały się niespecyficznie.

Po procesie barwienia próbkę należy zamontować.

Aby zobaczyć wyniki barwienia, tkankę należy ostrożnie nanieść na szkiełka przedmiotowe.

Do zamknięcia tkanki używa się gęstego odczynnika lub medium montażowego.

Próbka jest następnie gotowa do obserwacji pod mikroskopem.

Po omówieniu zasad immunohistochemii Drosophila jesteśmy gotowi, aby zobaczyć, jak przeprowadza się tę procedurę w praktyce.

W tym filmie skupimy się na odczynnikach, narzędziach i procesach stosowanych w immunohistochemii mózgu larwy Drosophila, zaczynając od utrwalania.

Stosowany przez nas proces obejmuje cały mózg i jest znany jako barwienie preparatów całych (whole mount staining).

Choć procedura sekcji różni się w zależności od rodzaju tkanki użytej w eksperymencie, główne etapy IHC pozostają takie same, dlatego przejdziemy bezpośrednio do etapu utrwalania.

Po zakończeniu sekcji mózgów larwalnych usunąć PBS za pomocą pipety.

Dodać utrwalacz i inkubować zgodnie z konkretnym protokołem; w przypadku mózgów czas inkubacji wynosi 23 min.

Po utrwalaniu przemyć próbki czterokrotnie w PBST.

Inkubować próbki w roztworze blokującym przez co najmniej 30 min w temperaturze pokojowej.

Stosując odpowiednie rozcieńczenia, inkubować w roztworze przeciwciała pierwszorzędowego przez noc w 4 °C.

Po okresie inkubacji przemyć mózgi czterokrotnie w PBST za pomocą końcówki pipety w temperaturze pokojowej.

Inkubować próbki w przeciwciałach wtórnych przez noc w 4 °C w ciemności, aby zapobiec blaknięciu fluoroforów.

Ponownie przemyć mózgi czterokrotnie w PBST.

Równoważyć mózgi w medium montującym przez jedną godzinę.

Po równoważeniu przenieść mózgi na szkiełko przedmiotowe za pomocą pipety p200 z odciętą końcówką.

Umieścić dystansory wokół próbki, aby zapobiec jej zmiażdżeniu.

Przykryć próbki szkiełkiem nakrywką.

Uszczelnić krawędzie szkiełka lakierem do paznokci. Mózgi larwalne są teraz gotowe do wizualizacji metodą immunohistochemiczną.

Po omówieniu immunohistochemii mózgów Drosophila, przeanalizujmy alternatywne sposoby stosowania procedur IHC.

Do przygotowania larw Drosophila do obrazowania można zastosować alternatywne techniki sekcji i fiksacji.

W tym eksperymencie badacze chcą dowiedzieć się, w jaki sposób komórki tworzą specyficzne kształty.

Robią to poprzez śledzenie morfologii komórek końcowych cewek tchawkowych larw.

Badacze wykorzystują mutant linię much wyrażającą GFP.

Ekspresja GFP jest indukowana poprzez poddanie działania ciepła w kąpieli wodnej.

Larwy są wybiierane pod mikroskopem sekcyjnym z fluorescencją.

Muchy emitujące fluorescencję wskazują na pomyślną aktywację GFP.

Muchy te poddaje się alternatywnej formie fiksacji termicznej; sekcja nie jest konieczna.

Po zastosowaniu oprogramowania wspomagającego śledzenie, identyfikowane są morfologie komórkowe odgałęzień tchawkowych i światła naczynia.

Jajnik Drosophila stanowi doskonały model do zrozumienia, w jaki sposób komórki macierzyste oddziałują z otoczeniem komórkowym.

IHC jajników Drosophila rozpoczyna się od identyfikacji samic Drosophila na podstawie obecności jajników zamiast jąder, które są widoczne u samców.

Zebrane larwy samic są przenoszone do oddzielnych dołków, gdzie są ostrożnie sekcjonowane w celu uzyskania struktury znanej jako ciało tłuszczowe, w którym znajdują się jajniki.

Ciała tłuszczowe są fiksowane i barwione, a następnie – po umieszczeniu tkanki na szkiełkach – jajniki są oddzielane od tkanki ciała tłuszczowego. Po zamontowaniu i wizualizacji szkiełek, barwienie fluorescencyjne ujawnia lokalizację komórek somatycznych i pierwotnych komórek płciowych w jajniku larwalnym.

Immunohistochemia larw Drosophila ma wiele podobieństw do IHC poczwerek i osobników dorosłych.

Na przykład badacze mogą wykorzystać IHC do analizy siatkówek Drosophila na różnych etapach rozwojowych: larwalnym, poczwarkowym i dorosłym, ilustrując tym samym różnice między procedurami immunohistochemicznymi dla poczwerek, larw i osobników dorosłych.

Wyniki pokazują różne stadia rozwoju siatkówek Drosophila.

Immunohistochemia larw Drosophila jest narzędziem o szerokim zakresie zastosowań i wariantów. W tym filmie omówiliśmy procedury barwienia immunocytochemicznego larw, w tym sekcję, utrwalanie, barwienie i montowanie preparatów. Dziękujemy za oglądanie!