Badanie wpływu probiotyków na kolonizację pneumokoków za pomocą testu przylegania in vitro

Ogólnym celem tej procedury jest zbadanie zdolności probiotycznej komórki paciorkowca levarius do hamowania przylegania pneumokoków do linii komórek nabłonkowych. Osiąga się to poprzez uprzednie przygotowanie monowarstw komórek nabłonka CCL 23. Na 24-dołkowej płytce następnie słowac i pneumokoki są kolejno dodawane do monowarstwy i komórki są inkubowane.

W ostatnim etapie studzienki są myte w celu usunięcia nieprzylegających bakterii. Komórki nabłonkowe CCL 23 są poddawane lizie, a zawartość studzienki jest zbierana. Ostatecznie wpływ salivariusa na przyleganie do zaleceń dotyczących pneumokoków można ocenić, określając ilościowo liczbę pneumokoków związanych z komórkami.

Metoda ta pomaga odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie chorób zakaźnych, takie jak to, czy probiotyki mogą hamować przyleganie patogenów bakteryjnych, takich jak pneumokoki. Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy zaczęliśmy badać potencjalne zastosowanie hipnozy lactobacillus, GG i innych probiotyków w drogach oddechowych. Zademonstrują tę procedurę Jane Manning i Zen doktorantom z naszego laboratorium Na dzień przed eksperymentem podzielono na kulturę konfluencji, CCL 23 komórki nabłonkowe, a następnie rozcieńczono je w pożywce Prewarm do stężenia 150 000 komórek na mililitr w sterylnej probówce o pojemności 50 mililitrów.

Następnie wysiew, jeden mililitr komórek na studzienkę na 24-dołkowej płytce do hodowli tkankowej poddanej działaniu substancji i inkubować komórki przez noc. Następnie za pomocą 10 mikrolitrów zaszczepić pętlę, 10 do 12 dobrze oddzielonych kolonii każdej kultury bakteryjnej do 10-mililitrowej porcji bulionu Todd Hewitt plus 0,5% ekstraktu drożdżowego. Krótko wirować i inkubować kultury przez 14 do 16 godzin w dniu eksperymentu.

Wiruj każdą z kultur bakteryjnych przez trzy do pięciu sekund, a następnie dodaj 100 mikrolitrów pneumokoków i 100 mikrolitrów salivariusa do oznakowanych wstępnie rozgrzanych probówek, zawierających 10 mililitrów bulionu. Wiruj zaszczepione probówki przez trzy do pięciu sekund i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby wyhodować kultury do połowy fazy logarytmicznej. Po potwierdzeniu co najmniej 80% płynności co w hodowli komórkowej CCL 23, użyj pipety transferowej, aby usunąć pożywkę z każdej studzienki płytki 24-dołkowej, lekko przechylając płytkę, aby uniknąć naruszenia monowarstwy komórek, a następnie umyj studzienki dwukrotnie, dodając około 500 mikrolitrów wstępnie podgrzanego PBS i delikatnie usuwając płyn za pomocą pipety transferowej.

Przechyl płytkę podczas prania, aby zachować monowarstwę po drugim praniu. Dodaj 500 mikrolitrów wstępnie podgrzanej pożywki do każdej studzienki i włóż płytkę z powrotem do inkubatora, przygotowując kultury bakteryjne. Najpierw zmierz gęstość optyczną jednego mililitra kultury levarius przy chłonnym 600.

Następnie przenieś pięć mililitrów kultury Sal Levarius do 10-mililitrowej probówki i odwiruj do probówki przez cztery minuty w temperaturze 1 870 G w temperaturze pokojowej. Po odrzuceniu snat Resus zawiesić osad w 200 do 1000 mikrolitrach punktu 85% chlorku sodu w zależności od odczytu OD do końcowego stężenia około 1,5 razy 10 do dziewiątej jednostki tworzącej kolonię na mililitr. Dodanie odpowiedniej liczby bakterii jest najtrudniejszą częścią eksperymentu, ponieważ rzeczywista liczba dodanych bakterii nie jest określana, dopóki nie zostanie przeprowadzone liczenie kolonii następnego dnia.

Teraz przenieś zawieszony inokulum śliny do mikrorurki z napisem "wysoki". Rozcieńczyć wysokie stężenie w ilości od jednego do 10 i od jednego do 100 w 85% roztworze chlorku sodu, aby uzyskać średnie i niskie stężenia alvaru do testu, probówki wirowe między rozcieńczeniami, aby utworzyć studzienki kontrolne heparyny. Usuń 40 mikrolitrów pożywki z każdej studzienki kontrolnej i dodaj 50 mikrolitrów heparyny do końcowego stężenia 100 jednostek na mililitr na studzienkę.

Dodaj 10 mikrolitrów punktu, 85% chlorku sodu tylko do komórek CCL 23, a komórki CCL 23 plus pneumokoki tylko całkowicie zawirują wszystkie stężenia w obszarach SIV. Następnie dodaj 10 mikrolitrów nierozcieńczonego jednego do 10 i jednego do 100 siv różnych stężeń do odpowiednich studzienek, aby ułatwić kontakt bakterii z komórką. Jednowarstwowo odwirować płytkę przez trzy minuty w temperaturze 114 g w temperaturze pokojowej, a następnie inkubować płytkę przez godzinę, podczas gdy komórki inkubują, szeregowo rozcieńczyć wywar śliny w punkcie 85% chlorku sodu i użyć sterylnego rozsiewacza do rozproszenia 100 mikrolitrów 10 do minus pięć, 10 do minus sześć i 10 do minus siedmiu w dwóch egzemplarzach na płytkach agarowych z krwią końską.

Hoduj płytki w pozycji odwróconej przez noc w kierunku końca monowarstwy jako inkubację ratowników. Zmierz gęstość optyczną hodowli pneumokoków, a następnie odwiruj jeden mililitr komórek. Resus zawiesić osad w 300 do 2000 mikrolitrach punktu 85% chlorku sodu w zależności od odczytu OD do końcowego stężenia około 150 milionów jednostek tworzących kolonie na mililitr.

Następnie dodać 10 mikrolitrów nierozcieńczonych pneumokoków do wszystkich studzienek z wyjątkiem studzienek kontroli ujemnej, ponownie odwirować 24-dołkową płytkę, a następnie inkubować kultury co przez trzy godziny na etapie inkubacji. Seryjnie rozcieńczyć i pokryć wywar pneumokokokowy w podobny sposób jak w przypadku salivariusa. Po trzech godzinach inkubacji sprawdź komórki pod mikroskopem pod kątem jakiegokolwiek efektu cytopatycznego.

Teraz wyjmij pożywkę z każdej studzienki i delikatnie umyj kultury co trzy razy jednym XPBS, aby usunąć nieprzylegające bakterie, uważając, aby nie naruszyć monowarstw. Następnie płucz ogniwa z 200 mikrolitrami 0,1%Dig toin przez siedem minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Następnie dodaj 800 mikrolitrów THB do każdego.

Dobrze pipetuj kilka razy w górę i w dół i zbierz zawiesiny komórek z każdej studzienki do oznakowanych mikroprobówek wirówkowych. Na koniec należy seryjnie rozcieńczyć przylegające pneumokoki, a następnie następnego dnia policzyć kolonie na odpowiednich płytkach do rozcieńczania. W celu ilościowego określenia pneumokoków i alvaru w tej tabeli przedstawiono wyniki reprezentatywnego eksperymentu, w którym pneumokoki dodano do komórek CCL 23 godzinę po dodaniu słowaru.

Przestrzeganie zaleceń dotyczących pneumokoków określono ilościowo zarówno za pomocą liczby żywotnych, jak i lit. Wyniki A-Q-P-C-R były spójne między tymi dwiema metodami zarówno dla bezwzględnej liczby bakterii, jak i procentowej adherencji. Znormalizowane do liczby przylegających pneumokoków w studzienkach zawierających same pneumokoki.

Heparyna jest stosowana jako kontrola, ponieważ wiadomo, że hamuje przyleganie do zaleceń dotyczących pneumokoków. W związku z tym zmniejszenie adhezancji o około 40% lub więcej w próbkach pneumokoków i heparyny w porównaniu z samą pneumokokami wskazuje na pomyślny wynik testu. Ponieważ ślina hamuje przyleganie do pneumokoków w sposób zależny od dawki, przy czym wysokie stężenie salivariusa wynoszące około 10 salivarius na jedną pneumokoki skutkowało najniższym przestrzeganiem zaleceń dotyczących pneumokoków.

Przeszczepy te wykazują przyleganie pneumokoków do komórek CCL 23 po dodaniu śliny, na godzinę przed pneumokokami jednocześnie lub godzinę po pneumokokach. Alvar jest bardziej skuteczny w hamowaniu przylegania do pneumokoków, gdy jest dodawany przed pneumokokami, ponieważ zarówno wysokie, jak i średnie dawki Alvara znacznie zmniejszały przyleganie do pneumokoków w teście przededycyjnym. Natomiast w wydaniu Coit i po wydaniu testuje się tylko wysokie dawki Slovaru, które hamowały przestrzeganie zaleceń lekarskich przez pneumokoki.

Tak więc po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykonać test in vitro, aby zmierzyć hamowanie przylegania pneumokoków przez probiotyczne obszary komórek paciorkowców.