Name: Badanie wpływu probiotyków na kolonizację pneumokoków za pomocą testu przylegania in vitro (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-28T13:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Poznaj metodę testu przylegania in vitro do badania wpływu Streptococcus salivarius na kolonizację pneumokoków w liniach komórek nabłonkowych CCL 23. Technika ta pozwala ocenić skuteczność probiotyków w zapobieganiu infekcjom.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Prace te były wspierane przez fundusze z Murdoch Childrens Research Institute oraz Programu Wsparcia Infrastruktury Operacyjnej rządu Wiktorii.

<ol><li>O'Brien, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Burden+of+disease+caused+by+Streptococcus+pneumoniae+in+children+younger+than+5+years%3A+global+estimates%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Burden of disease caused by Streptococcus pneumoniae in children younger than 5 years: global estimates.</a> Lancet. 374, 893-902 (2009).</li>
<li>Bogaert, D., de Groot, R., Hermans, P. W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streptococcus+pneumoniae+colonisation%3A+the+key+to+pneumococcal+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Streptococcus pneumoniae colonisation: the key to pneumococcal disease.</a> Lancet Infect. Dis. 4 (04), 144-154 (2004).</li>
<li>Weinberger, D. M., Malley, R., Lipsitch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serotype+replacement+in+disease+after+pneumococcal+vaccination%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Serotype replacement in disease after pneumococcal vaccination.</a> Lancet. 378 (10), 1962-1973 (2011).</li>
<li>Jacoby, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+the+co-occurrence+of+Streptococcus+pneumoniae+with+other+bacterial+and+viral+pathogens+in+the+upper+respiratory+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Modelling the co-occurrence of Streptococcus pneumoniae with other bacterial and viral pathogens in the upper respiratory tract.</a> Vaccine. 25, 2458-2464 (2007).</li>
<li>Kwambana, B., Barer, M., Bottomley, C., Adegbola, R., Antonio, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+acquisition+and+high+nasopharyngeal+co-colonisation+by+Streptococcus+pneumoniae+and+three+respiratory+pathogens+amongst+Gambian+new-borns+and+infants%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Early acquisition and high nasopharyngeal co-colonisation by Streptococcus pneumoniae and three respiratory pathogens amongst Gambian new-borns and infants.</a> BMC Infect. Dis. 11, (2011).</li>
<li>Licciardi, P. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protecting+against+pneumococcal+disease%3A+critical+interactions+between+probiotics+and+the+airway+microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Protecting against pneumococcal disease: critical interactions between probiotics and the airway microbiome.</a> PLoS Pathog. 8, (2012).</li>
<li>Popova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beneficial+effects+of+probiotics+in+upper+respiratory+tract+infections+and+their+mechanical+actions+to+antagonize+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Beneficial effects of probiotics in upper respiratory tract infections and their mechanical actions to antagonize pathogens.</a> J. Appl. Microbiol. 113 (6), 1305-1318 (2012).</li>
<li>Pracht, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PavA+of+Streptococcus+pneumoniae+modulates+adherence%2C+invasion%2C+and+meningeal+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">PavA of Streptococcus pneumoniae modulates adherence, invasion, and meningeal inflammation.</a> Infect. Immun. 73, 2680-2689 (2005).</li>
<li>Adamou, J. E., Wizemann, T. M., Barren, P., Langermann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adherence+of+Streptococcus+pneumoniae+to+human+bronchial+epithelial+cells+%28BEAS-2B%29%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Adherence of Streptococcus pneumoniae to human bronchial epithelial cells (BEAS-2B).</a> Infect. Immun. 66, 820-822 (1998).</li>
<li>Wong, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+Streptococcus+pneumoniae+adherence+to+human+epithelial+cells+in+vitro+by+the+probiotic+Lactobacillus+rhamnosus+GG%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Res.+Notes%22%5BJournal%5D)">Inhibition of Streptococcus pneumoniae adherence to human epithelial cells in vitro by the probiotic Lactobacillus rhamnosus GG.</a> BMC Res. Notes. 6 (1), 135(2013).</li>
<li>Wescombe, P. A., Heng, N. C. K., Burton, J. P., Chilcott, C. N., Tagg, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streptococcal+bacteriocins+and+the+case+for+Streptococcus+salivarius+as+model+oral+probiotics%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Streptococcal bacteriocins and the case for Streptococcus salivarius as model oral probiotics.</a> Future Microbiol. 4, 819-835 (2009).</li>
<li>Di Pierro, F., Adami, T., Rapacioli, G., Giardini, N., Streitberger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+evaluation+of+the+oral+probiotic+Streptococcus+salivarius+K12+in+the+prevention+of+recurrent+pharyngitis+and%2For+tonsillitis+caused+by+Streptococcus+pyogenes+in+adults%5BTitle%5D)+AND+%22Expert.+Opin.+Biol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Clinical evaluation of the oral probiotic Streptococcus salivarius K12 in the prevention of recurrent pharyngitis and/or tonsillitis caused by Streptococcus pyogenes in adults.</a> Expert. Opin. Biol. Ther. 13 (3), 339-343 (2013).</li>
<li>Fiedler, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+mechanisms+of+respiratory+tract+streptococci+against+Streptococcus+pyogenes+biofilm+formation+and+epithelial+cell+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Protective mechanisms of respiratory tract streptococci against Streptococcus pyogenes biofilm formation and epithelial cell infection.</a> Appl. Environ. Microbiol. 79, 1265-1276 (2013).</li>
<li>Slotved, H. C., Satzke, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+growth+of+pneumococcal+isolates+representing+23+different+serotypes%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Res.+Notes%22%5BJournal%5D)">In vitro growth of pneumococcal isolates representing 23 different serotypes.</a> BMC Res. Notes. 6, 10-1186 (2013).</li>
<li>Carvalho, M. dG. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+and+improvement+of+real-time+PCR+assays+targeting+lytA%2C+ply%2C+and+psaA+genes+for+detection+of+pneumococcal+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Evaluation and improvement of real-time PCR assays targeting lytA, ply, and psaA genes for detection of pneumococcal DNA.</a> J. Clin. Microbiol. 45, 2460-2466 (2007).</li>
<li>Tonnaer, E. L. G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+glycosaminoglycans+in+the+attachment+of+pneumococci+to+nasopharyngeal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+Infect%22%5BJournal%5D)">Involvement of glycosaminoglycans in the attachment of pneumococci to nasopharyngeal epithelial cells.</a> Microbes Infect. 8, 316-322 (2006).</li>
<li>Smith-Vaughan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+nasal+bacterial+load+and+its+association+with+otitis+media%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Ear+Nose+Throat+Disord%22%5BJournal%5D)">Measuring nasal bacterial load and its association with otitis media.</a> BMC Ear Nose Throat Disord. 6, (2006).</li>
<li>Letourneau, J., Levesque, C., Berthiaume, F., Jacques, M., Mourez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+assay+of+bacterial+adhesion+onto+mammalian+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">In vitro assay of bacterial adhesion onto mammalian epithelial cells.</a> J. Vis. Exp. , (2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Krytyczną częścią tego testu jest dodanie odpowiednich stężeń S. salivarius i pneumokoków w sekcjach 3.1.7 i 3.1.12. Stężenia są szacowane na podstawie odczytów OD, ale dokładna inokula nie jest określana, dopóki płytki nie zostaną policzone następnego dnia. Z tego powodu zalecamy wykonanie krzywych wzrostu w celu zmierzenia OD i liczby żywotnych (CFU/ml) w czasie dla wszystkich szczepów bakteryjnych użytych w teście, aby zidentyfikować środkową fazę logarytmiczną i pomóc w oszacowaniu stężenia przez OD. Ponadto...

Streptococcus pneumoniae (pneumokoki) to bakteria Gram-dodatnia, która może powodować infekcje, w tym zapalenie płuc, zapalenie ucha środkowego i zapalenie opon mózgowych. Jest to główna przyczyna chorób u dzieci w krajach o niskich dochodach i odpowiada za około 800 000 zgonów dzieci poniżej piątego roku życiarocznie1. Pneumokoki są często przenoszone w nosogardzieli małych dzieci. Chociaż ta kolonizacja jest ogólnie uważana za bezobjawową, poprzedza zakażenie pneumokokami i służy jako rezerwuar dla bakterii w populacjach ludzkich2. Skoniugowane szczepienie przeciw pneumokokom skutecznie ogranicza nosicielstwo serotypów zawartych w szczepionce. Istnieje jednak ponad 90 serotypów pneumokokowych, a szczepienie może prowadzić do zastąpienia serotypu, w wyniku czego po eliminacji serotypów szczepionkowych następuje wzrost nosicielstwa i chorób spowodowanych serotypaminieszczepionkowymi3. Ponadto w niektórych populacjach wysokiego ryzyka kolonizacja pneumokokami często występuje bardzo wcześnie w życiu, przed podaniem pierwszej dawki szczepionki4,5. Ostatnio zaproponowano stosowanie probiotyków jako dodatkową strategię hamowania kolonizacji pneumokoków6,7. Testy przylegania in vitro zastosowano do zbadania przestrzegania zaleceń dotyczących pneumokoków8,9. Testy te zostały przystosowane do badania wpływu probiotyku Lactobacillus rhamnosus GG (LGG) na przestrzeganie zaleceń dotyczących pneumokoków10.
Oprócz LGG i innych bakterii kwasu mlekowego, Streptococcus salivarius, powszechny mieszkaniec jamy ustnej, został przebadany jako potencjalny probiotyk dla dróg oddechowych ze względu na jego potencjał kolonizacyjny i zdolność do hamowania pneumokoków i innych patogenów układu oddechowego in vitro11-13. Przedstawiony tutaj protokół opisuje test przylegania stosowany do badania wpływu S. salivarius K12 na przyleganie pneumokoków do ludzkiej linii komórek nabłonkowych CCL-23. Przed zastosowaniem w teście izolaty pneumokoków oceniono pod kątem zdolności do adhezacji, ponieważ właściwości wzrostu i przylegania mogą się znacznie różnić między izolatami10,14. Krzywe wzrostu pneumokoków i S. salivarius przeprowadzono w celu określenia środkowej fazy logarytmicznej i oszacowania stężenia (jednostki tworzące kolonie lub CFU/ml) na podstawie gęstości optycznej (OD, ryc. 1). Zaleca się zbadanie wzrostu przez liczbę żywotnych i OD dla każdego izolatu przed użyciem w teście. Test ten można wykonać w dowolnym laboratorium ze standardowymi urządzeniami i sprzętem do hodowli tkankowych. W niniejszym protokole badany jest wpływ trzech dawek S. salivarius podanych na 1 godzinę przed dodaniem pneumokoków na przyleganie S. pneumoniae PMP843, izolatu nosiciela serotypu 19F pochodzącego z wymazu z nosogardzieli. Przedstawiono dwa różne sposoby ilościowego oznaczania przylegających pneumokoków: posiew na agarze z krwią w celu określenia liczby żywotnych oraz ekstrakcja DNA i wykrywanie genu lytA pneumokoków metodą qPCR15. Podstawowy protokół testu przylegania może być łatwo zmodyfikowany w celu przetestowania różnych dawek lub czasu podawania probiotyków, a także może być stosowany z innymi szczepami lub gatunkami bakterii.

<table><tbody><tr><td>Minimalna zawartość podstawowych pożywek (MEM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SH30244.01</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SH30084.03</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Kolba T-75</td><td>Nunc</td><td>156472</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Ogniwa CCL-23</td><td>ATCC</td><td>CCL-23</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Technologie Trypsyna</td><td>Życia</td><td>15090046</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>24-dołkowa płytka do hodowli komórkowej</td><td>Nunc</td><td>142475</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Płytki z agarem z krwią końską (HBA)</td><td>Oxoid</td><td>PP2001</td><td>Dopuszczalne są również płytki z agarem z krwią owczą</td></tr><tr><td>Todd-Hewitt</td><td>Broth</td><td>Oxoid CM0189</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Ekstrakt z drożdży</td><td>Beckton Dickinson</td><td>212750</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Digitonina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D141-100MG</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Kuwety jednorazowe</td><td>Kartell</td><td>1938</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Heparyna</td><td>Pfizer</td><td>2112105</td><td>jest dostępna w sterylnych ampułkach w dawce 5 000 j.m./5m/&nbsp;</td></tr><tr><td>Sterylny rozsiewacz</td><td>Technoplas</td><td>S10805050</td><td>alternatywnie, rozsiewacz do szkła może być zanurzony w 96% etanolu i sterylizowany płomieniowo przed każdym użyciem</td></tr><tr><td>Lizozym</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6876</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Mutanolizyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9901</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Proteinaza K</td><td>Qiagen</td><td>19133</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>SDS 20% roztwór</td><td>Ambion</td><td>AM9820</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>RNaza A</td><td>Qiagen</td><td>19101</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Mini-zestaw QIAamp DNA (250)</td><td>Qiagen</td><td>51306</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Podkład LytA F</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Wykonany na zamówienie</td><td>sekwencja 5' -> 3' ACGCAATCTAGCAGATGAAGCA</td></tr><tr><td>Podkład LytA R</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Wykonany na zamówienie</td><td>sekwencja 5' -> 3'&nbsp; TCGTGCGTTTTAATTCCAGCT</td></tr><tr><td>Sonda LytA</td><td>Eurogentec</td><td>Wykonana na zamówienie</td><td>sekwencja 5' -> 3' Cy5-TGCCGAAAACGCTTGATACAGGGAG-BHQ3, można stosować alternatywne fluorofory</td></tr><tr><td>Woda wolna od nukleaz</td><td>Ambion</td><td>AM9906</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Brilliant III Ultra Szybki QPCR mastermix</td><td>Agilent Technologies</td><td>600880</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Thermo-Fast 96 Płytka detekcyjna&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AB-1100</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Ultraprzezroczyste paski z nakrętką qPCR</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AB-0866</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>System QPCR Mx3005</td><td>firmy Agilent Technologies</td><td>401449</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>*Alternatywne źródła są dostępne dla większości/wszystkich wymienionych</td><td></td><td></td> produktów<td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

badanie wpływu probiotyków na kolonizację pneumokoków za pomocą testu przylegania in vitro

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Przyleganie Streptococcus pneumoniae (pneumokoków) do nabłonkowej wyściółki nosogardzieli może prowadzić do kolonizacji i jest uważane za warunek wstępny dla infekcji pneumokokowych, takich jak zapalenie płuc i zapalenie ucha środkowego. Testy przylegania in vitro mogą być stosowane do badania przyłączenia pneumokoków do monowarstw komórek nabłonka oraz do zbadania potencjalnych interwencji, takich jak stosowanie probiotyków, w celu zahamowania kolonizacji pneumokoków. Opisany tutaj protokół służy do zbadania skutków działania probiotyku Streptococcus salivarius w sprawie przylegania pneumokoków do ludzkiej linii komórek nabłonkowych CCL-23 (czasami określanych jako komórki HEp-2). Test obejmuje trzy główne etapy: 1) przygotowanie komórek nabłonkowych i bakteryjnych, 2) dodanie bakterii do monowarstw komórek nabłonka oraz 3) wykrycie przylegających pneumokoków za pomocą liczenia żywotnych (seryjne rozcieńczanie i posiew) lub ilościowego PCR w czasie rzeczywistym (qPCR). Technika ta jest stosunkowo prosta i nie wymaga specjalistycznego sprzętu poza konfiguracją do hodowli tkankowej. Test może być wykorzystany do testowania innych gatunków probiotyków i/lub potencjalnych inhibitorów kolonizacji pneumokoków i może być łatwo zmodyfikowany w celu rozwiązania innych pytań naukowych dotyczących przylegania i inwazji pneumokoków.

Wyniki reprezentatywnego eksperymentu, w którym pneumokoki (S. pneumoniae PMP843, kolonizujący izolat 19F) zostały dodane do komórek CCL-23 1 h po dodaniu S. salivarius, a przyleganie pneumokoków zostało ilościowo określone zarówno za pomocą liczenia żywych komórek, jak i qPCR genu lytA, przedstawiono w Table 2. Wyniki obu metod były zgodne zarówno w odniesieniu do bezwzględnej liczby bakterii (wyrażonej jako CFU/ml), jak i procentu przylegania, znormalizowanego do liczby przyl...

Testy przestrzegania zaleceń in vitro mogą być wykorzystane do badania przyczepiania się Streptococcus pneumoniae do monowarstw komórek nabłonka i do zbadania potencjalnych interwencji, takich jak użycie probiotyków do hamowania kolonizacji pneumokoków.

Badanie wpływu probiotyków na kolonizację pneumokoków za pomocą testu przylegania in vitro

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zbadanie zdolności probiotycznej bakterii streptococcus cell levarius do hamowania adhezji pneumokoków do linii komórek nabłonkowych. W tym celu w pierwszej kolejności przygotowuje się monowarstwy komórek nabłonkowych CCL 23. Następnie w płytce 24-dołkowej do monowarstwy dodaje się sekwencyjnie slovar oraz pneumokoki, po czym komórki poddaje się inkubacji.W ostatnim kroku studni są płukane w celu usunięcia bakterii nieprzylegających. Komórki nabłonkowe CCL 23 zostają poddane lizie, a zawartość studni zostaje zebrana. Ostatecznie wpływ szczepu salivarius na adhezję pneumokoków można ocenić poprzez ilościowe określenie liczby pneumokoków związanych z komórkami.Niniejsza metoda pomaga odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie chorób zakaźnych, takie jak pytanie, czy probiotyki mogą hamować adhezję patogenów bakteryjnych, takich jak pneumokoki. Pomysł na tę metodę pojawił się po raz pierwszy, gdy zaczęliśmy badać potencjalne zastosowanie Lactobacillus rhamnosus GG oraz innych probiotyków w drogach oddechowych. Procedurę tę zademonstrują Jane Manning oraz Zen, doktoranci z naszego laboratorium. Dzień przed eksperymentem podzielić kulturę konfluencyjnych komórek nabłonkowych CCL 23, a następnie rozcieńczyć je w uprzednio ogrzanym medium do stężenia 150 000 komórek na mililitr w sterylnej probówce o pojemności 50 ml.Następnie wysiej jeden mililitr komórek na każdą studnię w odpowiednio przygotowanej 24-dołkowej płytce do hodowli tkanek i inkubuj komórki przez noc. Następnie, używając pętli o pojemności 10 µL, zaszczep od 10 do 12 oddzielonych kolonii każdej kultury bakteryjnej do 10 ml alikwotu pożywki Todd Hewitt z dodatkiem 0,5% ekstraktu z drożdży. Krótko wymieszaj na wirówce typu vortex i inkubuj kultury przez 14 do 16 godzin w dniu przeprowadzenia eksperymentu.Każdą z kultur bakteryjnych należy wymieszać w wirówce typu vortex przez trzy do pięciu sekund, a następnie dodać 100 µL pneumokoków i 100 µL salivarius do opisanych, uprzednio ogrzanych probówek zawierających 10 ml pożywki płynnej. Probówki po inokulacji należy wymieszać w wirówce typu vortex przez trzy do pięciu sekund i inkubować w temperaturze 37 °C aż do osiągnięcia przez kultury średniej fazy logarytmicznej. Po potwierdzeniu co najmniej 80% konfluencji hodowli komórek CCL 23, należy za pomocą pipety transferowej usunąć medium z każdej studzienki płytki 24-dołkowej, lekko przechylając płytkę, aby nie naruszyć monowarstwy komórek, a następnie dwukrotnie przemyć studzienki, dodając około 500 µL uprzednio ogrzanego PBS i delikatnie usuwając ciecz pipetą transferową.Podczas płukania przechylaj płytkę, aby pomóc w zachowaniu monowarstwy po drugim płukaniu. Dodaj 500 µL podgrzanego wcześniej medium do każdej studni i przełóż płytkę z powrotem do inkubatora, przygotowując kultury bakteryjne. Najpierw zmierz gęstość optyczną jednego mililitra kultury levarius przy absorbancji 600.Następnie przenieś 5 ml kultury Sal Levarius do probówki o pojemności 10 ml i wiruj przez cztery minuty przy 1 870 Gs w temperaturze pokojowej. Po odlaniu nadsączu, zawieś osad w 200–1000 µL 0,85% chlorku sodu, zależnie od odczytu OD, do uzyskania końcowego stężenia wynoszącego około 1,5 × 10⁹ jednostek tworzących kolonie na mililitr. Dodanie odpowiedniej liczby bakterii jest najtrudniejszą częścią eksperymentu, ponieważ rzeczywista liczba dodanych bakterii zostaje określona dopiero po przeliczeniu kolonii następnego dnia.Przenieś teraz resuspensowane szczepionkowe inokulum ze śliny do probówki do wirówki mikrocentryfużowej z oznaczeniem „high”. Rozcieńcz stężenie wysokie w stosunku 1:10 oraz 1:100 w 0,85% chlorku sodu, aby przygotować stężenia średnie i niskie do analizy; mieszaj probówki w wirówce między rozcieńczeniami w celu przygotowania studzienek kontrolnych z heparyną. Pobierz 40 µL medium z każdej studzienki kontrolnej i dodaj 50 µL heparyny do uzyskania stężenia końcowego 100 jednostek na ml na studzienkę.Do studni zawierających wyłącznie komórki CCL 23 oraz studni z komórkami CCL 23 i pneumokokami dodaj 10 µL 0,85% NaCl i dokładnie wymieszaj wszystkie obszary z różnymi stężeniami SIV za pomocą vortexa. Następnie, aby umożliwić kontakt bakterii z monowarstwą komórek, dodaj 10 µL nieosłabionych oraz rozcieńczeń 1:10 i 1:100 różnych stężeń SIV do odpowiednich studni. Wirowarką odwiruj płytkę przez 3 minuty przy 114 ×g w temperaturze pokojowej, a następnie inkubuj płytkę przez godzinę. W międzyczasie wykonaj seryjne rozcieńczenia roztworu pierwotnego śliny w 0,85% NaCl, a następnie za pomocą sterylnego rozpylacza nanieś po 100 µL rozcieńczeń 10⁻⁵, 10⁻⁶ i 10⁻⁷ w dwóch powtórzeniach na płytki z agarem z krwią końską.Inkubuj płytki w pozycji odwróconej przez noc pod koniec wzrostu monowarstwy. Zmierz gęstość optyczną hodowli pneumokoków, a następnie odwiruj jeden mililitr komórek. Resuspenduj osad w 300 do 2000 µL 0,85% NaCl, zależnie od odczytu OD, do końcowego stężenia wynoszącego około 150 milionów jednostek tworzących kolonie na mililitr.Następnie dodaj 10 µL nierozcieńczonych pneumokoków do wszystkich studzienek z wyjątkiem studzienek kontroli negatywnej, ponownie odwiruj płytkę 24-dołkową, a następnie inkubuj kokultury przez trzy godziny. Wykonaj rozcieńczenia seryjne i wysiej roztwór zapasowy pneumokoków w sposób analogiczny do salivarius. Po trzech godzinach inkubacji sprawdź pod mikroskopem, czy w komórkach wystąpił efekt cytopatyczny.Następnie usuń pożywkę z każdej studzienki i delikatnie przemyj kokultury trzykrotnie przy użyciu 1 XPBS, aby usunąć bakterie nieprzylegające, uważając, by nie uszkodzić monowarstw. Następnie poddaj komórki lizie, dodając 200 µL 0,1% Digitoniny i inkubując przez siedem minut w temperaturze 37 °C i 5% CO2. Na koniec dodaj do każdej próbki 800 µL THB.Kilkukrotnie pipetuj zawiesinę w górę i w dół, a następnie zbierz zawiesiny komórkowe z każdej studni do oznakowanych probówek do mikrowirowania. Na koniec wykonaj rozcieńczenia seryjne przylepnych pneumokoków, a następnego dnia policz kolonie na odpowiednich płytkach z rozcieńczeniami. Aby ilościowo określić liczbę pneumokoków i alvar w tej tabeli, przedstawiono wyniki z reprezentatywnego eksperymentu, w którym pneumokoki dodano do komórek CCL 23 godzinę po dodaniu slovar.Adhezję pneumokoków ilościowo określono zarówno za pomocą liczenia żywych komórek, jak i wyników qPCR. Wyniki obu metod były spójne zarówno w odniesieniu do bezwzględnej liczby bakterii, jak i procentowej adhezji. Wyniki znormalizowano do liczby adherentnych pneumokoków w studzienkach zawierających wyłącznie pneumokoki.Heparyna jest wykorzystywana jako kontrola, ponieważ wiadomo, że hamuje ona przyleganie pneumokoków. Zatem redukcja przylegania o około 40% lub więcej w próbkach zawierających pneumokoki oraz heparynę w porównaniu do próbek z samymi pneumokokami świadczy o powodzeniu testu. Salivarius hamuje przyleganie pneumokoków w sposób zależny od dawki, przy czym wysokie stężenie salivarius (około 10 komórek salivarius na jednego pneumokoka) skutkowało najniższym przyleganiem pneumokoków.Wykresy te obrazują adhezję pneumokoków do komórek CCL 23 w przypadku dodania salivariusu na godzinę przed pneumokokami, równocześnie z nimi lub na godzinę po nich. Salivarius jest skuteczniejszy w hamowaniu adhezji pneumokoków, gdy zostanie dodany przed pneumokokami, ponieważ zarówno wysokie, jak i średnie dawki salivariusu znacząco zredukowały adhezję pneumokoków w teście przed dodaniem. Natomiast w testach równoczesnych i po dodaniu, tylko wysokie dawki salivariusu hamowały adhezję pneumokoków.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak przeprowadzić badanie in vitro w celu pomiaru inhibicji przylegania pneumokoków przez probiotyk streptococcus cell areas.

investigating-effects-probiotics-on-pneumococcal-colonization-using

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Badanie wpływu probiotyków na kolonizację pneumokokową z wykorzystaniem in vitro testu adhezji

Niniejszy protokół opisuje prosty test adhezji bakteryjnej, polegający na zliczaniu jednostek tworzących kolonie bakterii, które przylgnęły do hodowli komórkowych. Test ten jest wiarygodny, niezależny od badanej adhezyny, a jego liczne modyfikacje są stosowane w większości laboratoriów zajmujących się patogenezą bakteryjną.

In Vitro Analiza Adhezji Bakteryjnej do Komórek Nabłonkowych Ssaków

Źródło: Jagau, H. i wsp. Zakażenie Pneumokokami pierwotnych komórek śródbłonka człowieka w stałym przepływie. J. Vis. Exp. (2019 rok)Ten film pokazuje wizualizację w czasie rzeczywistym przyczepiania się pneumokoków do sznurków czynnika von Willebranda (VWF) na komórkach śródbłonka w warunkach stałego przepływu pożywki. Przedstawiono w nim etapy stymulowania uwalniania VWF, znakowania strun i ilościowego określania wiązania bakterii.

Ocena przyczepiania się pneumokoków do pierwotnych komórek śródbłonka człowieka przy stałym przepływie pożywki

Źródło: Calatayud Arroyo, M., i inni. Ocena opłacalności syntetycznego konsorcjum bakteryjnego na interfejsie in vitro jelito-mikroorganizm. J. Vis. Exp. (2018).Ten film prezentuje model in vitro żywioł–mikrob do badania żywotności bakterii. Współhodowla komórek Caco-2 i HT29-MTX jest inkubowana z bakteriami wstępnie poddanymi zabiegom w symulowanych warunkach trawiennych. Integralność bariery nabłonkowej ocenia się za pomocą oporu elektrycznego nabłonka, a frakcje z ośrodka, rozpuszczonego...

Model jelit in vitro do oceny zrastów i internalizacji bakteryjnej

Film pokazuje test przylegania do fazy stałej do oceny tworzenia biofilmu. W płytce wielodołkowej bakterie w pożywce uzupełnionej solą żółciową przylegają do powierzchni stałych, tworząc biofilmy, co potwierdza kolorymetria poprzez barwienie fioletem krystalicznym i obróbkę etanolem.

Test przylegania do fazy stałej w celu oceny tworzenia się biofilmu

Opisano kolonizację mysiego nosogardzieli Streptococcus pneumoniae i późniejszą ekstrakcję przylegających lub zrekrutowanych komórek. Technika ta polega na przepłukiwaniu nosogardzieli i zbieraniu płynu przez nozdrza i można ją dostosować do różnych odczytów, w tym różnicowej kwantyfikacji komórek i analizy ekspresji mRNA in situ.

Charakterystyka reakcji zapalnych podczas kolonizacji donosowej Streptococcus pneumoniae

Śledzenie w czasie rzeczywistym wpływu czynników wirulencji pneumokoków w modelu ostrego mysiego zapalenia płuc z wykorzystaniem bakterii bioluminescencyjnych

Konkurencja w Streptococcus pneumoniae jest wywoływana przez bakteriocyny, małe peptydy przeciwdrobnoustrojowe o działaniu hamującym w stosunku do pneumokoków i innych pokrewnych gatunków. Tutaj opisujemy zoptymalizowany test nakładki bakteryjnej, który pozwala na scharakteryzowanie aktywności bakteriocyny i spektrum hamowania, odporności specyficznej dla bakteriocyny oraz wykrywania wydzielanych peptydów quorum sensing.

Wykorzystanie testu nakładkowego do jakościowego pomiaru produkcji bakterii i wrażliwości na bakterie pneumokokowe

To badanie szczegółowo opisuje proces podawania precyzyjnych ilości probiotyków noworodkom myszy. Konfiguracja eksperymentalna została zoptymalizowana tak, aby obejmowała między innymi dawkowanie probiotyków, metody podawania i oznaczanie ilościowe bakterii w jelitach.

Badania probiotyczne na nowonarodzonych myszach z użyciem zgłębnika

Opisujemy protokół dla trójwymiarowego modelu kohodowli zakażonych dróg oddechowych, wykorzystującego komórki CFBE41o, makrofagi THP-1 i Pseudomonas aeruginosa, ustalony na granicy powietrze-ciecz. Model ten zapewnia nową platformę do jednoczesnego testowania skuteczności antybiotyków, funkcji bariery nabłonkowej i markerów stanu zapalnego.

P. aeruginosa (P. aeruginosa) Zakażona kohodowla 3D komórek nabłonka oskrzeli i makrofagów na granicy faz powietrze-ciecz w celu przedklinicznej oceny środków przeciwinfekcyjnych

Wykrywanie interakcji patogenów gospodarz-bakteria na podstawie przestrzegania fenotypu za pomocą wysokoprzepustowego obrazowania fluorescencyjnego wraz z automatycznymi metodami analizy statystycznej umożliwia szybką ocenę potencjalnych interakcji bakteryjnych z komórkami gospodarza.

Zautomatyzowane, wysokowydajne wykrywanie przylegania bakterii do komórek gospodarza

Protokół ten opisuje niezbędne kroki kolonizacji myszy z pks+ Escherichia coli w warunkach niezapalnych, a także nieinwazyjne metody walidacji kolonizacji i oceny ekspansji pks+ E. coli w kału.

Kolonizacja przez myszą pks+ Escherichia coli w warunkach niezapalnych

Poznaj metodę testu przylegania in vitro do badania wpływu Streptococcus salivarius na kolonizację pneumokoków w liniach komórek nabłonkowych CCL 23. Technika ta pozwala ocenić skuteczność probiotyków w zapobieganiu infekcjom.

Badanie wpływu probiotyków na kolonizację pneumokoków za pomocą testu przylegania in vitro

Przeglądaj więcej filmów