Name: Łatwy pomiar współczynników dyfuzji białek błony plazmatycznej znakowanych EGFP za pomocą spektroskopii korelacji obrazów k-space (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 43 s
Description: Poznaj metodę pomiaru współczynników dyfuzji białek błony plazmatycznej znakowanych EGFP w żywych komórkach ssaków za pomocą spektroskopii korelacji obrazów k-space.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Lundbeck Junior Group Leader Fellowship dla LNN. PWW dziękuje za wsparcie finansowe ze strony Kanadyjskiej Rady ds. Badań Nauk Przyrodniczych i Inżynierii (NSERC). Dziękujemy również Duńskiemu Centrum Bioobrazowania Molekularnego na Uniwersytecie Południowej Danii za dostęp do mikroskopii z wirującym dyskiem.

Akwizycja białek oznaczonych EGFP w błonie plazmatycznej do analizy kICS może być wykonana na mikroskopie epifluorescencyjnym, ustawie TIRF lub na mikroskopie z wirującym dyskiem w celu uzyskania obrazów interesującej nas błony. Do analizy potrzebny jest rozmiar piksela kamery, a także czas między klatkami obrazu. Do analizy można wykorzystać sekwencje obrazów o długości 100-1 200 klatek z częstotliwością odświeżania 4-30 Hz. Podczas akwizycji ważne jest, aby przez cały czas trwania obrazowania utrzymywać ostrość błony i skupić się na ułamku płaskiej błony, w której fluorescencja jest równomiernie rozprowadzona. Ruchome pęcherzyki, wystające obszary błony i organelle komórkowe mogą zostać wycięte w dalszej części procesu analizy. Czas akwizycji powinien być tak dobrany, aby nie było dryftu ani ruchu ogniwa.
Aby uzyskać skrypty kodu kICS dla MATLAB, skontaktuj się z Paulem Wisemanem (Paul.Wiseman@McGill.ca). Przy pierwszym użyciu kodu kICS otwórz MATLAB i kliknij plik, następnie ustaw ścieżkę, a następnie kliknij dodaj z podfolderami i znajdź folder na komputerze, w którym znajduje się kod kICS. Następnie kliknij ok, zapisz i zamknij. Teraz kontynuuj analizę upraw opisaną w kolejnych punktach.
1. Zaimportuj interesującą sekwencję obrazów do programu do analizy obrazowania jako stos TIFF
Zapisz plik pod nazwą: stack1.tif.
<ol>
	<li>Wybierz prostokątny obszar zainteresowania (ROI) w płaskiej części błony, z wyłączeniem ruchomych organelli komórkowych i wystających obszarów błony. Wielkość uprawy jest dobierana tak, aby wygenerowano wystarczającą ilość statystyk dla dobrych działek k2.</li>
	<li>Przytnij region i zapisz go jako plik TIFF w odpowiednim folderze. Jeśli istnieje kilka kadrów z tego samego filmu, użyj przyrostu liczbowego, np. "stack1crop.tif", "stack1crop2.tif", " stack1crop3.tif".</li>
	<li>Umieść folder zawierający uprawy lokalnie na komputerze, a nie na serwerze, podczas wykonywania analizy kICS.</li>
</ol>
2. Importuj uprawy do oprogramowania do analizy jeden po drugim, aby przeprowadzić analizę
<ol>
	<li>Otwórz MATLAB i wpisz "icsgui" w oknie poleceń i naciśnij ENTER. Graficzny interfejs użytkownika ICS to nazwa pliku wykonywalnego programu graficznego interfejsu użytkownika do spektroskopii korelacji obrazów.</li>
	<li>W graficznym interfejsie użytkownika ICS kliknij zakładkę "kICS". Zrzut ekranu okna analizy pokazano na rysunku 1.</li>
	<li>Znajdź folder o nazwie folderu "Kod MATLAB" i przewiń do pliku o nazwie pliku "Skrypty" i otwórz go, klikając go dwukrotnie. Alternatywnie kliknij plik prawym przyciskiem myszy i wybierz "otwórz za pomocą MATLAB" lub przejdź do pliku, otwórz w MATLAB i otwórz plik skryptów. Ten plik nazywa się Edytor.</li>
	<li>W edytorze przewiń do "Załaduj zestawy danych kICS", a następnie skopiuj lub wpisz nazwę pliku i lokalizację folderu w wierszu poleceń, który zaczyna się od img = np. "C:\Users\Documents\AQP3dynamics\stack1crop.tif". W wierszu poleceń poniżej lokalizacji folderu ustaw liczbę ramek do analizy – np. [1:500]. Użyj tych samych ustawień dla wszystkich kolejnych filmów w serii danych. Jeśli w późniejszych klatkach występuje przesunięcie ostrości, należy je wykluczyć z analizy.</li>
	<li>W edytorze kliknij "zapisz", a następnie kliknij "oceń komórkę". Zestaw danych jest teraz ładowany do oprogramowania analitycznego.</li>
	<li>W oknie Analiza kICS w graficznym interfejsie użytkownika wprowadź ustawienia analizy:
	<ol>
		<li>Odznacz pola "Komórka T".</li>
		<li>Wprowadź liczbę opóźnień czasowych, które mają być analizowane. Liczba opóźnień czasowych (τ) będzie miała wpływ na wykres dyfuzji i musi być tak dobrana, aby wykres dyfuzji był liniowy. Zacznij od wpisania 25, a następnie zmniejsz do miejsca, w którym wykres dyfuzji jest liniowy. τ to liczba opóźnień czasowych, które porównuje analiza kICS, a opóźnienie czasowe to czas między jedną klatką a drugą. Należy wybrać najmniejszą wartość, która daje wykres liniowy. Maksymalna liczba opóźnień jest wybierana tak, aby uzyskać dopasowanie liniowe, wybranie wyższej wartości spowoduje wygenerowanie danych, których nie można dopasować do linii.</li>
		<li>Wprowadź maksymalną wartość k2 (patrz kółko 1 na rysunku 1), zwykle jest to 20-50. Dobry wykres k2 to wykres, na którym znajduje się wiele punktów danych, które są rozmieszczone wzdłuż linii. Zacznij od wprowadzenia liczby 70, a następnie zmniejsz po ocenie wykresów k2 i dyfuzji i wybierz najniższą wartość, w której punkty danych skupiają się wokół linii prostej. Wartość k2 jest kwadratem wielkości przestrzennego wektora k w przestrzeni Fouriera. 
		Początkowo analizę należy powtarzać aż do wyznaczenia najlepszych wartości, a następnie używać tych samych ustawień dla wszystkich kolejnych filmów w serii danych, ale zawsze sprawdzać, czy wybrane ustawienia dobrze pasują do danych: dobre wykresy k2 i liniowy wykres dyfuzyjny.</li>
		<li>Kliknij "Przechowuj ustawienia i kontynuuj".</li>
		<li>Kliknij "tak", aby wyświetlić wszystkie wykresy.</li>
		<li>Kliknij "Załaduj serię obrazów" (patrz kółko 2 na rysunku 1), a następnie kliknij "przestrzeń robocza".</li>
		<li>Wybierz "imgSerCrop", a następnie kliknij "Importuj z obszaru roboczego".</li>
		<li>Wprowadź ustawienia systemu obrazowania. W polu "rozmiar piksela" wprowadź projektowany rozmiar piksela dla systemu obrazowania, w którym rejestrowane są stosy obrazów. Dla AQP3-EGFP użyto 0,111. W polu "Wprowadź czas (s) między klatkami" dla AQP3-EGFP użyto wartości 0,1150.</li>
		<li>Kliknij "wybierz ROI", wpisz "1", kliknij ok i "użyj całego obrazu".</li>
		<li>Kliknij "Wykonaj analizę kICS" i kliknij tak, aby wykonać "filtrowanie nieruchome". Wyniki otworzą się automatycznie jako obrazy.</li>
		<li>Zminimalizuj okno ustawień, zminimalizuj okno informacji o komórce i zminimalizuj okno fotofizyki. W oknie dynamiki sprawdź, czy wykres dynamiki pokazuje liniowe dopasowanie danych do linii o ujemnym nachyleniu, co oznacza, że punkty danych są skorelowane i można założyć dyfuzję swobodną. Zapisać współczynnik dyfuzji dla określonych ustawień opóźnienia czasowego i k2 (nie jest konieczne notowanie odchylenia standardowego pasowania). Punkty danych na wykresach k2 muszą być zgrupowane wokół linii dla danych opóźnień czasowych.</li>
		<li>Zaznacz pole wyboru "Zapisz otwarte figury jako obrazy", a następnie kliknij "Zapisz otwarte figury jako obrazy", aby zapisać pliki wynikowe. Zapisz w nowym folderze w folderze C:\Users\Documents\AQP3diffusion. Kliknij "wyczyść bieżące dane" i kontynuuj analizę następnej uprawy.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Średnia obliczonego współczynnika dyfuzji jest obliczana, aby uzyskać przegląd analizowanych danych
<ol>
	<li>Wprowadź poszczególne współczynniki dyfuzji z każdego ROI w arkuszu kalkulacyjnym (pamiętaj, aby zanotować wartości τ i k2), użyj nazw upraw, jak określono powyżej.</li>
	<li>Oblicz średni współczynnik dyfuzji i odchylenie standardowe za pomocą arkusza kalkulacyjnego.</li>
	<li>Wykonaj test Kołmogorowa-Smirnowa lub test t uczniów, aby ocenić różnice statystyczne przy użyciu 5% poziomu istotności. Można dokonać porównań ilościowych między komórkami (na przykład leczonymi i nieleczonymi).</li>
	<li>Otwórz wersję arkusza kalkulacyjnego wykresów dyfuzyjnych, która została wygenerowana przez oprogramowanie analityczne dla każdej uprawy, i uśrednij dane dla każdego warunku dla każdego opóźnienia czasowego. Wygeneruj nowy uśredniony wykres dyfuzji do prezentacji w artykułach lub prezentacjach.</li>
</ol>

<ol><li>Kolin, D. L., Ronis, D., Wiseman, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((k-Space+image+correlation+spectroscopy%3A+A+method+for+accurate+transport+measurements+independent+of+fluorophore+photophysics%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">k-Space image correlation spectroscopy: A method for accurate transport measurements independent of fluorophore photophysics.</a> Biophysical Journal. 91, 3061-3075 (2006).</li>
<li>Saxton, M. J., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-particle+tracking%3A+Applications+to+membrane+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biophysics+and+Biomolecular+Structure%22%5BJournal%5D)">Single-particle tracking: Applications to membrane dynamics.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 26, 373-399 (1997).</li>
<li>Bannai, H., Levi, S., Schweizer, C., Dahan, M., Triller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+lateral+diffusion+of+membrane+molecules+with+quantum+dots%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Imaging the lateral diffusion of membrane molecules with quantum dots.</a> Nat Protoc. 1, 2628-2634 (2006).</li>
<li>Jaqaman, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+single-particle+tracking+in+live-cell+time-lapse+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences.</a> Nat Methods. 5, 695-702 (2008).</li>
<li>Pinaud, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+partitioning+of+a+glycosyl-phosphatidylinositol-anchored+protein+in+glycosphingolipid-rich+microdomains+imaged+by+single-quantum+dot+tracking%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Dynamic partitioning of a glycosyl-phosphatidylinositol-anchored protein in glycosphingolipid-rich microdomains imaged by single-quantum dot tracking.</a> Traffic. 10, 691-712 (2009).</li>
<li>Wieser, S., Axmann, M., Schutz, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Versatile+analysis+of+single-molecule+tracking+data+by+comprehensive+testing+against+Monte+Carlo+simulations%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Versatile analysis of single-molecule tracking data by comprehensive testing against Monte Carlo simulations.</a> Biophys J. 95, 5988-6001 (2008).</li>
<li>Sbalzarini, I. F., Koumoutsakos, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feature+point+tracking+and+trajectory+analysis+for+video+imaging+in+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Feature point tracking and trajectory analysis for video imaging in cell biology.</a> Journal of Structural Biology. 151, 182-195 (2005).</li>
<li>Durisic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+correction+of+blinking+bias+in+image+correlation+transport+measurements+of+quantum+dot+tagged+macromolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Detection and correction of blinking bias in image correlation transport measurements of quantum dot tagged macromolecules.</a> Biophys J. 93, 1338-1346 (2007).</li>
<li>Umenishi, F., Verbavatz, J. M., Verkman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cAMP+regulated+membrane+diffusion+of+a+green+fluorescent+protein-aquaporin+2+chimera%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">cAMP regulated membrane diffusion of a green fluorescent protein-aquaporin 2 chimera.</a> Biophys J. 78, 1024-1035 (2000).</li>
<li>Levin, M. H., Haggie, P. M., Vetrivel, L., Verkman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusion+in+the+endoplasmic+reticulum+of+an+aquaporin-2+mutant+causing+human+nephrogenic+diabetes+insipidus%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Diffusion in the endoplasmic reticulum of an aquaporin-2 mutant causing human nephrogenic diabetes insipidus.</a> The Journal of biological chemistry. 276, 21331-21336 (2001).</li>
<li>Semrau, S., Schmidt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Particle+image+correlation+spectroscopy+%28PICS%29%3A+retrieving+nanometer-scale+correlations+from+high-density+single-molecule+position+data%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Particle image correlation spectroscopy (PICS): retrieving nanometer-scale correlations from high-density single-molecule position data.</a> Biophys J. 92, 613-621 (2007).</li>
<li>Petersen, N. O., Hoddelius, P. L., Wiseman, P. W., Seger, O., Magnusson, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+membrane+receptor+distributions+by+image+correlation+spectroscopy%3A+concept+and+application%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Quantitation of membrane receptor distributions by image correlation spectroscopy: concept and application.</a> Biophys J. 65, 1135-1146 (1993).</li>
<li>Marlar, S., Arnspang, E. C., Koffman, J. S., Løcke, E. M., Christensen, B. M., Nejsum, L. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+cAMP+increases+aquaporin-3+plasma+membrane+diffusion%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Elevated cAMP increases aquaporin-3 plasma membrane diffusion.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 306, (2014).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

W artykule przedstawiono szczegółowy przegląd krok po kroku, w jaki sposób można zastosować metodę analizy kICS do wyznaczania współczynników dyfuzji na podstawie obrazów mikroskopowych białek znakowanych białkami fluorescencyjnymi. Analiza jest niezależna od wyboru sondy o bardzo szerokim zakresie dynamiki gęstości znakowania, a zatem może być również stosowana do białek znakowanych kropkami kwantowymi, a także barwników i białek fluorescencyjnych, takich jak EGFP.
Aby obliczyć prawidłowe wsp...

Czterowymiarowa organizacja czasoprzestrzenna i boczna ruchliwość białek błony plazmatycznej są ściśle regulowane i mogą odgrywać rolę w funkcjonowaniu, aktywności i interakcjach białko-białko. Dyfuzja boczna białek błony plazmatycznej była tradycyjnie badana poprzez obliczanie współczynników dyfuzji dla pojedynczych cząstek na podstawie obrazowania poklatkowego białek błony plazmatycznej znakowanych kropkami kwantowymi lub barwnikiem2-4. Takie podejście wymaga wstawienia znacznika zewnątrzkomórkowego do białka błony plazmatycznej w celu znakowania kropkami kwantowymi lub barwnikiem, co może zagrozić fałdowaniu i funkcji białka, a zatem nie może być osiągnięte w przypadku niektórych białek. Wykazano, że steryczna objętość kropki kwantowej spowalnia dyfuzję białka5, a co więcej, tylko niewielka część białek w populacji jest znakowana kropkami kwantowymi i nie wiadomo, czy ta frakcja jest reprezentatywna dla całkowitej puli białek błony plazmatycznej. Pomiary współczynników dyfuzji za pomocą śledzenia pojedynczych cząstek (SPT) na podstawie serii obrazów białek znakowanych kropkami kwantowymi obejmują mapowanie zobrazowanych pozycji pików cząstek za pomocą dwuwymiarowych dopasowań Gaussa, a następnie obszernych algorytmów analizy. Analiza jest bardzo intensywna obliczeniowo, wymaga obszernego dopasowania krzywej nieliniowej w każdej klatce obrazu sekwencji poklatkowej do przybliżeń funkcji rozpiętości punktów mikroskopu (zwykle dwuwymiarowych przestrzennych Gaussianów), a następnie powiązania pozycji cząstek w trajektorie cząstek opisujące ruch pojedynczych cząsteczek6,7.
Niedawno opracowana technika korelacji obrazów, spektroskopia korelacji obrazów k-Space (kICS) umożliwia względnie proste pomiary współczynników dyfuzji fluorescencyjnie znakowanych białek błony plazmatycznej. Możliwość rutynowego obliczania współczynników dyfuzji białek błonowych znakowanych białkami fluorescencyjnymi za pomocą kICS jest unikalnym narzędziem, które ma kilka zalet w porównaniu z tradycyjną analizą SPT z użyciem kropek kwantowych: Nie jest wymagane wprowadzanie znaczników zewnątrzkomórkowych i czasochłonne znakowanie zewnątrzkomórkowe (można stosować linie komórkowe wyrażające białka fluorescencyjne); Współczynniki dyfuzji są ekstrahowane z całkowitej puli białek fluorescencyjnych w porównaniu z podzbiorem znakowanym kropkami kwantowymi; Analiza jest prosta bez konieczności śledzenia pojedynczych białek, a analizę można przeprowadzić przy użyciu istniejącego kodu bez konieczności dodatkowego programowania przez użytkownika. Metoda jest szybka, ponieważ jest to technika uśredniania, która umożliwia szybkie obliczanie i obliczanie współczynników dyfuzji. Te szybkie pomiary dyfuzji dla populacji białek uzupełniają bardziej szczegółowe informacje o transporcie molekularnym uzyskane dla podzbioru populacji za pomocą żmudnych metod SPT.
kICS czas koreluje sekwencje obrazów z mikroskopii fluorescencyjnej, które zostały najpierw przekształcone w przestrzeń Fouriera, a tym samym oddziela fluktuacje fluorescencji spowodowane fotofizyką od tych spowodowanych transportem molekularnym1. W rezultacie, kICS może określić gęstość liczbową, prędkość przepływu i dyfuzję cząsteczek znakowanych fluorescencyjnie, będąc bezstronnym przez złożone fotowybielanie lub mruganie fluoroforów. To sprawia, że kICS jest użytecznym narzędziem do szybkiego określania dynamiki dyfuzji znakowanych fluorescencyjnie białek błony komórkowej bez konieczności tworzenia niestandardowych algorytmów pisania. Oprócz białek znakowanych fluorescencyjnie, kICS można również zastosować do białek błonowych znakowanych kropkamikwantowymi 8.
Ten artykuł krok po kroku wprowadza do tego, jak używać kICS do wyodrębniania współczynników dyfuzji białek błony plazmatycznej oznaczonych EGFP, pokazując, jak umieścić uprawę, jak używać kodu i jak oceniać wygenerowane poletka, z których wyodrębniane są współczynniki dyfuzji. Jako przykład przedstawiono dane uzyskane za pomocą wirującej mikroskopii dyskowej ustawionej w trybie półcałkowitej fluorescencji wewnętrznego odbicia (TIRF), białka kanału wodnego nerek akwaporyny-3 (AQP3) znakowanego EGFP.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>31600-083</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>10082147</td><td></td></tr><tr><td>Penicilin&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/13752?lang=en&amp; region=DK">13752</a></td><td></td></tr><tr><td>Kanamycyna</td><td>Gibco</td><td>15160070</td><td></td></tr><tr><td>Streptomycyna</td><td>Gibco</td><td>11860038</td><td></td></tr><tr><td>Czerwone wolne podłoże fenolowe</td><td>Gibco</td><td>11880-028</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d8418?lang=en&amp; region=DK">D8418 </a></td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630056</td><td></td></tr><tr><td>Aparatura</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wirujący dysk Mikroskop</td><td>Nikon</td><td>Ti Eclipse</td><td></td></tr><tr><td>EMCCD Kamera</td><td>Andor</td><td>Ixon+</td><td></td></tr></tbody></table>

Łatwy pomiar współczynników dyfuzji białek błony plazmatycznej znakowanych egfp za pomocą spektroskopii korelacji obrazów k-space

Easy Measurement of Diffusion Coefficients of EGFP-tagged Plasma Membrane Proteins Using k-Space Image Correlation Spectroscopy

Dyfuzja boczna i kompartmentalizacja białek błony komórkowej są ściśle regulowane w komórkach, dlatego badanie tych procesów ujawni nowe informacje na temat funkcji i regulacji białek błony komórkowej. Niedawno opracowano spektroskopię korelacji obrazów k-Space (kICS)1, aby umożliwić rutynowe pomiary współczynników dyfuzji bezpośrednio z obrazów znakowanych fluorescencyjnie białek błony plazmatycznej, co pozwoliło uniknąć systematycznych błędów wprowadzonych przez fotofizykę sondy. Chociaż podstawy teoretyczne analizy są złożone, metoda może być wdrażana przez osoby niebędące ekspertami przy użyciu ogólnodostępnego kodu do pomiaru współczynników dyfuzji białek. kICS oblicza funkcję korelacji czasowej na podstawie stosu obrazów z mikroskopii fluorescencyjnej po transformacji Fouriera każdego obrazu do przestrzeni odwrotnej (k-). Następnie uśrednianie kołowe, transformacja logarytmu naturalnego i dopasowania liniowe do funkcji korelacji dają współczynnik dyfuzji. Niniejszy artykuł zawiera przewodnik krok po kroku dotyczący analizy obrazu i pomiaru współczynników dyfuzji za pomocą kICS.
Po pierwsze, za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego uzyskuje się sekwencję obrazu o wysokiej liczbie klatek na sekundę fluorescencyjnie znakowanego białka błony plazmatycznej. Następnie wybierany jest obszar zainteresowania (ROI) unikający organelli wewnątrzkomórkowych, ruchomych pęcherzyków lub wystających obszarów błony. Stos ROI jest importowany do ogólnodostępnego kodu, a kilka zdefiniowanych parametrów (patrz sekcja Metoda) jest ustawianych do analizy kICS. Następnie program generuje wykres "nachylenie zboczy" na podstawie funkcji korelacji czasowej w przestrzeni k, a współczynnik dyfuzji jest obliczany na podstawie nachylenia wykresu. Poniżej znajduje się procedura kICS krok po kroku do pomiaru współczynnika dyfuzji białka błonowego przy użyciu kanału wodnego nerek akwaporyny-3 oznaczonej EGFP jako przykładu kanonicznego.

Aby uzyskać odpowiednie stosy obrazów do analizy metodą kICS, można wykorzystać różne systemy mikroskopowe. Możliwa jest analiza sekwencji obrazów z mikroskopu epi-fluorescencyjnego, jak również z układu TIRF lub mikroskopu z dyskiem obrotowym (spinning disk). Błona musi być płaska, bez dużych, ruchomych organelli komórkowych lub ruchomych pęcherzyków/obiektów. Niniejsza praca przedstawia sekwencję obrazów time-lapse białka AQP3 znakowanego EGFP w żywych komórkach MDCK, obrazowanych na mikroskopie z dyskiem obrotowym z o...

Ten artykuł zawiera przewodnik krok po kroku po technice analizy fluktuacji k-Space Image Correlation Spectroscopy (kICS) do pomiaru współczynników dyfuzji fluorescencyjnie znakowanych białek błony plazmatycznej w żywych komórkach ssaków.

Łatwy pomiar współczynników dyfuzji białek błony plazmatycznej znakowanych EGFP za pomocą spektroskopii korelacji obrazów k-space

Lateral diffusion and compartmentalization of plasma membrane proteins are tightly regulated in cells and thus, studying these processes will reveal new ...

Ogólnym celem tej procedury jest pomiar współczynników dyfuzji białek błonowych w żywych komórkach. Osiąga się to poprzez uprawę komórek wykazujących ekspresję białka z tagiem GFP, a następnie wykonanie sekwencji obrazów w odstępach czasu (time-lapse) przy użyciu mikroskopu z dyskiem obrotowym, z ustawieniem ostrości na błonę plazmatyczną. Drugim krokiem jest wybór wycinka w stosie obrazów, w którym błona jest płaska i nie występują ruchome organella.Następnie wycinek analizuje się przy użyciu oprogramowania do spektroskopii korelacyjnej obrazów opartej na przypadkach. Ostatnim krokiem jest wyciągnięcie średniej z wykresów dyfuzji w programie Excel. W rezultacie mikroskopia żywych komórek w połączeniu z techniką kicks jest wykorzystywana do pomiaru współczynnika dyfuzji białka błonowego.Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu biofizyki błon, takie jak wyznaczanie współczynników dyfuzji białek błonowych w różnych warunkach. Przy pierwszym uruchomieniu kodu kicks należy otworzyć program MATLAB i kliknąć plik. Następnie należy ustawić ścieżkę, kliknąć dodaj z podfolderami i odnaleźć na komputerze folder, w którym znajduje się kod kicks.Kliknij OK. Przed zapisaniem danych i zamknięciem programu MATLAB podczas akwizycji ważne jest, aby utrzymać membranę w ostrości przez cały czas obrazowania. Wybierz prostokątny obszar zainteresowania (ROI) na płaskim fragmencie membrany, gdzie fluorescencja jest rozłożona równomiernie.Należy wykluczyć ruchome organelle komórkowe oraz wystające regiony błony. Rozmiar kadru dobiera się tak, aby uzyskać statystykę wystarczającą do prawidłowego wykreślenia wykresów K kwadrat. Wykadruj wybrany obszar i zapisz go w formacie tiff.Zapisz plik w odpowiednim folderze. Jeśli z tego samego filmu uzyskano kilka wycinków, zastosuj numerację przyrostową, np. stack one crop, do tiff, stack one, crop two, tif itd. Aby przeprowadzić analizę, najpierw otwórz program Matlab, wpisz ICS gooey w oknie poleceń i naciśnij enter ICS.GUI jest nazwą pliku wykonywalnego programu graficznego interfejsu użytkownika do spektroskopii korelacyjnej obrazów w pakiecie ICS Gooey. Kliknij zakładkę kicks. Znajdź folder o nazwie MATLAB code.Przewiń do pliku o nazwie scripts i otwórz go, klikając dwukrotnie. Plik ten nazywa się edytorem. W edytorze.Przewiń, aby załadować zestawy danych kopnięć. Następnie skopiuj lub wpisz nazwę pliku i lokalizację folderu w wierszu poleceń. W wierszu poleceń poniżej lokalizacji folderu.Ustaw liczbę klatek do analizy. Stosuj te same ustawienia dla wszystkich kolejnych filmów w serii danych. W przypadku wystąpienia przesunięcia ostrości w późniejszych klatkach.Należy wykluczyć te elementy z analizy w edytorze. Kliknij zapisz, a następnie kliknij ewaluuj. Zbiór danych został teraz wczytany do oprogramowania analitycznego w oknie analizy kicks w interfejsie graficznym.Wprowadź ustawienia analizy, odznaczając najpierw pola dotyczące limfocytów T. Następnie wprowadź liczbę opóźnień czasowych (timelag) do analizy. Wprowadź maksymalną wartość K kwadrat.Wstępnie wartość ta zazwyczaj mieści się w przedziale od 20 do 50. Analizę należy powtarzać do momentu wyznaczenia optymalnych wartości, a następnie zastosować te ustawienia dla wszystkich kolejnych filmów w serii danych. Zawsze należy sprawdzać, czy wybrane ustawienia zapewniają dobre dopasowanie do danych, co potwierdzają odpowiednie wykresy kwadratów reszt oraz liniowy wykres dyfuzji.Następnie kliknij ustawienia zapisu i kontynuuj. Następnie kliknij tak, aby wyświetlić wszystkie wykresy. Kliknij załaduj serię obrazów, a następnie kliknij obszar roboczy.Wybierz obszar przycięcia serii obrazów przed kliknięciem przycisku importuj z obszaru roboczego. Następnie w polu rozmiar piksela wprowadź ustawienia zbierania danych systemu obrazowania. Wpisz rzutowany rozmiar piksela dla systemu obrazowania, przy którym pozyskano stosy obrazów.Kliknij „select ROIs” i wprowadź jedną z nich. Następnie kliknij „okay” i wybierz „whole image”. Kliknij „do kicks analysis”, a następnie kliknij „yes”, aby przeprowadzić filtrowanie obiektów nieruchomych.Wyniki otworzą się automatycznie w formie obrazów. Zminimalizuj okno ustawień, okno informacji o komórce oraz okno fotofizyki w oknie dynamiki. Sprawdź, czy wykres dynamiki wykazuje liniowe dopasowanie danych z ujemnym nachyleniem, co oznacza, że punkty danych są skorelowane i można założyć występowanie dyfuzji swobodnej.Zapisz współczynnik dyfuzji dla określonego opóźnienia czasowego i ustawień K kwadrat. Punkty danych na wykresach K kwadrat muszą skupiać się wokół linii dla danego czasu. Zaznacz pole wyboru Lags, wybierz opcję zapisz otwarte rysunki jako obrazy, a następnie kliknij zapisz otwarte rysunki jako obrazy, aby zapisać pliki z wynikami.Zapisz dane w nowym folderze, a następnie kliknij przycisk czyszczenia aktualnych danych (clear current data) i kontynuuj analizę kolejnej rośliny. Używając wcześniej ustalonych nazw roślin, wprowadź poszczególne współczynniki dyfuzji z każdego ROI do arkusza kalkulacyjnego, pamiętając o odnotowaniu liczby opóźnień czasowych oraz wartości K kwadrat. Oblicz średni współczynnik dyfuzji oraz odchylenie standardowe przy użyciu programu do arkuszy kalkulacyjnych.W celu oceny różnic statystycznych należy przeprowadzić test MOV Smirnoffa lub test t Studenta. Przy zastosowaniu poziomu istotności 5% można dokonać ilościowych porównań między komórkami. Arkusz kalkulacyjny z wykresami dyfuzji został wygenerowany przez oprogramowanie analityczne dla każdej uprawy, a dane dla każdego stanu w każdym odstępie czasu zostały uśrednione.Wygeneruj nowy wykres średniej dyfuzji do prezentacji w publikacjach lub podczas wystąpień. Przedstawione tutaj wyniki to sekwencja obrazów time-lapse akwaporyny 3 znakowanej EGFP. Obrazowanie przeprowadzono na żywych komórkach MDCK, będących komórkami nabłonka nerkowego, przy użyciu mikroskopu z dyskiem rotacyjnym z ostrością ustawioną na błonę komórkową.Przedstawiono tutaj obraz komórki z zaznaczonymi prostokątami przykładowymi wycinkami ROI służącymi do wyboru obszarów. Ważne jest, aby wycinać fragmenty na peryferiach komórki, gdzie błona jest jednorodna i płaska, tak aby wizualizowana była wyłącznie dyfuzja dwuwymiarowa. Należy unikać organelli komórkowych, pęcherzyków i wypustek błonowych; dla celów analizy istotne jest również, aby podczas rejestracji sekwencji czasowej nie występował dryft.Ten reprezentatywny wycinek został wykluczony z analizy oraz obliczeń typu kicks z powodu obecności ruchomych pęcherzyków, które mogą wpływać na współczynnik dyfuzji. Inny przykład wykluczonego wycinka, w którym występuje otwór w błonie, pokazano tutaj. Przedstawiono tutaj wykres dyfuzji dla jednego wycinka wygenerowanego z użyciem metody kicks.Metodę tę można wykorzystać do wyznaczenia współczynnika dyfuzji białka znakowanego białkiem fluorescencyjnym, barwnikiem lub kropkami kwantowymi. Nachylenie krzywej na wykresie dyfuzji jest po prostu ujemną wartością współczynnika dyfuzji; przedstawiony tutaj wykres dyfuzji dla akwaporyny 3 znakowanej EGFP zawiera zbyt wiele opóźnień czasowych. W tym przypadku analiza została przeprowadzona ponownie, ale z mniejszą liczbą opóźnień czasowych, tak aby wykres dyfuzji był liniowy.Przedstawiono tutaj typowy wykres kwadratowy przypadku. Jest to radialnie uśredniona i logarytmicznie przekształcona krzywa korelacji dla wybranego opóźnienia czasowego z tych wykresów K kwadrat. Nachylenie jest wykreślone w funkcji opóźnień czasowych, a wynikiem jest wcześniej pokazany wykres dyfuzji.Podczas analizy wykresów K kwadrat kluczowe jest dokonanie oceny dopasowania na podstawie tego konkretnego wykresu K kwadrat. Można wywnioskować, że zakres danych jest zbyt mały i nie mógł zostać poddany analizie, ponieważ powinien on wykazywać ujemny nachylenie i liniowo spadać do poziomu szumu. Ten wykres K kwadrat wymaga ponownej analizy z obniżoną maksymalną wartością K kwadrat, ponieważ dopasowanie przestało być prawidłowe, co wskazują rosnące reszty przy większych wartościach K kwadrat.W takim przypadku analizę należy przeprowadzić ponownie, wprowadzając niższą maksymalną wartość K kwadrat. Przedstawiono tutaj średni wykres dyfuzji uśredniony dla 10 powtórzeń. Wykres dyfuzji został wygenerowany na podstawie pliku Excel z analizy.Współczynnik dyfuzji białka AQUAPORIN three EGFP oblicza się zgodnie z poniższą procedurą. Można zastosować również inne metody, takie jak pomiar współczynnika dyfuzji białek błonowych po dodaniu różnych leków, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, np. czy współczynnik dyfuzji zmienia się po leczeniu farmakologicznym oraz czy prawdopodobne są zmiany w środowisku lipidowym i/lub oddziaływaniach białko-białko w błonie.

easy-measurement-diffusion-coefficients-egfp-tagged-plasma-membrane

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Łatwe pomiary współczynników dyfuzji białek membrany plazmatycznej z oznaczeniem EGFP za pomocą spektroskopii korelacji obrazu przestrzeni k

Opisano technikę badania partycjonowania białek fluorescencyjnych w tratwach lipidowych błony plazmatycznej żywych komórek. Metoda ta wykorzystuje różnice w czasie dyfuzji białek znajdujących się wewnątrz lub na zewnątrz tratw lipidowych. Akwizycja danych może być przeprowadzana dynamicznie w warunkach kontrolnych lub po dodaniu leku.

Oznaczanie partycji sond znakowanych fluorescencyjnie w tratwach lipidowych w żywych komórkach metodą spektroskopii korelacyjnej fluorescencji (FCS)

Multiple-Target Tracing to autorski algorytm opracowany do śledzenia pojedynczo znakowanych cząsteczek w błonie plazmatycznej żywych komórek. Efektywne wykrywanie, szacowanie i śledzenie cząsteczek w czasie przy wysokiej gęstości znakowania zapewnia przyjazne dla użytkownika, kompleksowe narzędzie do badania dynamiki błon w skali nanometrycznej.

Mapowanie dyfuzji molekularnej w błonie plazmatycznej za pomocą Multiple-Target Tracing (MTT)

Ten film demonstruje użycie spektroskopii fluktuacji fluorescencji do wykrywania interakcji między białkami na powierzchni komórki na styku komórka-komórka. Poprzez ekspresję transbłonowego receptora adhezyjnego będącego przedmiotem zainteresowania znakowanego białkiem fluorescencyjnym i mieszanie dwóch różnych populacji komórek zawierających dwie spektralnie oddzielone znaczniki fluorescencyjne, trans-interakcja między receptorami dwóch sąsiednich komórek o różnej fluorescencji jest oceniana...

Spektroskopia fluktuacji fluorescencji w celu zbadania interakcji białek w kontaktach komórkowych

Przestrzenny rozkład i czasowa dynamika białek błony komórkowej i lipidów to gorący temat w biologii. W tym przypadku problem ten został rozwiązany za pomocą czasoprzestrzennej analizy fluktuacji obrazu, która zapewnia koncepcyjnie te same fizyczne wielkości śledzenia pojedynczych cząstek, ale wykorzystuje małe znaczniki molekularne i standardowe konfiguracje mikroskopowe.

Od szybkiego obrazowania fluorescencyjnego do prawa dyfuzji molekularnej na żywych błonach komórkowych w komercyjnym mikroskopie

Opisano metodę pomiaru dyfuzji białek w błonach pierwotnych komórek odpornościowych za pomocą spektroskopii korelacji fluorescencji (FCS). W niniejszej pracy zilustrowano zastosowanie przeciwciał do znakowania fluorescencyjnego.

Dyfuzja molekularna w błonach plazmatycznych limfocytów pierwotnych mierzona za pomocą spektroskopii korelacji fluorescencji

Tutaj prezentujemy protokół do przeprowadzenia analizy ilościowej poziomu asocjacji plazmato-błonowej dla fluorescencyjnie oznakowanego białka związanego obwodowo. Metoda opiera się na obliczeniowej dekompozycji błonowej i cytoplazmatycznej składowej sygnału obserwowanej w komórkach znakowanych markerem fluorescencyjnym błony plazmatycznej.

Oznaczanie partycjonowania błony plazmatycznej dla białek związanych obwodowo

Tutaj prezentujemy protokół do analizy obrazu śledzenia pojedynczych cząstek, który umożliwia ilościową ocenę współczynników dyfuzji, typów ruchu i rozmiarów klastrów pojedynczych cząstek wykrywanych przez mikroskopię fluorescencyjną.

Protokół przetwarzania obrazu do analizy wielkości dyfuzji i klastra receptorów błonowych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Ten artykuł ma na celu przedstawienie protokołu, jak zbudować mikroskop spektroskopii korelacji fluorescencji (svFCS) do pomiaru dyfuzji molekularnej na błonie komórkowej żywych komórek.

Spektroskopia korelacji fluorescencji zmienności plamki do analizy dyfuzji molekularnej na błonie plazmatycznej żywych komórek

Prezentujemy eksperymentalny protokół i proces analizy danych do przeprowadzenia dwukolorowej spektroskopii korelacji krzyżowej fluorescencji (FCCS) na żywo w połączeniu z transferem energii rezonansowej Förster (FRET) w celu zbadania dynamiki receptorów błonowych w żywych komórkach przy użyciu nowoczesnych technik znakowania fluorescencji.

Dwukolorowa spektroskopia korelacji krzyżowej fluorescencji w celu zbadania interakcji białko-białko i dynamiki białek w żywych komórkach

W niniejszym artykule opiszemy procedurę pomiaru współczynników dyfuzji z wykorzystaniem wielofotonowego odzyskiwania fluorescencji po fotowybielaniu. Rozpoczniemy od ustawienia lasera wzdłuż drogi optycznej do próbki i określenia odpowiednich parametrów eksperymentalnych, a następnie przejdziemy do generowania i wreszcie dopasowywania krzywych odzyskiwania fluorescencji.

Pomiar współczynników dyfuzji za pomocą dwufotonowej regeneracji fluorescencji po fotobieleniu

Poznaj metodę pomiaru współczynników dyfuzji białek błony plazmatycznej znakowanych EGFP w żywych komórkach ssaków za pomocą spektroskopii korelacji obrazów k-space.

Łatwy pomiar współczynników dyfuzji białek błony plazmatycznej znakowanych EGFP za pomocą spektroskopii korelacji obrazów k-space (Wideo) | JoVE Journal

Łatwy pomiar współczynników dyfuzji białek błony plazmatycznej znakowanych EGFP za pomocą spektroskopii korelacji obrazów k-space

Przeglądaj więcej filmów