Łatwy pomiar współczynników dyfuzji białek błony plazmatycznej znakowanych EGFP za pomocą spektroskopii korelacji obrazów k-space

Ogólnym celem tej procedury jest pomiar współczynników dyfuzji białek błonowych w żywych komórkach. Osiąga się to poprzez uprawę komórek wykazujących ekspresję białka z tagiem GFP, a następnie wykonanie sekwencji obrazów w odstępach czasu (time-lapse) przy użyciu mikroskopu z dyskiem obrotowym, z ustawieniem ostrości na błonę plazmatyczną. Drugim krokiem jest wybór wycinka w stosie obrazów, w którym błona jest płaska i nie występują ruchome organella.

Następnie wycinek analizuje się przy użyciu oprogramowania do spektroskopii korelacyjnej obrazów opartej na przypadkach. Ostatnim krokiem jest wyciągnięcie średniej z wykresów dyfuzji w programie Excel. W rezultacie mikroskopia żywych komórek w połączeniu z techniką kicks jest wykorzystywana do pomiaru współczynnika dyfuzji białka błonowego.

Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu biofizyki błon, takie jak wyznaczanie współczynników dyfuzji białek błonowych w różnych warunkach. Przy pierwszym uruchomieniu kodu kicks należy otworzyć program MATLAB i kliknąć plik. Następnie należy ustawić ścieżkę, kliknąć dodaj z podfolderami i odnaleźć na komputerze folder, w którym znajduje się kod kicks.

Kliknij OK. Przed zapisaniem danych i zamknięciem programu MATLAB podczas akwizycji ważne jest, aby utrzymać membranę w ostrości przez cały czas obrazowania. Wybierz prostokątny obszar zainteresowania (ROI) na płaskim fragmencie membrany, gdzie fluorescencja jest rozłożona równomiernie.

Należy wykluczyć ruchome organelle komórkowe oraz wystające regiony błony. Rozmiar kadru dobiera się tak, aby uzyskać statystykę wystarczającą do prawidłowego wykreślenia wykresów K kwadrat. Wykadruj wybrany obszar i zapisz go w formacie tiff.

Zapisz plik w odpowiednim folderze. Jeśli z tego samego filmu uzyskano kilka wycinków, zastosuj numerację przyrostową, np. stack one crop, do tiff, stack one, crop two, tif itd. Aby przeprowadzić analizę, najpierw otwórz program Matlab, wpisz ICS gooey w oknie poleceń i naciśnij enter ICS.

GUI jest nazwą pliku wykonywalnego programu graficznego interfejsu użytkownika do spektroskopii korelacyjnej obrazów w pakiecie ICS Gooey. Kliknij zakładkę kicks. Znajdź folder o nazwie MATLAB code.

Przewiń do pliku o nazwie scripts i otwórz go, klikając dwukrotnie. Plik ten nazywa się edytorem. W edytorze.

Przewiń, aby załadować zestawy danych kopnięć. Następnie skopiuj lub wpisz nazwę pliku i lokalizację folderu w wierszu poleceń. W wierszu poleceń poniżej lokalizacji folderu.

Ustaw liczbę klatek do analizy. Stosuj te same ustawienia dla wszystkich kolejnych filmów w serii danych. W przypadku wystąpienia przesunięcia ostrości w późniejszych klatkach.

Należy wykluczyć te elementy z analizy w edytorze. Kliknij zapisz, a następnie kliknij ewaluuj. Zbiór danych został teraz wczytany do oprogramowania analitycznego w oknie analizy kicks w interfejsie graficznym.

Wprowadź ustawienia analizy, odznaczając najpierw pola dotyczące limfocytów T. Następnie wprowadź liczbę opóźnień czasowych (timelag) do analizy. Wprowadź maksymalną wartość K kwadrat.

Wstępnie wartość ta zazwyczaj mieści się w przedziale od 20 do 50. Analizę należy powtarzać do momentu wyznaczenia optymalnych wartości, a następnie zastosować te ustawienia dla wszystkich kolejnych filmów w serii danych. Zawsze należy sprawdzać, czy wybrane ustawienia zapewniają dobre dopasowanie do danych, co potwierdzają odpowiednie wykresy kwadratów reszt oraz liniowy wykres dyfuzji.

Następnie kliknij ustawienia zapisu i kontynuuj. Następnie kliknij tak, aby wyświetlić wszystkie wykresy. Kliknij załaduj serię obrazów, a następnie kliknij obszar roboczy.

Wybierz obszar przycięcia serii obrazów przed kliknięciem przycisku importuj z obszaru roboczego. Następnie w polu rozmiar piksela wprowadź ustawienia zbierania danych systemu obrazowania. Wpisz rzutowany rozmiar piksela dla systemu obrazowania, przy którym pozyskano stosy obrazów.

Kliknij „select ROIs” i wprowadź jedną z nich. Następnie kliknij „okay” i wybierz „whole image”. Kliknij „do kicks analysis”, a następnie kliknij „yes”, aby przeprowadzić filtrowanie obiektów nieruchomych.

Wyniki otworzą się automatycznie w formie obrazów. Zminimalizuj okno ustawień, okno informacji o komórce oraz okno fotofizyki w oknie dynamiki. Sprawdź, czy wykres dynamiki wykazuje liniowe dopasowanie danych z ujemnym nachyleniem, co oznacza, że punkty danych są skorelowane i można założyć występowanie dyfuzji swobodnej.

Zapisz współczynnik dyfuzji dla określonego opóźnienia czasowego i ustawień K kwadrat. Punkty danych na wykresach K kwadrat muszą skupiać się wokół linii dla danego czasu. Zaznacz pole wyboru Lags, wybierz opcję zapisz otwarte rysunki jako obrazy, a następnie kliknij zapisz otwarte rysunki jako obrazy, aby zapisać pliki z wynikami.

Zapisz dane w nowym folderze, a następnie kliknij przycisk czyszczenia aktualnych danych (clear current data) i kontynuuj analizę kolejnej rośliny. Używając wcześniej ustalonych nazw roślin, wprowadź poszczególne współczynniki dyfuzji z każdego ROI do arkusza kalkulacyjnego, pamiętając o odnotowaniu liczby opóźnień czasowych oraz wartości K kwadrat. Oblicz średni współczynnik dyfuzji oraz odchylenie standardowe przy użyciu programu do arkuszy kalkulacyjnych.

W celu oceny różnic statystycznych należy przeprowadzić test MOV Smirnoffa lub test t Studenta. Przy zastosowaniu poziomu istotności 5% można dokonać ilościowych porównań między komórkami. Arkusz kalkulacyjny z wykresami dyfuzji został wygenerowany przez oprogramowanie analityczne dla każdej uprawy, a dane dla każdego stanu w każdym odstępie czasu zostały uśrednione.

Wygeneruj nowy wykres średniej dyfuzji do prezentacji w publikacjach lub podczas wystąpień. Przedstawione tutaj wyniki to sekwencja obrazów time-lapse akwaporyny 3 znakowanej EGFP. Obrazowanie przeprowadzono na żywych komórkach MDCK, będących komórkami nabłonka nerkowego, przy użyciu mikroskopu z dyskiem rotacyjnym z ostrością ustawioną na błonę komórkową.

Przedstawiono tutaj obraz komórki z zaznaczonymi prostokątami przykładowymi wycinkami ROI służącymi do wyboru obszarów. Ważne jest, aby wycinać fragmenty na peryferiach komórki, gdzie błona jest jednorodna i płaska, tak aby wizualizowana była wyłącznie dyfuzja dwuwymiarowa. Należy unikać organelli komórkowych, pęcherzyków i wypustek błonowych; dla celów analizy istotne jest również, aby podczas rejestracji sekwencji czasowej nie występował dryft.

Ten reprezentatywny wycinek został wykluczony z analizy oraz obliczeń typu kicks z powodu obecności ruchomych pęcherzyków, które mogą wpływać na współczynnik dyfuzji. Inny przykład wykluczonego wycinka, w którym występuje otwór w błonie, pokazano tutaj. Przedstawiono tutaj wykres dyfuzji dla jednego wycinka wygenerowanego z użyciem metody kicks.

Metodę tę można wykorzystać do wyznaczenia współczynnika dyfuzji białka znakowanego białkiem fluorescencyjnym, barwnikiem lub kropkami kwantowymi. Nachylenie krzywej na wykresie dyfuzji jest po prostu ujemną wartością współczynnika dyfuzji; przedstawiony tutaj wykres dyfuzji dla akwaporyny 3 znakowanej EGFP zawiera zbyt wiele opóźnień czasowych. W tym przypadku analiza została przeprowadzona ponownie, ale z mniejszą liczbą opóźnień czasowych, tak aby wykres dyfuzji był liniowy.

Przedstawiono tutaj typowy wykres kwadratowy przypadku. Jest to radialnie uśredniona i logarytmicznie przekształcona krzywa korelacji dla wybranego opóźnienia czasowego z tych wykresów K kwadrat. Nachylenie jest wykreślone w funkcji opóźnień czasowych, a wynikiem jest wcześniej pokazany wykres dyfuzji.

Podczas analizy wykresów K kwadrat kluczowe jest dokonanie oceny dopasowania na podstawie tego konkretnego wykresu K kwadrat. Można wywnioskować, że zakres danych jest zbyt mały i nie mógł zostać poddany analizie, ponieważ powinien on wykazywać ujemny nachylenie i liniowo spadać do poziomu szumu. Ten wykres K kwadrat wymaga ponownej analizy z obniżoną maksymalną wartością K kwadrat, ponieważ dopasowanie przestało być prawidłowe, co wskazują rosnące reszty przy większych wartościach K kwadrat.

W takim przypadku analizę należy przeprowadzić ponownie, wprowadzając niższą maksymalną wartość K kwadrat. Przedstawiono tutaj średni wykres dyfuzji uśredniony dla 10 powtórzeń. Wykres dyfuzji został wygenerowany na podstawie pliku Excel z analizy.

Współczynnik dyfuzji białka AQUAPORIN three EGFP oblicza się zgodnie z poniższą procedurą. Można zastosować również inne metody, takie jak pomiar współczynnika dyfuzji białek błonowych po dodaniu różnych leków, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, np. czy współczynnik dyfuzji zmienia się po leczeniu farmakologicznym oraz czy prawdopodobne są zmiany w środowisku lipidowym i/lub oddziaływaniach białko-białko w błonie.