Name: Zastosowanie fali uderzeniowej w hodowlach komórkowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-08T18:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 39 s
Description: Poznaj metodę zastosowania fali uderzeniowej w hodowlach komórkowych w celu uzyskania powtarzalnych wyników. Technika ta minimalizuje zakłócenia fizyczne i umożliwia analizę genów oraz cytokin metodą PCR.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Reinerowi Schultheissowi i Wolfgangowi Schadenowi za inspirację dla tego modelu. Dziękujemy również Christianowi Dorfmüllerowi za jego ogromne wysiłki na rzecz wspierania naszych badań.
Wielkie podziękowania dla Roberta Göschla i Hansa Hoheneggera za staranną techniczną realizację naszych pomysłów!

Etyczne uprawnienie
Po uzyskaniu pisemnej świadomej zgody pacjentów, pobrano pępowinę z cesarskiego cięcia na Oddziale Ginekologii w celu wyizolowania ludzkich komórek śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC). Zgodę uzyskała komisja etyczna Uniwersytetu Medycznego w Innsbrucku (nr UN4435).
1. Przygotuj kąpiel wodną IVSWT
<ol>
	<li>Przygotuj 3,5 l wody z kranu w odpowiednim zbiorniku. Woda musi być podgrzana do temperatury 37 °C (patrz protokół 6).</li>
	<li>Wlej wodę do łaźni wodnej, aż poziom wody znajdzie się około 3 cm poniżej krawędzi. Zwróć uwagę, aby całkowicie pokryć membranę wodą. Będzie to wymagało około przygotowanych 3,5 l.</li>
	<li>Podłącz czujnik temperatury do zasilania.</li>
	<li>Umieść czujnik w przeznaczonej do tego oprawce na tylnej ścianie łaźni wodnej.</li>
	<li>Podłącz ogrzewanie do zasilania czujnika temperatury. Nie rób tego bez wody w wannie, ponieważ grzejnik stopi pleksi.</li>
	<li>Poczekaj, aż woda osiągnie stabilną temperaturę 37 °C. Regularnie mieszaj wodę patyczkiem, aby zagwarantować stałą temperaturę przez cały czas trwania kąpieli wodnej.</li>
</ol>
2. Przygotowanie komórek i kolb hodowlanych
<ol>
	<li>Komórki nasienne przez noc o pożądanej gęstości w kolbach hodowlanych T25 lub hodować komórki w kolbach bezpośrednio, aż osiągną pożądaną konfluencję.</li>
	<li>Przed eksperymentem ustaw kolby pionowo.</li>
	<li>Napełnij kolby hodowlane pożywką hodowlaną aż do momentu znalezienia się tuż pod szyjką. Nie wlewać zbyt dużej ilości pożywki do kolb, ponieważ medium stykające się z szyjką lub nakrętką zamykającą może zostać zanieczyszczone.</li>
	<li>Przykręcić kolby z solidnymi nakrętkami bez filtrów, aby zapobiec zanieczyszczeniu wodą. Należy pamiętać, że woda w wannie i sama kąpiel nie są sterylne.</li>
	<li>Uszczelnić nakrętki preparatem Parafilm przed włożeniem do łaźni wodnej.</li>
	<li>Zamocuj szczelnie zamknięte kolby hodowlane w dostarczonym stojaku.</li>
	<li>Włożyć stałą kolbę do łaźni wodnej. Zwróć uwagę, aby środek kolby do hodowli komórkowej znajdował się na tej samej wysokości co środek membrany aplikatora fali uderzeniowej. Prowadzi Cię linia z boku wanny.</li>
</ol>
3. Zdefiniuj parametry leczenia
<ol>
	<li>Określ odległość między źródłem fali uderzeniowej a próbką. Zidentyfikuj idealne parametry leczenia, przeprowadzając eksperyment pilotażowy polegający na znalezieniu parametrów, jak opisano na rysunku 6.</li>
	<li>Wybierz odpowiednie parametry zabiegu (energia, strumień energii, gęstość, częstotliwość) na urządzeniu do fal uderzeniowych. Ponownie zapoznaj się z rysunkiem 6.</li>
</ol>
4. Aplikacja fali uderzeniowej
<ol>
	<li>Nałóż dużą ilość dostępnego na rynku żelu do transmisji ultradźwięków na aplikator fali uderzeniowej, a także na membranę łaźni wodnej. Ma to na celu zapewnienie sprzężenia. Między aplikatorem a membraną nie powinno znajdować się powietrze ani pęcherzyki powietrza, ponieważ pochłaniałyby one fale uderzeniowe.</li>
	<li>Podłącz aplikator do membrany i trzymaj go stabilnie na środku membrany. Uważaj, aby był wyrównany w poziomie.</li>
	<li>Upewnij się, że prawidłowe pionowe położenie sondy wewnątrz łaźni wodnej jest zgodne ze wskazanym oznaczeniem z boku wanny.</li>
	<li>Trzymać środki aplikatora i kolby stabilnie w linii poziomej.</li>
	<li>Aktywuj urządzenie do fal uderzeniowych i aplikuj impulsy, utrzymując kolbę hodowlaną oraz aplikator w stabilnej pozycji podczas całego zabiegu.</li>
</ol>
5. Po leczeniu
<ol>
	<li>Wyjąć kolbę hodowlaną z łaźni wodnej.</li>
	<li>Osusz go zwykłymi ręcznikami papierowymi.</li>
	<li>Dokładnie przetrzeć kolbę środkami dezynfekującymi.</li>
	<li>Usuń uszczelkę i nasadkę Parafilm.</li>
	<li>Odpipetować pożywkę znajdującą się wewnątrz kolb do probówek odśrodkowych.</li>
	<li>Odpowiednio odwirować. Parametry wirowania zależą od rodzaju użytego ogniwa, np. W przypadku HUVEC należy użyć 290 g w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Dodać 5 ml pożywki do hodowli komórkowej do kolby. Zawiesić odwirowany osad komórkowy z 2 ml pożywki do hodowli komórkowych. Odpipetować zawiesinę do kolby. W ten sposób fragmenty komórek lub komórki, które mogły zostać oderwane podczas leczenia, nie gubią się.</li>
</ol>
Pułapki
<ol>
	<li>Przygotowanie, jak również obróbka, powinny być przeprowadzane w sterylnych warunkach wewnątrz przepływu laminarnego, aby uniknąć zanieczyszczenia hodowli komórkowej.</li>
	<li>Zaleca się dobrą praktykę hodowli komórkowych, aby uniknąć zanieczyszczenia sond. W szczególności zdecydowanie zaleca się dezynfekcję zewnętrznej strony kolb przed ponownym umieszczeniem ich w inkubatorze. Kąpiel wodna, podobnie jak woda w środku, nie jest sterylna!</li>
	<li>Nie podłączaj grzejnika do zasilania, chyba że łaźnia wodna jest napełniona wodą, aby uniknąć uszkodzenia wanny zbudowanej z pleksiglasu.</li>
	<li>Użyj dużych ilości żelu ultradźwiękowego na aplikatorze fali uderzeniowej, aby zagwarantować prawidłowe sprzężenie i rozchodzenie się fali do kąpieli. Powietrze, a nawet małe pęcherzyki powietrza pochłaniają fale uderzeniowe!</li>
	<li>Sprawdź położenie sond wewnątrz łaźni wodnej w stosunku do aplikatora, aby zapewnić obróbkę całego obszaru wzrostu.</li>
	<li>Nie zanurzaj sond zbyt głęboko w wodzie, aby uniknąć zanieczyszczenia.</li>
</ol>

<ol><li>Haupt, G., Haupt, A., Ekkernkamp, A., Gerety, B., Chvapil, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+shock+waves+on+fracture+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Urology%22%5BJournal%5D)">Influence of shock waves on fracture healing.</a> Urology. 39, 529-532 (1992).</li>
<li>Schaden, W., Fischer, A., Sailler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracorporeal+shock+wave+therapy+of+nonunion+or+delayed+osseous+union%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Orthop.+Relat.+Res%22%5BJournal%5D)">Extracorporeal shock wave therapy of nonunion or delayed osseous union.</a> Clin. Orthop. Relat. Res. 387, 90-94 (2001).</li>
<li>Schaden, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shock+wave+therapy+for+acute+and+chronic+soft+tissue+wounds%3A+a+feasibility+study%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Surg.+Res%22%5BJournal%5D)">Shock wave therapy for acute and chronic soft tissue wounds: a feasibility study.</a> J. Surg. Res. 143, 1-12 (2007).</li>
<li>Tepeköylü, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shock+wave+treatment+induces+angiogenesis+and+mobilizes+endogenous+CD31%2FCD34-positive+endothelial+cells+in+a+hindlimb+ischemia+model%3A+Implications+for+angiogenesis+and+vasculogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Thorac.+Cardiovasc.+Surg%22%5BJournal%5D)">Shock wave treatment induces angiogenesis and mobilizes endogenous CD31/CD34-positive endothelial cells in a hindlimb ischemia model: Implications for angiogenesis and vasculogenesis.</a> J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 146, 971-978 (2013).</li>
<li>Nishida, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracorporeal+cardiac+shock+wave+therapy+markedly+ameliorates+ischemia-induced+myocardial+dysfunction+in+pigs+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Extracorporeal cardiac shock wave therapy markedly ameliorates ischemia-induced myocardial dysfunction in pigs in vivo.</a> Circulation. 110, 3055-3061 (2004).</li>
<li>Fukumoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracorporeal+cardiac+shock+wave+therapy+ameliorates+myocardial+ischemia+in+patients+with+severe+coronary+artery+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Coron.+Artery+Dis%22%5BJournal%5D)">Extracorporeal cardiac shock wave therapy ameliorates myocardial ischemia in patients with severe coronary artery disease.</a> Coron. Artery Dis. 17, 63-70 (2006).</li>
<li>Gotte, G., Amelio, E., Russo, S., Marlinghaus, E., Musci, G., Suzuki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short-time+non-enzymatic+nitric+oxide+synthesis+from+L-arginine+and+hydrogen+peroxide+induced+by+shock+waves+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Short-time non-enzymatic nitric oxide synthesis from L-arginine and hydrogen peroxide induced by shock waves treatment.</a> FEBS Lett. 520, 153-155 (2002).</li>
<li>Wang, F. S., Wang, C. J., Huang, H. J., Chung, H., Chen, R. F., Yang, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+shock+wave+mediates+membrane+hyperpolarization+and+Ras+activation+for+osteogenesis+in+human+bone+marrow+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Physical shock wave mediates membrane hyperpolarization and Ras activation for osteogenesis in human bone marrow stromal cells.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 287, 648-655 (2001).</li>
<li>Mittermayr, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracorporeal+shock+wave+therapy+%28ESWT%29+minimizes+ischemic+tissue+necrosis+irrespective+of+application+time+and+promotes+tissue+revascularization+by+stimulating+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Surg%22%5BJournal%5D)">Extracorporeal shock wave therapy (ESWT) minimizes ischemic tissue necrosis irrespective of application time and promotes tissue revascularization by stimulating angiogenesis.</a> Ann. Surg. 253, 1024-1032 (2011).</li>
<li>Baker, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+the+mouse+aortic+ring+assay+to+study+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Use of the mouse aortic ring assay to study angiogenesis.</a> Nat. Protoc. 22, 89-104 (2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Znaczenie proponowanego modelu dla leczenia falą uderzeniową in vitro polega na tym, że fale mogą rozchodzić się po przejściu przez hodowlę komórkową, w przeciwieństwie do istniejących modeli. W ten sposób można uniknąć zakłócających skutków fizycznych, takich jak siły rozciągające. Model ten bardziej przypomina warunki panujące in vivo niż te, w których inni naukowcy przykładają fale bezpośrednio do kolb do hodowli komórkowych.
Dodatkowym atutem jest możliwość zmiany odległo...

Fale uderzeniowe to fale ciśnienia dźwięku powstające w wyniku nagłego uwolnienia energii, np. jako grzmot podczas błyskawicy. W medycynie fale uderzeniowe są stosowane od ponad 30 lat w litotrypsji do rozpadu kamieni nerkowych. Od czasu przypadkowego stwierdzenia pogrubienia kości biodrowej u pacjentów z litotrypsją na początku lat 80. XX wieku, przeprowadzono pierwsze badania w celu oceny wpływu leczenia falą uderzeniową (SWT) na gojenie się kości1. Można zaobserwować imponujące wyniki poprawy gojenia się niezrostów kości długich2. Następnie wskazania rozszerzono na rany tkanek miękkich3. Wyniki badań podstawowych wykazały, że fale uderzeniowe powodują biologiczny bodziec w tkance docelowej bez żadnych późniejszych uszkodzeń. Po uwolnieniu angiogennych czynników wzrostu (np. VEGF, PlGF, FGF) następuje znaczna angiogeneza. Doprowadziło to do dalszego rozszerzenia wskazań w kierunku patologii niedokrwiennych. Nasza grupa i inni wykazali pozytywny wpływ SWT na chorobę niedokrwienną serca w modelach zwierzęcych, a także w badaniach klinicznych4-6.
Jednak dokładny mechanizm przekształcania fizycznego bodźca SWT w sygnał biologiczny (mechanotransdukcja) pozostaje w dużej mierze nieznany. Ponieważ zainteresowanie SWT ze strony kilku dziedzin medycyny stale rośnie, poszukiwanie tego mechanizmu staje się coraz bardziej intensywne. Dlatego eksperymenty z falą uderzeniową in vitro zyskują na znaczeniu. Oprócz zmniejszenia liczby doświadczeń na zwierzętach i opłacalności, największą zaletą leczenia falą uderzeniową in vitro (IVSWT) może być możliwość zbadania specyficznego zachowania określonego typu komórek. W regeneracji tkanek za pośrednictwem fali uderzeniowej najprawdopodobniej zaangażowane są wszystkie komórki leczonej tkanki, a nawet omawiane są skutki ogólnoustrojowe. Niemniej jednak każdy typ komórki odgrywa określoną rolę i ma swoją własną wewnętrzną funkcję. IVSWT umożliwia nam wykrycie tej konkretnej funkcji, a tym samym pozwala nam lepiej zrozumieć złożone procesy leżące u jej podstaw.
Dzisiejsza wiedza na temat wpływu fali uderzeniowej na hodowle komórkowe obejmuje wzrost proliferacji, zmianę receptorów błony komórkowej, wzrost i przyspieszenie różnicowania komórek, uwalnianie czynników wzrostu i chemo-atraktantów, a także zwiększoną migrację komórek7-9.
Rozpraszające efekty fizyczne w większości modeli in vitro Opisano różne metody stosowania fal uderzeniowych na hodowlach komórkowych. Fakt ten prowadzi do problemu, że bardzo trudno jest porównać wyniki, ponieważ fizyczne warunki stymulacji komórek są dość różne między tymi modelami. Ogólnie rzecz biorąc, wszystkie istniejące modele koncentrują się na tym, jak najlepiej zastosować fale uderzeniowe do komórek.
Pozostaje jednak pytanie: Co dzieje się z falami po przejściu hodowli komórkowej? Główny problem polega na tym, że różnica impedancji akustycznej pożywki do hodowli komórkowej i otaczającego powietrza jest tak duża, że ponad 99% fal uderzeniowych zostaje odbitych (rysunek 1).
Ze względu na różnicę w impedancji akustycznej dwóch mediów, fale nie tylko odbijają się, ale następuje przesunięcie fazowe o 180°, co powoduje silne siły rozciągające na komórki Rysunek 2.
Impedancja akustyczna jest definiowana jako iloczyn gęstości materiału i jego prędkości dźwięku Z=ρ x c. Dla wody impedancja akustyczna wynosi ZWater= 1 440 000 Ns/m3, dla powietrza tylko 420 Ns/m3. Duża różnica tych dwóch wartości powoduje odbicie i przesunięcie fazowe fal uderzeniowych. Przesunięcie fazowe zamienia impuls dodatniego ciśnienia w falę rozciągającą.
Nawet jeśli ta siła rozciągająca nie jest szkodliwa dla komórek, przeszkadza ona w naśladowaniu efektów fali uderzeniowej in vivo in vitro. In vivo te siły rozciągające prawie nie występują ze względu na duże struktury ciała.
Ponadto, fale biegnące z tyłu mogą nawet przeszkadzać tym nadchodzącym. Może to powodować zakłócenia. Znane są dwa rodzaje zakłóceń. Interferencja konstruktywna oznacza, że obie fale są dodawane, co skutkuje podwojeniem amplitudy Rysunek 3. Interferencja destrukcyjna występuje, gdy fale spotykają się ze sobą diametralnie przeciwstawnymi. Powoduje to zniesienie fal (rys. 3). Dlatego IVSWT potrzebuje modelu, który umożliwia rozchodzenie się fal uderzeniowych po przejściu przez hodowlę komórkową.
Kąpiel wodna IVSWT
Rozważania wynikające z wyżej wymienionych obaw doprowadziły nas do zaprojektowania kąpieli wodnej w celu uniknięcia opisanych problemów Rysunek 4. Zasadniczo składa się z pojemnika zbudowanego z pleksiglasu z membraną do łączenia każdego rodzaju aplikatora fali uderzeniowej. Do sprzężenia między tą membraną a aplikatorem należy użyć żelu do transmisji ultradźwięków. Łaźnia wodna jest napełniana odgazowaną wodą, aby uniknąć kawitacji, która wystąpiłaby, gdyby gaz został rozcieńczony w wodzie. Grzałka na dole z czujnikiem temperatury podłączonym do jednostki sterującej umożliwia regulację temperatury w celu imitacji warunków in vivo i uniknięcia wychładzania się kultur komórkowych podczas zabiegu. Temperaturę można utrzymać na stałym poziomie 37 stopni Celsjusza, tak jak ma to miejsce w inkubatorze. Uchwyt na próbki komórek pozwala na zanurzenie dowolnego rodzaju kolby hodowlanej lub probówki. W związku z tym naczynie na próbkę musi być całkowicie wypełnione pożywką hodowlaną, ponieważ pęcherzyki powietrza blokowałyby fale uderzeniowe! Absorber w kształcie klina na tylnej ścianie wanny niszczy fale, aby nie odbijały się i nie cofały, aby uniknąć zakłóceń.
Kolejną zaletą innych modeli IVSWT jest możliwość zmiany odległości między aplikatorem a kolbami hodowlanymi. Wyniki naszej grupy i innych osób korzystających z tego modelu wyraźnie pokazują, że każdy typ komórek reaguje bardzo specyficznie na różne parametry leczenia. Co więcej, określenie odległości między źródłem fal a próbką ma kluczowe znaczenie, ponieważ pozwala nam kontrolować ogniwa, aby znajdowały się w określonej pozycji w stosunku do ogniska aplikatora fali uderzeniowej.

<table><tbody><tr><td>Urządzenie do fal uderzeniowych Orthogold</td><td>Technologie Regeneracji Tkanek, Woodstock, GA &ndash; wyprodukowane przez MTS-Europe GmbH, Konstancja, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kąpiel wodna IVSWT V2.0</td><td>Johann Hohenegger - Produkty</td><td></td><td></td>techniczne</tr><tr><td>EBM-2 Basal Medium 500 m +EGM-2 SingleQuot Suppl. & Czynniki wzrostu</td><td>Lonza</td><td>CC-3156 & CC-4176</td><td>Pożywka ta została użyta do pokazanych eksperymentów z HUVEC w celu napełnienia kolby do hodowli komórkowych. W przypadku innych typów komórek użyj zalecanej pożywki.</td></tr><tr><td><a href="http://www.labplanet.com/pechiney-parafilm-m-pm996.html">Pechiney&nbsp; Parafilm M PM996</a></td><td>Pechiney Opakowanie z tworzywa sztucznego</td><td>PH-LF-PM996-EA w labplanet.com</td><td>do uszczelniania kolb</td></tr><tr><td>Pipety serologiczne Falcon 25 ml</td><td>Becton Dickinson Labware</td><td>357525</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta serologiczna CellMate II&nbsp;</td><td>Matrix Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Skintact Żel ultradźwiękowy</td><td>Skintact</td><td>UL-01 250 ml</td><td></td></tr><tr><td>T25 Kolby do hodowli komórkowych</td><td>COSTAR</td><td>3056</td><td></td></tr><tr><td>Mikrozid środek dezynfekujący</td><td>Sch&uuml; lke</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3,5 l Odgazowana woda</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ręczniki</td><td></td><td></td><td></td> papierowe</tr></tbody></table>

zastosowanie fali uderzeniowej w hodowlach komórkowych

Shock Wave Application to Cell Cultures

Fale uderzeniowe są obecnie dobrze znane ze swoich efektów regeneracyjnych. Wyniki badań podstawowych wykazały, że fale uderzeniowe powodują biologiczny bodziec skierowany do komórek lub tkanek bez żadnych późniejszych uszkodzeń. W związku z tym eksperymenty in vitro cieszą się coraz większym zainteresowaniem. Opisano różne metody nakładania fal uderzeniowych na hodowle komórkowe. Ogólnie rzecz biorąc, wszystkie istniejące modele koncentrują się na tym, jak najlepiej zastosować fale uderzeniowe do komórek.
Pozostaje jednak pytanie: Co dzieje się z falami po przejściu hodowli komórkowej? Różnica między impedancją akustyczną pożywki do hodowli komórkowej a otaczającym powietrzem jest tak duża, że ponad 99% fal uderzeniowych zostaje odbitych! W związku z tym opracowaliśmy model, który składa się głównie z pojemnika zbudowanego z pleksiglasu, który umożliwia rozchodzenie się fal w wodzie po przejściu przez hodowlę komórkową. Pozwala to uniknąć efektów kawitacji, a także odbicia fal, które w przeciwnym razie zakłóciłyby nadchodzące. Dzięki temu modelowi jesteśmy w stanie naśladować warunki in vivo, a tym samym zdobywać coraz większą wiedzę na temat tego, w jaki sposób bodziec fizyczny fal uderzeniowych jest przekształcany w biologiczny sygnał komórkowy ("mechanotransdukcja").

Stosując opisaną metodę, poddaliśmy działaniu fal uderzeniowych ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej (HUVECs), które wcześniej wyizolowaliśmy z pępowin. Pępowiny pobrano podczas planowych cięć cesarskich.
Komórki HUVEC przy konfluencji 90% w kolbie hodowlanej T25 poddano terapii systemem fal uderzeniowych elektrohydraulicznych. Parametry zabiegu obejmowały gęstość strumienia energii 0,1 mJ/mm2 oraz częstotliwość 5 Hz. Z odległości 5 cm od źródła fal uderzeniowych do warstwy k...

Fale uderzeniowe są obecnie dobrze znane ze swoich efektów regeneracyjnych. W związku z tym eksperymenty in vitro cieszą się coraz większym zainteresowaniem. W związku z tym opracowaliśmy model do badań fal uderzeniowych in vitro (IVSWT), który umożliwia nam naśladowanie warunków in vivo, unikając w ten sposób rozpraszających efektów fizycznych.

Zastosowanie fali uderzeniowej w hodowlach komórkowych

Shock waves nowadays are well known for their regenerative effects. Basic research findings showed that shock waves do cause a biological stimulus to ...

Ogólnym celem tej procedury jest uniknięcie rozpraszających efektów fizycznych podczas zabiegu fal uderzeniowych in vitro w celu uzyskania powtarzalnych wyników. Osiąga się to poprzez całkowite napełnienie kolby do hodowli komórkowej pożywką hodowlaną, a następnie umieszczenie kolby w podgrzewanej kąpieli wodnej. Drugim krokiem jest zastosowanie znacznej ilości żelu ultradźwiękowego podczas sprzęgania aplikatora z kąpielą wodną.Następnie aplikator zostaje przyłożony poziomo do membrany kąpieli wodnej. W ostatnim kroku należy upewnić się, że źródło fali uderzeniowej znajduje się w linii z centrum kolby do hodowli komórek, aby komórki znajdowały się w ognisku fali. Ostatecznie można przeprowadzić analizę komórek, na przykład za pomocą real-time PCR oraz panelu cytokin, aby wykazać zmiany w wybranych genach i cytokinach.Pomysł na ten model pojawił się, gdy zauważyliśmy, że istniejące metody bezpośredniego stosowania krótkich fal do kultur komórkowych nie uwzględniają efektu odbicia fali na granicy rozdziału między medium hodowlanym a powietrzem otaczającym. Procedurę zaprezentuje dr Chante, doktorant z mojej grupy badawczej. Na początek należy podgrzać 3,5 litrów wody z kranu do 37 °C.Następnie przelej podgrzaną wodę do łaźni wodnej. Poziom wody powinien znajdować się trzy centymetry poniżej górnej krawędzi łaźni wodnej i całkowicie zakrywać membranę. W dalszej kolejności podłącz czujnik temperatury do zasilacza i umieść go w uchwycie na tylnej ściance łaźni wodnej.Następnie, mieszając wodę, podłącz grzałkę do zasilania i podgrzej wodę do stabilnej temperatury 37 °C. W warunkach sterylnych wysiej komórki do kolb hodowlanych T 25.W ten sposób po inkubacji przez noc osiągną 90% konfluencji. Następnie ustaw kolby pionowo i wypełnij je połem hodowlanym do poziomu szyjki kolby, aby uniknąć kontaminacji. Nie dopuść do kontaktu pożywki z szyjką kolby lub zakrętką.Następnie zamknij kolby szczelnym nakrętką bez filtra, aby zapobiec zanieczyszczeniu wodą z kąpieli. Następnie uszczelnij nakrętki parafilmem. Po uszczelnieniu kolb zamocuj je w statywie.Następnie umieść przymocowane kolby w kąpieli wodnej i wyrównaj środek kolby do hodowli komórek. Za pomocą środka membrany aplikatora fal uderzeniowych nałóż odpowiednią ilość żelu transmisyjnego do ultradźwięków na aplikator fal uderzeniowych oraz na membranę kąpieli wodnej. Następnie podłącz aplikator do membrany, upewniając się, że pomiędzy nimi nie znajdują się pęcherzyki powietrza.Następnie przyłóż aplikator do fal uderzeniowych do środka membrany i upewnij się, że jest on wyrównany poziomo i pionowo względem kolby z kulturą komórek, aby zagwarantować opracowanie całego obszaru wzrostu komórek. Następnie przeprowadź eksperyment pilotażowy w celu ustalenia optymalnej odległości między aplikatorem a kolbą z kulturą, a także w celu zdefiniowania właściwych parametrów zabiegu. Pamiętaj o utrzymaniu kolby z kulturą i aplikatora w stabilnej pozycji podczas aktywacji urządzenia do generowania fal uderzeniowych.Po ustaleniu optymalnej odległości przeprowadź eksperyment zgodnie z wybranymi parametrami terapii falą uderzeniową. Po zakończeniu zabiegu wyjmij kolbę z hodowlą komórek z łaźni wodnej, osusz ją ręcznikami papierowymi i zdezynfekuj zewnętrzną powierzchnię kolby. Następnie przenieś medium z kolby do probówki do wirówki.Odwirować komórki przy zastosowaniu standardowych parametrów wirowania. Osad komórkowy resuspendować w dwóch mililitrach pożywki do hodowli komórkowej, następnie przenieść zawiesinę komórkową z powrotem do kolby zawierającej pięć mililitrów pożywki do hodowli komórkowej i hodować komórki do uzyskania wymaganej konfluencji dla eksperymentów z analizy komórkowej. Analiza real-time PCR komórek śródbłonka ludzkiej żyły pępowinowej wykazała zwiększenie poziomu mRNA tie 2 po zastosowaniu terapii falą uderzeniową.Sugeruje to, że terapia falą uderzeniową zwiększa proliferację komórek śródbłonka oraz angiogenezę. Poziomy cytokin w żyle pępowinowej. Liczbę komórek śródbłonka określono przy użyciu macierzy cytokinowej.Stwierdzono również istotny wzrost poziomu dwóch cytokin prozapalnych, IL six oraz IL eight, z których obie biorą udział w procesie zapalnym towarzyszącym angiogenezie po jej rozwoju. Technika ta utorowała drogę licznym badaczom w dziedzinie podstaw naukowych fal uderzeniowych do badania efektów na pojedynczym typie komórek w eksperymentach in vitro. Mamy nadzieję przekonać jeszcze więcej naukowców do korzystania z tego modelu w celu uzyskania powtarzalnych i porównywalnych wyników w badaniach nad falami uderzeniowymi.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Zastosowanie fali uderzeniowej w kulturach komórkowych

Opracowano nowy eksperyment impulsowego zwiększania ciśnienia w komórkach z wykorzystaniem pręta Kolsky'ego w celu zbadania mechanizmów molekularnych i komórkowych urazowego uszkodzenia mózgu wywołanego falą uderzeniową.

Impulsywne zwiększanie ciśnienia w komórkach neuronalnych na potrzeby badań nad urazowym uszkodzeniem mózgu

W tym filmie urządzenie z rurką uderzeniową jest używane do generowania fali uderzeniowej poprzez rozerwanie membrany polimerowej poprzez kontrolowane zwiększanie ciśnienia. Fala uderzeniowa uderza w wycinki mózgu znajdujące się w zabezpieczonej torbie, wywołując urazowe uszkodzenie wycinka mózgu.

Wywoływanie urazu urazowego w wycinku mózgu za pomocą urządzenia z rurką uderzeniową

Międzykomórkowe fale Ca2+ są napędzane przez kanały połączeń szczelinowych i półkanały. W tym miejscu opisujemy metodę pomiaru międzykomórkowych fal Ca2 + w monowarstwach komórkowych w odpowiedzi na lokalny bodziec mechaniczny pojedynczej komórki oraz jej zastosowanie do badania właściwości i regulacji kanałów połączeń szczelinowych i półkanałów.

Propagacja fal wapniowych indukowana stymulacją mechaniczną w monowarstwach komórkowych: przykład komórek śródbłonka rogówki bydła

Opracowaliśmy zautomatyzowaną platformę do hodowli komórek i przesłuchań do eksperymentów stymulacji komórek na mikroskalę.  Platforma oferuje prostą, wszechstronną i precyzyjną kontrolę w hodowli i stymulacji małych populacji komórek oraz odzyskiwaniu lizatów do analiz molekularnych.  Platforma doskonale nadaje się do badań, w których wykorzystuje się cenne komórki i/lub odczynniki.

Wszechstronna, zautomatyzowana platforma do eksperymentów ze stymulacją komórek w mikroskali

Pokazujemy test oparty na mikrofluidyce do pomiaru skali czasowej dla komórek do przejścia przez sekwencję zwężeń w skali mikronów.

Technika mikroprzepływowa do badania odkształcalności komórek

Tutaj prezentujemy protokół izolacji i hodowli pojedynczych komórek za pomocą platformy mikroprzepływowej, który wykorzystuje nową koncepcję projektowania mikrostudzienek, aby umożliwić wysokowydajną izolację pojedynczych komórek i długoterminową hodowlę klonalną.

Platforma mikroprzepływowa do wysokowydajnej izolacji i hodowli pojedynczych komórek

Mikroprzepływowy chip został stworzony do produkcji par złotych kropek do generowania pęcherzyków tandemowych i pokrytych fibronektyną wysp do tworzenia wzorów pojedynczych komórek w pobliżu. Wynikowe pole przepływu scharakteryzowano za pomocą prędkości obrazu cząstek i wykorzystano do badania różnych efektów biologicznych, w tym poracji błony komórkowej, deformacji błony i wewnątrzkomórkowej odpowiedzi wapnia.

System mikroprzepływowy z modelowaniem powierzchni do badania interakcji pęcherzyków kawitacyjnych z komórką i wynikających z niej efektów biologicznych na poziomie pojedynczej komórki

Zrozumienie, w jaki sposób komórki są modulowane przez ekspozycję na fale uderzeniowe, może pomóc w zidentyfikowaniu mechanizmów stojących za urazami wywołanymi przez wybuch. Protokół ten wykorzystuje specjalnie skonstruowane rurki uderzeniowe do przykładania fal uderzeniowych o różnym ciśnieniu do monowarstw komórek i identyfikowania ich późniejszego wpływu na żywotność komórek.

Ocena pierwotnych efektów wybuchu in vitro

Tutaj prezentujemy protokół korzystania z naczyń w kształcie litery O, wyspecjalizowanych do hodowli zawiesinowych agregatów komórkowych, z wytrząsaniem orbitalnym. Komórki HEK293 wyhodowane w tej torbie tworzą bardziej jednorodne agregaty niż te hodowane w konwencjonalnych naczyniach hodowlanych.

Orbitalna hodowla wstrząsowa komórek ssaków w naczyniach w kształcie litery O w celu wytworzenia jednolitych agregatów

Ten artykuł opisuje nowy model pierwotnego uszkodzenia mózgu spowodowanego wybuchem. Rurka uderzeniowa napędzana sprężonym powietrzem służy do wystawiania in vitro mysich kultur hipokampa na pojedynczą falę uderzeniową. Jest to prosty i szybki protokół generujący powtarzalne uszkodzenie tkanki mózgowej o wysokiej przepustowości.

Nowatorski model in vitro urazowego uszkodzenia mózgu

Poznaj metodę zastosowania fali uderzeniowej w hodowlach komórkowych w celu uzyskania powtarzalnych wyników. Technika ta minimalizuje zakłócenia fizyczne i umożliwia analizę genów oraz cytokin metodą PCR.

Zastosowanie fali uderzeniowej w hodowlach komórkowych

Przeglądaj więcej filmów