Zastosowanie fali uderzeniowej w hodowlach komórkowych
8 kwietnia 2014
Fale uderzeniowe są obecnie dobrze znane ze swoich efektów regeneracyjnych. W związku z tym eksperymenty in vitro cieszą się coraz większym zainteresowaniem. W związku z tym opracowaliśmy model do badań fal uderzeniowych in vitro (IVSWT), który umożliwia nam naśladowanie warunków in vivo, unikając w ten sposób rozpraszających efektów fizycznych.
Ogólnym celem tej procedury jest uniknięcie rozpraszających efektów fizycznych podczas zabiegu fal uderzeniowych in vitro w celu uzyskania powtarzalnych wyników. Osiąga się to poprzez całkowite napełnienie kolby do hodowli komórkowej pożywką hodowlaną, a następnie umieszczenie kolby w podgrzewanej kąpieli wodnej. Drugim krokiem jest zastosowanie znacznej ilości żelu ultradźwiękowego podczas sprzęgania aplikatora z kąpielą wodną.
Następnie aplikator zostaje przyłożony poziomo do membrany kąpieli wodnej. W ostatnim kroku należy upewnić się, że źródło fali uderzeniowej znajduje się w linii z centrum kolby do hodowli komórek, aby komórki znajdowały się w ognisku fali. Ostatecznie można przeprowadzić analizę komórek, na przykład za pomocą real-time PCR oraz panelu cytokin, aby wykazać zmiany w wybranych genach i cytokinach.
Pomysł na ten model pojawił się, gdy zauważyliśmy, że istniejące metody bezpośredniego stosowania krótkich fal do kultur komórkowych nie uwzględniają efektu odbicia fali na granicy rozdziału między medium hodowlanym a powietrzem otaczającym. Procedurę zaprezentuje dr Chante, doktorant z mojej grupy badawczej. Na początek należy podgrzać 3,5 litrów wody z kranu do 37 °C.
Następnie przelej podgrzaną wodę do łaźni wodnej. Poziom wody powinien znajdować się trzy centymetry poniżej górnej krawędzi łaźni wodnej i całkowicie zakrywać membranę. W dalszej kolejności podłącz czujnik temperatury do zasilacza i umieść go w uchwycie na tylnej ściance łaźni wodnej.
Następnie, mieszając wodę, podłącz grzałkę do zasilania i podgrzej wodę do stabilnej temperatury 37 °C. W warunkach sterylnych wysiej komórki do kolb hodowlanych T 25.
W ten sposób po inkubacji przez noc osiągną 90% konfluencji. Następnie ustaw kolby pionowo i wypełnij je połem hodowlanym do poziomu szyjki kolby, aby uniknąć kontaminacji. Nie dopuść do kontaktu pożywki z szyjką kolby lub zakrętką.
Następnie zamknij kolby szczelnym nakrętką bez filtra, aby zapobiec zanieczyszczeniu wodą z kąpieli. Następnie uszczelnij nakrętki parafilmem. Po uszczelnieniu kolb zamocuj je w statywie.
Następnie umieść przymocowane kolby w kąpieli wodnej i wyrównaj środek kolby do hodowli komórek. Za pomocą środka membrany aplikatora fal uderzeniowych nałóż odpowiednią ilość żelu transmisyjnego do ultradźwięków na aplikator fal uderzeniowych oraz na membranę kąpieli wodnej. Następnie podłącz aplikator do membrany, upewniając się, że pomiędzy nimi nie znajdują się pęcherzyki powietrza.
Następnie przyłóż aplikator do fal uderzeniowych do środka membrany i upewnij się, że jest on wyrównany poziomo i pionowo względem kolby z kulturą komórek, aby zagwarantować opracowanie całego obszaru wzrostu komórek. Następnie przeprowadź eksperyment pilotażowy w celu ustalenia optymalnej odległości między aplikatorem a kolbą z kulturą, a także w celu zdefiniowania właściwych parametrów zabiegu. Pamiętaj o utrzymaniu kolby z kulturą i aplikatora w stabilnej pozycji podczas aktywacji urządzenia do generowania fal uderzeniowych.
Po ustaleniu optymalnej odległości przeprowadź eksperyment zgodnie z wybranymi parametrami terapii falą uderzeniową. Po zakończeniu zabiegu wyjmij kolbę z hodowlą komórek z łaźni wodnej, osusz ją ręcznikami papierowymi i zdezynfekuj zewnętrzną powierzchnię kolby. Następnie przenieś medium z kolby do probówki do wirówki.
Odwirować komórki przy zastosowaniu standardowych parametrów wirowania. Osad komórkowy resuspendować w dwóch mililitrach pożywki do hodowli komórkowej, następnie przenieść zawiesinę komórkową z powrotem do kolby zawierającej pięć mililitrów pożywki do hodowli komórkowej i hodować komórki do uzyskania wymaganej konfluencji dla eksperymentów z analizy komórkowej. Analiza real-time PCR komórek śródbłonka ludzkiej żyły pępowinowej wykazała zwiększenie poziomu mRNA tie 2 po zastosowaniu terapii falą uderzeniową.
Sugeruje to, że terapia falą uderzeniową zwiększa proliferację komórek śródbłonka oraz angiogenezę. Poziomy cytokin w żyle pępowinowej. Liczbę komórek śródbłonka określono przy użyciu macierzy cytokinowej.
Stwierdzono również istotny wzrost poziomu dwóch cytokin prozapalnych, IL six oraz IL eight, z których obie biorą udział w procesie zapalnym towarzyszącym angiogenezie po jej rozwoju. Technika ta utorowała drogę licznym badaczom w dziedzinie podstaw naukowych fal uderzeniowych do badania efektów na pojedynczym typie komórek w eksperymentach in vitro. Mamy nadzieję przekonać jeszcze więcej naukowców do korzystania z tego modelu w celu uzyskania powtarzalnych i porównywalnych wyników w badaniach nad falami uderzeniowymi.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia model do prób fal uderzeniowych in vitro (IVSWT), zaprojektowany w celu odtworzenia warunków in vivo przy jednoczesnym zminimalizowaniu zakłócających efektów fizycznych. Metodologia ta ma na celu zwiększenie powtarzalności wyników w eksperymentach dotyczących terapii falą uderzeniową.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- neuronauka
- biologia
- medycyna regeneracyjna
Wstęp
- Fale uderzeniowe są znane ze swoich efektów regeneracyjnych.
- Do badania tych efektów coraz częściej wykorzystuje się eksperymenty in vitro.
- Minimalizacja zakłóceń fizycznych jest kluczowa dla uzyskania dokładnych wyników.
- Replikowanie warunków in vivo może poprawić trafność eksperymentalną.
Cel badania
- Opracowanie wiarygodnego modelu in vitro do badań nad falami uderzeniowymi.
- Uniknięcie zakłóceń fizycznych podczas zabiegu.
- Osiągnięcie powtarzalnych wyników w analizie komórkowej.
Zastosowane metody
- Napełnianie kolby do hodowli komórkowych pożywką hodowlaną.
- Umieszczenie kolby w podgrzewanej łaźni wodnej.
- Stosowanie żelu do USG w celu zapewnienia skutecznego sprzężenia aplikatora.
- Wyrównanie źródła fali uderzeniowej względem środka kolby.
Główne wyniki
- Komórki są umieszczane w ognisku fali w celu zapewnienia optymalnej terapii.
- Do analizy można wykorzystać PCR w czasie rzeczywistym oraz macierze cytokin.
- Można obserwować zmiany w interesujących nas genach i cytokinach.
Wnioski
- Model IVSWT skutecznie naśladuje warunki in vivo.
- Minimalizacja czynników rozpraszających prowadzi do bardziej powtarzalnych wyników.
- Podejście to może zwiększyć zrozumienie wpływu fal uderzeniowych na komórki.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Model ten wypełnia istotną lukę w badaniach nad falami uderzeniowymi, umożliwiając powtarzalne badania in vitro, które ściśle naśladują warunki in vivo. Dzięki eliminacji artefaktów odbiicia fal poprzez zastosowanie układu sprzężonego wodnie, wspiera on niezawodną weryfikację mechanistyczną (de-risking) terapii falami uderzeniowymi we wczesnej fazie odkrywania leków. Podejście to zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów dla szlaków angiogennych i zapalnych, istotnych w wskazaniach sercowo-naczyniowych oraz w procesach gojenia ran.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie szlaków mechanotransdukcji łączących fizyczne bodźce w postaci fal uderzeniowych z odpowiedziami biologicznymi w komórkach śródbłonka.
- Wartość operacyjna: Zapewnia ustandaryzowaną platformę do spójnego stosowania bodźców fizycznych w różnych eksperymentach.
- Wartość prognostyczna: Wspiera testowanie hipotez dotyczących wpływu fal uderzeniowych na ekspresję genów oraz uwalnianie cytokin istotnych dla angiogenezy i stanu zapalnego.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Pozwala na uzyskanie ilościowych, powtarzalnych odczytów za pomocą czasu rzeczywistego PCR oraz macierzy cytokinowych w celu oceny modulacji szlaków sygnałowych.
- Wartość operacyjna: Tworzy skalowalny, wielokrotnego użytku system ekspozycji na fale uderzeniowe przy minimalnej zmienności technicznej.
- Gotowość do analizy: Generuje zestandaryzowane odpowiedzi biologiczne, które umożliwiają wiarygodną ocenę związków lub bodźców w dalszych etapach przesiewowych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Łączy wyniki uzyskane in vitro z istotnością in vivo poprzez replikację fizjologicznych warunków propagacji fali.
- Redukcja ryzyka mechanistycznego: Wyjaśnia zależności dawka-odpowiedź między intensywnością bodźca fizycznego a odpowiedzią biologiczną w ludzkich komórkach śródbłonka.
- Modelowanie przedkliniczne: Wspiera wczesną ocenę indukowanych falą uderzeniową sygnałów proangiogennych i przeciwzapalnych przed rozpoczęciem badań na zwierzętach.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w początkowy etap procesu odkrywania leków, wspierając walidację celu poprzez uzyskanie wglądu w mechanizmy działania przed przejściem do identyfikacji związku wiodącego i przedklinicznych badań skuteczności.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia weryfikację hipotez dotyczących wpływu fal uderzeniowych na ekspresję genów oraz profile wydzielnicze komórek śródbłonka.
- Przesiewanie: Zapewnia powtarzalne, ilościowe odczyty molekularne, niezbędne do standaryzacji testów i porównywania wyników między eksperymentami.
- Analityka: Umożliwia analizę statystyczną zwiększonej ekspresji genów (np. Tie2) oraz wzrostu poziomu cytokin (IL-6, IL-8) w celu określenia istotnych odpowiedzi biologicznych.
- Badania translacyjne: Pozwala na powiązanie obserwacji mechanotransdukcji in vitro ze znanymi procesami angiogennymi i zapalnymi in vivo.
- Zastosowania szerokie: Oferuje elastyczną platformę, którą można zastosować do wielu typów komórek poza modelami śródbłonka, w celu szerszej eksploracji szlaków sygnałowych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celu poprzez redukcję szumów wynikających z artefaktów fizycznych podczas dostarczania fali uderzeniowej.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność i standaryzację między laboratoriami i eksperymentami dzięki kontrolowanemu rozprzestrzenianiu się fal.
- Wartość strategiczna: Poprawia jakość decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go), zapewniając wyraźniejsze powiązania mechanistyczne między bodźcem fizycznym a odpowiedzią komórkową.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację podejść opartych na falach uderzeniowych z uwzględnieniem ryzyka poprzez wyjaśnienie progów efektu biologicznego.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w utrzymaniu kultur komórkowych, stosowaniu technik sterylnych oraz obsłudze sprzętu do generowania fal uderzeniowych.
- Zależne od dostępu do źródła fal uderzeniowych, łaźni wodnej z kontrolą temperatury oraz żelu ultradźwiękowego do sprzężenia akustycznego.
- Wymaga standaryzacji pozycjonowania kolb, aplikacji żelu oraz kontroli środowiskowej w celu zapewnienia spójności ogniskowania fali.
- Wiąże się z koniecznością dostosowania parametrów podczas przenoszenia modelu na inne typy komórek lub naczynia hodowlane.
- Ograniczone potrzebą walidacji odpowiedzi biologicznych w różnych liniach komórkowych w celu potwierdzenia uniwersalności wyników dotyczących mechanotransdukcji.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:05
Title
1:22
Preparation of Water Bath for In Vitro Shock Wave Trials
1:59
Cell and Culture Flask Preparation
2:53
Application of Shock Waves to the Water Bath
3:47
Cell Analysis Post-shock Wave Treatment
4:27
Results: Shock Wave Treatment of Human Umbilical Vein Endothelial Cells
5:03
Conclusion
