Name: Automatyczna separacja C. elegans skolonizowanych przez patogen bakteryjny (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 18 s
Description: Poznaj automatyczną separację C. elegans skolonizowanych przez Pseudomonas aeruginosa z użyciem wormsortera. Ta metoda pozwala badać odpowiedź immunologiczną i mechanizmy rozpoznawania patogenów w organizmie nicienia.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Fundacji Medycznej Ellisona za wsparcie. Pragniemy również podziękować członkom laboratorium Abby Dernburg za pomoc w korzystaniu z sortera robaków.

1. Uzyskanie zsynchronizowanej kultury młodych dorosłych zwierząt
<ol>
	<li>Hoduj robaki na kilku płytkach NGM obsianych bakteriami OP50-1 E. coli (10x skoncentrowanymi z nasyconej kultury), aż wiele robaków osiągnie stan ciężkości.</li>
	<li>Potraktuj ciężkie zwierzęta roztworem do przygotowania jaj, aby uzyskać zsynchronizowaną kulturę (jaja).</li>
	<li>Jaja na talerzu na kilku 60-milimetrowych płytkach NGM wysianych 10x skoncentrowanym OP50-1 o gęstości około 150-200 jaj na talerz.</li>
	<li>Inkubować płytki w temperaturze 25 °C przez 2 dni (do momentu, gdy robaki osiągną stadium L4 - Young Adult).</li>
</ol>
2. Przygotowanie płytek Pseudomonas aeruginosa i infekowanie robaków
<ol>
	<li>W dniu przygotowania jaj (etap 1.1) zaszczepić kulturę PA14::GFP w 2 ml pożywki King's B zawierającej ryfampicynę o końcowym stężeniu 100 μg/ml. Inkubować kulturę w temperaturze 37 °C z mieszadłem O/N.</li>
	<li>Umieść kulturę PA14::GFP na tylu płytkach powolnego zabijania (SKP), ile jest potrzebne do testu. Na każdą szalkę Petriego SKP o średnicy 150 mm należy pobrać pipetę 75-100 μl nasyconej kultury i równomiernie rozprowadzić za pomocą sterylnego szklanego rozsiewacza. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez 20-24 godziny.</li>
	<li>Wyjąć płytki z inkubatora i pozostawić do ostygnięcia do temperatury pokojowej (~20 min). Używając bufora M9, umyj robaki z kroku 1.4 na płytkach PA14::GFP w minimalnej objętości płynu. W przypadku stosowania płyt o średnicy 150 mm na jednej płycie można umieścić kilkaset ślimaków.</li>
	<li>Inkubować płytki w temperaturze 25 °C przez 18-21 godzin. W przypadku młodych dorosłych robaków narażonych na P. aeruginosa jest to okno czasowe pokazujące optymalny rozkład zwierząt skolonizowanych i nieskolonizowanych.</li>
</ol>
3. Konfiguracja sortera robaków
Przed wykonaniem sortowania próbek upewnij się, że maszyna działa prawidłowo. Szczegółowe informacje można uzyskać pod adresem http://www.unionbio.com/support/documents.aspx?id=43, a podstawowe kroki opisano poniżej.
<ol>
	<li>Ustaw ciśnienie zaworu osłony na około 5 psi (zakres 4.5-5.5).</li>
	<li>Aby sprawdzić, czy natężenie przepływu płynu w osłonie jest odpowiednie, umieść stożkową rurkę o pojemności 15 ml pod dozownikiem, włącz zawór osłony i wyłącz zawór sortera. Trzymaj probówkę pod dozownikiem przez 60 sekund. Objętość w probówce powinna wynosić 9-10 ml. Jeśli wykracza poza ten zakres, odpowiednio wyreguluj ciśnienie zaworu osłonowego.</li>
	<li>Aby upewnić się, że natężenie przepływu płynu w osłonie (ustawione jak w kroku 3.2) umożliwi dokładne sortowanie, należy przetestować szybkość sortowania przy użyciu cząstek kontrolnych o wielkości 40 μm:</li>
	<li>Wyłącz zawór osłony. Dodać do zbiornika około 25 ml roztworu cząstek kontrolnych.</li>
	<li>Włącz zawór osłony i zawór próbki.</li>
	<li>W oprogramowaniu komputerowym przejdź do "trybu kontroli cząstek" i kliknij pobierz.</li>
	<li>Upewnij się, że natężenie przepływu cząstek wynosi ~5-8 cząstek/s, przy czym TOF (czas przelotu) przybliża szerokość cząstki, 40 μm. Taki TOF wskazuje, że w danym momencie przechodzi przez niego tylko jeden obiekt o wielkości 40 μm. Jeśli wartości wykraczają poza ten zakres, odpowiednio dostosuj ustawienia (zgodnie z powyższymi wskazówkami).</li>
</ol>
4. Sortowanie robaków skolonizowanych i nieskolonizowanych
<ol>
	<li>Za pomocą M9 umyj robaki do stożkowych probówek o pojemności 15 ml. Pozwól, aby dorosłe robaki opadły grawitacyjnie na dno rurki i usuń supernatant. Napełnij tubkę świeżym M9. Powtórz ten proces 3-4 razy. Usuwa to dużą część larw, a także nadmiar bakterii i trwa około 10 minut.</li>
	<li>Dodaj robaki do zbiornika sortera robaków za pomocą delikatnie mieszającego małego mieszadła.</li>
	<li>Dostosuj początkowe wzmocnienie sygnału, ustawiając zielony PMT na 600, a czerwony i żółty PMT na 200.</li>
	<li>Rozpocznij zbieranie danych, aby dostosować ustawienia.</li>
	<li>Dąż do szybkości sortowania 25-30 zdarzeń (robaków) na sekundę. Jeśli szybkość liczbowa jest zbyt wysoka, rozcieńczyć odpowiednio robaki w zbiorniku M9. Jeśli szybkość jest zbyt niska, dodaj więcej robaków w małej objętości M9.</li>
	<li>Jeśli eksperyment wymaga bardzo rygorystycznego oddzielenia robaków skolonizowanych i nieskolonizowanych, ustaw "test koincydencji" na "czysty". Gwarantuje to, że w przypadku, gdy dwa obiekty znajdują się zbyt blisko siebie lub w tym samym upuszczeniu, maszyna odrzuca upuszczenie, zamiast je zbierać.</li>
	<li>Aby posortować populację, która Cię interesuje, narysuj bramki wokół osi wskazujące wielkość (aby uzyskać dorosłe robaki) i intensywność fluorescencji (tj. wysoka dla skolonizowanych, niska dla nieskolonizowanych). Wartości dla bramkowania fluorescencyjnego muszą być określone empirycznie.</li>
	<li>Umieść płytkę wielodołkową lub szalkę Petriego pod dozownikiem, aby zebrać robaki, a następnie otwórz zawór sortujący, aby rozpocząć sortowanie robaków.</li>
	<li>Zbierz małą populację zwierząt, aby sprawdzić pod mikroskopem, czy posortowana populacja jest populacją będącą przedmiotem zainteresowania. Jeśli nie, odpowiednio dostosuj parametry bramkowania i kontynuuj pobieranie próbek.</li>
</ol>

<ol><li>Pulak, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Techniques+for+analysis%2C+sorting%2C+and+dispensing+of+C.+elegans+on+the+COPAS+flow-sorting+system%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Techniques for analysis, sorting, and dispensing of C. elegans on the COPAS flow-sorting system.</a> Methods Mol. Biol. , 275-286 (2006).</li>
<li>Dupuy, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+analysis+of+in+vivo+spatiotemporal+promoteractivity+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Genome-scale analysis of in vivo spatiotemporal promoteractivity in Caenorhabditis elegans.</a> Nat. Biotechnol. 25, 663-668 (2007).</li>
<li>Squiban, B., Belougne, J., Ewbank, J., Zugasti, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+and+Automated+High-throughput+Genome-wide+RNAi+Screens+in+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in elegans.</a> J. Vis. Exp. (60), (2012).</li>
<li>Doitsidou, M., Flames, N., Lee, A. C., Boyanov, A., Hobert, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+screening+for+mutants+affecting+dopaminergic-neuron+specification+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Automated screening for mutants affecting dopaminergic-neuron specification in C. elegans.</a> Nat. Methods. 5, 869-872 (2008).</li>
<li>Pujol, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+innate+immune+responses+to+infection+and+wounding+in+the+C.+elegans+epidermis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Distinct innate immune responses to infection and wounding in the C. elegans epidermis.</a> Curr. Biol. 18, 481-489 (2008).</li>
<li>Medzhitov, R., Janeway, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immune+recognition%3A+mechanisms+and+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Innate immune recognition: mechanisms and pathways.</a> Immunol. Rev. 173, 89-97 (2000).</li>
<li>Matzinger, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tolerance%2C+danger%2C+and+the+extended+family%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Tolerance, danger, and the extended family.</a> Annu. Rev. Immunol. 12, 991-1045 (1994).</li>
<li>Mariathasan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopyrin+activates+the+inflammasome+in+response+to+toxins+and+ATP%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cryopyrin activates the inflammasome in response to toxins and ATP.</a> Nature. 440, 228-232 (2006).</li>
<li>Melo, J. A., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inactivation+of+conserved+C.+elegans+genes+engages+pathogen-+and+xenobiotic-associated+defenses%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Inactivation of conserved C. elegans genes engages pathogen- and xenobiotic-associated defenses.</a> Cell. 149, 452-466 (2012).</li>
<li>Chen, G. Y., Nunez, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sterile+inflammation%3A+sensing+and+reacting+to+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Sterile inflammation: sensing and reacting to damage.</a> Nat. Rev. Immunol. 10, 826-837 (2010).</li>
<li>Tenor, J. L., Aballay, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conserved+Toll-like+receptor+is+required+for+Caenorhabditis+elegans+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">A conserved Toll-like receptor is required for Caenorhabditis elegans innate immunity.</a> EMBO Rep. 9, 103-109 (2008).</li>
<li>Pujol, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reverse+genetic+analysis+of+components+of+the+Toll+signaling+pathway+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">A reverse genetic analysis of components of the Toll signaling pathway in Caenorhabditis elegans.</a> Curr. Biol. 11, 809-821 (2001).</li>
<li>McEwan, D. L., Kirienko, N. V., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+translational+inhibition+by+Pseudomonas+aeruginosa+Exotoxin+A+Triggers+an+immune+response+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Host translational inhibition by Pseudomonas aeruginosa Exotoxin A Triggers an immune response in Caenorhabditis elegans.</a> Cell Host Microbe. 11, 364-374 (2012).</li>
<li>Dunbar, T. L., Yan, Z., Balla, K. M., Smelkinson, M. G., Troemel, E. R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C.+elegans+detects+pathogen-induced+translational+inhibition+to+activate+immune+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">C. elegans detects pathogen-induced translational inhibition to activate immune signaling.</a> Cell Host Microbe. 11, 375-386 (2012).</li>
<li>Irazoqui, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+pathogenesis+and+host+responses+during+infection+of+C.+elegans+by+P.+aeruginosa+and+S.+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Distinct pathogenesis and host responses during infection of C. elegans by P. aeruginosa and S. aureus.</a> PLoS Pathog. 6, (2010).</li>
<li>Pukkila-Worley, R., Ausubel, F. M., Mylonakis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+albicans+infection+of+Caenorhabditis+elegans+induces+antifungal+immune+defenses%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Candida albicans infection of Caenorhabditis elegans induces antifungal immune defenses.</a> PLoS Pathog. , (2011).</li>
<li>Shapira, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conserved+role+for+a+GATA+transcription+factor+in+regulating+epithelial+innate+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A conserved role for a GATA transcription factor in regulating epithelial innate immune responses.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 14086-14091 (2006).</li>
<li>Troemel, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p38+MAPK+regulates+expression+of+immune+response+genes+and+contributes+to+longevity+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">p38 MAPK regulates expression of immune response genes and contributes to longevity in C. elegans.</a> PLoS Genet. , 183 (2006).</li>
<li>Twumasi-Boateng, K., Shapira, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissociation+of+immune+responses+from+pathogen+colonization+supports+pattern+recognition+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Dissociation of immune responses from pathogen colonization supports pattern recognition in C. elegans.</a> PLoS One. , 7 (2012).</li>
<li>Jakobsen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+alkaloid+compound+harmane+increases+the+lifespan+of+Caenorhabditis+elegans+during+bacterial+infection%2C+by+modulating+the+nematode%27s+innate+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The alkaloid compound harmane increases the lifespan of Caenorhabditis elegans during bacterial infection, by modulating the nematode's innate immune response.</a> PLoS One. 8, (2013).</li>
<li>Portal-Celhay, C., Bradley, E. R., Blaser, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+intestinal+bacterial+proliferation+in+regulation+of+lifespan+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Control of intestinal bacterial proliferation in regulation of lifespan in Caenorhabditis elegans.</a> BMC Microbiol. 12, 49 (2012).</li>
<li>Troemel, E. R., Felix, M. A., Whiteman, N. K., Barriere, A., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microsporidia+are+natural+intracellular+parasites+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Microsporidia are natural intracellular parasites of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> PLoS Biol. 6, 2736-2752 (2008).</li>
<li>Montalvo-Katz, S., Huang, H., Appel, M. D., Berg, M., Shapira, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+with+soil+bacteria+enhances+p38-dependent+infection+resistance+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Association with soil bacteria enhances p38-dependent infection resistance in Caenorhabditis elegans.</a> Infect. Immun. 18, 514-520 (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Metoda, którą opisujemy, wykorzystuje fluorescencyjne znakowanie jednostek znajdujących się poza robakiem, aby śledzić interakcje między robakiem a jego otoczeniem. W przedstawionym przez nas przypadku separacja opierała się na znakowaniu patogenu i została zastosowana do oddzielenia robaków z dużym obciążeniem patogenem od tych bez (lub niewielkich) obciążeń. Późniejsza analiza ekspresji genów nie wykazała różnicy w odpowiedziach immunologicznych między dwiema grupami, co sugeruje, że były one niezależne od obciążenia p...

Automatyczne sortowanie robaków jest bardzo podobne do FACS, działa poprzez pomiar sygnału fluorescencyjnego w robaku (zazwyczaj dostarczanego przez transgeniczną ekspresję białek reporterowych), gdy przechodzi on wyprostowany w probówce, umożliwiając przekierowanie albo do probówki/studni, albo do pojemnika na odpady zgodnie z parametrami bramkowania ustalonymi przez badacza1. Sorter robaków może ułatwić badania na wiele sposobów; Przykładem zastosowania go jako narzędzia analitycznego jest badanie, w którym śledzono czasoprzestrzenne wzorce aktywności promotora dla prawie 1000 genów2, 
Jednak głównym zastosowaniem sortera robaków są badania genetyczne, śledzące docelowe poziomy ekspresji genów lub lokalizację białka fluorescencyjnego wzdłuż osi robaka3-5.
Tutaj opisujemy nowe zastosowanie sortera robaków, w następstwie kolonizacji robaka przez fluorescencyjnie oznakowany patogen. Korzystając z tego narzędzia, skupiliśmy się na związku między kolonizacją/obciążeniem patogenem a odpowiedzią immunologiczną, aby uzyskać nowy wgląd w mechanizmy odpowiedzialne za inicjację odpowiedzi immunologicznej u robaka.
Praktycznie we wszystkich organizmach badanych do tej pory, inicjacja wrodzonych odpowiedzi immunologicznych na patogeny mikrobiologiczne zależy od rozpoznania wzorców molekularnych związanych z patogenami (PAMPs) i/lub wzorców molekularnych związanych z niebezpieczeństwem/uszkodzeniem (DAMPs)6,7. Pierwszym z nich są konserwatywne struktury mikrobiologiczne, które obejmują składniki ściany komórkowej drobnoustrojów, jej wici lub dwuwarstwy lipidowej6; drugi obejmuje obie uwolnione cząsteczki (np. ATP8), zmienione białka lub inne markery zmienionych procesów komórkowych9,10. Oba typy sygnałów są rozpoznawane przez białka oznaczone jako receptory rozpoznawania wzorców (PRR), które po specyficznym związaniu cząsteczki wzorca aktywują łańcuch zdarzeń prowadzących do odpowiedzi ochronnej. C. elegans okazał się niezwykle przydatny jako podatny model do analizy różnych aspektów interakcji gospodarz-patogen, ale jedną rzeczą, która nie jest dobrze poznana, jest to, w jaki sposób odpowiedzi immunologiczne są inicjowane w robaku. Wykazano, że żaden z przypuszczalnych receptorów, które są ortologiczne w stosunku do receptorów rozpoznawania wzorców (PRR) w innych organizmach, nie wiąże PAMP, a wiele ortologów PRR, które są kluczowe dla odpowiedzi immunologicznej w innych organizmach, wykazuje zaskakująco ograniczony wkład w odpowiedzi i oporność na patogeny robaków. Na przykład receptor Drosophila Toll, który jest niezbędny do uodparniania się na patogeny Gram-dodatnie, jest reprezentowany przez C. elegans przez jedyny homolog, tol-1, który przyczynia się do ochrony przed patogenem Gram-ujemnym Salmonella Typhimurium11, ale nie przed innymi badanymi patogenami Gram-ujemnymi lub -dodatnimi11,12 . Obserwacje te, w połączeniu z danymi wskazującymi, że odpowiedzi immunologiczne mogą być indukowane przez zakłócanie translacji białek komórkowych, doprowadziły niektórych do sugestii, że C. elegans wykrywa przede wszystkim DAMPs9,13,14. Niemniej jednak doniesienia opisujące zdolność martwych patogenów do indukowania odpowiedzi immunologicznej sugerują, że wiązanie PAMP może odgrywać ważną rolę w rozpoznawaniu patogenów u C. elegans15,16. Wcześniejsze prace koncentrujące się na odpowiedziach immunologicznych w genetycznie identycznych populacjach C. elegans zsynchronizowanych z wiekiem wykazały dużą indywidualną zmienność w kolonizacji jelit przez bakteryjny patogen Gram-ujemny Pseudomonas aeruginosa.
Jednak badania profilowania transkrypcyjnego traktowały te różnorodnie skolonizowane populacje jako jedną całość17,18. Wykorzystując tę zmienność, opracowaliśmy protokół skupiający automatyczny sortownik robaków na oddzielaniu różnie skolonizowanych populacji Caenorhabditis elegans narażonych na P. aeruginosa wykazujący ekspresję GFP. Badanie ekspresji genów w różnie skolonizowanych populacjach ułatwiło ocenę związku między obciążeniem patogenem (i związanymi z nim uszkodzeniami) a odpowiedziami immunologicznymi oraz dostarczyło nowych informacji na temat rozpoznawania patogenów u C. elegans19. Poniżej opisujemy protokół, który można zastosować do sortowania robaków zakażonych dowolnym patogenem znakowanym fluorescencyjnie.
Potencjalnym użytkownikom powinno się zauważyć, że liczba robaków wymaganych do uporządkowania zależy od charakteru kolejnych analiz i używanych protokołów. Na przykład, w przypadku analizy ekspresji genów mikromacierzy, >1,000 robaków będzie potrzebnych do uzyskania wystarczającej ilości RNA, jeśli stosowane są standardowe protokoły, ale ~100 robaków wystarczy, jeśli zastosuje się amplifikację, co pozwoli na szybkie zbieranie materiału, a tym samym zminimalizuje stres u robaków.

<table><tbody><tr><td>Bufor M9</td><td>przygotowany we własnym zakresie</td><td></td><td>Przepis w wormbook.org</td></tr><tr><td>Ryfampicyna</td><td>Sigma</td><td>R3501</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór do przygotowania jaj</td><td>przygotowany w domu</td><td></td><td>50 ml wody; 40 ml wybielacza; 10 ml 10 N wodorotlenku sodu</td></tr><tr><td>Płytki NGM</td><td>przygotowane we własnym zakresie</td><td></td><td>Przepis na</td></tr><tr><td>wormbook.org Talerze SKP</td><td>przygotowane we własnym zakresie</td><td></td><td>Przepis taki sam jak NGM: tylko 0,35% peptonu zamiast 0,25%</td></tr> <tr><td>Kontroluj cząstki testowe</td><td>Union Biometrica</td><td>310-5071-001</td><td></td></tr></tbody></table>

automatyczna separacja c. elegans skolonizowanych przez patogen bakteryjny

Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen

Sorter robaków to narzędzie analogiczne do maszyny FACS, która jest używana w badaniach nad Caenorhabditis elegans, zazwyczaj do sortowania robaków na podstawie ekspresji fluorescencyjnego reportera. W tym miejscu zwracamy uwagę na alternatywne zastosowanie tego instrumentu do sortowania robaków według stopnia ich kolonizacji przez patogen wykazujący ekspresję GFP. To nowe zastosowanie pozwoliło nam zająć się związkiem między kolonizacją jelita robaka a indukcją odpowiedzi immunologicznej. Chociaż odpowiedzi immunologiczne C. elegans na różne patogeny zostały udokumentowane, nadal nie wiadomo, co je inicjuje. Dwie główne możliwości (które nie wykluczają się wzajemnie) to rozpoznawanie wzorców molekularnych związanych z patogenami oraz wykrywanie uszkodzeń spowodowanych infekcją. Aby odróżnić te dwie możliwości, narażenie na patogen musi być oddzielone od szkód, które powoduje. Sortownik robaków umożliwił oddzielenie robaków, które były w znacznym stopniu skolonizowane przez Gram-ujemny patogen Pseudomonas aeruginosa, z uszkodzeniami prawdopodobnie spowodowanymi przez obciążenie patogenem, od robaków, które były podobnie narażone, ale nie zostały skolonizowane lub zostały skolonizowane w niewielkim stopniu. Te odrębne populacje wykorzystano do oceny związku między obciążeniem patogenem a indukcją transkrypcyjnej odpowiedzi immunologicznej. Wyniki sugerują, że oba są dysocjowane, co potwierdza możliwość rozpoznania patogenu.

W przypadku C. elegans o tym samym wieku i identycznym genotypie, poddanych ekspozycji na P. aeruginosa, obserwuje się szeroki rozkład poziomów kolonizacji (Rysunek 1A). Dzięki zastosowaniu opisanego tutaj protokołu można przeprowadzić efektywną separację nicieni nieskolonizowanych od skolonizowanych (Rysunek 1B). W przeciwieństwie do osobników nieskolonizowanych, nicienie skolonizowane wykazują oznaki uszkodzeń, takie jak spowolnienie ruchów i zmniejszona częstotliwość...

Sorter robaków ułatwia badania genetyczne u Caenorhabditis elegans, sortując robaki według ekspresji fluorescencyjnych reporterów. W tym miejscu opisujemy nowe zastosowanie: sortowanie według kolonizacji przez patogen wykazujący ekspresję GFP i wykorzystujemy je do zbadania słabo poznanej roli rozpoznawania patogenu w inicjowaniu odpowiedzi immunologicznej.

Automatyczna separacja C. elegans skolonizowanych przez patogen bakteryjny

The wormsorter is an instrument analogous to a FACS machine that is used in studies of Caenorhabditis elegans, typically to sort worms based on expression ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest ocena wpływu kolonizacji oraz związanych z nią uszkodzeń na inicjację wrodzonych odpowiedzi immunologicznych u C. elegans. Osiąga się to poprzez eksponowanie zsynchronizowanej populacji młodych dorosłych osobników C. elegans na Pseudomonas aeruginosa wykazującą ekspresję zielonego białka fluorescencyjnego (GFP), co pozwala na uzyskanie populacji nicieni w różnym stopniu skolonizowanych przez patogen. Po przemyciu, populacje nicieni o różnym stopniu kolonizacji są rozdzielane na czyste grupy, z uwzględnieniem dwóch skrajnych przypadków: nicieni całkowicie skolonizowanych oraz nieskolonizowanych.Następnie z tych populacji ekstrahuje się RNA i ocenia ekspresję genów odpornościowych w porównaniu do nicieni hodowanych na niepatogennych e coli. W celu zbadania związku między odpowiedzią odpornościową a kolonizacją, uzyskano wyniki wykazujące, że wrodzona odpowiedź odpornościowa C. elegans na p arosa może być oddzielona od kolonizacji przez patogen. Główną zaletą tej techniki w stosunku do innych podejść w badaniu inicjacji odpowiedzi odpornościowej u C. elegans jest fakt, że rozwiązuje ona problem zmienności infekcji w populacjach nicieni, co pozwala nam na rozdzielenie różnych aspektów procesu infekcji.Ta metoda może pomóc w uzyskaniu odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące odporności wrodzonej u nicieni, takie jak podstawa inicjacji odpowiedzi odpornościowej, i to w sposób wysokoprzepustowy. Jaki jest wpływ różnych manipulacji genetycznych lub środowiskowych na zdolność do przeciwstawiania się kolonizacji przez patogeny? Aby rozpocząć, należy hodować nicienie na kilku płytkach z pożywką NGM zaszczepionych bakteriami e coli, aż wiele osobników osiągnie stadium dorosłe.Następnie należy potraktować ciężarne zwierzęta roztworem do preparacji jaj, aby uzyskać zsynchronizowaną hodowlę. W kolejnym kroku jaja należy wysiać na kilka 60-milimetrowych szalek NGM z naniesionymi bakteriami, zachowując gęstość około 150 do 200 jaj na szalkę.Aby uzyskać kilka tysięcy nicieni, potrzebnych będzie co najmniej 15 do 20 płytek. W przypadku eksperymentu z sortowaniem, jeśli wymagana jest większa liczba nicieni, użytkownicy powinni zwiększyć skalę, stosując płytki o większej średnicy z większą liczbą jaj na płytkę. Inkubować płytki w temperaturze 20 °C przez dwa dni, aż nicienie osiągną stadium L4 lub stadium młodego dorosłego.Następnego dnia, podczas przygotowania jaj, zaszczep kulturę POSA wykazującą ekspresję GFP, PA 14 GFP, do dwóch mililitrów pożywki Kings B zawierającej antybiotyk. Inkubuj kulturę w temperaturze 37°C z wytrząsaniem przez noc. Następnego dnia wysej kulturę PA 14 GFP na odpowiednią liczbę szalek do powolnego uśmiercania (slow killing plates) niezbędnych do przeprowadzenia testu, na każdą szalkę Petriego o średnicy 150 mm.Odpipetować od 75 do 100 µL nasyconej kultury i rozprowadzić równomiernie. Używając sterylnego szklanego rozpylacza, inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez 20 do 24 godzin. Wyjąć z inkubatora płytki z PA 14 GFP i pozostawić je do ostygnięcia do temperatury pokojowej.W międzyczasie, aby zebrać nicienie wyhodowane na płytkach NGM, dodaj niewielką ilość buforu M9, wystarczającą do pokrycia powierzchni płytki. Delikatnie zakręć płytką i przelej ciecz do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Pozostaw nicienie do osadzenia się na dnie i usuń nadmiar cieczy przed przeniesieniem ich na płytki PA 14 GFP. W minimalnej objętości cieczy, przy użyciu płytek o średnicy 150 mm, na jednej płytce można umieścić kilkaset nicieni.Inkubuj płytki w temperaturze 25 °C przez 18 do 21 godzin w przypadku młodych dorosłych nicieni wyeksponowanych na p arosa. Jest to okno czasowe zapewniające optymalny rozkład zwierząt skolonizowanych i nieskolonizowanych. Przed przystąpieniem do sortowania próbek należy upewnić się, że urządzenie działa prawidłowo. Kluczowe kroki opisano tutaj, a szczegółowe informacje są dostępne online.Ustaw ciśnienie zaworu osłonki na około five PSI, aby zweryfikować, czy szybkość przepływu płynu osłonowego jest odpowiednia. Umieść probówkę stożkową o pojemności 15 milliliter pod dozownikiem. Otwórz zawór osłonki i zamknij zawór sortera.Przytrzymaj probówkę pod dozownikiem przez 60 sekund. Objętość w probówce powinna wynosić od 9 do 10 mililitrów. Jeśli wartość ta wykracza poza ten zakres.Odpowiednio dostosuj ciśnienie zaworu osłony, aby zapewnić taki przepływ płynu osłony, który umożliwi precyzyjne sortowanie. Przetestuj szybkość sortowania, najpierw zamykając zawór osłony. Następnie dodaj około 25 mililitrów roztworu cząsteczek kontrolnych do zbiornika.Włącz zawór osłonki i zawór próbki w oprogramowaniu komputerowym. Przejdź do trybu kontroli cząstek i kliknij przycisk acquire. Upewnij się, że szybkość przepływu cząstek wynosi około pięć do ośmiu cząstek na sekundę, a czas przelotu odpowiada szerokości cząstki 40 µm.Zapewni to, że w danym momencie przechodzi tylko jeden obiekt o wielkości 40 mikronów. Jeśli wartości wykraczają poza ten zakres, należy odpowiednio dostosować ustawienia. Wykorzystując bufor M9, należy wypłukać nicienie do stożkowych probówek o pojemności 15 ml, pozwolić dorosłym osobnikom opaść na dno probówki pod wpływem grawitacji, a następnie usunąć nadsącz.Napełnij probówkę świeżym buforem M nine. Powtórz ten proces od trzech do czterech razy. Pozwala to na usunięcie znacznej części larw, a także nadmiaru bakterii, i zajmuje około 10 minut.Przenieś nicienie do zbiornika sortera z niewielkim mieszadłem magnetycznym, pracującym w trybie łagodnego mieszania. Dostosuj początkową wzmocnienie sygnału, ustawiając zielony fotopowielacz na 600, a fotopowielacze czerwony i żółty na 200. Rozpocznij akwizycję danych, aby dostroić ustawienia.Dąż do uzyskania szybkości sortowania od 25 do 30 zdarzeń lub nicieni na sekundę. Jeśli szybkość jest zbyt wysoka, rozcieńcz nicienie w zbiorniku za pomocą pożywki M9. Odpowiednio dobierz bufor.Jeśli tempo jest zbyt niskie, należy dodać więcej nicieni w niewielkiej objętości pożywki M9. Jeżeli eksperyment wymaga bardzo rygorystycznej separacji nicieni skolonizowanych od nieskolonizowanych, należy ustawić funkcję sprawdzania koincydencji (coincidence check) na tryb „pure”. Zapewnia to, że jeśli dwa obiekty znajdują się zbyt blisko siebie lub w tej samej kropli, maszyna odrzuci tę kroplę.Zamiast zbierać próbkę w celu sortowania populacji, wyznacz bramki wokół osi wskazującej wielkość i intensywność fluorescencji. Wartości dla bramkowania fluorescencji muszą zostać określone empirycznie. Następnie umieść płytkę wielodołkową lub szalkę Petriego pod dozownikiem, aby zebrać nicienie.Następnie otwórz zawór sortujący, aby rozpocząć sortowanie nicieni. Zbierz niewielką populację zwierząt, aby zweryfikować pod mikroskopem, czy posortowana populacja jest populacją docelową. W przeciwnym razie odpowiednio dostosuj parametry bramkowania i kontynuuj zbieranie próbek.Kiedy w podobnym wieku genetycznie identyczne osobniki C. elegans są eksponowane na ekspresyjące GFP P. arosa, obserwuje się szeroki rozkład poziomu kolonizacji; efektywną separację osobników nieskolonizowanych od skolonizowanych osiągnięto za pomocą sortera nicieni. W przeciwieństwie do nicieni nieskolonizowanych, osobniki skolonizowane wykazują wyraźne objawy, takie jak spowolnienie ruchów i zmniejszona częstotliwość defekacji. To ostatnie może być przyczyną, dla której nicienie skolonizowane przez P. arosa mają trudności z eliminacją infekcji.Cztery geny uległy indukcji w sposób podobny do ekspozycji na P arosa, niezależnie od statusu kolonizacji nicieni, a do pomiaru ekspresji tych genów wykorzystano ilościową R-T-P-C-R. Wiadomo, że te cztery geny stanowią część odpowiedzi immunologicznej C. elegans. Lys dwa koduje lizozym dwa, dwa niecharakteryzowane geny odpowiadają specyficznie na infekcję (z czego jeden przyczynia się również do odporności na infekcję), a PGP pięć reaguje zarówno na infekcję, jak i na stres wywołany metalami ciężkimi.Wyniki te potwierdzają wcześniej opublikowane dane wskazujące, że kolonizacja i związane z nią uszkodzenia nie są niezbędne do wywołania odpowiedzi immunologicznej. Zamiast tego, wskazując na wzorce molekularne związane z patogenami jako sygnał, dane wykazujące indukcję PGP five u zwierząt nieskolonizowanych, u których nie spodziewano się wystąpienia rozległych uszkodzeń, sugerują występowanie nakładania się programów regulacyjnych kontrolujących odpowiedzi immunologiczne oraz ogólne odpowiedzi stresowe u C. elegans.Metoda ta może dostarczyć nowych informacji na temat inicjacji odpowiedzi immunologicznej u *C. elegans*, ale może zostać zastosowana również do badania innych zagadnień, takich jak wpływ warunków środowiskowych lub manipulacji genetycznych na kolonizację lub konkurencję między różnymi patogenami, a nie tylko procesów infekcyjnych. Metodę tę można również wykorzystać do śledzenia innych interakcji nicieni z ich środowiskiem, np. pobierania lub sekwestracji metabolitów lub substancji chemicznych. Po przeprowadzeniu tej procedury posortowane populacje interesujące badacza mogą zostać wykorzystane w wielu celach wykraczających poza analizę ekspresji genów.Obejmują one pobieranie żywych zwierząt do późniejszych testów infekcji lub przeżywalności oraz eksperymentów behawioralnych. Technika ta stanowi przydatne narzędzie do badania wpływu ekspozycji na patogeny i kolonizacji na odporność wrodzoną oraz sea elegance.I.

automated-separation-c-elegans-variably-colonized-bacterial

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Zautomatyzowane oddzielenie C. elegans zmiennie kolonizowane przez patogenną bakterię

Źródło: Taylor, M. N., et.al. Wykorzystanie danych dotyczących pojedynczego robaka do ilościowego określenia niejednorodności interakcji Caenorhabditis elegans z bakteriami. J. Vis. Exp. (2022)Ten film pokazuje narażenie wolnych od zarazków, dopasowanych do wieku robaków Caenorhabditis elegans na szczep bakteryjny w celu kolonizacji jelit. Wyjaśnia selektywne usuwanie nieprzylegających i zewnętrznych bakterii, pozostawiając tylko żywe bakterie przylegające do nabłonka jelitowego w celu...

Ocena kolonizacji bakteryjnej jelit u C. elegans wolnych od zarazków

Źródło: Petersen, C. i in., Izolacja i charakterystyka naturalnej mikrobioty nicienia modelowego Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (2022)Ten film pokazuje izolację i hodowlę gatunków bakterii związanych z Caenorhabditis elegans. Liza C. elegans oparta na koralikach, a następnie selektywna hodowla, umożliwia izolację różnorodnych szczepów mikroorganizmów do dalszej analizy.

Izolacja i hodowla bakterii związanych z Caenorhabditis elegans

Źródło: Chen, Y. i inni. Ocena zjadliwości i patogenezy infekcji Aeromonas w modelu Caenorhabditis elegans . J. Vis. Exp. (2018)Ten film demonstruje test przeżycia z użyciem C. elegans do modelowania patogenezy Aeromonas , gdzie doustne spożycie bakterii prowadzi do infekcji i śmiertelności jelit, umożliwiając ilościową ocenę zjadliwości bakterii w żywym systemie gospodarza.

Modelowanie patogenezy aeromonasów u C. elegans za pomocą testu przetrwania

Źródło: Le, T. A. N., i in., Measuring the Effects of Bacteria and Chemicals on the Jelit of Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (2019)Ten film demonstruje test oparty na fluorescencji mającycy na celu ilościową przepuszczalność jelit u osób C. elegans, które były narażone na Pseudomonas aeruginosa. W porównaniu z kontrolami karmionymi Escherichia coli, robaki poddane patogenom wykazują zwiększoną przeciekliwość fluoroforu do jamy ciała, co wskazuje na uszkodzenie bariery nabłonkowej.

Ocena przepuszczalności jelit u C. elegans po ekspozycji na bakterie

Tutaj prezentujemy nicienia Caenorhabditis elegans jako wszechstronny model gospodarza do badania interakcji mikrobiologicznych.

Nicienie Caenorhabditis elegans - wszechstronny model in vivo do badania interakcji gospodarz-mikroorganizm

Tutaj opisujemy protokół, który jest elastycznym, wszechstronnym narzędziem przesiewowym o wysokiej zawartości, które może być wykorzystane do badania interakcji gospodarz-patogen i może być wykorzystane do odkrywania leków.

Wysokoprzepustowy, o wysokiej zawartości, płynny system patologiczny C. elegans

Dzikie nicienie Caenorhabditis są związane z wieloma drobnoustrojami, często w świetle jelit lub infekującymi jelita. Protokół ten szczegółowo opisuje metodę wzbogacania niekulturowych drobnoustrojów kolonizujących jelito, wykorzystując odporność naskórka dauer.

Selektywne czyszczenie dzikich nicieni Caenorhabditis w celu wzbogacenia o bakterie mikrobiomu jelitowego

Mikroby jelitowe, w tym bakterie zewnątrzkomórkowe i patogeny wewnątrzkomórkowe, takie jak wirus Orsay i mikrosporydia (grzyby), są często kojarzone z dzikimi nicieniami Caenorhabditis. W artykule przedstawiono protokół wykrywania i ilościowego oznaczania drobnoustrojów, które kolonizują i/lub infekują nicienie C. elegans, a także pomiaru obciążenia patogenami po kontrolowanych infekcjach w laboratorium.

Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ RNA (FISH) w celu wizualizacji kolonizacji i infekcji mikrobiologicznej w jelitach Caenorhabditis elegans

Ten protokół opisuje 96-dołkowe zakłócenie pojedynczych bakteriologicznie skolonizowanych Caenorhabditis elegans po zimnym paraliżu i bieleniu powierzchni w celu usunięcia zewnętrznych bakterii. Otrzymaną zawiesinę umieszcza się na płytkach agarowych, aby umożliwić dokładne, średnioprzepustowe określenie ilościowe obciążenia bakteryjnego w dużej liczbie pojedynczych robaków.

Wykorzystanie danych dotyczących pojedynczego robaka do ilościowego określenia niejednorodności w interakcjach Caenorhabditis elegans z bakteriami

Caenorhabditis elegans jest jednym z głównych gatunków modelowych w biologii, jednak prawie wszystkie badania są prowadzone pod nieobecność naturalnie związanych z nim mikrobów. Opisane tutaj metody pomogą lepiej zrozumieć różnorodność powiązanych mikroorganizmów jako podstawę przyszłych badań funkcjonalnych nad C. elegans.

Izolacja i charakterystyka naturalnej mikrobioty nicienia modelowego Caenorhabditis elegans

Poznaj automatyczną separację C. elegans skolonizowanych przez Pseudomonas aeruginosa z użyciem wormsortera. Ta metoda pozwala badać odpowiedź immunologiczną i mechanizmy rozpoznawania patogenów w organizmie nicienia.

Automatyczna separacja C. elegans skolonizowanych przez patogen bakteryjny

Przeglądaj więcej filmów