Automatyczna separacja C. elegans skolonizowanych przez patogen bakteryjny
21 marca 2014
Sorter robaków ułatwia badania genetyczne u Caenorhabditis elegans, sortując robaki według ekspresji fluorescencyjnych reporterów. W tym miejscu opisujemy nowe zastosowanie: sortowanie według kolonizacji przez patogen wykazujący ekspresję GFP i wykorzystujemy je do zbadania słabo poznanej roli rozpoznawania patogenu w inicjowaniu odpowiedzi immunologicznej.
Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest ocena wkładu kolonizacji i związanych z nią uszkodzeń w inicjację wrodzonych odpowiedzi immunologicznych w elegancji morskiej. Osiąga się to poprzez wystawienie zsynchronizowanej populacji młodych dorosłych morskich elegancji na działanie Pseudomonas arosa wykazującego ekspresję białka zielonej fluorescencji lub GFP, które wytwarza populację robaków różnie skolonizowanych przez patogen. Po umyciu różnicowym, skolonizowane populacje robaków są rozdzielane na czyste populacje, koncentrując się na dwóch skrajnościach w pełni skolonizowanych i nieskolonizowanych robaków.
Następnie z tych populacji ekstrahuje się RNA i ocenia ekspresję genów odpornościowych w porównaniu z robakami hodowanymi na niepatogennych bakteriach E. coli. W celu zbadania związku między odpowiedzią immunologiczną a kolonizacją, uzyskano wyniki pokazujące, że wrodzona odpowiedź immunologiczna elegancji morskiej na p arosa może być oddzielona od kolonizacji patogenu. Główną przewagą tej techniki nad innymi podejściami do badania inicjacji odpowiedzi immunologicznej w elegancji morskiej jest to, że odnosi się ona do zmienności infekcji w ciepłych populacjach, co pozwala nam wyodrębnić różne aspekty procesu infekcji.
Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące elegancji morskiej, odporności wrodzonej, takich jak to, co jest podstawą inicjacji wrodzonych odpowiedzi immunologicznych i w sposób wysokoprzepustowy. Jaki jest wpływ różnych manipulacji genetycznych lub środowiskowych na zdolność do opierania się kolonizacji patogenów? Aby rozpocząć, hoduj robaki na kilku nicieniach, pożywkach wzrostowych lub płytkach NGM obsianych bakteriami E. coli, aż wiele robaków osiągnie stadium grobu.
Następnie potraktuj zwierzęta grobowe roztworem do przygotowania jaj, aby uzyskać zsynchronizowaną kulturę. Następny talerz. Jaja na kilku 60-milimetrowych płytkach NGM są obsiane bakteriami o gęstości około 150 do 200 jaj na płytkę.
Do uzyskania kilku tysięcy robaków potrzebnych będzie co najmniej 15 do 20 płytek. W przypadku eksperymentu sortowania użytkownicy powinni zwiększyć skalę, używając płytek o większej średnicy z większą liczbą jaj na płytkę, jeśli potrzebna jest większa liczba robaków. Inkubuj płytki w temperaturze 20 stopni Celsjusza przez dwa dni, aż robaki osiągną stadium L cztery lub młodego dorosłego osobnika.
Następnego dnia przygotowania jaj należy zaszczepić A GFP wykazujący ekspresję kultury POSA, PA 14 GFP, w dwóch mililitrach pożywki Kings B.Medium zawierającej antybiotyk. Inkubuj kulturę w temperaturze 37 stopni Celsjusza z mieszaniem przez noc. Następnego dnia umieść kulturę PA 14 GFP na tylu płytkach do powolnego zabijania, ile potrzeba do testu na każdej 150-milimetrowej szalce Petriego.
Odpipetować od 75 do 100 mikrolitrów nasyconych kultur i równomiernie rozprowadzić. Za pomocą sterylnego rozsiewacza szkła inkubować płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 20 do 24 godzin. Wyjąć płytki z PA 14 GFP z inkubatora i pozostawić je do ostygnięcia do temperatury pokojowej.
W międzyczasie, aby zebrać robaki wyhodowane na płytkach NGM, dodaj niewielką ilość buforu M 9 wystarczającą do przykrycia płytki. Delikatnie zakręć płytką i przenieś płyn do stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów. Pozwól robakom osiąść na dnie i usuń nadmiar płynu przed przeniesieniem robaków na płytki PA 14 GFP W minimalnej objętości płynu, przy użyciu płytek 150 milimetrowych, na jednej płytce można umieścić kilkaset robaków.
Inkubować płytki w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez 18 do 21 godzin w przypadku młodych dorosłych robaków narażonych na działanie p. arosa. Jest to okno czasowe wyświetlające optymalny rozkład zwierząt skolonizowanych i nieskolonizowanych przed wykonaniem sortowania próbki, aby upewnić się, że maszyna działa prawidłowo. Podstawowe kroki są opisane tutaj, a szczegóły można uzyskać online.
Ustaw ciśnienie zaworu osłony na około pięć PSI, aby sprawdzić, czy natężenie przepływu płynu w osłonie jest odpowiednie. Umieść stożkową rurkę o pojemności 15 mililitrów pod dozownikiem. Włącz zawór osłony i wyłącz zawór sortera.
Przytrzymaj probówkę pod dozownikiem przez 60 sekund. Objętość w rurze powinna wynosić od dziewięciu do 10 mililitrów. Jeśli znajduje się poza tym zakresem.
Wyreguluj odpowiednio ciśnienie zaworu osłony, aby upewnić się, że natężenie przepływu płynu w osłonie umożliwi dokładne sortowanie. Przetestuj szybkość sortowania, najpierw wyłączając zawór osłony. Następnie dodaj około 25 mililitrów roztworu cząstek kontrolnych do zbiornika.
Włącz zawór osłonowy i zawór próbki w oprogramowaniu komputerowym. Przejdź do trybu kontroli cząsteczek i kliknij pobierz. Upewnij się, że natężenie przepływu cząstek wynosi około pięciu do ośmiu cząstek na sekundę, a czas lotu jest zbliżony do szerokości cząstki o wielkości 40 mikrometrów.
Zapewni to, że tylko jeden obiekt o średnicy 40 mikronów przechodzi przez ten sam czas. Jeśli wartości wykraczają poza ten zakres, dostosuj odpowiednio ustawienia. Używając robaków z buforem M nine do 15-mililitrowych stożkowych probówek, pozwól dorosłym robakom opaść grawitacyjnie na dno rurki i usuń supernatant.
Napełnij probówkę świeżym buforem M nine. Powtórz ten proces trzy do czterech razy. Usuwa to dużą część larw, a także nadmiar bakterii i zajmuje około 10 minut.
Dodaj robaki do zbiornika sortera robaków zawierającego delikatnie mieszający mały mieszadło. Dostosuj początkowe wzmocnienie sygnału, ustawiając zieloną lampę fotopowielacza na 600, a czerwoną i żółtą rurkę fotopowielacza na 200. Rozpocznij zbieranie danych, aby dostosować ustawienia.
Celuj w sortowanie od 25 do 30 zdarzeń lub robaków na sekundę. Jeśli szybkość liczbowa jest zbyt wysoka, rozcieńczyć robaki w zbiorniku za pomocą M dziewięciu. Odpowiednio buforować.
Jeśli szybkość jest zbyt niska, dodaj więcej robaków w małej objętości M dziewięć. Jeśli eksperyment wymaga bardzo rygorystycznego oddzielenia robaków skolonizowanych od nieskolonizowanych, ustaw test koincydencji na czysty. Gwarantuje to, że jeśli dwa obiekty znajdą się zbyt blisko siebie lub w tym samym upuszczeniu, maszyna odrzuci upuszczenie.
Zamiast zbierać je w celu sortowania interesującej populacji, narysuj bramki wokół osi wskazującej rozmiar i intensywność fluorescencji. Wartości dla bramkowania fluorescencyjnego muszą być określone empirycznie. Następnie umieść płytkę wielodołkową lub szalkę Petriego pod dozownikiem, aby zebrać robaki.
Następnie otwórz zawór sortowania, aby rozpocząć sortowanie robaków. Zbierz małą populację zwierząt, aby sprawdzić pod mikroskopem, czy posortowana populacja jest populacją będącą przedmiotem zainteresowania. Jeśli nie, dostosuj odpowiednio parametry bramkowania i kontynuuj pobieranie próbek.
Gdy wiek dopasowany do genetycznie identycznej elegancji morskiej, która jest narażona na ekspresję GFP, posa skutkuje szerokim rozkładem poziomów kolonizacji, osiągnięto skuteczne oddzielenie robaków nieskolonizowanych od skolonizowanych za pomocą sortera robaków. W przeciwieństwie do robaków nieskolonizowanych, skolonizowane robaki wykazują wyraźne oznaki ospałości i zmniejszają wypróżnianie. To ostatnie może być powodem, dla którego robaki skolonizowane przez P arosa mają trudności z usunięciem infekcji.
Cztery geny indukowano podobnie jak ekspozycję na P arosa, niezależnie od statusu kolonizacji robaków, a do pomiaru ekspresji genów użyto ilościowego R-T-P-C-R. Wiadomo, że te cztery geny są częścią odpowiedzi immunologicznej CL egan. Lys dwa kodują lizozym dwa niescharakteryzowane geny odpowiedź specyficznie na infekcję, z których jeden przyczynia się również do odporności na infekcje, a PGP pięć reaguje na infekcję, a także na stres metalami ciężkimi.
Wyniki potwierdzają wcześniej opublikowane wyniki wskazujące, że kolonizacja i związane z nią uszkodzenia nie są wymagane do odpowiedzi immunologicznej. Zamiast tego wskazanie na wzorce molekularne związane z patogenami jako dane sygnałowe pokazujące, że PGP 5 jest indukowany u zwierząt nieskolonizowanych, których nie oczekuje się, że będą doświadczać. Rozległe uszkodzenia sugerują nakładanie się programów regulacyjnych, kontrolujących reakcje immunologiczne i ogólne reakcje na stres w morskiej elegancji.
Metoda ta może dostarczyć nowych informacji na temat inicjacji odpowiedzi immunologicznych u osób o eleganckim wyglądzie morza, ale może być również zastosowana do innych kwestii, takich jak wpływ warunków środowiskowych lub manipulacji genetycznych na kolonizację lub konkurencję między różnymi patogenami poza procesami infekcji. Metoda ta może być również stosowana do śledzenia innych interakcji robaków z ich środowiskiem, takich jak spożycie lub sekwestracja metabolitów lub substancji chemicznych. Zgodnie z tą procedurą, posortowane populacje będące przedmiotem zainteresowania mogą być wykorzystywane do różnych celów poza ekspresją genów.
Obejmują one zbieranie żywych zwierząt do późniejszych testów infekcji lub przeżycia lub eksperymentów behawioralnych. Technika ta stanowi użyteczny środek do badania wpływu ekspozycji na patogeny i kolonizacji na wrodzoną odporność i elegancję morską
.Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
W niniejszym badaniu wykorzystano urządzenie wormsorter w celu usprawnienia przesiewów genetycznych u Caenorhabditis elegans poprzez sortowanie nicieni na podstawie stopnia kolonizacji przez patogen wykazujący ekspresję GFP. Badania koncentrują się na analizie roli rozpoznawania patogenów w inicjowaniu odpowiedzi immunologicznych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Immunologia
- Genetyka
Wstęp
- Wrodzona odpowiedź immunologiczna u Caenorhabditis elegans jest kluczowa dla przetrwania w obliczu patogenów.
- Zależność między kolonizacją przez patogeny a odpowiedzią immunologiczną pozostaje słabo poznana.
- Do wizualizacji kolonizacji przez patogeny można wykorzystać reportery fluorescencyjne.
- Poprzednie metody nie uwzględniały w wystarczającym stopniu zmienności stopnia zakażenia w populacjach nicieni.
Cel badania
- Ocena wpływu kolonizacji przez patogen na inicjację odpowiedzi immunologicznej.
- Ocena ekspresji genów odpornościowych u nicieni eksponowanych na szczep patogenny.
- Rozdzielenie populacji nicieni na podstawie poziomu kolonizacji w celu przeprowadzenia analizy.
Zastosowane metody
- Narażanie zsynchronizowanych populacji młodych dorosłych nicieni na Pseudomonas aeruginosa wykazującą ekspresję GFP.
- Przemywanie i sortowanie nicieni na grupy w pełni skolonizowane i nieskolonizowane.
- Ekstrakcja RNA z posortowanych populacji w celu analizy ekspresji genów.
- Porównanie odpowiedzi immunologicznej z nicieniami hodowanymi na niepatogennych E. coli.
Główne wyniki
- Odpowiedzi odpornościowe nieswoiste mogą być rozdzielone od poziomu kolonizacji przez patogen.
- Zróżnicowanie infekcji w populacjach nicieni można analizować przy użyciu tej techniki.
- Analiza ekspresji genów ujawnia odmienne odpowiedzi odpornościowe w zależności od stopnia kolonizacji.
- Metoda ta pozwala na lepsze zrozumienie procesu infekcji u Caenorhabditis elegans.
Wnioski
- Technika wormsorter jest skuteczna w badaniu odpowiedzi immunologicznych u nicieni.
- Rozpoznawanie patogenów odgrywa istotną rolę w inicjowaniu odpowiedzi odpornościowej.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tej metodzie, aby dalej zgłębiać mechanizmy immunologiczne.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Metoda ta umożliwia badaczom z sektora biofarmaceutycznego oddzielenie ekspozycji na patogen od uszkodzeń gospodarza w modelach infekcji, co wspiera mechanistyczne ograniczanie ryzyka w badaniu szlaków odpowiedzi odpornościowej. Poprzez izolację populacji C. elegans o zróżnicowanym stopniu kolonizacji, opracowane podejście pozwala na skalowalną ocenę hipotez dotyczących walidacji celów w odporności wrodzonej. Technika ta zwiększa pewność prognostyczną we wczesnej fazie odkrywania leków, wyjaśniając, czy aktywacja odporności wynika z rozpoznania patogenu, czy z uszkodzenia komórkowego.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Pozwala na weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez rozdzielenie odpowiedzi immunologicznych zależnych od kolonizacji od odpowiedzi niezależnych od kolonizacji.
- Wartość operacyjna: Umożliwia funkcjonalną walidację celu poprzez ilościowe porównanie ekspresji genów w posortowanych populacjach nicieni.
- Wartość prognostyczna: Wspomaga selekcję projektów badawczych poprzez wyjaśnienie, czy aktywacja immunologiczna jest napędzana przez wzorce molekularne związane z patogenami.
Przesiewy i opracowanie testów
- Wartość naukowa: Przygotowuje standaryzowane systemy biologiczne do dalszych analiz przesiewowych poprzez generowanie czystych kohort nicieni skolonizowanych i nieskolonizowanych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalność testów dzięki precyzyjnemu sortowaniu w oparciu o progi intensywności fluorescencji GFP.
- Skalowalność: Ułatwia przygotowanie do wysokoprzepustowych analiz przesiewowych poprzez przetwarzanie tysięcy nicieni w jednej serii przy użyciu platformy wormsorter.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Łączy dane dotyczące odpowiedzi immunologicznej z fazy odkryć z walidacją przedkliniczną poprzez zdefiniowanie sygnatur immunologicznych niezależnych od kolonizacji.
- Mechanistyczna redukcja ryzyka: Zmniejsza niejednoznaczność w walidacji celu poprzez oddzielenie obciążenia patogenem od przyczyn uszkodzeń gospodarza.
- System istotny dla choroby: Wykorzystuje C. elegans jako genetycznie podatny model do badania konserwatywnych szlaków odporności wrodzonej, które mają zastosowanie w systemach ssaków.
Integracja potoku i przepływu pracy
Urządzenie wormsorter wpisuje się w kontinuum procesu identyfikacji od odkrycia do fazy leadu, umożliwiając ukierunkowany na hipotezy screening modulatorów odporności w modelach infekcji.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez poprzez izolowanie subpopulacji nicieni w celu oceny indukcji genów odpornościowych niezależnie od ładunku patogenów.
- Przesiewanie: Dostarcza standaryzowanych populacji nicieni gotowych do analiz, służących do przesiewania związków pod kątem kolonizacji lub punktów końcowych związanych z odpornością.
- Analityka: Generuje ilościowe odczyty ekspresji genów odpornościowych (np. lys-2, pgp-5), które umożliwiają porównania między różnymi warunkami eksperymentalnymi.
- Badania translacyjne: Wspierają ciągłość przedkliniczną poprzez identyfikację odpowiedzi odpornościowych występujących przed wykrywalnym uszkodzeniem tkanek.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Służy jako platforma wielokrotnego użytku do sortowania C. elegans na podstawie dowolnego reportera fluorescencyjnego, co umożliwia wdrożenie w wielu projektach.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej w inicjacji odpowiedzi immunologicznej.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację i powtarzalność pomiędzy laboratoriami dzięki zautomatyzowanemu sortowaniu opartemu na fluorescencji.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go poprzez wyjaśnienie, czy aktywacja immunologiczna wymaga kolonizacji przez patogen.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów z uwzględnieniem ryzyka w oparciu o sygnatury immunologiczne niezależne od kolonizacji.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna w zakresie hodowli C. elegans, obchodzenia się z patogenami oraz obsługi aparatury do cytometrii przepływowej.
- Zależne od dostępu do wormsortera lub równoważnego sortera cząstek aktywowanego fluorescencją z odpowiednimi ustawieniami dyszy i ciśnienia.
- Konieczna jest międzyzespołowa standaryzacja strategii bramkowania GFP oraz protokołów przygotowania nictoni.
- Rozważania dotyczące adaptacji obejmują optymalizację wrażliwości na siły ścinające dla różnych stadiów rozwojowych nictoni oraz szczepów patogenów.
- Ograniczenia praktyczne obejmują potencjalny stres nictoni wywołany ciśnieniem sortowania oraz konieczność empirycznej kalibracji progów fluorescencji.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:05
Title
1:49
Infection of Synchronized Young Adult Worms with Pseudomonas aeruginosa
4:44
Setting up the Wormsorter
6:19
Sorting Colonized vs Noncolonized Worms
8:28
Results: Colonization is Not Required for the Transcriptional Response to P. aeruginosa
10:19
Conclusion
