Identyfikacja modyfikacji potranslacyjnych kompleksów białek roślinnych

Ogólnym celem tej procedury jest identyfikacja potranslacyjnych modyfikacji białek zaangażowanych w kompleksy białek roślinnych, najpierw przejściowo lub stabilnie wyrażanych w planie, białku będącym przedmiotem zainteresowania. Następnie wyekstrahuj wszystkie białka z tkanki rośliny i wytrącić białko będące przedmiotem zainteresowania. Następnie oddziel białka wytrącone immunologicznie na żelu akrylowym, a następnie wyekstrahuj i strawij białka z interesującego nas pasma żelu.

Teraz prześlij próbki białek do spektrometrii mas. Ostatecznie wyniki spektrometrii mas mogą wykryć dynamiczne zmiany w modyfikacjach potranslacyjnych, takich jak fosforylacja. W przeciwieństwie do metod alternatywnych, takich jak inkubacja kinazy in vitro z substratem, ta metoda powoduje ekspresję białek w sadzarce.

Nie musisz więc wiedzieć, która kinaza jest odpowiedzialna za fosforylację. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii roślin, takie jak sposób transdukowania sygnałów w odpowiedzi na stres, zmiany środowiskowe lub rozpoznawanie patogenów. Oprócz identyfikacji fosforylacji, miejsc aktywowanych kompleksów białkowych oporności, metoda ta może być szeroko stosowana do dowolnej modyfikacji potranslacyjnej dowolnego kompleksu białek roślinnych.

Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w tej metodzie, będą miały problemy, ponieważ nie są przyzwyczajone do pracy z dużą ilością ekstraktu i wykonywania większej liczby kroków protokołu w ciągu jednego dnia. W celu uzyskania przejściowej ekspresji należy wyhodować szczepy tohin agrobacterium do fazy stacjonarnej. Zbierz agrobakterie przez odwirowanie w temperaturze 3000 g przez pięć minut.

Ponownie zawiesić granulki i bufor infiltracji. Bufor. Teraz infiltruje. Czterotygodniowe rośliny hamana NCOA z agrobakteriami ręcznie za pomocą jednomililitrowej strzykawki bezigłowej lub próżniowo z 0,02% środkiem powierzchniowo czynnym, dwa do pięciu dni po infiltracji.

Zbierz naciekane liście, liście, zamroź je w ciekłym azocie i przechowuj w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Następnie miele 20 gramów tkanki roślinnej i ciekłego azotu za pomocą moździerza i tłuczka w 80 mililitrach zimnego buforu C do 20 gramów. Dobrze wymieszaj i rozmroź na lodzie.

Teraz homogenizuj trzema seriami po 10 sekund każdy z pełną prędkością. Przefiltrować homogenat i odwirować w temperaturze 30 000 G przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. W międzyczasie do 100 mikrolitrów odpowiedniej matrycy powinowactwa w 500 mikrolitrach zimnego buforu blokującego D przez pięć minut w czterech stopniach Celsjusza i przemyć trzykrotnie jednym mililitrem zimnego buforu D. Następnie usunąć supernat ekstraktu z liści i przepuścić go przez strzykawkę o wielkości 0,45 mikrometra.

Przefiltrować do nowej rurki na lodzie. Podwielokrotność ekstraktu surowego. Na plamę immunologiczną.

Dodaj pięć wirów bufora ładowania strony XSDS i zagotuj próbki do denaturacji. Do każdej probówki dodać 50 mikrolitrów matrycy powinowactwa, zawieszonej w buforze D. Inkubować z delikatnym obracaniem przez dwie godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza, odwirować do osadzania matrycy powinowactwa.

Następnie należy pobrać porcję niezwiązanego ekstraktu na plamę immunologiczną. Wyrzuć resztę zdrowego rozsądku, pozostawiając około 500 mikrolitrów na dnie probówki. Zawiesić roztwór gnojowicy za pomocą końcówki o szerokim otworze.

Zbierz zmieszany roztwór gnojowicy z obu probówek w jednej probówce o pojemności 1.5 mililitra. Pulsować trzy razy przez pięć sekund za pomocą wirówki stołowej w celu wytrącenia matrycy powinowactwa i usunąć supernat po trzech do pięciu przemyciach jednym mililitrem zimnego buforu D. Usunąć nadmiar buforu D za pomocą igły strzykawki, eluować 200 mikrolitrami odpowiedniego buforu elucyjnego pod ciągłym wstrząsaniem. Pociągnij trzy EITy do jednej tuby.

Następnie zagęścić białka za pomocą 30 mikrolitrów wiru żywicy absorpcyjnej. Odznaczmy się na pięć minut i wytrącmy żywicę, wyrzućmy supernat. Dodaj 50 mikrolitrów jednego bufora ładującego stronę XSDS do wytrąconej matrycy powinowactwa lub wiru żywicy absorpcyjnej i gotuj przez 10 minut w temperaturze od 80 do 100 stopni Celsjusza w wirówce z blokiem grzewczym.

Gotowana matryca powinowactwa to żywica przez dwie minuty w temperaturze 10 000. GS podajemy pięć mikrolitrów supernatu na blok immunologiczny i biegnij z innymi frakcjami na 10-centymetrową stronę SDS. Żel do rozdzielania i identyfikacji fosforylowanych białek metodą spektrometrii mas.

Załaduj pozostałe 45 mikrolitrów na stronę SDS w postaci barwnika żelowego. Żel do stron SDS z koloidalnym blaskiem kamasi w kolorze niebieskim. Następnie oddetnij żel z obfitym myciem i wodą, najlepiej na noc.

Teraz za pomocą czystego skalpela wytnij interesujący nas pasek z żelu, pokrój żel w kostkę w kostkę o długości od dwóch do czterech milimetrów i przenieś próbkę do probówki. Umyj kawałki żelu 50% acetonrylem i 50 milimolowym wodorowęglanem amonu, aż do plamy. Następnie odpipetować roztwór.

Uważając, aby nie usunąć kawałków żelu. Odwodnić próbkę 100% nitrylem acetonowym przez pięć minut i usunąć wolny płyn. Następnie, aby zredukować wiązania białkowe di siarczkowe przy 10 milimolowych DTT i inkubować przez 30 do 45 minut w temperaturze 56 stopni Celsjusza z potrząsaniem, usuń teraz wolny płyn do alkilowania reszty cysteiny.

Dodaj 55 milimolowy chloroacetamid przez 20 do 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Usuń wolny płyn, a następnie umyj kawałki żelu dwukrotnie 50% nitrylem aceto przez 10 minut. Usuń wolny płyn.

Teraz odwodnij kawałki żelu 100% nitrylem acetonowym przez pięć minut i usuń wolny płyn do Tryptyku Digest. Przy 40 mikrolitrach roztworu roboczego trypsyny pozwól kawałkom żelu na ponowne nawodnienie przez 10 minut przy wystarczającym buforze trawiennym, aby pokryć kawałki żelu. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc, aby zatrzymać trawienie i ekstrahować peptydy z kawałków żelu w 5% sonikacji kwasu mrówkowego przez pięć do 10 minut.

Następnie przenieś supernat do nowej probówki, wysusz peptydy przez liofilizację lub koncentrator próżniowy i przechowuj próbki w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Ten eksperyment oczyszcza kompleks kinazy P-R-F-P-T-O z nacoa hamana, transgeniczna NACOA hamana eksprymująca 35 SPTO została przejściowo przekształcona za pomocą flagi 35 SPRF, a kompleks został immunologicznie wytrącony anty-Flag M dwa aros. Immuno bloty ilustrują skuteczną immunoprecypitację docelowego białka PRF, zarówno WOM, jak i oddziałującego białka efektorowego oczyszczonego z PRF, jak wskazano na wykrywanie przeciwciał i analizę spektrometrii mas.

W tym przypadku strategia polegała na celowaniu w białko PTO za pomocą Anti-Flag. Strategia została zmieniona. W celu identyfikacji miejsc fosforylacji PTO.

Całkowita ilość białka PTO składającego się zarówno z kompleksu PRF, jak i wolnej formy została immunologicznie wytrącona za pomocą Anti-Flag M two aros i poddana frakcjonowaniu strony SDS, trawieniu tryptykowi ingel i analizie spektrometrii mas w wyniku uzyskania peptydów PTO obejmujących około 80% jego sekwencji. Co ciekawe, zidentyfikowano zestaw pojedynczych miejsc fosforylacji peptydów PTO. Należy zauważyć, że miejsca podwójnej fosforylacji zostały zidentyfikowane tylko w obecności któregokolwiek z białek efektorowych.

Ważne jest, aby uzyskać wystarczającą ilość białka roślinnego, aby zidentyfikować składniki kompleksu białkowego, a także wykryć modyfikację potranslacyjną białka będącego przedmiotem zainteresowania. Pamiętaj, że modyfikacje mapowania, takie jak fosforylacja, wymagają rozsądnej ilości białka ze spektrometrii mas, więc na żelu powinno być widoczne przynajmniej słabe pasmo Postępując zgodnie z tą procedurą. Inne metody, takie jak I, identyfikacja złożonych składników może być przeprowadzona w celu odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak to, w jaki sposób aktywacja kompleksu immunologicznego prowadzi do odporności funkcjonalnej.

Nie zapominaj, że praca z organicznymi, bakteriami i BBL brzytwy może być niezwykle niebezpieczna, dlatego należy podjąć środki ostrożności, takie jak noszenie rękawiczek i ochraniaczy na kolana.