Identyfikacja modyfikacji potranslacyjnych kompleksów białek roślinnych

Ogólnym celem niniejszej procedury jest identyfikacja modyfikacji potranslacyjnych białek zaangażowanych w kompleksy białkowe roślin, które zostały uprzednio wyeksponowane przejściowo lub stabilnie w roślinach z użyciem znaczników białka docelowego. Następnie należy wyekstrahować całkowitą pulę białek z tkanki roślinnej i przeprowadzić immunoprecypitację białka docelowego. W kolejnym kroku białka poddane immunoprecypitacji należy rozdzielić na żelu akrylamidowym, a następnie wyciąć i poddać trawieniu białka z interesującego nas prążka żelowego.

Następnie należy poddać próbki białek analizie za pomocą spektrometrii mas. W efekcie wyniki spektrometrii mas pozwalają wykryć dynamiczne zmiany w modyfikacjach potranslacyjnych, takich jak fosforylacja. W przeciwieństwie do alternatywnych metod, takich jak inkubacja kinazy z substratem in vitro, metoda ta umożliwia ekspresję białek w organizmach roślinnych.

Dzięki temu nie trzeba wiedzieć, która kinaza odpowiada za fosforylację. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu biologii roślin, takie jak sposób przekazywania sygnałów w odpowiedzi na stres, zmiany środowiskowe lub rozpoznanie patogenów. Oprócz identyfikacji miejsc fosforylacji w aktywowanych kompleksach białek odpornościowych, metodę tę można szeroko zastosować do dowolnej modyfikacji potranslacyjnej dowolnego kompleksu białkowego roślin.

Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności, ponieważ nie są przyzwyczajone do pracy z dużymi ilościami ekstraktu oraz do wykonywania większej liczby kroków protokołu w ciągu jednego dnia. W przypadku ekspresji przejściowej należy hodować szczepy Agrobacterium do fazy stacjonarnej. Bakterie Agrobacterium należy zebrać poprzez wirowanie przy 3000 Gs przez pięć minut.

Resuspend granulaty w buforze do infiltracji. Następnie przeprowadź infiltrację czterotygodniowych roślin NCOA hamana agrobakteriami, wykonując ją ręcznie za pomocą beziglowej strzykawki o pojemności 1 ml lub metodą próżniową z dodatkiem 0,02% surfaktantu, dwa do pięciu dni po infiltracji.

Zebrać zainfiltrowane liście, zamrozić je w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze minus 80°C. Następnie rozetrzeć 20 g tkanki roślinnej z ciekłym azotem za pomocą moździerza i tłuczka, dodając do 20 g tkanki 80 ml zimnego buforu C. Dobrze wymieszać i rozmrozić na lodzie.

Następnie przeprowadź homogenizację w trzech cyklach po 10 sekund każdy przy pełnej prędkości. Homogenizat przefiltruj i odwiruj przy 30 000 G przez 30 minut w temperaturze 4 °C. W tym czasie 100 µL odpowiedniej macierzy powinowactwa inkubuj z 500 µL zimnego buforu blokującego D przez pięć minut w temperaturze 4 °C, a następnie przemyj trzy razy 1 ml zimnego buforu D. Następnie oddziel supernatant ekstraktu z liści i przepuść go przez strzykawkę z filtrem 0,45 µm.

Przefiltruj do nowej probówki na lodzie. Rozdziel ekstrakt surowy na alikwoty. Do analizy immunoblotu.

Dodaj pięć µL buforu do ładowania żeli SDS-PAGE, wymieszaj w wortexie i zagotuj próbki w celu denaturacji. Do każdej probówki dodaj 50 µl macierzy powinowactwa zawieszonej w buforze D. Inkubuj przez dwie godziny w temperaturze 4 °C przy łagodnym obracaniu, a następnie odwirowuj, abyt zbrylić macierz powinowactwa.

Następnie pobierz alikwot nieprzypisanego ekstraktu do analizy immuno-blot. Pozostałą część odrzuć, pozostawiając w dnie probówki około 500 µL. Resuspenduj zawiesinę za pomocą końcówki o szerokim otworze.

Połącz zmieszany roztwór zawiesiny z obu probówek w jednej probówce o pojemności 1,5 ml. Przeprowadź trzy cykle wirowania po pięć sekund za pomocą wirówki naktowej, aby wytrącić macierz powinowactwa, a następnie usuń supernatant po trzech do pięciu przemyciach 1 ml zimnego buforu D. Nadmiar buforu D usuń za pomocą igły strzykawki, a następnie przeprowadź elucję 200 µl odpowiedniego buforu elucyjnego przy stałym wytrząsaniu. Połącz trzy frakcje EIT w jednej probówce.

Następnie skoncentruj białka, używając 30 µL żywicy absorpcyjnej, i wymieszaj na wortexie. Pozostaw na pięć minut, a następnie odwiruj żywicę i odlej supernatnat. Do osadu z macierzy powinowactwa lub żywicy absorpcyjnej dodaj 50 µL buforu do ładowania SDS-PAGE 1X i gotuj przez 10 minut w temperaturze od 80 do 100 °C w bloku grzejnym wirówki.

Gotowaną macierz powinowactwa inkubowano z żywicą przez dwie minuty przy 10 000. GS. Alikwot 5 µL supernatantu przeznaczono do immunoblokkingu i naniesiono wraz z innymi frakcjami na żel SDS-PAGE o długości 10 cm w celu rozdzielenia i identyfikacji białek fosforylowanych za pomocą spektrometrii mas.

Nanieś pozostałe 45 µL na żel do elektroforezy SDS-PAGE. Żel SDS-PAGE zabarw barwnikiem colloidal Coomassie brilliant blue. Następnie odbarw żel, płukając go obficie wodą, najlepiej przez całą noc.

Następnie, używając czystego skalpela, wycinamy z żelu interesujący nas prążek, dzielimy plaster żelu na kostki o wymiarach od dwóch do czterech milimetrów i przenosimy próbkę do probówki. Fragmenty żelu przemywamy 50% acetonitrylem i 50 mM wodorowęglanem amonu aż do całkowitego odbarwienia. Następnie odsysamy roztwór pipetą.

Należy uważać, aby nie usunąć fragmentów żelu. Próbkę odwadżamy w 100% acetonitrylu przez pięć minut, a następnie usuwamy wolny płyn. Następnie, aby zredukować mostki dwusiarczkowe białek, dodajemy 10 mM DTT i inkubujemy przez 30 do 45 minut w 56 °C przy potrząsaniu; po tym czasie usuwamy wolny płyn w celu alkilowania reszt cysteiny.

Dodaj 55 millimolarny chloroacetamid i inkubuj przez 20 do 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Odlej wolny płyn, a następnie przemyj fragmenty żelu dwukrotnie 50% acetonitylem przez 10 minut. Odlej wolny płyn.

Następnie odwodnij fragmenty żelu w 100% acetonitrylu przez pięć minut i usuń wolny płyn przed trawieniem metodą Triptych Digest. Dodając 40 µL roztworu roboczego trypsyny, pozwól fragmentom żelu rehydratować przez 10 minut w ilości buforu do trawienia wystarczającej do przykrycia fragmentów żelu. Inkubuj w temperaturze 37 °C przez noc. Aby zatrzymać trawienie i wyekstrahować peptydy z fragmentów żelu, zastosuj 5% kwas formowy i poddaj próbki sonikacji przez od pięciu do 10 minut.

Następnie przenieś supernatant do nowej probówki, wysusz peptydy poprzez liofilizację lub za pomocą koncentratora próżniowego i przechowuj próbki w temperaturze -20 °C. W tym eksperymencie oczyszczono kompleks kinazy P-R-F-P-T-O z nacoa hamana; transgeniczne NACOA hamana wykazujące ekspresję 35 SPTO zostało przejściowo przekształcone za pomocą 35 SPRF flag, a kompleks wytrącono immunologicznie przy użyciu przeciwciała Anti-Flag M two aros. Immunobloty obrazują efektywne wytrącanie immunologiczne docelowego białka PRF, przy czym zarówno PTO, jak i oddziałujące białko efektorowe zostały współoczyszczone z PRF, co potwierdzono w analizie z wykorzystaniem przeciwciał oraz spektrometrii mas.

W tym przypadku strategia polegała na ukierunkowaniu przeciwciałem Anti-Flag na białko PTO. Strategię zmieniono w celu zidentyfikowania miejsc fosforylacji PTO.

Całkowita ilość białka PTO, obejmująca zarówno kompleks PRF, jak i formę wolną, została immunoprecypitowana przeciwciałami Anti-Flag M2, a następnie poddana frakcjonowaniu w metodzie SDS-PAGE, trawieniu trypsyną w żelu oraz analizie spektrometrią mas, co pozwoliło na zidentyfikowanie peptydów PTO obejmujących około 80% jego sekwencji. Co ciekawe, zidentyfikowano zestaw pojedynczych miejsc fosforylacji dla peptydów PTO. Należy zauważyć, że podwójne miejsca fosforylacji zidentyfikowano wyłącznie w obecności białek efektorowych.

Ważne jest uzyskanie odpowiedniej ilości białka roślinnego, aby zidentyfikować składniki kompleksu białkowego oraz wykryć modyfikacje potranslacyjne białka będącego przedmiotem zainteresowania. Należy pamiętać, że mapowanie modyfikacji, takich jak fosforylacja, wymaga odpowiedniej ilości białka do analizy spektrometrią mas, zatem po zastosowaniu tej procedury na żelu powinna być widoczna przynajmniej słaba prążka. Można zastosować inne metody, takie jak identyfikacja składników kompleksu, w celu odpowiedzi na dodatkowe pytania, np. w jaki sposób aktywacja kompleksu immunologicznego prowadzi do odporności funkcjonalnej.

Pamiętaj, że praca z buforami organicznymi, bakteriami i ostrzami BBL może być niezwykle niebezpieczna, dlatego należy zachować środki ostrożności, takie jak noszenie rękawiczek i fartuchów laboratoryjnych.