Name: Identyfikacja modyfikacji potranslacyjnych kompleksów białek roślinnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: Poznaj metodę identyfikacji modyfikacji potranslacyjnych w kompleksach białek roślinnych z wykorzystaniem spektrometrii masowej. Technika ta umożliwia badanie fosforylacji i interakcji białkowych w roślinach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

VN jest wspierany przez Towarzystwo Królewskie. JPR jest członkiem Australijskiej Rady ds. Badań Naukowych (FT0992129). Dziękujemy dr Miriam Gifford za krytyczną lekturę manuskryptu.

Uwaga: wszystkie kroki są wykonywane w temperaturze pokojowej, chyba że zaznaczono inaczej.
1. Przygotowanie materiałów roślinnych i
<ol>
	<li>Dla N. benthamiana
	<ol>
		<li>Hodować szczepy Agrobacterium tumefaciens będące przedmiotem zainteresowania do przejściowej ekspresji (w tym przykładzie Prf-FLAG, Prf-3xHA, Pto-FLAG i pusty wektor jako kontrola) przez wytrząsanie (200 obr./min) w płynnej kulturze (pożywka L z odpowiednimi antybiotykami) w temperaturze 28 °C do fazy stacjonarnej.</li>
		<li>Zebrać i ogranulować agrobakterie przez odwirowanie (3 000 x g przez 5 min). Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić granulowane agrobakterie w buforze infiltracyjnym.</li>
		<li>Zmierzyć ilość agrobakterii, uzyskując wartość gęstości optycznej (OD) przy absorbancji 600 nm (Abs 600 nm). Dostosuj OD bakterii do 0,1-0,8.</li>
		<li>Naciekać 4-tygodniowe rośliny N. benthamiana (22 °C, 16 godzin światła) agrobakteriami ręcznie (za pomocą 1 ml strzykawki bezigłowej) lub próżniowo (dodać 0,02% v/v środka powierzchniowo czynnego). 
		Uwaga: Użyj pierwszego, prawie w pełni rozwiniętego liścia i dwóch bezpośrednio starszych liści, aby uzyskać najbardziej efektywną ekspresję białka. W celu wykrycia ubikwitynowanych lub acetylowanych białek należy naciekać liście odpowiednio 100 nM MG-132 lub 100 ng/ml Trichostatyny A po 1 i 2 dniach od infiltracji.</li>
		<li>Zbierz infiltrowane liście 2-5 dni po infiltracji i zamroź w ciekłym azocie. Próbki należy przechowywać w zamrażarce o temperaturze -80 °C. 
		Uwaga: Określ wcześniej najlepszy poziom ekspresji białka, które Cię interesuje, pobierając próbki w ciągu 5 dni i wykrywając poziomy białka za pomocą immunoblottingu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dla stabilnych linii transgenicznych A. thaliana
	<ol>
		<li>Nasiona A. thaliana uprawiać na 6-dołkowych płytkach uzupełnionych 5 ml płynnego podłoża MS (1% w/v sacharozy) na dołek. Umieść od trzech do pięciu nasion (wysterylizowanych i rozwarstwionych) interesującej nas linii transgenicznej lub nieprzekształconej linii kontrolnej na studzienkę. Wstrząsać z prędkością 200 obr./min przez dwa dni przed przeniesieniem płytki do pomieszczenia wzrostowego i pozostawić na 2 tygodnie (22 °C, 10 godzin światła).</li>
		<li>Pobrać próbki i zamrozić w ciekłym azocie. 
		Uwaga: Możesz użyć jako kontroli linii transgenicznej wyrażającej niepowiązane białko z tym samym znacznikiem, co białko będące przedmiotem zainteresowania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>
	<ol>
		<li>Przygotować bufor A. Odgazować bufor przez 1-2 godziny (dla RLK, innych białek związanych z błoną i białek jądrowych dodać 1% v/v IGEPAL CA-63053). 
		Uwaga: Bufor A można przechowywać w temperaturze 4 °C przez czas nieokreślony. Możesz użyć 1% v/v Triton zamiast IGEPAL CA-360.</li>
		<li>Przygotować 80 ml zimnego buforu B co najmniej 1-2 godziny przed ekstrakcją. 
		Uwaga: Idealny stosunek buforu tkankowego do ekstrakcyjnego wynosi 1:4 (w/v).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Ekstrakcja białka
<ol>
	<li>Tuż przed ekstrakcją przygotować 80 ml zimnego buforu C. 
	Uwaga: Dodać 10 μM MG-132 w celu wykrycia ubikwitynowanych białek.</li>
	<li>Zmielić 20 g tkanki N. benthamiana (około 15 liści) lub siewek A. thaliana (2-4 g na płytkę 6-dołkową) w ciekłym azocie za pomocą moździerza i tłuczka.</li>
	<li>Dodać 80 ml zimnego buforu C do 20 g zmielonej tkanki, dobrze wymieszać i rozmrozić na lodzie. 
	Uwaga: Zmielić wszystkie próbki w tym samym czasie (białko będące przedmiotem zainteresowania i kontrolne).</li>
	<li>Homogenizować w 3 seriach po 10 sekund każdy z pełną prędkością za pomocą homogenizatora tkankowego (wstępnie schłodzonego w temperaturze 4 °C). Przefiltrować przez tkankę o wielkości 22-25 μm i odwirować przy 30 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C. 
	Uwaga: Alternatywnie homogenizować ze świeżym, wstępnie schłodzonym moździerzem i tłuczkiem.</li>
	<li>Do etapów blokowania i przemywania matrycy powinowactwa przygotować 20 ml buforu D.</li>
	<li>Umieścić 100 ml odpowiedniej matrycy powinowactwa przy użyciu 500 ml zimnego buforu D zawierającego 1 % masy ciała przez 5 minut w temperaturze 4 °C. 
	Uwaga: Preferowane matryce powinowactwa obejmują agarozę anty-FLAG M2, agarozę streptawidyny, GFP-Trap_A i agarozę anty-HA.</li>
	<li>Przemyć 3x 1 ml zimnego buforu D.</li>
	<li>Usunąć supernatant ekstraktu z liści i przefiltrować przez filtr strzykawkowy 0,45 μm do nowej probówki na lodzie. 
	Uwaga: Kolor ekstraktu powinien być zielony lub żółty; Jeśli próbka zmieniła kolor na brązowy, należy ją wyrzucić i zacząć od nowa.</li>
	<li>Pobrać podwielokrotność surowego ekstraktu do immunoblotu, dodać 5x bufor ładujący SDS-PAGE, odwirować i zdenaturować przez gotowanie próbek przez 10 minut w temperaturze 80-100 °C w bloku grzewczym.</li>
</ol>
3. Immunoprecypitacja białek
<ol>
	<li>Podzielić ekstrakt białkowy na dwie probówki o pojemności 50 ml i dodać 50 μl matrycy powinowactwa zawieszonej w buforze D do każdej probówki. Inkubować z delikatnymi obrotami przez 2 godziny w temperaturze 4 °C. 
	Uwaga: Nie stwierdzono, aby dłuższe inkubacje zwiększały plony.</li>
	<li>Przygotować 600 μl (6x objętość kulki matrycy powinowactwa) buforu elucyjnego, dodając do buforu D (stężenia końcowe): 0,5% BSA, 0,25 mg/ml peptydu FLAG (dla agarozy anty-FLAG M2) lub 10 mM D-biotyny (dla agarozy Streptawidyny). 
	Uwaga: Elucja nie jest zalecana w przypadku matryc GFP-Trap_A i anty-HA, dlatego należy przejść bezpośrednio do wrzenia w buforze ładującym 1x SDS-PAGE, krok 3.11.</li>
	<li>Wytrącić matrycę powinowactwa przez odwirowanie w temperaturze 4 °C (5 min przy 1 000 x g).</li>
	<li>Pobrać porcję niezwiązanego ekstraktu na immunoblot, odrzucić resztę supernatantu, pozostawiając około 500 μl na dnie probówki.</li>
	<li>Ponownie zawiesić roztwór gnojowicy za pomocą końcówki o szerokim otworze.</li>
	<li>Przenieść zmieszany roztwór zawiesiny z obu probówek do jednej probówki o pojemności 1,5 ml. 
	Uwaga: Od teraz używaj 1,5 ml niskobiałkowych probówek do mikrofuge.</li>
	<li>Pulsować 3x przez 5 sekund za pomocą wirówki stołowej, aby wytrącić matrycę powinowactwa i usunąć supernatant.</li>
	<li>Przemyć 3-5x 1 ml zimnego buforu D. Pomiędzy płukaniami wytrysnąć matrycę powinowactwa zgodnie z wcześniejszym opisem i wyrzucić supernatant. W ostatnim praniu usuń nadmiar buforu D za pomocą igły strzykawki. 
	Uwaga: Końcowe płukanie przy użyciu buforu D z 0,1% IGEPAL może być użyte w celu dalszego zmniejszenia niespecyficznego wiązania.</li>
	<li>Eluować za pomocą 200 μl odpowiedniego buforu elucyjnego (dla agarozy anty-FLAG M2 lub streptawidyny, patrz krok 3.2) 3x, 5 minut za każdym razem, przy ciągłym wstrząsaniu.</li>
	<li>Połącz 3 eluaty w jednej probówce. Zagęść białka za pomocą 30 μl żywicy absorpcyjnej. Odstawić na 5 minut i wytrącić żywicę (2 minuty przy 10 000 x g). Odrzucić supernatant. 
	Uwaga: W przypadku GFP-Trap_A i agarozy anty-HA należy pominąć kroki 3.9 i 3.10.</li>
	<li>Dodać 50 μl 1x bufora ładującego SDS-PAGE do wytrąconej matrycy powinowactwa lub żywicy absorpcyjnej. Wirować i gotować przez 10 minut w temperaturze 80-100 °C w bloku grzewczym.</li>
	<li>Odwirować gotowaną matrycę powinowactwa lub żywicę przez 2 minuty przy 10 000 x g. Podwielokrotność 5 μl supernatantu do immunoblot i przeprowadzić z innymi frakcjami na żel SDS-PAGE o długości ~10 cm (ryc. 2).</li>
	<li>W celu separacji i identyfikacji fosforylowanych białek za pomocą spektrometrii mas, pozostałe 45 μl należy załadować na żel SDS-PAGE o długości ~19 cm, jeśli wymagana jest dodatkowa separacja (Rysunek 2). 
	Uwaga: Między wszystkimi próbkami można umieścić pusty pas ruchu, aby zmniejszyć zanieczyszczenie próbek.</li>
</ol>
4. Trawienie białek
<ol>
	<li>Zabarwić żel SDS-PAGE koloidalną plamą Coomassie Brilliant Blue (cCBB). 
	Uwaga: Zminimalizuj obchodzenie się z żelem, aby zmniejszyć zanieczyszczenie keratynami. Upewnij się, że żaden ze sprzętów ani narzędzi nie był używany do immunoblottingu lub innych czynności, które mogły pozostawić resztkowe zanieczyszczenie białkami.</li>
	<li>Odplamić żel przez obfite mycie w wodzie, najlepiej O/N. Odetnij interesujący nas pasek od żelu czystą żyletką. 
	Uwaga: W razie potrzeby wyrównaj żel z immunoblotem, aby zlokalizować właściwy obszar. Ponieważ fosforylacja może opóźnić migrację białek na SDS-PAGE, należy przeciąć obszar bezpośrednio powyżej i poniżej pasma zainteresowania.</li>
	<li>Plasterek żelu pokrój w kostkę o grubości 2-4 mm (gwarantuje to, że żel zostanie pokryty roztworami w tubce bez zatykania końcówek pipet). Umieść w tubie.</li>
	<li>Oszacuj objętość potrzebną do utrzymania żelu w głębokim zanurzeniu. Użyj tej ilości do derywatyzacji, inkubacji z ekstrakcją proteazy i peptydów, a następnie użyj podwójnej lub potrójnej objętości do mycia. 
	Uwaga: W typowym trawieniu zawierającym około 100 μl pociętych kawałków żelu należy użyć 500 μl roztworu do przemycia, 2 x 180 μl do odwodnienia, 150 μl do redukcji, 120 μl do alkilacji i 120 μl do trawienia.</li>
	<li>Umyj kawałki żelu 2 x 20 minut (lub do momentu odbarwienia), dodając 50% acetonitrylu (w 50 mM wodorowęglanu amonu, ABC). Odpipetować roztwór, uważając, aby nie usunąć kawałków żelu.</li>
	<li>Odwodnić 100% acetonitrylem przez 5 minut i usunąć wolny płyn. 
	Uwaga: Żel powinien wydawać się skurczony i biały. Jeśli niebieski kolor utrzymuje się, należy inkubować dłużej w acetonitrylu/ABC i/lub w podwyższonej temperaturze (45-55 °C).</li>
	<li>Zredukuj wiązania dwusiarczkowe białek, dodając 10 mM DTT do wody i inkubuj przez 30-45 minut w temperaturze 56 ºC z wytrząsaniem. Usuń wolny płyn.</li>
	<li>Reszty alkilatowo-cysteinowe przez dodanie 55 mM chloroacetamidu (w 50 mM ABC) przez 20-30 min (temperatura pokojowa, ciemność). Usuń wolny płyn.</li>
	<li>Umyj kawałki żelu 2 x 10 min z 50% acetonitrylem (w 50 mM ABC). Usuń wolny płyn.</li>
	<li>Odwodnić kawałki żelu 100% acetonitrylem przez 5 minut i usunąć wolny płyn.</li>
	<li>Do trawienia tryptycznego dodać 40 μl roztworu roboczego trypsyny (100 ng trypsyny w buforze wytrawiającym: 50 mM ABC, 5% acetonitrylu dla przeciętnego pasma barwionego Coomassie). Pozostaw kawałki żelu do nawodnienia przez 10 minut. Dodać tyle buforu wytrawiającego, aby w razie potrzeby pokryć kawałki żelu. Inkubować w temperaturze 37 °C O/N.</li>
	<li>Aby zatrzymać trawienie i wyekstrahować peptydy z kawałków żelu, dodaj 5% kwasu mrówkowego (w 50% acetonitrylu) (dodaj taką samą objętość jak objętość trawienia). Sonikacja przez 5-10 minut. Przenieść supernatant do nowej probówki. Powtórz ekstrakcję 3 razy.</li>
	<li>Wysuszyć peptydy przez liofilizację (preferowane) lub koncentrator próżniowy (taki jak Speed-Vac lub Savant). Przechowywać w temperaturze -20 ºC.</li>
	<li>Prześlij próbkę do spektrometrii mas. 
	Uwaga: Przesłaliśmy naszą próbkę do zakładu spektrometrii mas w The Sainsbury Laboratory (Norwich, Wielka Brytania). Protokoły w obiektach spektrometrii mas różnią się znacznie, ale zazwyczaj peptydy są rozpuszczone w 0,2% kwasie trifluorooctowym z 2% acetonitrylem przed załadowaniem do systemu chromatografii cieczowej sprzężonego z tandemową spektrometrią mas z elektrorozpylaniem.</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów (finansowych lub innych).

Wyjaśnienie mechanizmu aktywacji receptorów przez PAMP i efektory może w znacznym stopniu przyczynić się do naszego zrozumienia odporności roślin. W ciągu ostatnich 20 lat badania genetyczne i dwuhybrydowe drożdży odegrały zasadniczą rolę w odkryciu białek PRR i NB-LRR. Niedawno ustanowiono protokoły oparte na spektrometrii mas do identyfikacji białek regulowanych w różny sposób podczas sygnalizacji immunologicznej55-58, ich PTM11,33,59,60, składu kompleksów immunologicznych61 i celów efektorowych62. W tym miejscu opisujemy prosty protokół identyfikacji PTM regulujących aktywację kompleksów immunologicznych.
W porównaniu z poprzednio opisanymi protokołami, protokół ten pozwala na szczegółową identyfikację dynamicznych zmian PTM. Protokoły wielkoskalowych podejść proteomicznych mogą identyfikować PTM białek, ale nie są w stanie ujawnić plastyczności PTM ze względu na ograniczoną ilość białka. W przypadku fosforylacji białek, podejścia proteomiczne na dużą skalę zazwyczaj identyfikują tylko dominujące miejsca fosforylacji11,33,59. Szczegółowa charakterystyka stanu fosforylacji białka wymaga znacznej ilości białka, którą można uzyskać tylko poprzez częściowe oczyszczenie białka docelowego47. Opisany tutaj protokół łączy podejście do oczyszczania białka, które daje znaczną ilość białka docelowego, z analizą spektrometrii mas oczyszczonego białka. Zgodnie z tym protokołem, pojedyncze zdarzenie fosforylacji Pto przypisano głównie Ser-198, jak opisano wcześniej52 , ale niektóre widma spektrometrii mas również wspierały pojedyncze zdarzenie fosforylacji na Thr-195 lub Thr-199. Gdy zaobserwowano zdarzenia podwójnej fosforylacji Pto, dominującą kombinacją fosforylowanych aminokwasów były Ser-198 i Thr-199, chociaż zaobserwowano również kombinacje w innych miejscach (Tabela 1). Wyniki te wyraźnie pokazują plastyczność miejsc fosforylacji kinaz białkowych oraz zdolność opisanego protokołu do szczegółowego scharakteryzowania wszystkich możliwych miejsc fosforylacji.
Najważniejszymi etapami tego protokołu są: 1) wystarczająca ekstrakcja białek; 2) ochrona PTM; oraz 3) wystarczająca ilość białka docelowego. Po pierwsze, aby uzyskać wystarczającą ekstrakcję białek, ważne jest, aby zmielić tkankę w ciekłym azocie, a następnie użyć homogenizatora tkankowego, jak opisano w protokole. Jeśli homogenizator tkankowy nie jest dostępny, można użyć moździerza i tłuczka. Ważne jest również, aby stosować stosunek jednego do trzech (lub czterech) gramów tkanki do objętości buforu ekstrakcyjnego. Ten stosunek tkanki do buforu i sugerowany przez nas bufor o wysokiej mocy zapewnią, że pH pozostanie neutralne podczas procesu ekstrakcji. Stwierdziliśmy, że ma to szczególne znaczenie w przypadku ekstrakcji A. thaliana i pomidorów52. Ochronę PTM można osiągnąć poprzez włączenie do wszystkich odpowiednich inhibitorów enzymów, które mogą usuwać PTM. Bardzo ważne jest również wykonanie wszystkich etapów w temperaturze 4 °C oraz wstępne schłodzenie i urządzeń. Wyższe plony białka docelowego można osiągnąć poprzez wykorzystanie roślin wykazujących ekspresję białka w wystarczających ilościach oraz poprzez użycie dużej ilości tkanki (około 20 g). Najważniejszym krokiem do uzyskania wystarczającej ilości białka docelowego jest zagęszczenie białka docelowego poprzez bezpośrednie immunoprecypitację. Znaczenie tego kroku podkreśla fakt, że nie udało nam się zidentyfikować PTM Pto po immunoprecypitacji Prf ze względu na ograniczoną ilość koimmunoprecypitowanego Pto (Figura 2B). W przeciwieństwie do tego, bezpośrednia immunoprecypitacja PTO dała znacznie bardziej mierzalne peptydy (Figura 2C), co doprowadziło do około 80% pokrycia sekwencji białka i identyfikacji PTM (Tabela 1). Zdecydowanie zalecamy również stosowanie znaczników epitopowych do immunoprecypitacji białek. W porównaniu z przeciwciałami wyniesionymi przeciwko białkom natywnym, matryca powinowactwa epitopów-znaczników może dać większe ilości częściowo oczyszczonego białka. Używając przeciwciała wyhodowanego przeciwko natywnemu białkuPto 51 (Figura 2A) do immunoprecypitacji, byliśmy w stanie zidentyfikować tylko pojedynczą fosforylację dwóch dominujących miejsc fosforylacji Pto.
Protokół ten został opracowany przede wszystkim w celu częściowego oczyszczenia białka cytoplazmatycznego N. benthamiana i późniejszej identyfikacji ich miejsc fosforylacji. Jednak korzystając z opisanych tutaj modyfikacji, protokół ten można łatwo dostosować do białek A. thaliana i białek związanych z błoną. Głównym celem tego protokołu jest uzyskanie wystarczającej ilości białka docelowego do identyfikacji PTM, a nie osiągnięcie najwyższej czystości kompleksu. Jeżeli wymagana jest wyższa czystość kompleksu, do niniejszego protokołu52 można dodać drugi etap oczyszczania. W takim przypadku pierwszy etap pozwoli na elucję białka docelowego z matrycy powinowactwa bez użycia wysokich soli lub kwasów, a kolejny etap może pociągać za sobą matrycę, która wymaga trudnych warunków elucji. Należy podkreślić, że przetestowaliśmy ten protokół tylko pod kątem identyfikacji miejsc fosforylacji i że obecnie testujemy jego zdolność do szczegółowej identyfikacji dodatkowych PTM.
Nasze reprezentatywne wyniki wyraźnie pokazują plastyczność miejsc fosforylacji kinaz białkowych oraz zdolność opisanego protokołu do charakteryzowania miejsc fosforylacji. Co najważniejsze, podkreślają, że identyfikacja miejsc fosforylacji zależnych od małej ilości białek za pomocą spektrometrii mas i jednopunktowych mutacji miejsc autofosforylacji może dać mylące wyniki. Pokazujemy tutaj i poprzednio47 , że podwójna fosforylacja Pto na Ser-198 i Thr-199 jest związana z aktywacją kompleksu Prf / Pto. W przeciwieństwie do tego, wcześniej opublikowane wyniki47,63 wykazały, że jednopunktowe mutacje Ser-198 i Thr-199 do alaniny, które zapobiegają fosforylacji w tych miejscach, są zdolne do sygnalizowania sugerującego, że fosforylacja tych miejsc nie jest warunkiem wstępnym złożonej aktywacji. Wyniki te można teraz wyjaśnić fosforylacją miejsca wtórnego Thr-195. Podobny wgląd w plastyczność miejsca fosforylacji innych kinaz białkowych można uzyskać po zastosowaniu tego protokołu. Co więcej, podejście łączone wykorzystujące miejsca fosforylacji, mutacje punktowe, białka, które mogą hamować określone kinazy (efektory), w połączeniu z immunoprecypitacją białek i analizą spektrometrii mas, doprowadzi do lepszego zrozumienia ewolucyjnego znaczenia plastyczności miejsc fosforylacji kinaz białkowych.

Szlaki immunologiczne polegają na różnych modyfikacjach potranslacyjnych (PTM) białek, aby szybko transdukować sygnały i aktywować odpowiedzi immunologiczne1. PTM to szybkie, odwracalne i wysoce specyficzne zmiany chemiczne w strukturze białka, które mogą wpływać na konformację, aktywność, stabilność, lokalizację i interakcje białko-białko2-4. W roślinach zidentyfikowano ponad 300 typów PTM, w tym ubikwitynację, sumoilację, siarczanowanie, glikozylację i fosforylację2,5. Coraz więcej dowodów wskazuje na znaczenie PTM w różnych aspektach odporności roślin1,5,6. Fosforylacja białek, odwracalne przyłączanie grupy fosforanowej do reszty seryny, treoniny lub tyrozyny, jest regulatorem wielu funkcji komórkowych i nie jest zaskoczeniem, że jest to najlepiej zbadany PTM w kaskadach sygnalizacji obrony roślin5-11. Sygnalizacja zależna od fosforylacji jest integralną częścią aktywacji obronnej roślin inicjowanej po zewnątrzkomórkowym postrzeganiu drobnoustrojów przez receptory transbłonowe lub rozpoznawaniu wewnątrzkomórkowym przez wielodomenowe białka oporności5,8.
Po inwazji na rośliny, mikroby są wykrywane przez receptory błony plazmatycznej zwane receptorami rozpoznawania wzorców (PRR)12. Znane PRR to albo białka podobne do receptorów (RLP), albo kinazy receptoropodobne (RLK), z których oba zawierają ektodomenę wiążącą ligand i jednoprzebiegową domenę transbłonową. W przeciwieństwie do RLP, RLK mają wewnątrzkomórkową domenę kinazy13-15. Ektodomena PRR wiąże się z konserwatywnymi cząsteczkami elicytorowymi drobnoustrojów zwanymi wzorcami molekularnymi związanymi z patogenami (PAMP), co w przypadku RLK prowadzi do autofosforylacji i transfosforylacji w obrębie domeny wewnątrzkomórkowej 6,16. Po indukowanej percepcją fosforylacji PRR, późniejsza fosforylacja białek cytoplazmatycznych, w tym kinaz17,18, ligaz E319, kinaz białkowych aktywowanych mitogenem (MAPK)20,21, kinaz białkowych zależnych od wapnia (CDPK)22,23 i czynników transkrypcyjnych24,25, prowadzi do odporności wyzwalanej przez PAMP (PTI).
Oprócz zewnątrzkomórkowej percepcji przez PRR, wewnątrzkomórkowe rozpoznawanie patogenów odbywa się poprzez receptory cytoplazmatyczne. Te wielodomenowe białka oporności (R) zawierają zmienną domenę N-końcową, centralny motyw wiążący nukleotydy (NB) i C-końcowe powtórzenia bogate w leucynę (LRR), a zatem nazywane białkami NB-LRR26,27. Białka R bezpośrednio lub pośrednio rozpoznają cząsteczki wirulencji pochodzące z patogenu, zwane efektorami, o których wiadomo również, że celują w PRR i inne węzły układu odpornościowego. Rozpoznanie indukuje silne mechanizmy obronne prowadzące do odporności wyzwalanej efektorowo (ETI)28-31. Białka NB-LRR mają niezbędny motyw wiążący ATP w domenie NB30,32, ale brakuje im domeny kinazy. Fosforylacja konserwatywnych domen NB-LRR została opisana w zakrojonym na szeroką skalę badaniu proteomicznym33, ale jej znaczenie dla ETI jest niejasne. Podobnie jak w przypadku PTI, aktywacja białek NB-LRR prowadzi do fosforylacji białek cytoplazmatycznych, w tym MAPK34-37 i CDPK38-40. Co najważniejsze, rozpoznawanie efektorów może prowadzić do fosforylacji białek dodatkowych, które oddziałują bezpośrednio z białkami NB-LRR41. Niektóre przykłady obejmują białka RIN4 (Arabidopsis thaliana) i Pto (pomidor, Solanum lycopersicum), które oddziałują z białkami NB-LRR, odpowiednio RPM142,43 i Prf44. Podczas zakażenia bakteriami Pseudomonas syringae białko efektorowe AvrB indukuje fosforylację RIN4, najprawdopodobniej przez receptoropodobną kinazę RIPK45,46. Podobnie w pomidorach efektory P. syringae AvrPto i AvrPtoB indukują fosforylację Pto47. W przeciwieństwie do RIN4, który nie ma domeny kinazy i musi być transfosforylowany, Pto jest aktywną kinazą zdolną do autofosforylacji48 i transfosforylacji substratów 49,50. Podczas gdy Pto wymaga aktywności kinazy do zależnej od efektora inicjacji sygnalizacji, mutanty Pto martwe w kinazie są nadal w stanie sygnalizować w sposób niezależny od efektora51. Niedawno wyjaśniliśmy te obserwacje, wykazując, że kompleks Prf / Pto jest oligomeryczny, zawiera wiele cząsteczek Prf i Pto52 i że cząsteczki Pto w tym samym kompleksie mogą się nawzajem transfosforylować47. Zaproponowaliśmy model, w którym jedna cząsteczka Pto (czujnika) oddziałuje z białkiem efektorowym, powodując zmianę konformacji białka NB-LRR (Prf), która z kolei aktywuje drugą cząsteczkę Pto (pomocnik) w kompleksie. Następnie cząsteczka pomocniczego Wom transfosforyluje czujnik Pto, prowadząc do pełnej aktywacji kompleksu oporowego47.
Te przykłady pokazują, że identyfikacja składników kompleksu immunologicznego i ich potencjalnych PTM po rozpoznaniu efektora może prowadzić do lepszego zrozumienia, w jaki sposób sygnały są przekazywane od percepcji efektora do dalszych celów. W tym miejscu opisujemy metodę oczyszczania białek oddziałujących z NB-LRR i późniejszą identyfikację ich PTM. Jako modelu używamy Nicotiana benthamiana i kompleksu Prf/Pto pomidora, ale ten sam protokół można łatwo zastosować do RLK z N. benthamiana i A. thaliana53 z niewielkimi modyfikacjami, jak opisujemy w protokole.

<table><tbody><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>Sigma</td><td>M8250</td><td></td></tr><tr><td>Acetosyringone</td><td>Sigma</td><td>D134406</td><td>toksyczny - 1 M zapas w</td></tr><tr><td>strzykawce DMSO 1 ml sterylna</td> igła do strzykawki <td>Terumo Terumo</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>NN-2525R</td><td></td></tr><tr><td>Silwet L-77 (środek powierzchniowo czynny)</td><td>Lehle Seeds</td><td>VIS-01</td><td>toksyczny</td></tr><tr><td>MG-132 (Z-Leu-Leu-Leu-al)</td><td>Sigma</td><td>C2211</td><td>1 M zapas w DMSO, przechowywać w temperaturze -80 &deg; C</td></tr><tr><td>Sole MS</td><td>Sigma</td><td>M5524</td><td>utleniające, toksyczne</td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma</td><td>16104</td><td></td></tr><tr><td>Baza Trizma</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td>dostosuj pH za pomocą 1 N HCl, aby uzyskać 1 M bufor Tris-HCl</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S3014</td><td>5 M zapas</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E6758</td><td>toksyczny - 0,5 M zapas</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>National Diagnostics</td><td>EC-606</td><td></td></tr><tr><td>IGEPAL CA-630</td><td>Sigma</td><td>I8896</td><td></td></tr><tr><td>PVPP (poliwinylopolipirolidon)</td><td>Sigma</td><td>P5288</td><td>nie mylić z PVP</td></tr><tr><td>DTT (DL-dithiothreitol)</td><td>Sigma</td><td>43815</td><td>toksyczny - 1 M zapas, przechowywać w temperaturze -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Koktajl inhibitorów proteazy roślinnej</td><td>Sigma</td><td>P9599</td><td>nie zamrażać/rozmrażać zbyt wiele razy</td></tr><tr><td>PMSF (fluorek fenylometylosulfonylu)</td><td>Sigma</td><td>P7626</td><td>, toksyczne</td></tr><tr><td>Technologia sygnalizacji komórkowej</td><td>kalikuliny A</td><td>9902</td><td></td></tr><tr><td>Fluorek sodu (NaF)</td><td>Sigma</td><td>S7920</td><td>toksyczny - 1 M zapas</td></tr><tr><td>Molibdenian sodu (Na2MoO4)</td><td>Sigma</td><td>S6646</td><td>0,5 M zapas</td></tr><tr><td>Ortowanadan sodu (Na3VO4)</td><td>Sigma</td><td>450243</td><td>toksyczna - Przygotuj 200 mM roztwór ortowanadanu sodu. Doprowadzić pH do 10,0 za pomocą 1 N NaOH lub 1 N HCl. Początkowe pH roztworu ortowanadatu sodu może się różnić w zależności od dużej ilości substancji chemicznej. Przy pH 10,0 roztwór będzie żółty. Gotuj roztwór, aż stanie się bezbarwny (około 10 min). Schłodzić do temperatury pokojowej. Ponownie ustaw pH na 10,0 i powtarzaj kroki 3 i 4, aż roztwór pozostanie bezbarwny, a pH ustabilizuje się na poziomie 10,0.</td></tr><tr><td>Kwas okadaikowy</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-3513</td><td></td></tr><tr><td>Homogenizator tkankowy Kinematica Polytron</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-451-320</td><td></td></tr><tr><td>Miracloth</td><td>Merck Millipore</td><td>475855-1R</td><td></td></tr><tr><td>anty-FLAG M2 agaroza</td><td>Sigma</td><td>A2220</td><td>ta matryca jest zalecana</td></tr><tr><td>Streptawidyna-agaroza</td><td>Thermo-Scientific</td><td>20347</td><td>to zalecana matryca</td></tr><tr><td>GFP-Trap_A</td><td>Chromotek</td><td>gta-20</td><td>ta matryca jest zalecana</td></tr><tr><td>Anty-HA-Agaroza</td><td>Sigma</td><td>A2095</td><td>ta matryca jest zalecana</td></tr><tr><td>0,45 &mu; m filtr</td><td>VWR</td><td>513-1902</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>FLAG peptyd</td><td>Sigma</td><td>F3290</td><td></td></tr><tr><td>D-biotyna</td><td>Sigma</td><td>47868</td><td></td></tr><tr><td>Żywica StrataClean</td><td>Agilent</td><td>400714</td><td>ta żywica absorpcyjna jest zalecana do wytrącania białek</td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Tetra Cell</td><td>Biorad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PROTEAN II XL Cell</td><td>Biorad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SimplyBlue SafeStain</td><td>Invitrogen</td><td>LC6060</td><td>ta plama jest zalecana</td></tr><tr><td>Probówki o niskim poziomie wiązania białka (LoBind)</td><td>Eppendorf</td><td>0030 108.116</td><td>te probówki są zalecane</td></tr><tr><td>Wodorowęglan amonu (ABC)</td><td>Sigma</td><td>9830</td><td>toksyczny</td></tr><tr><td>Acetonitryl</td><td>VWR</td><td>83639</td><td>toksyczny, łatwopalny</td></tr><tr><td>2-chloroacetamid</td><td>Sigma</td><td>22790</td><td>toksyczna</td></tr><tr><td>trypsyna</td><td>Promega</td><td>V5280</td><td>drażniący, uczulający</td></tr><tr><td>Kwas mrówkowy</td><td>Sigma</td><td>14265</td><td>toksyczny,</td></tr><tr><td>Sonikator do kąpieli wodnej</td><td>Ultravawe</td><td>Ultra BT Kąpiel</td><td></td>ultradźwiękowa</tr><tr><td>LTQ-Orbitrap XL</td><td>Thermo-Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trichostatyna A</td><td>Sigma</td><td>T8552</td><td>toksyczny</td></tr></tbody></table>

identyfikacja modyfikacji potranslacyjnych kompleksów białek roślinnych

Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

Rośliny szybko dostosowują się do zmieniającego się środowiska dzięki rozbudowanym systemom percepcji i sygnalizacji. Podczas ataku patogenu rośliny szybko reagują na infekcję poprzez rekrutację i aktywację kompleksów immunologicznych. Aktywacja kompleksów immunologicznych jest związana z modyfikacjami potranslacyjnymi (PTM) białek, takimi jak fosforylacja, glikozylacja lub ubikwitynacja. Zrozumienie, w jaki sposób choreografia tych PTM jest choreograficzna, doprowadzi do lepszego zrozumienia, w jaki sposób osiąga się opór.
Tutaj opisujemy metodę oczyszczania białek dla białek oddziałujących z wiązaniem nukleotydów bogatych w leucynę (NB-LRR) i późniejszą identyfikację ich modyfikacji potranslacyjnych (PTM). Przy niewielkich modyfikacjach protokół może być stosowany do oczyszczania innych kompleksów białek roślinnych. Metoda opiera się na ekspresji znakowanej epitopem wersji białka będącego przedmiotem zainteresowania, która jest następnie częściowo oczyszczana przez immunoprecypitację i poddawana spektrometrii mas w celu identyfikacji oddziałujących białek i PTM.
Ten protokół pokazuje, że: i). Dynamiczne zmiany w PTM, takie jak fosforylacja, mogą być wykrywane za pomocą spektrometrii mas; Ważne jest, aby mieć wystarczającą ilość białka będącego przedmiotem zainteresowania, co może zrekompensować brak czystości immunoprecypitatu; iii). Aby wykryć PTM białka będącego przedmiotem zainteresowania, białko to musi zostać immunoprecypitowane, aby uzyskać wystarczającą ilość białka.

Opisujemy tutaj protokół oczyszczania białek z etykietą z trwałych linii transgenicznych A. thaliana lub po ekspresji przejściowej białek w N. benthamiana. Jak zilustrowano na Ryc. 1, oczyszczanie białka docelowego jest powiązane ze spektrometrią mas, co umożliwia identyfikację białek oddziałujących oraz modyfikacji potranslacyjnych (PTM) białka docelowego. Protokół został opracowany z myślą o oczyszczaniu białek zaangażowanych w odporność roślin i identyfikacji ich PTM, jednak może zostać zastosowany do oczyszczania dowolnego białka roślinnego z etykietą.
Jako przykład wykorzystano oczyszczanie kompleksu Prf/Pto z N. benthamiana. Transgeniczna linia N. benthamiana 38-1254, ekspresująca 35S:Pto, została przejściowo przekształcona za pomocą 35S:Prf-FLAG, a kompleks został immunoprecypitowany przy użyciu agarozy anti-FLAG M2 (Rycina 2A). Immunobloty (IB) na Rycini 2A ilustrują, że większość białka docelowego (Prf) została immunoprecypitowana. Pto oraz oddziałujące z nim białko efektorowe AvrPtoB zostały współoczyszczone z Prf i wykryte przy użyciu przeciwciał oraz analizy spektrometrii mas (Ryciny 2A i 2B). Stwierdzono, że białko Pto współoczyszczone z Prf migrowało wolniej w żelu SDS-PAGE podczas współekspresji z konstruktami efektorowymi 35S:AvrPto oraz 35S:AvrPtoB (Rycina 2A). Oba białka efektorowe indukowały wolniejszą migrację Pto oddziałującego z Prf (Rycina 2A). Tę zależną od rozpoznania efektora wolniejszą migrację Pto przypisano wcześniej do fosforylacji, ponieważ mogła ona zostać zniesiona poprzez traktowanie fosfatazą44. Aby wykryć miejsca fosforylacji przyczyniające się do wolniejszej migracji Pto, poddano współoczyszczone z Prf białko Pto analizie spektrometrii mas. Pomimo wysokiej ekspresji Pto i łatwego wykrywania go za pomocą immunoblotów, udało się odzyskać peptydy pokrywające jedynie 57% sekwencji Pto i nie zidentyfikowano żadnych miejsc fosforylacji (Rycina 2B).
Następnie zmieniliśmy strategię, aby skierować przeciwciała anty-FLAG przeciwko białku Pto. Rośliny WT N. benthamiana zostały przejściowo przekształcone za pomocą 35S:Prf-3HA oraz 35S:Pto-FLAG, z dodatkiem lub bez 35S:AvrPto i 35S:AvrPtoB. Całkowita ilość białka Pto, obejmująca zarówno formy związane w kompleksie z Prf, jak i formy wolne, została immunoprecypitowana za pomocą agarozy anty-FLAG M2, a następnie poddana frakcjonowaniu metodą SDS-PAGE, trawieniu trypsyną w żelu oraz analizie spektrometrią masową (Ryc. 2C). Dzięki temu podejściu zidentyfikowaliśmy peptydy Pto obejmujące około 80% jego sekwencji oraz nieznane białko oddziałujące o masie 100 kDa. Zidentyfikowaliśmy zestaw pojedynczych i podwójnych miejsc fosforylacji dla peptydów Pto 187-202 i 188-202 (Tabela 1). Ser-198 i Thr-199 były dominującymi miejscami fosforylacji, lecz wykryto również inne miejsca fosforylacji (Tabela 1). Co najważniejsze, podwójna fosforylacja w pozycjach Ser-198 i Thr-199 została zidentyfikowana wyłącznie w obecności któregokolwiek z białek efektorowych (Tabela 1). Niedawno zidentyfikowaliśmy podobny zestaw miejsc fosforylacji Pto i wykazaliśmy znaczenie zdarzenia podwójnej fosforylacji dla sygnalizacji47. Postępując zgodnie z opisanym tutaj protokołem, byliśmy w stanie zidentyfikować dynamiczne zmiany w stanie fosforylacji białka docelowego.
<img alt="Schemat ekspresji i ekstrakcji białek; immunoprecypitacja, elektroforeza, spektrometria mas." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51095/51095fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51095/51095fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Ogólny schemat doświadczenia. Białko docelowe do immunoprecypitacji (IP) jest znakowane i ekspresjonowane in planta, przejściowo w Nicotiana benthamiana lub stabilnie w Arabidopsis thaliana. Po ekstrakcji białek białko docelowe jest immunoprecypitowane przy użyciu macierzy powinowactwa. Białka są rozdzielane na żelu akrylamidowym metodą elektroforezy. Pasy żelu zostają wycięte. Białka są ekstrahowane z pasów żelu i poddawane spektrometrii mas. Identyfikowane są miejsca fosforylacji oraz białka oddziałujące. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51095/51095fig1highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz.</a>
<img alt="Analiza oddziaływań białkowych; immunoblot; wyniki SDS-PAGE; Prf, AvrPtoB, Pto; prążki masy cząsteczkowej." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51095/51095fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51095/51095fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Immunoprecypitacja białek Prf i Pto. A). Konstrukt 35S:Prf-FLAG wykazano w ekspresji przejściowej w linii 38-12 (35S:Pto) wraz z pustym wektorem (EV), 35S:AvrPto lub 35S:AvrPtoB. Trzy dni po infiltracji białko Prf immunoprecypitowano z użyciem macierzy powinowactwa anty-FLAG. Wykonano immunobloty (IB) dla Prf, AvrPtoB i Pto. Jak wskazują strzałki na dole panelu immunoblotu dla Pto, AvrPto i AvrPtoB indukują wolniejszą migrację Pto. B). Konstrukt 35S:Prf-FLAG wykazano w ekspresji przejściowej w linii 38-12 (35S:Pto) wraz z pustym wektorem (EV), 35S:AvrPto lub 35S:AvrPtoB. Trzy dni po infiltracji białko Prf immunoprecypitowano z użyciem agarozy anty-FLAG i rozdzielono metodą SDS-PAGE. Żel zabarwiono koloidalnym błękitem Coomassie (cCBB), a widoczne prążki białek Prf, Pto i AvrPtoB wycięto z żelu i przeanalizowano metodą spektrometrii mas. Wskazano procentowe pokrycie peptydowe sekwencji Pto i Prf zidentyfikowanych metodą spektrometrii mas. C). Konstrukty 35S:Prf-3xHA i 35S:Pto-FLAG wykazano w ekspresji przejściowej wraz z 35S:AvrPtoB, 35S:AvrPto lub pustym wektorem (EV) w N. benthamiana. Trzy dni po infiltracji całkowitą ilość Pto-FLAG immunoprecypitowano z użyciem agarozy anty-FLAG i rozdzielono metodą SDS-PAGE. Widoczne prążki Pto oraz białek oddziałujących z Pto wycięto z żelu i przeanalizowano metodą spektrometrii mas. Pto oraz prążek białka oddziałującego z Pto o masie 100 kDa są wyraźnie widoczne na żelu zabarwionym koloidalnym błękitem Coomassie (cCBB), podczas gdy Prf jest nieco mniej widoczny (jak wskazują strzałki). IP: immunoprecypitacja; IB: immunoblot; CBB: barwienie błękitem Coomassie; cCBB: barwienie koloidalnym błękitem Coomassie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51095/51095fig2highres.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony obraz.</a>
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody >
		<tr >
			<td></td>
			<td colspan="3">Prf</td>
		</tr >
		<tr >
			<td></td>
			<td rowspan="2">EV</td>
			<td rowspan="2">AvrPto</td>
			<td rowspan="2">AvrPtoB</td>
		</tr >
		<tr >
			<td>Peptyd Pto 188-202</td>
		</tr >
		<tr >
			<td>GTELDQ[pT195]HLSTVVK</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>0</td>
		</tr >
		<tr >
			<td>GTELDQTHL[pS198]TVVK</td>
			<td>10</td>
			<td>7</td>
			<td>5</td>
		</tr >
		<tr >
			<td>GTELDQTHLS [pT199]VVK</td>
			<td>8</td>
			<td>3</td>
			<td>4</td>
		</tr >
		<tr >
			<td>G[pT190]ELDQTHLS[pT199]VVK</td>
			<td>0</td>
			<td>1</td>
			<td>2</td>
		</tr >
		<tr >
			<td>GTELDQTHL[pS198][pT199]VVK</td>
			<td>0</td>
			<td>8</td>
			<td>4</td>
		</tr >
		<tr >
			<td>GTELDQTHLSTVVK</td>
			<td>46</td>
			<td>26</td>
			<td>48</td>
		</tr >
		<tr >
			<td>Peptyd Pto 187-202</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr >
		<tr >
			<td>KGTELDQ[pT195]HLS TVVK</td>
			<td>0</td>
			<td>1</td>
			<td>0</td>
		</tr >
		<tr >
			<td>KGTELDQTHL[pS198]TVVK</td>
			<td>17</td>
			<td>17</td>
			<td>12</td>
		</tr >
		<tr >
			<td>KGTELDQTHLS[pT199]VVK</td>
			<td>4</td>
			<td>2</td>
			<td>2</td>
		</tr >
		<tr >
			<td>KGTELDQ[pT195]HLS [pT199]VVK</td>
			<td>0</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
		</tr >
		<tr >
			<td>KGTELDQTHL[pS198][pT199]VVK</td>
			<td>0</td>
			<td>7</td>
			<td>5</td>
		</tr >
		<tr >
			<td>KGTELDQTHLSTVVK</td>
			<td>21</td>
			<td>37</td>
			<td>18</td>
		</tr >
		<tr >
			<td>Peptydy 187-202 i 188-202</td>
			<td>83</td>
			<td>88</td>
			<td>50</td>
		</tr >
		<tr >
			<td>Procent peptydów z dwoma zdarzeniami fosforylacji</td>
			<td>0%</td>
			<td>26,9%</td>
			<td>11,2%</td>
		</tr >
		<tr >
			<td>Pokrycie sekwencji Pto</td>
			<td>78%</td>
			<td>79%</td>
			<td>82%</td>
		</tr >
	</tbody >
</table>
Tabela 1. Podwójna fosforylacja peptydu Pto po aktywacji sygnalizacji. 35S:Prf-3xHA oraz 35S:Pto-FLAG wyekspresowano przejściowo wraz z pustym wektorem (EV), 35S:AvrPto lub 35S:AvrPtoB w N. benthamiana. Trzy dni po infiltracji całkowitą ilość białka Pto-FLAG immunoprecypitowano przy użyciu macierzy powinowactwa anty-FLAG i rozdzielono za pomocą SDS-PAGE. Widoczne prążki Pto na żelu barwionym koloidalnym Coomassie brilliant blue wycięto i poddano analizie za pomocą spektrometrii mas. Wskazano liczbę peptydów Pto zidentyfikowanych z 0, 1 i 2 zdarzeniami fosforylacji.
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody >
		<tr >
			<td >Tabela buforów</td >
			<td ></td >
			<td ></td >
		</tr >
		<tr >
			<td >Pożywka L</td >
			<td >Tryptona</td >
			<td >10 g/L</td >
		</tr >
		<tr >
			<td ></td >
			<td >Ekstrakt drożdżowy</td >
			<td >5 g/L</td >
		</tr >
		<tr >
			<td ></td >
			<td >NaCl</td >
			<td >5 g/L</td >
		</tr >
		<tr >
			<td ></td >
			<td >D-glukoza</td >
			<td >1 g/L</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >Bufor do agroinfiltracji</td >
			<td >MgCl2</td >
			<td >10 mM</td >
		</tr >
		<tr >
			<td ></td >
			<td >MES</td >
			<td >10 mM</td >
		</tr >
		<tr >
			<td ></td >
			<td >Dostosować do pH 5,5</td >
			<td ></td >
		</tr >
		<tr >
			<td ></td >
			<td >Acetosyringona (opcjonalnie)</td >
			<td >150 μM</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >Bufor A</td >
			<td >Tris-HCl pH 7,5</td >
			<td >150 mM</td >
		</tr >
		<tr >
			<td ></td >
			<td >NaCl</td >
			<td >150 mM</td >
		</tr >
		<tr >
			<td ></td >
			<td >EDTA</td >
			<td >5 mM</td >
		</tr >
		<tr >
			<td ></td >
			<td >EGTA</td >
			<td >2 mM</td >
		</tr >
		<tr >
			<td ></td >
			<td >Glicerol</td >
			<td >5% (v/v)</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >Bufor B</td >
			<td >Bufor A</td >
			<td ></td >
		</tr >
		<tr >
			<td ></td >
			<td >PVPP</td >
			<td >2% (w/v)</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >Bufor C</td >
			<td >Bufor B</td >
			<td ></td >
		</tr >
		<tr >
			<td ></td >
			<td >Ditiotreitol (DTT)</td >
			<td >10 mM</td >
		</tr >
		<tr >
			<td ></td >
			<td >Koktajl inhibitorów proteaz roślinnych</td >
			<td >1% (v/v)</td >
		</tr >
		<tr >
			<td ></td >
			<td >Fluorek fenylometylosulfonylowy (PMSF)</td >
			<td >0,5 mM</td >
		</tr >
		<tr >
			<td ></td >
			<td >Kalkulin A</td >
			<td >50 nM</td >
		</tr >
		<tr >
			<td ></td >
			<td >Fluorek sodu (NaF)</td >
			<td >50 mM</td >
		</tr >
		<tr >
			<td ></td >
			<td >Molibdan sodu (Na2MoO4)</td >
			<td >10 mM</td >
		</tr >
		<tr >
			<td ></td >
			<td >Ortowanadan sodu</td >
			<td >1 mM</td >
		</tr >
		<tr >
			<td ></td >
			<td >Kwas okadaikowy</td >
			<td >100 nM</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >Bufor D</td >
			<td >Bufor C bez PVPP</td >
			<td ></td >
		</tr >
		<tr >
			<td >5x bufor do prób SDS-PAGE</td >
			<td >Tris-HCl pH 6,8</td >
			<td >60 mM</td >
		</tr >
		<tr >
			<td ></td >
			<td >SDS</td >
			<td >2%</td >
		</tr >
		<tr >
			<td ></td >
			<td >Glicerol</td >
			<td >0,15%</td >
		</tr >
		<tr >
			<td ></td >
			<td >Błękit bromofenolowy</td >
			<td >0,10%</td >
		</tr >
		<tr >
			<td ></td >
			<td >DTT (dodać bezpośrednio przed użyciem)</td >
			<td >50 mM</td >
		</tr >
	</tbody >
</table>
Tabela 2. Składy buforów i pożywek.

Opisujemy tutaj protokół oczyszczania i charakterystyki kompleksów białek roślinnych. Pokazujemy to, immunoprecypitując pojedyncze białko w kompleksie, dzięki czemu możemy zidentyfikować jego modyfikacje potranslacyjne i oddziałujących partnerów.

Identyfikacja modyfikacji potranslacyjnych kompleksów białek roślinnych

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest identyfikacja modyfikacji potranslacyjnych białek zaangażowanych w kompleksy białkowe roślin, które zostały uprzednio wyeksponowane przejściowo lub stabilnie w roślinach z użyciem znaczników białka docelowego. Następnie należy wyekstrahować całkowitą pulę białek z tkanki roślinnej i przeprowadzić immunoprecypitację białka docelowego. W kolejnym kroku białka poddane immunoprecypitacji należy rozdzielić na żelu akrylamidowym, a następnie wyciąć i poddać trawieniu białka z interesującego nas prążka żelowego.Następnie należy poddać próbki białek analizie za pomocą spektrometrii mas. W efekcie wyniki spektrometrii mas pozwalają wykryć dynamiczne zmiany w modyfikacjach potranslacyjnych, takich jak fosforylacja. W przeciwieństwie do alternatywnych metod, takich jak inkubacja kinazy z substratem in vitro, metoda ta umożliwia ekspresję białek w organizmach roślinnych.Dzięki temu nie trzeba wiedzieć, która kinaza odpowiada za fosforylację. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu biologii roślin, takie jak sposób przekazywania sygnałów w odpowiedzi na stres, zmiany środowiskowe lub rozpoznanie patogenów. Oprócz identyfikacji miejsc fosforylacji w aktywowanych kompleksach białek odpornościowych, metodę tę można szeroko zastosować do dowolnej modyfikacji potranslacyjnej dowolnego kompleksu białkowego roślin.Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności, ponieważ nie są przyzwyczajone do pracy z dużymi ilościami ekstraktu oraz do wykonywania większej liczby kroków protokołu w ciągu jednego dnia. W przypadku ekspresji przejściowej należy hodować szczepy Agrobacterium do fazy stacjonarnej. Bakterie Agrobacterium należy zebrać poprzez wirowanie przy 3000 Gs przez pięć minut.Resuspend granulaty w buforze do infiltracji. Następnie przeprowadź infiltrację czterotygodniowych roślin NCOA hamana agrobakteriami, wykonując ją ręcznie za pomocą beziglowej strzykawki o pojemności 1 ml lub metodą próżniową z dodatkiem 0,02% surfaktantu, dwa do pięciu dni po infiltracji.Zebrać zainfiltrowane liście, zamrozić je w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze minus 80°C. Następnie rozetrzeć 20 g tkanki roślinnej z ciekłym azotem za pomocą moździerza i tłuczka, dodając do 20 g tkanki 80 ml zimnego buforu C. Dobrze wymieszać i rozmrozić na lodzie.Następnie przeprowadź homogenizację w trzech cyklach po 10 sekund każdy przy pełnej prędkości. Homogenizat przefiltruj i odwiruj przy 30 000 G przez 30 minut w temperaturze 4 °C. W tym czasie 100 µL odpowiedniej macierzy powinowactwa inkubuj z 500 µL zimnego buforu blokującego D przez pięć minut w temperaturze 4 °C, a następnie przemyj trzy razy 1 ml zimnego buforu D. Następnie oddziel supernatant ekstraktu z liści i przepuść go przez strzykawkę z filtrem 0,45 µm.Przefiltruj do nowej probówki na lodzie. Rozdziel ekstrakt surowy na alikwoty. Do analizy immunoblotu.Dodaj pięć µL buforu do ładowania żeli SDS-PAGE, wymieszaj w wortexie i zagotuj próbki w celu denaturacji. Do każdej probówki dodaj 50 µl macierzy powinowactwa zawieszonej w buforze D. Inkubuj przez dwie godziny w temperaturze 4 °C przy łagodnym obracaniu, a następnie odwirowuj, abyt zbrylić macierz powinowactwa.Następnie pobierz alikwot nieprzypisanego ekstraktu do analizy immuno-blot. Pozostałą część odrzuć, pozostawiając w dnie probówki około 500 µL. Resuspenduj zawiesinę za pomocą końcówki o szerokim otworze.Połącz zmieszany roztwór zawiesiny z obu probówek w jednej probówce o pojemności 1,5 ml. Przeprowadź trzy cykle wirowania po pięć sekund za pomocą wirówki naktowej, aby wytrącić macierz powinowactwa, a następnie usuń supernatant po trzech do pięciu przemyciach 1 ml zimnego buforu D. Nadmiar buforu D usuń za pomocą igły strzykawki, a następnie przeprowadź elucję 200 µl odpowiedniego buforu elucyjnego przy stałym wytrząsaniu. Połącz trzy frakcje EIT w jednej probówce.Następnie skoncentruj białka, używając 30 µL żywicy absorpcyjnej, i wymieszaj na wortexie. Pozostaw na pięć minut, a następnie odwiruj żywicę i odlej supernatnat. Do osadu z macierzy powinowactwa lub żywicy absorpcyjnej dodaj 50 µL buforu do ładowania SDS-PAGE 1X i gotuj przez 10 minut w temperaturze od 80 do 100 °C w bloku grzejnym wirówki.Gotowaną macierz powinowactwa inkubowano z żywicą przez dwie minuty przy 10 000. GS. Alikwot 5 µL supernatantu przeznaczono do immunoblokkingu i naniesiono wraz z innymi frakcjami na żel SDS-PAGE o długości 10 cm w celu rozdzielenia i identyfikacji białek fosforylowanych za pomocą spektrometrii mas.Nanieś pozostałe 45 µL na żel do elektroforezy SDS-PAGE. Żel SDS-PAGE zabarw barwnikiem colloidal Coomassie brilliant blue. Następnie odbarw żel, płukając go obficie wodą, najlepiej przez całą noc.Następnie, używając czystego skalpela, wycinamy z żelu interesujący nas prążek, dzielimy plaster żelu na kostki o wymiarach od dwóch do czterech milimetrów i przenosimy próbkę do probówki. Fragmenty żelu przemywamy 50% acetonitrylem i 50 mM wodorowęglanem amonu aż do całkowitego odbarwienia. Następnie odsysamy roztwór pipetą.Należy uważać, aby nie usunąć fragmentów żelu. Próbkę odwadżamy w 100% acetonitrylu przez pięć minut, a następnie usuwamy wolny płyn. Następnie, aby zredukować mostki dwusiarczkowe białek, dodajemy 10 mM DTT i inkubujemy przez 30 do 45 minut w 56 °C przy potrząsaniu; po tym czasie usuwamy wolny płyn w celu alkilowania reszt cysteiny.Dodaj 55 millimolarny chloroacetamid i inkubuj przez 20 do 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Odlej wolny płyn, a następnie przemyj fragmenty żelu dwukrotnie 50% acetonitylem przez 10 minut. Odlej wolny płyn.Następnie odwodnij fragmenty żelu w 100% acetonitrylu przez pięć minut i usuń wolny płyn przed trawieniem metodą Triptych Digest. Dodając 40 µL roztworu roboczego trypsyny, pozwól fragmentom żelu rehydratować przez 10 minut w ilości buforu do trawienia wystarczającej do przykrycia fragmentów żelu. Inkubuj w temperaturze 37 °C przez noc. Aby zatrzymać trawienie i wyekstrahować peptydy z fragmentów żelu, zastosuj 5% kwas formowy i poddaj próbki sonikacji przez od pięciu do 10 minut.Następnie przenieś supernatant do nowej probówki, wysusz peptydy poprzez liofilizację lub za pomocą koncentratora próżniowego i przechowuj próbki w temperaturze -20 °C. W tym eksperymencie oczyszczono kompleks kinazy P-R-F-P-T-O z nacoa hamana; transgeniczne NACOA hamana wykazujące ekspresję 35 SPTO zostało przejściowo przekształcone za pomocą 35 SPRF flag, a kompleks wytrącono immunologicznie przy użyciu przeciwciała Anti-Flag M two aros. Immunobloty obrazują efektywne wytrącanie immunologiczne docelowego białka PRF, przy czym zarówno PTO, jak i oddziałujące białko efektorowe zostały współoczyszczone z PRF, co potwierdzono w analizie z wykorzystaniem przeciwciał oraz spektrometrii mas.W tym przypadku strategia polegała na ukierunkowaniu przeciwciałem Anti-Flag na białko PTO. Strategię zmieniono w celu zidentyfikowania miejsc fosforylacji PTO.Całkowita ilość białka PTO, obejmująca zarówno kompleks PRF, jak i formę wolną, została immunoprecypitowana przeciwciałami Anti-Flag M2, a następnie poddana frakcjonowaniu w metodzie SDS-PAGE, trawieniu trypsyną w żelu oraz analizie spektrometrią mas, co pozwoliło na zidentyfikowanie peptydów PTO obejmujących około 80% jego sekwencji. Co ciekawe, zidentyfikowano zestaw pojedynczych miejsc fosforylacji dla peptydów PTO. Należy zauważyć, że podwójne miejsca fosforylacji zidentyfikowano wyłącznie w obecności białek efektorowych.Ważne jest uzyskanie odpowiedniej ilości białka roślinnego, aby zidentyfikować składniki kompleksu białkowego oraz wykryć modyfikacje potranslacyjne białka będącego przedmiotem zainteresowania. Należy pamiętać, że mapowanie modyfikacji, takich jak fosforylacja, wymaga odpowiedniej ilości białka do analizy spektrometrią mas, zatem po zastosowaniu tej procedury na żelu powinna być widoczna przynajmniej słaba prążka. Można zastosować inne metody, takie jak identyfikacja składników kompleksu, w celu odpowiedzi na dodatkowe pytania, np. w jaki sposób aktywacja kompleksu immunologicznego prowadzi do odporności funkcjonalnej.Pamiętaj, że praca z buforami organicznymi, bakteriami i ostrzami BBL może być niezwykle niebezpieczna, dlatego należy zachować środki ostrożności, takie jak noszenie rękawiczek i fartuchów laboratoryjnych.

identification-post-translational-modifications-plant-protein

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Identyfikacja modyfikacji potranslacyjnych kompleksów białkowych roślin

Opisano niezawodne i użyteczne podejście do wykrywania modyfikacji histonów w konkretnych genach roślin. Metoda ta łączy immunoprecypitację chromatyny (ChIP) z ilościową PCR w czasie rzeczywistym. Pozwala ona na wykrycie modyfikacji histonów w konkretnych genach odgrywających rolę w różnych procesach fizjologicznych.

Wykrywanie modyfikacji histonów w liściach roślin

Przedstawiamy wariant metody QUICK (QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown), wprowadzonej wcześniej w celu odróżnienia rzeczywistych od fałszywych oddziaływań białko-białko. Nasze podejście opiera się na znakowaniu metabolicznym 15N , modulowaniu powinowactwa oddziaływań białko-białko poprzez obecność lub brak ATP, immunoprecypitacji oraz ilościowej spektrometrii mas.

Protokół identyfikacji oddziaływań białko-białko w oparciu o znakowanie metaboliczne 15N, immunoprecypitację, ilościową spektrometrię mas oraz modulację powinowactwa

Ukierunkowana degradacja białek stanowi główny mechanizm regulujący funkcjonowanie komórki. Zachodzi za pośrednictwem konserwatywnego szlaku ubikwityna-proteasom, który przyłącza łańcuchy poliubikwityny do białka docelowego, które następnie służą jako molekularne "znaczniki" dla proteasomu 26S. W tym miejscu opisujemy prosty i niezawodny bezkomórkowy test proteasomalnej degradacji białek.

Oznaczanie degradacji proteasomalnej w systemie bezkomórkowym u roślin

Tworzenie kompleksów białkowych in vivo można wizualizować za pomocą dwucząsteczkowej komplementacji fluorescencji. Partnerzy interakcji są łączeni z komplementarnymi częściami znaczników fluorescencyjnych i przejściowo ulegają ekspresji w liściach tytoniu, co skutkuje odtworzonym sygnałem fluorescencyjnym po bliskim zbliżeniu dwóch białek.

Interakcje białko-białko uwidocznione przez dwucząsteczkową komplementację fluorescencyjną w protoplastach i liściach tytoniu

Ustaliliśmy metodę oczyszczania białek interakcji koregulacyjnych za pomocą systemu LC-MS/MS.

Metoda przygotowania białek do wysokoprzepustowej identyfikacji białek oddziałujących z kofaktorem jądrowym za pomocą analizy LC-MS/MS

Tutaj prezentujemy protokół przechwytywania interaktomii zastosowany do protoplastów mezofilu z liści Arabidopsis thaliana. Metoda ta opiera się w dużej mierze na sieciowaniu UV in vivo i pozwala na izolację i identyfikację białek wiążących mRNA roślin ze środowiska fizjologicznego.

Wychwytywanie interaktomu mRNA z protoplastów roślinnych

Badanie wielu, endogennych modyfikacji potranslacyjnych dla docelowego białka może być niezwykle trudne. Opisane tutaj techniki wykorzystują zoptymalizowany bufor do lizy i system filtrów opracowany ze specyficznymi matrycami powinowactwa do kierowania PTM, do wykrywania modyfikacji acetylacji, ubikwitynacji, SUMOylacji 2/3 i fosforylacji tyrozyny dla białka docelowego przy użyciu jednego, usprawnionego systemu.

Wykorzystanie kompleksowego systemu wzbogacania immunoprecypitacji w celu zidentyfikowania endogennego profilu modyfikacji potranslacyjnej dla białek docelowych

Prezentujemy tutaj sprawdzony i przetestowany protokół oczyszczania kompleksów importujących białka chloroplastowe (kompleks TOC-TIC) za pomocą znacznika TAP. Jednoetapowy protokół izolacji powinowactwa może być potencjalnie zastosowany do dowolnego białka i może być wykorzystany do identyfikacji nowych partnerów interakcji za pomocą spektrometrii mas.

Oczyszczanie powinowactwa kompleksów białkowych chloroplastów translokonu za pomocą znacznika TAP

Ten przepływ pracy opisuje wydajność efektywnego czasowo i kosztowo wzbogacania wielu modyfikacji potranslacyjnych białek (PTM) jednocześnie dla ilościowej globalnej analizy proteomicznej. Protokół wykorzystuje wzbogacanie PTM na poziomie peptydów wieloma sprzężonymi przeciwciałami, a następnie niezależną od danych analizę spektrometrii mas w celu uzyskania biologicznego wglądu w przesłuchy PTM.

Jednoczesne wzbogacenie powinowactwa dwóch modyfikacji potranslacyjnych do kwantyfikacji i lokalizacji miejsca

Tutaj prezentujemy krok po kroku protokół do przeprowadzenia eksperymentu z etykietowaniem zbliżeniowym (PL) na ogórku (Cucumis sativus L.) przy użyciu białka AT4G18020 (APRR2)-AirID jako modelu. Metoda opisuje budowę wektora, transformację konstruktu poprzez agroinfiltrację, infiltrację biotyny, ekstrakcję białek i oczyszczanie białek znakowanych biotyną za pomocą techniki oczyszczania powinowactwa.

Etykietowanie zbliżeniowe oparte na AirID dla interakcji białko-białko w roślinach

Poznaj metodę identyfikacji modyfikacji potranslacyjnych w kompleksach białek roślinnych z wykorzystaniem spektrometrii masowej. Technika ta umożliwia badanie fosforylacji i interakcji białkowych w roślinach.

Identyfikacja modyfikacji potranslacyjnych kompleksów białek roślinnych

Przeglądaj więcej filmów