Name: Projektowanie i analiza zachowania preferencji temperaturowych i ich rytmu okołodobowego u Drosophila (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-13T13:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: Poznaj metodę oceny preferencji temperaturowej i jej rytmu okołodobowego u Drosophila. Technika ta pozwala badać niezależne mechanizmy regulacji rytmów dobowych w neurobiologii i chronobiologii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy wdzięczni doktorom Aravinthanowi Samuelowi i Marcowi Gershowowi, którzy pomogli opracować wstępną wersję aparatu behawioralnego oraz Matthew Batie, który zmodyfikował aparat behawioralny. Badania te były wspierane przez Trustee Grant z Cincinnati Children's Hospital, JST/PRESTO, March of Dimes i NIH R01 GM107582 do F.N.H.

1. Przygotowanie much
<ol>
	<li>Eksperymenty z jasnym ciemnym (LD)
	<ol>
		<li>Wychowuj muchy w inkubatorach (25 °C/40-60% wilgotności względnej (RH)) w cyklach jasnych 12 godzin/ciemnych 12 godzin (LD). Natężenie światła w inkubatorach wynosi ~500-1,000 luksów.</li>
		<li>Dwa inkubatory są niezbędne do przeprowadzenia testów behawioralnych w ciągu 24 godzin. Oba inkubatory powinny być wyposażone w programowalne światło z funkcją ON OFF. Powinny mieć również drzwi pełne, które nie przepuszczają światła (tj. brak szkła lub pleksi). 
		Uwaga: Jeden inkubator powinien być oznaczony jako inkubator "dzienny" i ustawiony na cykl LD trwający 12 godzin światła i 12 godzin ciemności. Drugi inkubator powinien być oznaczony jako inkubator "nocny" i ustawiony na odwrotność pierwszego, z 12-godzinną ciemnością, a następnie 12-godzinnym światłem. Inkubator nocny musi być umieszczony w pomieszczeniu, które jest dostępne w ciemności, w taki sposób, aby muchy doświadczające warunków nocnych były łatwo dostępne do eksperymentów.</li>
		<li>Umieścić fiolki z muchami w inkubatorach dziennych lub nocnych. Zebrać nowo wyklute muchy do świeżej fiolki, 20-30 na test i trzymać w tym samym inkubatorze przez 2-3 dni.</li>
		<li>Po 2-3 dniach użyj much do testu behawioralnego preferencji temperatury.
		<ol>
			<li>W przypadku eksperymentów dziennych (czas Zeitgebera (ZT) 0-12) zbieraj muchy z inkubatora dziennego.</li>
			<li>Tuż przed eksperymentami behawioralnymi wyjmij zebrane fiolki z muchami z inkubatora dziennego.</li>
			<li>Do eksperymentów nocnych (ZT 13-24) zbieraj muchy z nocnego inkubatora.</li>
			<li>Tuż przed eksperymentami behawioralnymi wyjmij zebrane fiolki z muchami z nocnego inkubatora, zawiń je w folię aluminiową i umieść w pudełku w ciemnym pomieszczeniu pod czerwoną lampą. 
			Uwaga: Ponieważ test behawioralny preferencji temperatury jest wykonywany w ciemności w przypadku eksperymentów nocnych, należy zapobiec ekspozycji much na światło do końca eksperymentów behawioralnych. 
			Uwaga: Muchy nie powinny być wystawione na działanie dwutlenku węgla w dniu, w którym mają się odbyć eksperymenty.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Eksperymenty z Ciągłą Ciemnością (DD)
	<ol>
		<li>Dzień DD
		<ol>
			<li>Dodatkowy inkubator jest niezbędny do eksperymentów dziennych DD, który nazywamy inkubatorem "przejściowym" przez resztę manuskryptu. Inkubator przejściowy musi być umieszczony w pomieszczeniu, które jest dostępne w ciemności, w taki sposób, aby muchy doświadczające warunków DD były łatwo dostępne w celu przeprowadzenia eksperymentów. Przykładowy harmonogram oświetlenia dla inkubatora przejściowego zakładałby, że światło jest włączone od 13:00 do 19:00, a światło wyłączone w godzinach 19:00-13:00 (rysunek 1).</li>
			<li>Zbierz muchy, które zostały wyhodowane w inkubatorze dziennym. Umieść fiolki z muchami w inkubatorze przejściowym między godziną 13 a 19, gdy światło jest włączone. W ten sposób muchy są odpowiednio wystawione na działanie światła do godziny 19, kiedy to światło się wyłącza.</li>
			<li>Następnego dnia, przed godziną 13, w ciemnościach wyjmij fiolki z muchami z inkubatora przejściowego, owiń je folią aluminiową i umieść w pudełku. Przechowuj pudełko w dowolnym inkubatorze jeszcze przez jeden dzień.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>DD Noc
		<ol>
			<li>Zbierz muchy, które zostały wyhodowane w nocnym inkubatorze w ciemności pod czerwoną lampą. Lub dodatkowo zbieraj muchy, gdy światło nocnego inkubatora jest włączone.</li>
			<li>Owiń zebrane fiolki folią aluminiową w ciemności za każdym razem, gdy światła są wyłączone i umieść fiolki w pudełku. Pojemnik należy przechowywać w dowolnym inkubatorze jeszcze przez dwa dni (Rysunek 1B). 
			Uwaga: Ponieważ test behawioralny preferencji temperatury jest przeprowadzany w ciemności w przypadku eksperymentów nocnych, należy zapobiec ekspozycji na światło much do końca eksperymentów behawioralnych.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Eksperymenty ze stałym światłem (LL)
	<ol>
		<li>Dzień LL
		<ol>
			<li>Do eksperymentów dziennych LL niezbędny jest dodatkowy inkubator. Inkubator utrzymuje stan LL (25 °C, 800 luksów), przy stale włączonym świetle.</li>
			<li>Zbieraj muchy, które zostały wyhodowane w inkubatorze dziennym. Umieść fiolki z muchami w inkubatorze LL w dowolnym momencie ich "dnia".</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Noc LL
		<ol>
			<li>Zbieraj muchy, które zostały wyhodowane w nocnym inkubatorze. Przenieść fiolki muchowe z inkubatora nocnego do inkubatora LL w czasie, gdy światło w inkubatorze nocnym jest włączone. 
			Uwaga: Na przykład światło wyłącza się o 7 rano w nocnym inkubatorze. Przenieść fiolki z muchami z inkubatora nocnego do inkubatora LL przed godziną 7 rano i przechowywać fiolki w inkubatorze LL przez kolejne 4 dni. 
			Uwaga: W 4 dniu w warunkach LL oscylacja aktywności lokomotorycznej zostaje zniesiona15,16, podczas gdy TPR jest nadal utrzymywany 3.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Aparatura do badania behawioralnego preferencji temperatury
<ol>
	<li>Umieść osłonę z pleksiglasu (29 cm x 19.2 cm) (Rysunek 4) na aluminiowej płycie.</li>
	<li>Monitoruj temperaturę powietrza między płytą a pokrywą. Sześć sond temperatury jest przymocowanych w różnych miejscach po wewnętrznej stronie pokrywy w obrębie jednego z pasów ruchu (rysunek 2). 
	Uwaga: Upewnij się, że sondy nie dotykają ani aluminiowej płyty, ani osłony z pleksiglasu. Temperaturę powietrza należy ustawić na gradient od 18 do 32 °C.</li>
	<li>Umieść urządzenie w pomieszczeniu o temperaturze 25 °C/65-75% wilgotności względnej. To pomieszczenie musi być odizolowane od wszelkiego światła zewnętrznego. Pomieszczenie ekologiczne jest zwykle wyposażone w wentylatory, które utrzymują określoną temperaturę i wilgotność. 
	Uwaga: Powietrze z wentylatora prawdopodobnie zakłóca stabilny gradient temperatury w urządzeniu. Aby temu zapobiec, używamy przezroczystego arkusza, który zakrywa obszar otaczający aparat.</li>
	<li>Przygotuj termometr i higrometr, aby sprawdzić temperaturę i wilgotność w pomieszczeniu środowiskowym. 
	Uwaga: Światło wpływa na preferencje temperaturowe Drosophila3. To samo natężenie światła powinno być równomiernie dostarczane do aparatu. Natężenie naszych środowiskowych lamp pokojowych wynosi ~ 800 luksów. 
	Uwaga: Po zakończeniu eksperymentów behawioralnych umieść rurkę podłączoną do zbiornika CO2 lub źródła w pobliżu otworu w górnej części aparatu, aby znieczulić i pozbyć się much.</li>
</ol>
3. Przygotowanie aparatury do użycia
<ol>
	<li>Włącz aparat na co najmniej 30 minut, aby prawidłowo ustalić gradient temperatury na powierzchni płytki (Rysunek 3).</li>
	<li>Pokryj pokrywę aparatu behawioralnego środkiem hydrofobowym, aby zapobiec wspinaniu się much po ścianach lub suficie pokrowca. Zetrzyj nadmiar środka hydrofobowego i pozostaw pokrowiec na 25-30 minut do wyschnięcia.</li>
	<li>Usuń kondensację z aluminiowej płyty. Umieść osłonę z pleksiglasu na aluminiowej płycie i zabezpiecz sześcioma zaciskami C (Rysunek 2). 
	Uwaga: Bardzo ważne jest, aby pokrywa była dobrze uszczelniona, w razie potrzeby można użyć podwójnej taśmy klejącej.</li>
	<li>Pozostaw przykrycie na co najmniej 15 minut. Gradient temperatury powietrza między aluminiową płytą a pokrywą powstaje w zakresie 18-32 °C.</li>
</ol>
4. Test zachowania preferencji temperaturowych
<ol>
	<li>Załaduj muchy do przestrzeni między aluminiową płytą a osłoną z pleksiglasu urządzenia przez małe otwory pośrodku każdego pasa osłony (rysunki 2 i 4). Zakryj otwory szkiełkami nakrywkowymi, aby zapobiec ucieczce much.</li>
	<li>W przypadku ciemności wyłącz wszystkie światła w pomieszczeniu środowiskowym. Czerwona lampa może być używana, gdy muchy są umieszczane w aparacie. Upewnij się, że muchy nie są wystawione na żadne światła z wyjątkiem czerwonej lampy, dopóki eksperymenty behawioralne nie zostaną zakończone.</li>
	<li>Do każdej próby należy użyć 20-25 dorosłych much, które nie mogą być ponownie wykorzystane w kolejnych próbach. Test behawioralny jest wykonywany przez 30 minut. Zrób kilka zdjęć z lampą błyskową lub bez. Uważaj, aby nie robić dużo hałasu ani żadnych gwałtownych ruchów podczas eksperymentów.</li>
	<li>Zapisz temperaturę wszystkich sześciu sond na urządzeniu. Zwróć uwagę na temperaturę w pomieszczeniu, a także wilgotność.</li>
	<li>Znieczulić muchy w aparacie gazowym dwutlenkiem węgla, poluzować zaciski, zdjąć osłonę z pleksi i usunąć muchy z płytki. Po każdym eksperymencie muchy są odrzucane. Wytrzyj kondensację lub wilgoć z płyty. Załóż pokrywę na płytkę i dokręć zaciskami, przygotowując się do następnego eksperymentu.</li>
	<li>Aby odzwierciedlić preferencje dotyczące temperatury przez cały dzień, okres 24 godzin jest podzielony na osiem stref czasowych, cztery w dzień i cztery w nocy. Na przykład używamy tych ZT lub CT 1-3, 4-6, 7-9, 10-12, 13-15, 16-18, 19-21 i 22-24. 
	Uwaga: Ponieważ zmiany fenotypu spowodowane efektami maskowania są oczekiwane zaraz po włączeniu lub wyłączeniu światła (ZT0) lub wyłączeniu (ZT12), nie badamy zachowania preferencji temperaturowych w tych okresach (ZT lub CT 0-1, 11,5-13 i 23,5-24). Aby wyniki były statystycznie prawidłowe, należy przeprowadzić co najmniej pięć prób w każdej strefie czasowej.</li>
</ol>
5. Analiza danych
<ol>
	<li>Oblicz gradient temperatury w następujący sposób: Określ miejsce umieszczenia sond temperatury na podstawie dwóch linijek, które są umieszczone na górnej i dolnej stronie osłony z pleksiglasu wzdłuż krawędzi (Rysunek 2A).</li>
	<li>Szacuje się, że gradient temperatury między sondami temperatury jest liniowy. Na podstawie lokalizacji sond temperatury, a także odpowiadających im zarejestrowanych temperatur, narysuj linie reprezentujące każdy stopień temperatury w odpowiedniej pozycji na zdjęciach. Policz liczbę much znajdujących się w każdym przedziale stopni. Wyklucz wszelkie muchy na ścianach lub suficie okładki.</li>
	<li>Oblicz procent much w każdym zakresie temperatur na każdym torze. Średnia preferowana temperatura jest obliczana przez zsumowanie iloczynów procentowej liczby much i temperatury w każdym przedziale, jak pokazano poniżej: 
	% much x 18,5 °C + % much x 19,5 °C + % much x 20,5 °C ....+ % much x 31,5 °C + % much x 32,5 °C.</li>
	<li>Obliczanie średniej preferowanej temperatury w każdej strefie czasowej: Zachowanie preferencji temperatury jest wykonywane >5 razy w każdej strefie czasowej (ZT 1-3, 4-6, 7-9, 10-12, 13-15, 16-18, 19-21 i 22-24). Aby obliczyć średnią preferowaną temperaturę w każdej strefie czasowej, średnia preferowana temperatura z każdej próby jest uśredniana razem. Słupki błędów s.e.m. są równe błędowi między próbami.</li>
</ol>

<ol><li>Krauchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+thermophysiological+cascade+leading+to+sleep+initiation+in+relation+to+phase+of+entrainment%5BTitle%5D)+AND+%22Sleep+Med.+Rev%22%5BJournal%5D)">The thermophysiological cascade leading to sleep initiation in relation to phase of entrainment.</a> Sleep Med. Rev. 11, 439-451 (2007).</li>
<li>Krauchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+sleep-wake+cycle+reconsidered+from+a+thermoregulatory+point+of+view%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Behav%22%5BJournal%5D)">The human sleep-wake cycle reconsidered from a thermoregulatory point of view.</a> Physiol. Behav. 90, 236-245 (2007).</li>
<li>Kaneko, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+Rhythm+of+Temperature+Preference+and+Its+Neural+Control+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Circadian Rhythm of Temperature Preference and Its Neural Control in Drosophila.</a> Curr. Biol. 22, 1851-1857 (2012).</li>
<li>Allada, R., Chung, B. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+organization+of+behavior+and+physiology+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Circadian organization of behavior and physiology in Drosophila.</a> Annu. Rev. Physiol. 72, 605-624 (2010).</li>
<li>Garrity, P. A., Goodman, M. B., Samuel, A. D., Sengupta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Running+hot+and+cold%3A+behavioral+strategies%2C+neural+circuits%2C+and+the+molecular+machinery+for+thermotaxis+in+C.+elegans+and+Drosophila.%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Running hot and cold: behavioral strategies, neural circuits, and the molecular machinery for thermotaxis in C. elegans and Drosophila.</a> Genes Dev. 24, 2365-2382 (2010).</li>
<li>Hamada, F. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+internal+thermal+sensor+controlling+temperature+preference+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An internal thermal sensor controlling temperature preference in Drosophila.</a> Nature. 454, 217-220 (2008).</li>
<li>Hong, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cAMP+signalling+in+mushroom+bodies+modulates+temperature+preference+behaviour+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">cAMP signalling in mushroom bodies modulates temperature preference behaviour in Drosophila.</a> Nature. 454, 771-775 (2008).</li>
<li>Dillon, M. E., Wang, G., Garrity, P. A., Huey, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review%3A+Thermal+preference+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Therm.+Biol%22%5BJournal%5D)">Review: Thermal preference in Drosophila.</a> J. Therm. Biol. 34, 109-119 (2009).</li>
<li>Viswanath, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opposite+thermosensor+in+fruitfly+and%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Opposite thermosensor in fruitfly and.</a> Nature. 423, 822-823 (2003).</li>
<li>Gallio, M., Ofstad, T. A., Macpherson, L. J., Wang, J. W., Zuker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+coding+of+temperature+in+the+Drosophila+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The coding of temperature in the Drosophila brain.</a> Cell. 144, 614-624 (2011).</li>
<li>Stevenson, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relative+importance+of+behavioral+and+physiological+adjustments+controlling+body+temperature+in+terrestrial+ectotherms%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+Nat%22%5BJournal%5D)">The relative importance of behavioral and physiological adjustments controlling body temperature in terrestrial ectotherms.</a> Am. Nat. 126 (3), (1985).</li>
<li>Refinetti, R., Menaker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+circadian+rhythm+of+body+temperature%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Behav%22%5BJournal%5D)">The circadian rhythm of body temperature.</a> Physiol. Behav. 51, 613-637 (1992).</li>
<li>Duffy, J. F., Dijk, D. J., Klerman, E. B., Czeisler, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Later+endogenous+circadian+temperature+nadir+relative+to+an+earlier+wake+time+in+older+people%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Later endogenous circadian temperature nadir relative to an earlier wake time in older people.</a> Am. J. Physiol. 275, 1478-1487 (1998).</li>
<li>Saper, C. B., Lu, J., Chou, T. C., Gooley, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hypothalamic+integrator+for+circadian+rhythms%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The hypothalamic integrator for circadian rhythms.</a> Trends Neurosci. 28, 152-157 (2005).</li>
<li>Konopka, R. J., Pittendrigh, C., Orr, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reciprocal+behaviour+associated+with+altered+homeostasis+and+photosensitivity+of+Drosophila+clock+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurogenet%22%5BJournal%5D)">Reciprocal behaviour associated with altered homeostasis and photosensitivity of Drosophila clock mutants.</a> J. Neurogenet. 6, 1-10 (1989).</li>
<li>Qiu, J., Hardin, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((per+mRNA+cycling+is+locked+to+lights-off+under+photoperiodic+conditions+that+support+circadian+feedback+loop+function%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">per mRNA cycling is locked to lights-off under photoperiodic conditions that support circadian feedback loop function.</a> Mol. Cell Biol. 16, 4182-4188 (1996).</li>
<li>Crocker, A., Sehgal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+sleep%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of sleep.</a> Genes Dev. 24, 1220-1235 (1220).</li>
<li>Hendricks, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rest+in+Drosophila+is+a+sleep-like+state%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Rest in Drosophila is a sleep-like state.</a> Neuron. 25, 129-138 (2000).</li>
<li>Shaw, P. J., Cirelli, C., Greenspan, R. J., Tononi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlates+of+sleep+and+waking+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Correlates of sleep and waking in Drosophila melanogaster.</a> Science. 287, 1834-1837 (2000).</li>
<li>Parisky, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PDF+cells+are+a+GABA-responsive+wake-promoting+component+of+the+Drosophila+sleep+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">PDF cells are a GABA-responsive wake-promoting component of the Drosophila sleep circuit.</a> Neuron. 60, 672-682 (2008).</li>
</ol>

Nie ma nic do ujawnienia.

W tym miejscu ilustrujemy szczegóły aparatu behawioralnego preferencji temperatury i analizę zachowania TPR. Drosophila wykazuje istotne, solidne i powtarzalne cechy TPR sterowanego zegarem. Jednak nasze dane sugerują, że co najmniej dwa czynniki, światło otoczenia i wiek, znacząco zaburzają fenotypy behawioralne TPR.
Obserwujemy, że światło znacząco wpływa na preferencję temperaturową u Drosophila. Jest to zgodne z faktem, że muchy w1118 trzymane w LD pre...

Temperatura jest wszechobecnym sygnałem środowiskowym. Zwierzęta wykazują różne zachowania, aby uniknąć szkodliwych temperatur i szukać komfortowych. Drosophila wykazuje silne zachowanie preferencji temperaturowej6,7. Kiedy muchy są wypuszczane do gradientu temperatury od 18 do 32 °C, muchy unikają zarówno ciepłych, jak i niskich temperatur i ostatecznie wybierają preferowaną temperaturę 25 °C rano3. Czujniki ciepłej temperatury to zestaw neuronów termosensorycznych, neuronów prądu przemiennego, które wyrażają kanał przejściowego potencjału receptora Drosophila (TPR), TRPA16,9. Czujniki niskiej temperatury znajdują się w 3. segmencie anteny, ponieważ ablacja 3. segmentów anteny powoduje brak unikania niskich temperatur6. Ostatnio zidentyfikowano białko TRPP Brivido (Brv)10. Ponieważ Brv ulega ekspresji w 3. segmencie anteny i pośredniczy w wykrywaniu zimna, Brv jest możliwą cząsteczką wykrywającą zimno, która ma kluczowe znaczenie dla zachowania preferencji temperatury. Podsumowując, muchy używają tych dwóch czujników temperatury, aby uniknąć ciepłych i niskich temperatur oraz znaleźć preferowaną temperaturę.
Podczas gdy ssaki wytwarzają ciepło, aby regulować temperaturę swojego ciała, ektotermy zazwyczaj dostosowują temperaturę swojego ciała do temperatury otoczenia11. Wiadomo, że niektóre ektotermy wykazują codzienne zachowanie TPR, które uważa się za strategię dla ektotermów w celu regulacji ich BTR12. Aby ustalić, czy muchy wykazywały TPR, powtórzyliśmy analizę behawioralną preferencji temperatury w różnych momentach w ciągu 24 godzin. Odkryliśmy, że Drosophila wykazuje dzienny TPR, który jest niski rano i wysoki wieczorem i podąża za wzorcem podobnym do BTR u ludzi13.
U Drosophila w mózgu znajduje się ~150 neuronów zegarowych. Neurony zegarowe, które regulują aktywność lokomotoryczną, nazywane są oscylatorami M i E. Jednak, co ciekawe, oscylatory M i E nie regulują TPR, zamiast tego wykazaliśmy, że neurony zegara DN2 w mózgu regulują TPR, ale nie aktywność lokomotoryczną. Dane te wskazują, że TPR jest regulowany niezależnie od aktywności lokomotorycznej. Warto zauważyć, że BTR ssaków jest również regulowany niezależnie od aktywności lokomotorycznej. Badania ablacji na szczurach pokazują, że BTR jest kontrolowany przez specyficzne neurony SCN, które celują w inny podzbiór neuronów strefy podkomorowej niż te, które kontrolują aktywność lokomotoryczną14. Dlatego nasze dane rozważają możliwość, że BTR ssaków i TPR muchy są ewolucyjnie konserwatywne3, ponieważ zarówno TPR much, jak i BTR ssaków wykazują rytmy temperaturowe zależne od zegara okołodobowego, które są regulowane niezależnie od aktywności lokomotorycznej.
Tutaj opisujemy szczegóły analizy testu behawioralnego TPR u Drosophila. Metoda ta pozwala na zbadanie nie tylko mechanizmu molekularnego i obwodów neuronalnych TPR, ale także tego, w jaki sposób mózg integruje różne sygnały środowiskowe i wewnętrzne zegary biologiczne.

<table><tbody><tr><td>Bright Lab Jr. Safelight</td><td>Amazon</td><td>#B00013J8UY</td><td>Czerwone światło do ciemnych pomieszczeń</td></tr><tr><td>Produkty</td><td></td><td>Rain X</td> SOPUS <td>Wodoodporny: Zastosuj osłonę z pleksi</td></tr><tr><td>C-Clamp</td><td>Home Depot</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Temperatura/higrometr</td><td>Fisher</td><td>15-077-963</td><td></td></tr><tr><td>Urządzenia Peltiera</td><td>TE Technology, Inc.</td><td>HP-127-1.4-1.15-71P</td><td></td></tr><tr><td>Termometr</td><td>Fluke</td><td>Fluke 52II</td><td></td></tr><tr><td>Sterownik laboratoryjny</td><td>Oven Industries</td><td>5R6-570-15R i 5R6-570-24R</td><td></td></tr><tr><td>Sonda czujnika temperatury</td><td>Oven Industries</td><td>TR67-32</td><td></td></tr><tr><td>Ogólny zasilacz</td><td></td><td></td> ATX 480 W <td>Komputerowy system chłodzenia</td></tr><tr><td>MCR220-QP-RES Podwójny grzejnik 120 mm ze zbiornikiem&nbsp;</td><td>Komputerowy system chłodzenia</td> <td>Swiftech</td><td></td></tr><tr><td>MCP350 In-Line 12V DC</td><td>Układ chłodzenia komputera</td><td>Swiftech</td><td></td></tr><tr><td>Grafika MCW50 Karta cieczy Układ</td><td>chłodzenia komputera</td><td>Swiftech</td><td></td></tr><tr><td>Wentylator SY1225SL12SH Scythe Kaze-Jyuni</td> Szalony <td>system chłodzenia komputera</td> <td>PC</td><td></td></tr></tbody></table>

projektowanie i analiza zachowania preferencji temperaturowych i ich rytmu okołodobowego u drosophila

Design and Analysis of Temperature Preference Behavior and its Circadian Rhythm in Drosophila

Zegar okołodobowy reguluje wiele aspektów życia, w tym sen, aktywność lokomotoryczną i rytm temperatury ciała (BTR) 1,2. Niedawno zidentyfikowaliśmy nową produkcję okołodobową Drosophila, zwaną rytmem preferencji temperatury (TPR), w której preferowana temperatura u much wzrasta w ciągu dnia i spada w nocy 3. Co zaskakujące, TPR i aktywność lokomotoryczna są kontrolowane przez odrębne neurony okołodobowe3. Aktywność lokomotoryczna Drosophila jest dobrze znanym wynikiem zachowań okołodobowych i wniosła istotny wkład w odkrycie wielu konserwatywnych genów i mechanizmów zegara okołodobowego ssaków4. W związku z tym zrozumienie TPR doprowadzi do identyfikacji nieznanych dotąd molekularnych i komórkowych mechanizmów okołodobowych. Tutaj opisujemy, jak wykonać i przeanalizować test TPR. Technika ta nie tylko pozwala na analizę molekularnych i neuronalnych mechanizmów TPR, ale także dostarcza nowych informacji na temat podstawowych mechanizmów funkcji mózgu, które integrują różne sygnały środowiskowe i regulują zachowania zwierząt. Co więcej, nasze niedawno opublikowane dane sugerują, że mucha TPR ma cechy wspólne z BTR3 ssaków. Drosophila są ektotermami, w których temperatura ciała jest zazwyczaj regulowana behawioralnie. Dlatego TPR jest strategią stosowaną do generowania rytmicznej temperatury ciała u tych much5-8. Wierzymy, że dalsze badania Drosophila TPR ułatwią scharakteryzowanie mechanizmów leżących u podstaw kontroli temperatury ciała u zwierząt.

Przykład rytmu preferencji temperatury przedstawiono na Rysunku 5. Jeśli procedura behawioralna zostanie przeprowadzona pomyślnie, muchy powinny wykazać TPR, w którym preferują niską temperaturę rano i wyższą temperaturę wieczorem. Wzrost preferencji temperatury o ~1-1.5 °C w ciągu dnia powinien być obserwowany niezależnie od tła genetycznego, ponieważ wykazaliśmy, że muchy w1118, yw oraz Canton S wykazują podobną preferencję temperatury w ciągu dnia3....

Niedawno zidentyfikowaliśmy nową metodę rytmu preferencji temperatury (TPR) u Drosophila, w której preferowana temperatura u muszek wzrasta w ciągu dnia i spada w nocy. TPR jest regulowany niezależnie od innego okołodobowego wyjścia, aktywności lokomotorycznej. Tutaj opisujemy budowę i analizę TPR u Drosophila.

Projektowanie i analiza zachowania preferencji temperaturowych i ich rytmu okołodobowego u Drosophila

The circadian clock regulates many aspects of life, including sleep, locomotor activity, and body temperature (BTR) rhythms1,2. We recently identified a ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest określenie preferencji temperaturowej muszek Drosophila. Jest to realizowane poprzez przygotowanie much oraz aparatury, która składa się z kontrolowanej temperatury aluminiowej podstawy. Po ustabilizowaniu temperatur w aparaturze wprowadza się grupę much, a po pół godzinie dokonuje się oceny ich preferencji temperaturowej.W ostateczności test ten można stosować w szerokiej gamie warunków eksperymentalnych. Przykładem mogą być rytmy okołodobowe preferencji temperaturowych. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie badanych rytmów.Ponieważ docelowe rytmy preferencji temperatury są kontrolowane przez inne mechanizmy niż aktywność lokomocyjna, ten test behawioralny doprowadzi do identyfikacji nowych mechanizmów molekularnych i komórkowych, których nie udało się wcześniej zidentyfikować za pomocą metod opartych na aktywności lokomocyjnej. Metoda ta może również pomóc w uzyskaniu odpowiedzi na kluczowe pytania z dziedziny neuronauki sensorycznej, takie jak odczuwanie temperatury i bólu. Ze względu na wysoką powtarzalność testów behawioralnych temperatury, badanie to pozwoli nam zmapować obwód neuronalny od detekcji temperatury do jej przetwarzania, co dostarczy nam większej wiedzy na temat integracji sensorycznej.Hodować muchy w inkubatorach z nawilżaniem, stosując cykl światła i ciemności 12:12. Protokół ten wymaga dwóch takich inkubatorów ustawionych według przeciwstawnych harmonogramów. Inkubator nocny powinien pozostawać w ciemności podczas standardowych godzin pracy.Podczas dostępu do inkubatora w trakcie cyklu nocnego należy użyć światła czerwonego do oświetlenia wnętrza. Należy zebrać kohorty od 20 do 30 nowo wyklutych much obu płci w dowolnej proporcji i utrzymywać je w inkubatorze przez dwa do trzech dni przed przeprowadzeniem testu. Dla każdego badanego warunku wymagane jest co najmniej pięć kohort.Aby zbudować komorę do testowania preferencji temperaturowych, należy zaprojektować pokrywę z pleksiglasu pasującą do płyty aluminiowej znajdującej się poniżej. Umieść cztery ogniwa Peltiera. Każde z ogniw Peltiera powinno być podłączone do kontrolerów temperatury, które mogą generować niskie lub wysokie temperatury, aby zapobiec przegrzaniu ogniw.System chłodzenia komputera jest połączony z rurkami wodnymi, wentylatorami chłodzącymi i zasilaczami w celu monitorowania temperatury płyty aluminiowej. Sondy temperatury są osadzone w krawędzi płyty aluminiowej i podłączone do kontrolerów temperatury. W pokrywie ustaw temperaturę zimnej i gorącej strony płyty odpowiednio na 12 i 36 °C.Przymocuj sześć sond temperatury w różnych pozycjach w obrębie jednego z pasów. Umieść aparat w pomieszczeniu o kontrolowanych warunkach środowiskowych, w temperaturze 25 °C i przy wilgotności względnej między 65 a 75%. Należy na bieżąco monitorować te warunki.Pomieszczenie musi posiadać system kontroli oświetlenia oraz dobrą cyrkulację powietrza, aby zapobiec destabilizacji temperatury przez przepływające powietrze. Należy osłonić obszar testowy za pomocą zasłony prysznicowej. W obrębie aparatury należy stosować jednorodne oświetlenie, ponieważ natężenie światła może wpływać na preferencje temperaturowe.Włącz urządzenie na co najmniej 30 minut, aby ustabilizować gradient temperatury na powierzchni płytki. Pokryj pokrywę aparatu behawioralnego środkiem hydrofobowym, aby zapobiec wspinaniu się much po ściankach lub suficie pokrywy.Wytrzyj nadmiar środka hydrofobowego i pozostaw osłonę do wyschnięcia na 25 do 30 minut; jeśli to konieczne, taśmę dwustronną można zastosować po pół godzinie. Wytrzyj kondensację z płyty aluminiowej. Następnie umieść osłonę z pleksiglasu na płycie aluminiowej i zabezpiecz ją za pomocą sześciu ścisków śrubowych.Bardzo ważne jest, aby pokrywa była szczelnie zamknięta. Będziemy monitorować temperaturę powietrza pomiędzy płytką a pokrywą. Należy upewnić się, że sondy nie dotykają ani aluminiowej płytki, ani pleksiglasowej pokrywy.Pozostaw pokrywę na płytce przez co najmniej 15 minut w celu wyrównania temperatury. W rezultacie gradient temperatury powietrza między aluminiową płytką a pokrywą będzie wynosił od 18 do 32 stopni Celsjusza. W przypadku dziennego eksperymentu behawioralnego wyjmij fiolki z much z inkubatora dziennego i niezwłocznie przeprowadź test behawioralny w świetle przed nocnym eksperymentem behawioralnym. Wyjmij fiolki z much z inkubatora nocnego.Zawinąć je w folię i umieścić w pudełku w ciemnym pomieszczeniu pod czerwoną lampą. Podczas eksperymentów przeprowadzanych w okresie ciemności światła w pomieszczeniu muszą pozostać wyłączone przez cały czas, aż do zakończenia badań behawioralnych. Można jednak używać czerwonych lamp do oświetlenia podczas aspiracji.Przenieś od 20 do 25 much w przestrzeń między płytami aluminiowymi. Następnie zakryj otwory szkiełkami przedmiotowymi, aby zapobiec ucieczce much. Pozostaw muchy w swobodnym ruchu na 30 minut.Po zakończeniu eksperymentu należy wykonać co najmniej dwa zdjęcia dla doświadczeń prowadzonych w świetle. W przypadku doświadczeń w ciemności należy użyć lampy błyskowej. Należy sprawdzić temperaturę aparatury.Należy odnotować temperaturę w pomieszczeniu oraz wilgotność powietrza. Aby usunąć muchy, należy podłączyć rurkę z dwutlenkiem węgla w pobliżu otworu na górze aparatury w celu znieczulenia owadów, a następnie je usunąć. Nie powinny być one poddawane ponownym testom. Następnie należy wytrzeć wszelką kondensację lub wilgoć z płytki.Załóż pokrywę na płytkę i zabezpiecz ją zaciskami. W przygotowaniu do kolejnego eksperymentu oblicz gradient temperatury w następujący sposób. Najpierw, za pomocą linijki, określ rozmieszczenie sond temperatury na podstawie ich lokalizacji oraz zarejestrowanych temperatur. Narysuj linie proste reprezentujące każdy stopień temperatury w odpowiednim miejscu na zdjęciu końcowej pozycji muchy.Następnie należy policzyć liczbę much w każdym przedziale jednogradusowym. Należy pominąć muchy znajdujące się na ściankach lub na suficie osłony. Oblicz procentowy udział much w każdym zakresie temperatur dla każdego toru, a następnie średnią preferowaną temperaturę dla każdego warunku.Zbierz dane z co najmniej pięciu prób. Następnie wykorzystaj wartości średnie z każdej próby, aby wyznaczyć średnią temperaturę preferowaną wraz z błędami. Muchy normalne hodowane w temperaturze 25 °C preferują niższą temperaturę rano niż wieczorem.Podczas dnia zmierzono wzrost preferowanej temperatury o 1 do 1,5 stopnia, natomiast przy przejściu z dnia w noc zaobserwowano spadek o 1,5 do 2 stopni Celsjusza. Analiza ta może być również wykorzystana do badania much mutantów.Na przykład stwierdzono, że preferencja temperaturowa much z wadliwą mutacją w kanale jonowym trip jest wyższa niż u grupy kontrolnej. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przeprowadzić test preferencji temperaturowej. Metoda ta pozwala na badanie mechanizmów molekularnych i obwodów neuronalnych, ofa i zegarów, a także tego, w jaki sposób mózg integruje różne sygnały środowiskowe w zegarach biologicznych.

design-analysis-temperature-preference-behavior-its-circadian-rhythm

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Projektowanie i analiza zachowania preferencji temperaturowych i ich rytmu circadiannego w Drosophila

Opisujemy procedury rejestracji dobowych rytmów aktywności lokomocyjnej Drosophila oraz późniejszej analizy danych. Rytmy aktywności lokomocyjnej są wiarygodnym behawioralnym wskaźnikiem zegarów okołodobowych zwierząt i są wykorzystywane jako standardowy odczyt funkcji zegara podczas badania mutantów okołodobowych lub analizowania wpływu środowiska na regulację systemu okołodobowego.

Oznaczanie aktywności lokomotorycznej w celu badania rytmów okołodobowych i parametrów snu u Drosophila

Muszki owocowe Drosophila potrafią rozróżniać niewielkie zmiany temperatury i dlatego wybierają środowiska o sprzyjających warunkach termicznych. Ten film opisuje test behawioralny, który testuje preferencje temperaturowe larw Drosophila na liniowym gradiencie termicznym.

Test gradientu temperatury: metoda badania preferencji temperatury u larw Drosophila

Ten film opisuje system monitorowania aktywności Drosophila (DAM) używany do śledzenia aktywności lokomotorycznej. Naukowcy wykorzystują dane dotyczące aktywności zebrane z DAM do badania rytmów okołodobowych u muszek owocowych. Prezentowany klip protokołu pokazuje, jak ładować muchy do urządzenia i rejestrować dane dotyczące aktywności do eksperymentów okołodobowych.

Drosophila Monitor aktywności (DAM): metoda pomiaru aktywności lokomotorycznej u much

Tutaj opisujemy test preferencji jasno-ciemnej dla larw Drosophila. Test ten dostarcza informacji na temat wrodzonej i okołodobowej regulacji wykrywania światła i przetwarzania fotozachowania.

Test preferencji świetlnej w celu zbadania wrodzonego i okołodobowego regulowanego fotozachowania u larw Drosophila

Obwód żywieniowy u larw Drosophila melanogaster służy prostemu, ale potężnemu modelowi, który pozwala na skorelowanie zmian w tempie karmienia ze zmianami w obwodach nerwowych stomatogastrycznych. Obwód ten składa się z centralnych neuronów serotoninergicznych, które wysyłają projekcje do haczyków ustnych, a także do jelita przedniego.

Analiza funkcjonalna obwodu żerowania larw u Drosophila

Wpływ genów i środowiska na przestrzeń społeczną Drosophila melanogaster można określić ilościowo za pomocą potężnego, ale prostego paradygmatu analitycznego. Pokazujemy tutaj różne czynniki, które mogą wpływać na tę przestrzeń społeczną, a zatem muszą być brane pod uwagę przy projektowaniu eksperymentów w tym paradygmacie.

Warunki wpływające na przestrzeń społeczną u Drosophila melanogaster

Tutaj prezentujemy protokół do określenia preferowanej temperatury środowiskowej larw Drosophila za pomocą ciągłego gradientu termicznego.

Test gradientu temperatury w celu określenia preferencji termicznych larw Drosophila

Tutaj prezentujemy protokół do automatycznego określania sprawności lokomotorycznej Drosophila przy zmieniających się temperaturach za pomocą programowalnej areny kontrolowanej temperaturą, która wytwarza szybkie i dokładne zmiany temperatury w czasie i przestrzeni.

Zautomatyzowana metoda określania wydajności Drosophila w odpowiedzi na zmiany temperatury w czasie i przestrzeni

Tutaj szczegółowo opisujemy, jak zsynchronizować Drosophila z dniem okołodobowym. Jest to pierwszy i najważniejszy krok niezbędny do badania rytmów biologicznych i chronobiologii.

Okołodobowe porywanie Drosophila melanogaster

Owady mają optymalny zakres temperatur otoczenia, w którym starają się pozostać, a wiele czynników zewnętrznych i wewnętrznych może zmienić tę preferencję. W tym miejscu opisujemy opłacalną i prostą metodę badania wyboru temperatury, która pozwala owadom swobodnie wykazywać swoje naturalne zachowania.

Określanie preferencji temperaturowych komarów i innych ektotermów

Poznaj metodę oceny preferencji temperaturowej i jej rytmu okołodobowego u Drosophila. Technika ta pozwala badać niezależne mechanizmy regulacji rytmów dobowych w neurobiologii i chronobiologii.

Projektowanie i analiza zachowania preferencji temperaturowych i ich rytmu okołodobowego u Drosophila

Przeglądaj więcej filmów