Projektowanie i analiza zachowania preferencji temperaturowych i ich rytmu okołodobowego u Drosophila
13 stycznia 2014
Niedawno zidentyfikowaliśmy nową metodę rytmu preferencji temperatury (TPR) u Drosophila, w której preferowana temperatura u muszek wzrasta w ciągu dnia i spada w nocy. TPR jest regulowany niezależnie od innego okołodobowego wyjścia, aktywności lokomotorycznej. Tutaj opisujemy budowę i analizę TPR u Drosophila.
Ogólnym celem tej procedury jest określenie preferencji temperaturowej drosophila. Osiąga się to poprzez uprzednie przygotowanie much i aparatu, który jest zamontowany wokół aluminiowej podstawy o kontrolowanej temperaturze. Po ustaleniu temperatury w aparacie ładuje się kohortę much i po pół godzinie ocenia się ich preferencję temperaturową.
Ostatecznie test może być stosowany w wielu różnych warunkach eksperymentalnych. Na przykład rytmy okołodobowe preferencji temperatury. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie docelowych rytmów.
Ponieważ ten docelowy rytm preferencji temperatury jest kontrolowany przez inne mechanizmy niż w przypadku aktywności lokomotywy, ten test zachowania doprowadzi do identyfikacji nowych mechanizmów molekularnych i komórkowych, które nie zostały wcześniej zidentyfikowane przy użyciu podejść do aktywności lokomotywy. Ta metoda może również pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie neurobiologii sensorycznej, takie jak temperatura i odczuwanie bólu. Ponieważ te testy behawioralne temperatury są bardzo solidne, ten test pozwoli nam zmapować obwód neuronalny od wykrywania temperatury do przetwarzania, co pozwoli nam uzyskać lepszy wgląd w integrację sensoryczną.
Hoduj muchy w nawilżanych inkubatorach z jasnym cyklem ciemnym 1212. Protokół ten wymaga dwóch takich inkubatorów ustawionych na przeciwstawne harmonogramy. Nocny inkubator powinien być ciemny w normalnych godzinach pracy.
Uzyskując dostęp do inkubatora w jego cyklu nocnym, użyj czerwonego światła, aby oświetlić inkubator. Zbierz kohorty od 20 do 30 nowo wyklutych much dowolnej płci i w dowolnym stosunku trzymaj je w inkubatorze przez dwa do trzech dni przed poddaniem ich testowi. Dla każdego badanego stanu wymaganych jest co najmniej pięć kohort.
Aby zbudować komorę do testowania preferencji temperatury, osłona z pleksiglasu musi być zaprojektowana tak, aby pasowała do aluminiowej płyty pod płytą. Umieść cztery przyrządy Peltiera. Każde z urządzeń Peltiera powinno być podłączone do regulatorów temperatury, które mogą generować niskie lub wysokie temperatury, aby zapobiec przegrzaniu pelterów.
Komputerowy system chłodzenia jest podłączony do rur wodnych, wentylatorów chłodzących powietrze i zasilaczy w celu monitorowania temperatury na aluminiowej płycie. Sondy temperatury są osadzone w krawędzi aluminiowej płyty i są podłączone do regulatorów temperatury. Ustaw zimną i gorącą stronę talerza odpowiednio na 12 i 36 stopni Celsjusza w pokrowcu.
Zamocuj sześć sond temperatury w różnych miejscach na jednym z pasów. Umieść urządzenie w pomieszczeniu o kontrolowanym poziomie 25 stopni Celsjusza i wilgotności względnej od 65 do 75%. Pamiętaj, aby monitorować te warunki.
Pomieszczenie musi mieć kontrolę światła i dobrą cyrkulację powietrza, aby powietrze krążące nie destabilizowało temperatury. Gradient osłaniaj obszar testowy zasłoną prysznicową. W aparacie należy stosować jednolite światło, ponieważ jasność może wpływać na preferencje temperaturowe.
Włącz urządzenie na co najmniej 30 minut. W celu ustalenia stabilnego gradientu temperatury na powierzchni płyty. Pokryj pokrywę aparatu behawioralnego środkiem hydrofobowym, aby zapobiec wspinaniu się much po ścianach lub suficie pokrowca.
Zetrzyj nadmiar środka hydrofobowego i w razie potrzeby pozostaw pokrywę na 25 do 30 minut, pół godziny później można użyć podwójnej taśmy klejącej. Zetrzyj kondensację z aluminiowej płyty. Następnie umieść osłonę z pleksi na aluminiowej płycie i zabezpiecz sześcioma zaciskami C.
Bardzo ważne jest, aby pokrywa była uszczelniona. Dobrze monitoruj temperaturę powietrza między płytą a pokrywą. Upewnij się, że sondy nie dotykają ani aluminiowej płyty, ani osłony z pleksiglasu.
Pozwól pokrywie wyrównać się na talerzu przez co najmniej 15 minut. Ostatecznie gradient temperatury powietrza między aluminiową płytą a pokrywą będzie wynosił od 18 do 32 stopni Celsjusza W przypadku dziennego eksperymentu behawioralnego wyjmij fiolki z muchami z dziennego inkubatora i przetestuj test behawioralny w świetle bezpośrednio przed nocnym eksperymentem behawioralnym. Wyjmij fiolki z muchami z nocnego inkubatora.
Zawiń je w folię i umieść w pudełku w ciemnym pomieszczeniu pod czerwoną lampą. W przypadku eksperymentów w okresach ciemności światła w pomieszczeniu muszą pozostać wyłączone przez cały czas, dopóki eksperymenty behawioralne nie zostaną zakończone. Jednak czerwone lampy mogą być używane do oświetlenia za pomocą aspiracji.
Obciążenie od 20 do 25 much w przestrzeń między aluminiową płytą. Następnie zakryj otwory szkiełkami nakrywkowymi, aby zapobiec ucieczce much. Pozwól muchom poruszać się przez 30 minut.
Po zakończeniu eksperymentu zrób co najmniej dwa zdjęcia do eksperymentów świetlnych. Do ciemnych eksperymentów należy użyć lampy błyskowej. Sprawdź temperaturę urządzenia.
Zwróć uwagę na temperaturę w pomieszczeniu, a także wilgotność, aby usunąć rurkę z dwutlenkiem węgla podłączoną do much w pobliżu otworu na górze aparatu, aby znieczulić muchy, wyrzuć muchy. Nie należy ich ponownie badać. Następnie zetrzyj kondensację lub wilgoć z płyty.
Załóż pokrywę na płytę i dokręć zaciskami w przygotowaniu Do następnego eksperymentu oblicz gradient temperatury w następujący sposób. Najpierw określ, gdzie znajdują się sondy temperatury za pomocą linijki na podstawie lokalizacji sond i ich zarejestrowanych temperatur. Narysuj proste linie reprezentujące każdy stopień temperatury w odpowiedniej pozycji na zdjęciu końcowej pozycji muchy.
Następnie policz liczbę much między każdym przedziałem jednego stopnia Celsjusza. Wyklucz wszelkie muchy na ścianach lub suficie pokrywy. Oblicz procent much w każdym zakresie temperatur na każdym torze, a następnie średnią preferowaną temperaturę dla każdego warunku.
Zbierz dane z co najmniej pięciu badań. Następnie użyj średnich wartości z każdej próby, aby określić średnią preferowaną temperaturę z błędami. Normalne muchy podniesione w temperaturze 25 stopni Celsjusza, preferują niższą temperaturę rano niż wieczorem.
Zmierzono wzrost preferencji temperatury o 1 do 1,5 stopnia w ciągu dnia i o 1,5 do dwóch stopni Celsjusza. Spadek zaobserwowano przy przejściu z dnia na noc. Test może być również wykorzystany do testowania zmutowanych much.
Na przykład stwierdzono, że preferencja temperaturowa much z wadliwą mutacją w podróży, jednym kanałem jonowym, jest wyższa niż w grupie kontrolnej. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przeprowadzić test zachowania preferencji temperatury. Metoda ta pozwala na badanie mechanizmów molekularnych i obwodów neurologicznych, ofa i zegarów, a także tego, w jaki sposób mózg integruje różne sygnały środowiskowe i zegary biologiczne.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie identyfikuje nowy wyjściowy sygnał rytmu okołodobowego u Drosophila, znany jako rytm preferencji temperatury (TPR), który zmienia się w zależności od pory dnia. Badania analizują, w jaki sposób TPR jest regulowany niezależnie od aktywności lokomotorycznej.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- neuronauka
- chronobiologia
- biologia behawioralna
Wstęp
- Rytm preferencji temperaturowej (TPR) jest nowo zidentyfikowanym produktem efektorowym rytmu okołodobowego.
- TPR wykazuje dobowe wahania, wzrastając w ciągu dnia i spadając w nocy.
- Zrozumienie TPR może dostarczyć wiedzy na temat mechanizmów regulacji okołodobowej.
- TPR różni się od innych zachowań okołodobowych, takich jak aktywność lokomotoryczna.
Cel badania
- Zbadanie preferencji temperaturowych muszek Drosophila.
- Analiza projektu i metodologii oceny TPR.
- Zbadanie wpływu TPR w kontekście rytmów okołodobowych.
Zastosowane metody
- Przygotowanie muszek Drosophila oraz aparatury eksperymentalnej.
- Ustanowienie warunków temperaturowych w kontrolowanym środowisku.
- Umieszczenie muszek w aparaturze w celu oceny preferencji temperaturowych.
- Ocena preferencji temperaturowych po półgodzinnym okresie obserwacji.
Główne wyniki
- TPR zostało pomyślnie zmierzone i wykazało wyraźne wahania dobowe.
- Metoda ta pozwala na testowanie różnych warunków eksperymentalnych.
- Wyniki przyczyniają się do zrozumienia rytmów okołodobowych u Drosophila.
- Otrzymane dane mogą pomóc w rozwiązaniu kluczowych pytań w dziedzinie biologii rytmów okołodobowych.
Wnioski
- TPR jest istotnym wynikiem okołodobowym, który funkcjonuje niezależnie od aktywności lokomotorycznej.
- Opracowana metodologia może zostać zastosowana w dalszych badaniach nad rytmami okołodobowymi.
- Zrozumienie TPR może prowadzić do szerszego wglądu w regulację okołodobową u innych organizmów.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ilościowa analiza rytmów preferencji temperatury (TPR) u Drosophila umożliwia mechanistyczną weryfikację wyników okołodobowych wykraczających poza aktywność lokomotoryczną, co wspiera walidację celów w procesach badawczych z zakresu neurobiologii i chronobiologii. Ten test behawioralny zapewnia wiarygodność prognostyczną niezbędną do analizy obwodów neuronalnych i szlaków molekularnych leżących u podstaw integracji sygnałów środowiskowych, bezpośrednio wpływając na wczesne etapy odkryć oraz strategie badań translacyjnych. Solidny i powtarzalny schemat postępowania czyni analizę TPR narzędziem wielokrotnego użytku dla interdyscyplinarnych zespołów B&R badających integrację sensoryczną oraz regulację okołodobową.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia analizę odrębnych wyników okołodobowych w celu funkcjonalnej walidacji celów w szlakach neuronalnych i molekularnych.
- Wspiera redukcję ryzyka biologicznego poprzez rozróżnienie mechanizmów kontrolujących TPR od tych regulujących aktywność lokomotoryczną.
- Ułatwia uzyskanie pewności prognostycznej w identyfikacji nowych genów i obwodów okołodobowych istotnych dla modeli chorób.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Zapewnia zwalidowany system testów behawioralnych do ilościowego pomiaru preferencji temperaturowej w kontrolowanych warunkach.
- Gwarantuje powtarzalność i standaryzację testów pomiędzy kohortami eksperymentalnymi i zmiennymi środowiskowymi.
- Umożliwia skalowalny screening mutantów genetycznych lub interwencji farmakologicznych wpływających na szlaki okołodobowe i sensoryczne.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodne z rozwojem biomarkerów translacyjnych poprzez modelowanie rytmicznej regulacji temperatury ciała u organizmów ektotermicznych.
- Wspiera ciągłość procesu od etapu odkryć do przedklinicznej walidacji funkcji obwodów neuronalnych i integracji sygnałów środowiskowych.
- Minimalizuje ryzyko decyzji dotyczących dalszego rozwoju, dostarczając wglądu w mechanizmy regulacji sensorycznej i okołodobowej istotne dla systemów ssaków.
Integracja potoku i przepływu pracy
Analiza TPR integruje się z kontinuum procesu odkrywania – od wczesnych badań mechanistycznych po opracowanie modeli przedklinicznych, umożliwiając weryfikację hipotez oraz wyjaśnienie szlaków sygnałowych dla celów okolodobowych i sensorycznych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera analizy oparte na hipotezach dotyczącą obwodów neuronalnych i mechanizmów molekularnych leżących u podłoża rytmów preferencji temperaturowych.
- Przesiewanie: Dostarcza ilościowe, powtarzalne wyniki do porównywania manipulacji genetycznych lub środowiskowych.
- Analityka: Zapewnia pomiary statystyczne rozkładów preferowanych temperatur oraz przesunięć fazy okołodobowej.
- Badania translacyjne: Łączy wyniki odkryć z modelami przedklinicznymi regulacji temperatury ciała i integracji sensorycznej.
- Wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy solidną, adaptacyjną platformę do ciągłej walidacji celów i badań mechanistycznych w ramach programów B+R.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach z zakresu neurobiologii sensorycznej oraz rytmów okołodobowych.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje fenotypowanie behawioralne za pomocą skalowalnych i powtarzalnych protokołów.
- Wartość strategiczna: Wspiera podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań oraz zwiększa efektywność kapitałową poprzez wczesne wyjaśnienie ryzyka biologicznego na etapie rozwoju.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów i modeli w portfelach neurobiologii i chronobiologii w oparciu o analizę ryzyka.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy specjalistycznej z zakresu neuronauki behawioralnej, chronobiologii oraz ilościowej analizy danych.
- Wymaga precyzyjnej kontroli środowiskowej i instrumentarium do regulacji temperatury oraz oświetlenia.
- Konieczna jest międzyzespołowa standaryzacja konfiguracji testów, zbierania danych oraz protokołów analizy.
- Metoda jest możliwa do dostosowania do różnych tło genetycznych i manipulacji eksperymentalnych w modelach Drosophila.
- Ograniczenia praktyczne obejmują wrażliwość na czynniki środowiskowe oraz konieczność rygorystycznej replikacji kohort.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:05
Title
1:49
Preparing the Flies
2:35
Assembling the Temperature Preference Apparatus
4:06
Preparing the Apparatus
5:18
Running the Temperature Preference Assay
7:53
Circadian Rhythms and TrpA1 Affect Temperature Preference
8:35
Conclusion
6:55
Data Analysis
